用於產毒性測試的組合物和方法

2024-03-01 04:53:15

用於產毒性測試的組合物和方法
【專利摘要】本發明涉及用於測試試劑的組合物和方法(例如，肉毒梭菌(Clostridium?botulinum)神經毒素(BoNT)檢測和分析)。尤其是，本發明涉及人誘導的多能幹(hiPS)來源的細胞用於試劑檢測和分析的用途。
【專利說明】用於產毒性測試的組合物和方法
[0001]本申請要求2011年9月29日提交的美國臨時申請N0.61/540，693的優先權，將其通過引用以其整體在本文合併。
【【技術領域】】
[0002]本發明涉及用於測試劑(例如，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)神經毒素(BoNT)檢測和分析)的組合物和方法。尤其是，本發明涉及人誘導的多能幹(hiPS)來源的細胞用於試劑檢測和分析的用途。
【【背景技術】】
[0003]由革蘭氏陽性，土壤-居住細菌肉毒梭菌(Clostridium botulinum)合成的肉毒桿菌神經毒素(BoNT)是人類知道的最毒性物質，且是神經麻痺性疾病肉毒中毒的成因劑(Johnson E (2005) in Topley and Wilson's microbiology and microbialinfections, ed S.P.Borriello, P.R.Murray, and G.Funke (Hodder Arnold, London, UnitedKingdom)，ppl035 - 1088)。已描述被指定為A~G的BoNT的7種免疫學不同的血清型(Gimenez DF&Gimenez JA (1995) Int J Food Microbiol27:1 ~9) oBoNT起初作為~150kDa的單鏈多肽合成，但翻譯後蛋白水解切割產生由二硫鍵連接的~IOOkDa和~50kDa的不同重和輕鏈(HC和LC)。HC還被功能性地分為HCe和HCn亞結構域。HCe結構域負責識別及結合導致胞吞的特定神經元細胞表面受體，而HCn結構域負責胞吞囊泡膜中的通道形成和跨內體膜的 LC 的轉位和內化(Montecucco et al., (2004)Trends Microbiol 12:442-446 ;Fischer A&Montal M(2007)J Biol Chem282:29604-29611 ；Fischer A, et al(2009)ProcNatl Acad Sci U S A106:1330-1335)。在轉位期間，二硫鍵切割，及LC釋放到細胞胞質溶膠及再作為 鋅-依賴性內肽酶摺疊為活性酶組分(Fischer et al., supra ；FischerA&Montal M(2007)Proc Natl Acad Sci U S A104:10447-10452)。LC然後特別在突觸前囊泡靶向及切割細胞內SNARE蛋白，這導致神經遞質釋放的抑制。各BoNT血清型具有不同切割靶，BoNT/A和E切割SNAP-25在不同位點，BoNT/B，D，F和G在不同位點切割VAMP/突觸泡蛋白，及 BoNT/C 切割 SNAP-25 和突觸融合蛋白(見 Montecucco C&Schiavo G(1994)MolMicrobiol 13:1 ~8 的綜述)。
[0004]天然存在的肉毒中毒是罕見但嚴重的疾病，在美國每年發生~110例和致死率是~5 ~10% (Johnson EA&Montecucco C(2008) in Handbook of Clinical Neurology, edAndrew G.Engel Elsevier, pp333_368)。由於它們的極度效力(對於 BoNT/A, lng/kg 的體重的估計的人致死劑量)(Bossi P, et al (2006)Cell Mol Life Sci63:2196-2212)，治療情況中涉及的疾病肉毒中毒的嚴重性和高成本，尤其以大規模，BoNT已被分類為類別A選擇劑及作為生物恐怖主義武器呈現嚴重的威脅(Arnon SS,等人(2001) JAMA285:1059-1070)。
[0005]BoNT/A及在更少得多的程度BoNT/B也被用作獨特和重要藥物來治療各種神經肌肉病症及用於化妝品。食品和藥物管理局批准的使用BoNT的條件包括化妝品治療及暫時減輕各種肌肉痙攣狀態病症，多汗和偏頭痛(Chaddock JA&Acharya KR(2011)FEBS J278:899~904)。BoNT的化妝品和臨床應用在增加，開發用於藥學目的的BoNT的新製劑使需要臨床試驗，精確的效力確定，及中和抗體篩選。例如，BoNT被藥學施用用於治療:疼痛病症，隨意肌肉強度，病灶張力失調，包括子宮頸，顱張力失調和良性自發眼瞼痙攣，單側面痙攣，及病灶痙攣狀態，胃腸病症，多汗和化妝皺紋修正，眼瞼痙攣，口顎肌張力失調，開頜類型，閉頜類型，夜磨牙症，Meige症候群，舌張力失調，眼瞼失用症，打開子宮頸張力失調，頸項前屈，頸後傾，頸側傾，斜頸，咽張力失調，喉張力失調，痙攣性發聲困難/收肌類型，痙攣性發聲困難/展肌類型，痙攣性呼吸困難，肢張力失調，臂張力失調，任務特定張力失調，作家痙攣，音樂家痙攣，高爾夫球員痙攣，腿張力失調，股內收，股外展膝屈曲，膝延伸，踝屈曲,踝延伸，馬蹄內翻足,畸形足張力失調,紋狀體趾,趾屈曲,趾延伸,軸張力失調，pisa症候群，腹部舞者張力失調，節段性張力失調，偏側肌張力障礙，一般張力失調，X-連鎖的張力失調帕金森症中的張力失調，皮質基底變性中的張力失調，X-連鎖的張力失調帕金森症中的張力失調，遲發張力失調，脊髓小腦共濟失調中的張力失調，帕金森病中的張力失調，亨廷頓病中的張力失調，Hallervorden-Spatz病中的張力失調，多巴-誘導的運動障礙/多巴-誘導的張力失調，遲發運動障礙/遲發張力失調，陣發性運動障礙/張力失調，運動性非-運動性作用-誘導的顎肌陣攣，肌陣攣肌纖維顫搐，剛性，良性肌肉痙攣，遺傳性下顎震顫，反常性頜肌肉活性，半咀嚼痙攣，肥大性鰓肌病，咬肌肥大，脛骨前肌肥大，眼球震顫，振動幻覺核上性凝視麻痺，癲癇，持續性不全癲癇，痙攣性斜頸操作計劃，展肌聲帶麻痺，頑固性突變發聲困難，上食管括約肌功能障礙，聲帶肉芽腫，口吃抽動穢語症候群，中耳肌陣攣，保護性喉閉合，喉切除術後，言語失敗，保護性上瞼下垂，眼瞼內翻括約肌Odii功能障礙，假性食道弛不能，非失弛緩症，食管運動神經病症，陰道痙攣，手術後固定震顫，膀胱功能障礙，逼肌括約肌協同 動作障礙，膀胱括約肌痙攣，單側面痙攣，神經支配恢復術運動障礙，化妝品使用克勞足，皺眉面部不對稱，頦肌笑靨，僵人症候群，破傷風前列腺增生，肥胖，治療嬰兒腦麻痺斜視，混合的麻痺相伴的，在視網膜剝離手術之後，在白內障手術之後，在無晶狀體肌炎斜視中，肌病斜視，分離垂直性偏斜，作為斜視手術的附加，內斜視，外斜視，失弛緩症，肛門龜裂，外分泌腺活動過度，Frey症候群，鱷淚症候群，多汗，腋掌足底鼻漏，中風中的相對多涎，在帕金森氏中，在肌萎縮側索硬化症中，痙攣性病情，在腦炎和脊髓炎自身免疫過程中，多發性硬化，橫貫性脊髓炎，Devic症候群，病毒感染，細菌感染，寄生蟲感染，真菌感染，在遺傳性痙攣性輕截癱卒中後症候群半球梗塞，腦幹梗塞，脊髓梗塞中，在中樞神經系統創傷，半球損傷，腦幹損傷，脊髓損傷中，在中樞神經系統出血，腦內出血，蛛網膜下出血,硬膜下出血,脊柱內出血中，在瘤形成,半球腫瘤,腦幹腫瘤和脊髓腫瘤中。由此,在環境中，食品中，藥學製備物中，為抗體檢測，及在研究應用中BoNT活性的定量和可靠的檢測在防止肉毒中毒，為反恐怖主義，以及新藥物開發和患者安全性和產品的質量控制和保證測試中是關鍵的。
[0006]許多BoNT檢測方法已出版，及它們可分為4大類別(Cai等人，(2007)Crit RevMicrobiol33:109~125的綜述):1.免疫學檢測全毒素的存在,但無法區別有活性的或無活性狀態的體外測定(ELISA) ；2.檢測毒素LC的酶促活性，但不區別有生物學活性的全毒素和僅LC的內肽酶測定；3.體內測定(小鼠生物測定)；及最後4.體內模擬測定諸如半隔膜測定，局部注射測定，及使用原代或永生化的細胞的基於細胞的測定。為了檢測完全有活性的BoNT，檢測測定應測量中毒過程的全部步驟(例如:結合於細胞表面受體的HC，胞吞，囊泡通道形成，二硫鍵切割，LC轉導進細胞胞質溶膠，及SNARE蛋白的最終蛋白水解切割)。僅小鼠生物測定和體內模擬測定測量全部這些步驟。小鼠生物測定涉及給小鼠靜脈內或腹膜內注射BoNT的不同稀釋，然後觀察小鼠肉毒中毒的症狀(肢麻痺，用力呼吸，裙皺的毛皮，等)(Hatheway CL (1988) in Laboratory diagnosis of infectiousdiseases:principles and practice.eds Balows A, Hausler WH, Ohashi M&TuranoMA(Springer-Verlag, New York)，pplll - 133 ;Schantz EJaK, D.A.(1978)Journal of theAssociation of Official Analytical Chemists61:96-99)和最終死亡。儘管MBA是定量的，且可監測全部中毒步驟，但其具有大的出錯率，在實驗室之間或實驗室之內不標準化，需要大量的動物，及對應設備及訓練的人員。半隔膜和局部注射測定減少動物痛苦，且一些足夠敏感，但仍需要大量的動物及熟練的人員。 [0007]這些測定的這些清楚地鑑定的缺點刺激了來自調控機構包括FDA和USDA的建議，以開發會提供對MBA特異性，敏感和定量替代性的基於細胞的模型(NationalInstitute of Environmental Health Sciences, 2008)。各種連續細胞系，包括神經-2a和PC-12，已用於毒性測試，但對與MBA競爭不是敏感足夠的。源於大鼠，小鼠或雞的原發性神經元，及源於小鼠胚胎幹細胞的神經元顯著地更敏感(Hall YH, et al(2004)JTmmunol Methods288:55-60 ；Keller JE, Cai F&Neale EA(2004)Biochemistry43:526-532 ；Lalli G, et al(1999)J Cell Scill2(Ptl6):2715-2724 ;Neale et al., (1999)J CellBioll47:1249-1260 ；Stahl AM, et al(2007)J Biomol Screenl2:370_377)。所描述的用於毒性測試及抗體檢測的最敏感細胞類型是原發性大鼠脊髓細胞(RSC)測定(Pellett等人，(2007) FEBS Lett581:4803-4808)，其相比MBA更敏感，可再現及良好關聯於小鼠生物測定(Pellett et al., (2010)J Pharmacol Toxicol Methods)。此外，源於胚胎幹細胞的神經兀已也顯不高度敏感(McNutt et al., (2011)Biochem Biophys Res Commun405:85-90 ；Pellett S, et al(2011)Biochem Biophys Res Commun404:388-392 ;Kiris E,et al(2011)Stem Cell Res)。但是，RSC測定仍需要使用一些動物及用於細胞製備的熟練的人員，且由於連續製備新批細胞的需求而不容易適應於測試標準化。
[0008]【發明概述】
[0009]本發明涉及用於測試試劑的組合物和方法(例如，肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)神經毒素(BoNT)檢測和分析)。尤其是，本發明涉及人誘導的多能幹(hiPS)來源的細胞用於試劑檢測和分析的用途。
[0010]本發明的實施方式提供用於研究，篩選，臨床和治療性應用的神經元細胞(例如，人(例如，iPS來源的))。在一些實施方式中，方法用於BoNT及對BoNT的中和抗體的檢測和分析。例示實施方式在這裡及下文所述。另外的實施方式在本文所述及在本領域技術人員的知識之內。
[0011]例如，在一些實施方式中，本發明提供檢定梭菌物種(例如，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)神經毒素(BoNT))的活性的方法,包括:(a)使人誘導的多能幹細胞(hiPS)來源的神經元細胞與包含NT的組合物接觸；及(b)檢定NT的生物學活性。在一些實施方式中，梭菌物種是肉毒梭菌(Clostridium botulinum),丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum),或巴氏梭菌(Clostridium baratii)。在一些實施方式中，BoNT包括全部7種知道的血清型，包括血清型A，B, C，D，E，F和G及各血清型之內已知道的亞型。在一些實施方式中，NT是重組體，突變體或嵌合NT。在一些實施方式中，生物學活性是SNAP-25，VAMP或突觸融合蛋白的切割。在一些實施方式中，測定是定性的，而在其他實施方式中，測定是定量的。在一些實施方式中，NT經純化，而在其他實施方式中，其在複合物，溶液或基質中。在一些實施方式中，NT是重組體。在一些實施方式中，NT與選自下列的另一分子綴合:治療性模式，標誌物，成像劑，酶，受體，抗體或生物活性化合物。在一些實施方式中，方法還包括在接觸hPS來源的神經元細胞之前，使NT與測試化合物接觸的步驟。在一些實施方式中，測試化合物是NT的抗體(例如，中和抗體)或小分子抑制物。在一些實施方式中，中和抗體經純化或在血清或抗毒素樣品中。
[0012]本發明還提供檢定梭菌物種神經毒素(例如，BoNT)的活性的方法，包括:(a)使人誘導的多能幹(hiPS)來源的神經元細胞與包含(a)NT ;及(b)中和抗體的組合物接觸；及(b)檢定NT的生物學活性。
[0013]本發明也涉及測定包含有生物學活性的BoNT的製備物(優選，藥學包含有生物學活性的BoNT的製備物)中有生物學活性的BoNT的量的方法及。在一些實施方式中，方法包括下列步驟:(a)使hiPS細胞來源的神經元細胞與包含有生物學活性的BoNT的製備物的樣品接觸 '及(b)測定存在於製備物中的有生物學活性的BoNT的量通過檢定樣品的BoNT的生物學活性。
[0014]在進一步實施方式中，本發明提供人誘導的多能幹(hiPS)細胞來源的神經元細胞用於檢定BoNT的活性的用途。
[0015]在本文描述了另外的實施方式。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0016]圖1顯示iPS神經元中的BoNT受體表達。A.使iPS細胞成熟4，7，10，14和21天，及經蛋白印跡檢定BoNT受體的表達水平。B.使iPS細胞成熟5，10，15和20天，並將成年人腦細胞用於實施定量-PCR測定。
[0017]圖2顯示平鋪在7種不同底物上的iPS神經元的BoNT/Al敏感度的比較(顯示在右側)。
[0018]圖3顯示iPS神經元和RSC細胞的BoNT/Al敏感度。
[0019]圖4顯示檢測iPS神經元中的BoNT/Al活性的時間依賴性。
[0020]圖5顯示相比RSC細胞，iPS神經元的BoNT/Al攝取速度。
[0021]圖6顯示由神經元的活性-依賴性BoNT/Al攝取。A.在細胞-刺激培養基中使iPS神經元和RSC細胞暴露於55U或275U的BoNT/Al經1，5，10和15分鐘，之後去除毒素，並24h溫育。B.使iPS神經元在神經元和細胞-刺激培養基中暴露於55U的BoNT/Al經1，5和lOmin。C.使神經元在細胞-刺激培養基中暴露於1.7~55U的BoNT/Al經5min，用神經元培養基洗滌兩次，並溫育24h。
[0022]圖7顯示iPS神 經元中抗體保護測定的蛋白印跡和光密度測定法數據。A.使iPS神經元暴露於1.5U的毒素和抗體經24h。B.使iPS神經元在細胞-刺激培養基中暴露於55U的毒素-抗體混合物經5分鐘，移出混合物，將細胞洗滌兩次，並溫育24h。
[0023]圖8顯示iPS神經元對BoNT/A複合物及純化的BoNT/A的敏感度。A.比較純化的BoNT/A I 和 BoNT/Al 複合物的 SDS-PAGE 凝膠(自 Invitrogen 的階梯:See Blue? Plus2前染色的標準)。B.在48h毒素暴露之後iPS神經元對BoNT/Al純化的毒素和BoNT/Al複合物的敏感度。
[0024]圖9顯示iPS神經元中BoNT/B，C和E活性的檢測。使iPS神經元成熟7天和使RSC細胞平行暴露於BoNT/B (A)，/C (B)及/E (C)的系列稀釋48h。
[0025]【定義】
[0026]為了輔助本發明的理解，以下定義許多術語和短語:[0027]如本文所用，術語「宿主細胞」指稱任何真核生物或原核生物細胞(例如，哺乳動物細胞，禽細胞，兩棲動物細胞，植物細胞，魚細胞和昆蟲細胞)，無論位於體外或體內。
[0028]如本文所用，術語〃細胞培養物〃指稱細胞的任何體外培養物。包括在此術語之內的是連續細胞系(例如，具有永生表型)，原代細胞培養物，有限細胞系(例如，非-轉化的細胞)和體外維持的任何其他細胞群，包括卵母細胞和胚胎。
[0029]如本文所用，術語「毒性」指稱，相比在毒物施用之前的相同的細胞或組織，對細胞或組織的任何有害或有害效應。
[0030]如本文所用，術語「藥物組合物」指稱活性劑與惰性或有活性的載體的組合，使組合物尤其適合於體外，體內或離體診斷或治療性用途。
[0031 ] 如本文所用，術語「藥學可接受的載體」指稱任何標準藥學載體，諸如磷酸鹽緩衝溶液，水，乳劑(例如，諸如油/水或水/油乳劑)，及各種類型的潤溼劑。組合物也可包括穩定劑和防腐劑。例如載體，穩定劑和佐劑。(見例如，Martin, Remington’s PharmaceuticalSciences, 15th Ed., Mack Publ.C0., Easton, PA[1975])?
[0032]如本文所用，術語「檢測(detect)」，「檢測(detecting) 」或「檢測(detection) 」可描述發現或分辯或特定觀察可檢測標記的組合物的一般行為。
[0033]如本文所用，術語〃純化的(purified) 〃或〃純化(to purify) 〃指稱自樣品去除組分(例如，混雜物)。例如，抗體通過去除混雜的非-免疫球蛋白來純化；它們也通過去除不與靶分子結合的免疫球蛋白來純化。非-免疫球蛋白的去除和/或不與靶分子結合的免疫球蛋白的去除導致樣品中靶-反應性免疫球蛋白的百分率的增加。在另一例中，重組多肽在細菌宿主細胞中表達,並將多肽通過去除宿主細胞蛋白來純化；樣品中重組多肽的百分率由此增加。
[0034]如本文所用，術語〃樣品〃以最廣義使用。在一種意義上，其意指包括自任何來源獲得的樣本或培養物，以及生物學和環境樣品。生物學樣品可從動物(包括人)得到及包括流體，固體，組織和氣體。生物學樣品包括細胞，組織，血製品，諸如血漿，血清等。但是該例不旨在被解釋為限制可應用於本發明的樣品類型。在一些實施方式中，樣品也可為包含有生物學活性的BoNT的製備物的樣品，諸如待應用於藥物或化妝目的的BoNT製備物。而且，在本公開的一方面，樣品也可為被懷疑包含BoNT的環境樣品或食品樣品。
[0035]【發明詳述】
[0036]本發明涉及測試試劑的組合物和方法(例如，肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)神經毒素(BoNT)檢測和分析)。尤其是，本發明涉及人誘導的多能幹(hiPS)來源的細胞用於試劑檢測和分析的用途。
[0037]本發明的實施方式提供檢測和分析BoNT的系統和方法。在一些實施方式中，系統和測定法利用人iPS來源的神經元作為用於肉毒神經毒素(BoNT)檢測的高度敏感和可再現的平臺。在一些實施方式中，神經元是GABA能，多巴胺能和穀氨酸能神經元的98%純泛(pan)-神經元群，並作為分化的細胞產生及冷凍保存。在另一方面，神經元是基本上純的GABA能，多巴胺能和穀氨酸能神經元的泛-神經元群，並作為分化的細胞產生及冷凍保存，其中關於神經元細胞而言，細胞是至少70 %，至少80 %，至少90 %，至少95 %或至少96 %純。在本發明的實施方式的開發過程期間進行的實驗展示，細胞表達由全部BoNT血清型的BoNT中毒所必需的全部受體和底物。BoNT檢測測定展示，源於iPS的神經元對於BoNT/A，B，C和E及中和抗體的定量檢測是高度敏感的。
[0038]在2007年11月，2個獨立小組首次顯示，人成纖維細胞可通過活化一小組沉默的基因來簡單地重編程為多能幹細胞(Takahashi K, et al (2007) Celll31:861-872 ；Yu J, etal (2007) Science318:1917-1920)。這些細胞被稱為誘導的多能幹細胞和可類似於細胞系維持及冷凍保存。此發現開啟了開發模擬全效、分化的人體細胞及不需要任何動物使用的巨大數的人iPS來源的細胞模型的機會。
[0039]在選擇用於在本文所述的系統和方法中使用的iPS細胞中，優選的是，細胞可可靠地和可再現地產生及以對於該研究足夠的量產生分化的細胞的純群。在一些實施方式中，該細胞可獲自 Cellular Dynamicslnc.(Madison, WI)。
[0040] 在本發明的實施方式的開發過程期間進行的實驗證實，源於人iPS的神經元是對於肉毒神經毒素，中和抗體和抑制物的檢測，及對於BoNT細胞進入及運輸研究高度敏感、選擇性和物種-特異性的細胞模型。這些神經元對於BoNT效力確定以及對於抗體檢測，抑制物篩選，及研究應用適合取代MBA。
[0041]【1.細胞】
[0042]如本文所述，本發明的實施方式提供試劑諸如BoNT的檢測和分析中使用的多能來源的幹細胞。在一些實施方式中，細胞是人(例如，人誘導的多能幹細胞來源的細胞(hiPS)來源的神經元細胞或人胚胎幹細胞)。產生iPS細胞的方法描述於，例如，Yu等人，Science.2009May8 ；324(5928):797-801.Epub2009, W02011056971 和 W02011025852，各通過引用以其整體在本文合併。在一些實施方式中，使用適合的方法將iPS細胞分化為神經元(例如，描述於美國專利申請US2010/0279403和US2010/0216181的那些，各通過引用以其整體在本文合併)。
[0043]在一些實施方式中，神經元是GABA能，多巴胺能和穀氨酸能神經元的98 %純泛-神經元群，並作為分化的細胞產生及冷凍保存。在一些實施方式中，利用可商購的神經兀來源的 iPS 細胞(例如，來自 Cellular Dynamics Inc.(Madison, WI)或 GlobalStem,(Rockville, MD)的那些)，儘管可利用其他來源的。在一些實施方式中，細胞是神經元hiPS細胞。
[0044]在另一方面，細胞是神經元是GABA能，多巴胺能和穀氨酸能神經元的基本上純的泛-神經元群，並作為分化的細胞產生及冷凍保存，其中細胞是相對於神經元細胞至少70%，至少80%，至少90%，至少95%或至少96%純。
[0045]本發明不限於本文所述的細胞。可利用另外的細胞系和原代細胞培養物。例如，在一些實施方式中，利用膽鹼能神經元。
[0046]在一些實施方式中，適合的細胞系表達對於BoNT中毒必需或足夠的受體和底物。[0047]在一些實施方式中，本發明提供系統和試劑盒，其包含本文所述的細胞系以及對於實施BoNT的檢測和分析必需、足夠或有用的組分。例如，在一些實施方式中，試劑盒包含細胞和細胞培養試劑(例如，板，緩衝劑，等)，測定試劑，對照(陽性和陰性BoNT和/或抑制物對照)和用於實施及分析測定的使用說明。
[0048]在本發明的一方面，hiPS細胞來源的神經元細胞通過由以上說到的過程產生的hiPS細胞分化和/或成熟為神經元細胞可獲得或已獲得。該神經元細胞分化,在一方面，可通過於約37°C及在約5% CO2下培養hiPS細胞來達到。在一方面，培養用培養基可為補充了 B27 及 glutamax 的 Neurobasal 培養基(Invitrogen, Inc., USA)。在仍另一方面，在聚-賴氨酸包被的板上培養細胞，在仍再一方面，板再包被基質膠(BD Bioscience, USA)。在一方面，將96孔板用於培養，其中細胞以約40，000細胞/孔的密度生長。在一方面，使細胞接種約24小時。之後，一方面使細胞成熟約2~約28天，在一方面，約4~約14或，在一方面，約4~約7天。
[0049]在一方面，所述的hiPS細胞來源的神經元細胞通過基本上描述於以下隨附實施例的分化和成熟過程獲得。
[0050]本發明的 實施方式也涉及由上述的分化和成熟過程獲得的hiPS細胞來源的神經元細胞。
[0051]在一方面，該hiPS細胞來源的神經元細胞特徵在於存在以下標誌物之一種或更多，在一方面全部:β 3-微管蛋白，NeuN, vGAT, vGLUT2, NSE神經元-特異性烯醇酶)或Tbrl (T-結構域轉錄因子I)。對於β 3-微管蛋白或NeuN而言，見到本發明的hiPS細胞來源的神經元細胞的培養物中陽性細胞數是約99%。對於vGAT或VGLUT2而言，在一方面見到，培養物的至少部分細胞對於所述的標誌物是陽性的。
[0052]在一方面，該hiPS細胞來源的神經元細胞特徵在於缺失以下標誌物之一種或更多及，在一方面全部:GFAP，TH, NNE (非-神經元烯醇酶)，Tbr2 (T-結構域轉錄因子2)，或NoGo a, C。對於GFAP而言，見到hiPS細胞來源的神經元細胞的培養物中陽性細胞數顯著地低，而在一方面，約5%以下或甚至約1%以下，在一方面，對於餘下標誌物而言，見到它們，如果存在，以可檢測的量以下存在。
[0053]上述的標誌物的存在或缺失或量可，在一方面，通過常規免疫學技術測定。例如，標誌物可通過免疫組織學染色技術，細胞裂解物的蛋白印跡分析測定或，至於β 3-微管蛋白或NeuN由FACS分析測定。還描述了其他檢測技術(見，例如，US2012/0178083,US2008/0280301, Englund2005, J Neurosci25:247-251 ；Dupuis2002, Neurobiology ofDiseaseslO: 358-365 ;各通過引用在本文合併)。
[0054]在再一方面，hiPS細胞來源的神經元細胞特徵在於以下電生理學性質之至少一種及，在一方面全部:Na2+通道被河豚毒素(TTX)抑制，K+通道被四乙基銨抑制，L-型Ca2+通道被硝苯地平抑制，P/Q-型Ca2+通道被W-美洲蜘蛛毒素IVA抑制或N-型Ca2+通道被W-食魚螺毒素GVIA抑制。該電生理學性質可由標準電生理學測量測試，包括，例如，在將細胞用相應抑制物處理之前及之後實施膜片鉗測量。
[0055]在另一方面，hiPS細胞來源的神經元細胞特徵在於對BoNT及，在一方面，對BoNT/A的敏感度。而且，細胞，在一方面，也以劑量依賴性方式敏感於其他神經毒性化合物及，尤其是，敏感於至少一種或全部以下化合物:星形孢菌素，ATP競爭性激酶抑制物，氯丙嗪或吩噻嗪。向上述的化合物的敏感度可在，例如，細胞活力測定中測定。
[0056]在一方面，關於神經突生長物而言，hiPS細胞來源的神經元細胞也敏感於以下化合物之至少一種及，在一方面全部:抗黴素A，絲裂黴素C，MK571，PD98092或星形孢菌素。
[0057]而且，在一方面，關於線粒體膜電位損失而言，hiPS細胞來源的神經元細胞敏感於以下化合物之至少一種或，在一方面，全部:抗黴素A或纈氨黴素。
[0058][I1.測定和用途】
[0059]本發明的實施方式提供檢定BoNT的組合物和方法。測定被用於研究，臨床，診斷和治療性應用中。
[0060]在一些實施方式中，測定利用多能細胞(例如，hiPS來源的神經元細胞)。使用人細胞提供物種-特 異性模型的優勢。此外，與源於癌細胞系或修飾的細胞系的神經元(其可不是體細胞神經元的反映)相反，源於多能細胞的神經元是正常，健康神經元的代表。
[0061]在一些實施方式中，測定利用神經元細胞例如，hiPS來源的神經元細胞，以篩選BoNT的效力。在其他實施方式中，測定就BoNT的毒性進行篩選。在仍進一步實施方式中，測定法就BoNT的中和抗體的存在或性質進行篩選或就活性篩選其他生物醫藥。在一些實施方式中，測定是定量的，而在其他實施方式中，它們是定性的。
[0062]在一些實施方式中，細胞首先培養在適合的基質中。在一些實施方式中，培養細胞，以便獲得神經元的成熟。相比既有測定中使用的細胞，在本發明的實施方式中使用的多能細胞提供更快速成熟的優勢。在一些實施方式中，細胞接下來暴露於毒素(例如，BoNT)經適合的時期。毒素暴露之後，通過使用適合的方法計算期望的參數(例如，EC50)。本文所述的測定適宜於檢測純化的BoNT和在複合物中(例如，與如見於天然環境及一些藥學製備物中的其他蛋白複合)的BoNT。本文所述的測定適宜於檢測任意數的BoNT血清型(例如，BoNT/A, B, C，D, E, F和其G)或變體或嵌合體。在一些實施方式中，BoNT被重組表達。在其他實施方式中，它們自細菌細胞純化。
[0063]在一些實施方式中，實施抗體保護測定，以測試中和抗體。儘管BoNT被有效用於就各種病情治療大量的患者(見Dhaked等人，Indian J Med Resl32:489_503的綜述)，一些會發展中和抗體，其會阻止進一步治療的成功。例如，在子宮頸張力失調的治療中估計，~5%的被治療的患者會發展會阻礙進一步治療的中和BoNT抗體(Kessler等人，(1999)J Neurol246:265~274)。目前，患者未被在它們的治療過程中，就中和抗體的發展進行監測，因為高度敏感和定量測定不是可商購的(Sesardic等人，(2004)MovDisordl9Suppl8:S85_91)。使用iPS神經元的本文呈現的測試平臺提供接收了 BoNT的重複的治療劑或化妝注射的患者血清中BoNT-中和抗體的敏感和定量檢測。中和抗體可在任意數的樣品類型中進行檢測(例如，純化的抗體，血清，抗毒素，等)。
[0064]在一些實施方式中，測試BoNT的小分子抑制物(例如，為研究或藥物篩選)。例如，在一些實施方式中，使細胞首先暴露於BoNT，然後暴露於抑制物，使細胞共暴露於二者，或使細胞首先暴露於抑制物，然後暴露於BoNT。
[0065]可利用任意數的適合的端點測量來檢定BoNT活性。例包括，但不限於，蛋白印跡，神經遞質釋放，ELISA(Nuss JE, et al (2010) J Biomol Screenl5:42_51)或細胞內表達的報告子諸如，例如，FRET傳感器(Dong等人，(2004)Proc Natl Acad Sci U S AlOl:14701-14706)。[0066]在一些實施方式中，本文所述的測定可用於在BoNT或衍生物作為藥物產生期間測試質量控制或在診斷評定，在臨床治療的優化及施劑及治療性模式的選擇中用於研究用途。
[0067]本文所述的測定的另外的應用包括，但不限於，檢測抑制物和診斷，臨床，篩選及研究用途。
[0068]在一些實施方式中，本發明提供檢定肉毒梭菌(Clostridium botulinum)神經毒素(BoNT)的活性的方法，包括:(a)使hiPS來源的神經元細胞與包含BoNT的組合物接觸；及(b)檢定BoNT的生物學活性。
[0069]在所述的方法的一方面，檢定可包括測定BoNT的生物學活性的存在或缺失。該測定有時也在本文被稱為定性測定。需知，基於BoNT生物學活性的存在或缺失，可總結於在包含或懷疑包含所述有生物學活性的BoNT的組合物中有生物學活性的BoNT的存在或缺失。而且，在仍另一方面，檢定可包括測定在包含有生物學活性的BoNT的組合物中有生物學活性的BoNT的量。需知 ，有生物學活性的BoNT的量可源於就在組合物中所述的BoNT檢定的生物學活性的量。該測定可有時在本文也被稱為定量測定。
[0070]在本發明的方法的一方面，BoNT是選自梭菌神經毒素的不同血清型組的神經毒素，例如，選自，例如，BoNT/A，BoNT/B，BoNT/C I，BoNT/D，BoNT/E，BoNT/F 或 BoNT/G。而且，在一方面，在本發明的方法中可將破傷風毒素(TeNT)用作神經毒素。
[0071]細菌肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)和破傷風梭菌(Clostridium tetani)分別天然地產生這些高度有力的神經毒素，例如，肉毒毒素(BoNT)和破傷風毒素(TeNT)。這些神經毒素特異性結合於神經元細胞及破壞神經遞質釋放。各毒素作為大致150kDa的無活性單鏈蛋白合成。翻譯後處理涉及二硫橋形成，及被細菌蛋白酶的限制的蛋白水解(切割)。有活性的二鏈神經毒素由2條鏈組成，由二硫鍵連接的大致50kDa的N-端輕鏈和大致IOOkDa的重鏈。神經毒素結構上由3個結構域組成，例如，催化性輕鏈，包括轉位結構域(N-端一半)和受體結合結構域(C-端一半)的重鏈,見,例如，Krieglsteinl990, EurJ Biocheml88，39 ;Krieglsteinl991，Eur J Biochem202，41 ;Krieglsteinl994，J ProteinCheml3, 49。BoNT多肽和TeNT多肽的結構已被描述於上述的參考文獻。
[0072]BoNT和TeNT的7種抗原性地不同的血清型是通過切割SNARE蛋白來阻斷突觸胞吐的Zn2+-內切蛋白酶。神經毒素導致見於肉毒中毒和破傷風病症的弛緩性肌肉麻痺，見Fischer2007,Proc Natl.Acad.Sc1.USA104, 10447。
[0073]在仍另一方面，修飾的BoNT或TeNT的活性可在本發明的方法中檢定。該修飾的 BoNT 可源於上述的 BoNT/A，BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F 或 BoNT/G 或通過向BoNT或TeNT的胺基酸序列導入至少一個取代，添加和/或缺失來源於TeNT。該修飾的BoNT或TeNT，由此，可具有與以上提及的任何一種BoNT或TeNT的胺基酸序列具有至少40%，至少50%，至少60%，至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少98%或至少99%同一性的胺基酸序列。本文所用的術語〃同一」指稱通過測定2個胺基酸序列之間的同一胺基酸數來表徵的序列同一性，其中序列被比對，從而獲得最高順序匹配。其可通過使用公開的以電腦程式編碼化的技術或方法計算諸如，例如，BLASTP 或 FASTA (Altschul 1990，J Mol Biol215, 403)。百分率同一性值，在一方面，在整個胺基酸序列上計算。為比較不同序列的基於各種算法的一系列程序是熟練的工人可利用的。在此情景中，Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法給出特別可靠的結果。為了實施序列比對，可使用程序PileUp (Higginsl989，CAB10S5，151)或程序Gap和BestFit (Needlemanl970, J Mol Biol48 ；443 ；Smithl981, Adv Appl Math2, 482)，其是 GCG軟體包的部分(Genetics Computer Groupl991, 575Science Drive, Madison, Wisconsin, USA53711)。以上以百分率(％)敘述的序列同一性值，在本發明的另一方面，使用程序GAP，用以下設置，在整個序列區測定:空位權重:50，長度重量:3，平均匹配:10.000和平均錯配:
0.000，除非另外特別說明，其應總是被用作用於序列比對的標準設置。
[0074]在一方面，各上述的修飾的BoNT或TeNT多肽保留一個或更多及，在另一方面，全部相應未修飾的多肽的生物學性質，即BoNT/A，BoNT/B, BoNT/Cl, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F,BoNT/G或TeNT。本領域技術人員會同意，在蛋白水解活化之後全生物學活性維持，即使可想到，未加工的前體可發揮一些生物學功能或是部分有活性的。本文所用的"生物學性質"指稱(a)受體結合，(b)內化，(c)跨內體膜轉位進胞質溶膠，和/或(d)涉及突觸囊泡膜融合的蛋白的內源性蛋白分解性切割。用於評定生物學活性的體內測定包括小鼠LD50測定和離體小鼠半隔膜測定,如描述於,例如，Dressier等人。(Dressler2005, Mov Disord20:1617-1619，Keller2006, Neurosciencel39:629-637)。生物學活性通常以小鼠單位(MU)表達。如本文所用，IMU是神經毒性組分的量，其在腹膜內注射之後殺滅50%的特定的小鼠群，即小鼠腹膜內LD50。在再一方面，修飾的多肽可改善或改變生物學性質，例如，它們可包含改善酶識別或可改善受體結合或上述任何其他性質的切割位點。
[0075]在一方面，修飾的BoNT或TeNT可檢定由本文所述的以上方法提到的生物學活性之一種或更多及，在一方面，全部。
[0076]在本發明的一方面，修飾的BoNT或TeNT選自，例如，BoNT或BoNt/TeNT雜合體，再靶向的BoNT，再靶向的TeNT和嵌合BoNT或TeNT。描述了修飾的BoNT和TeNT。
[0077]在本發明的方法的一方面，接觸包括使至少2個不同組分物理接近，以允許所述組分的物理和/或化學相互作用。在上述的方法中，使hiPS來源的神經元細胞與包含或懷疑包含有生物學活性的BoNT的組合物接觸。接觸在足以允許在組合物中包含的有生物學活性的BoNT對hiPS細胞來源的神經元細胞發揮其生物學活性的時間及條件下實施。在一方面，由此，接觸應使(a)受體結合，(b)內化，(c)跨內體膜轉位進胞質溶膠，和/或(d)突觸囊泡膜融合中涉及的蛋白或模擬hiPS細胞來源的神經元細胞中的所述過程的底物的內源性蛋白分解性切割。本領域技術人員熟知哪種條件需應用於hiPS細胞來源的神經元細胞的給定培養物。接觸可，在一方面，在細胞培養系統中實施，其中將hiPS細胞來源的神經兀細胞，在孔板上，在適合的培養基中，及在適合的培養條件下，通過向培養基添加待由本文所述的方法檢定BoNT活性的組合物的樣品來培養。
[0078]在一方面,適合的培養條件包含在約37°C及在約5% CO2下培養。在一方面，培養用培養基是補充了 B27 及 glutamax 的 Neurobasal 培養基(Invitrogen, Inc., USA)。在仍另一方面，在聚-賴氨酸包被的板上培養hiPS細胞來源的神經元細胞,在仍再一方面,利用再包被基質膠(BD BiosciencejUSA)的板。在一方面，將96孔板用於培養，其中細胞以約10，000~約100，000細胞，在再一方面，約20，000~約60，000細胞和在仍一方面約40，000細胞/孔的密度生長。在 一方面，使細胞接種約24小時。在一方面，然後，使細胞成熟約2~約28天，在一方面，約4~約14或，在一方面，約4~約7天，之後實施接觸。[0079]在仍一方面，所述的接觸如描述於下文隨附實施例進行實施。
[0080]在本發明的方法的一方面，包含有生物學活性的BoNT的組合物是已知包含有生物學活性的BoNT的組合物或懷疑包含有生物學活性的BoNT的組合物。組合物可除了所述的有生物學活性的BoNT之外，還包含其他成分，諸如，例如，適合的溶劑和/或穩定化劑諸如蛋白及，在一方面，80見'(撤70，撤17，撤33或見'順(他?))的複合蛋白，或其他蛋白穩定劑。組合物也可進一步包含例如，通過增強在本文別處提及的BoNT的任何生物學活性來輔助BoNT的生物學活性的蛋白。在仍一方面，組合物可包含多於一種BoNT。
[0081]在一方面，組合物是肉毒或包含有生物學活性的BoNT的其他細菌細胞或非-細菌細胞的細胞裂解物。在一方面，該組合物也是自該細胞裂解物由部分純化獲得的BoNT製備物，例如粗提物，或BoNT的純化，例如，純化的BoNT製備物。在另一方面，組合物是包含混合的組分的人工組合物。在仍一方面，組合物是如在本文別處定義的待用作藥物組合物的製備物。
[0082]在本發明的方法的一方面，檢定BoNT的生物學活性通過測定突觸囊泡膜融合中涉及的蛋白的內源性蛋白分解性切割或，如果存在，hiPS細胞來源的神經元細胞中由有生物學活性的BoNT的其他底物切割來實施。
[0083]在一些實施方式中，突觸囊泡膜融合中涉及的蛋白或其他基質具有由待檢定的BoNT或TeNT識別的神經毒素切割位點。本文所用的神經毒素切割位點指稱由神經毒素多肽的內源性蛋白酶識別及切割的切割位點。描述了被神經毒素蛋白酶識別的切割位點(見，例如，EP1926744B1 ;通過引用以其整體在本文合併)。原理上，神經毒素切割位點可為基質中天然地存在 的切割位點或是由神經毒素多肽蛋白酶識別及切割的人工設計的切割位點。
[0084]由BoNT/A蛋白酶識別及切割的神經毒素切割位點，在本發明的一方面，源於敏感於由BoNT/A切割的蛋白。在一方面，該蛋白是人SNAP25A或B或自下列物種的同源物，旁系同原物或其直系同原物:大鼠，小鼠，牛，擔尼魚屬(Danio),鯽屬(Carassius),爪蟾屬(Xenopus),電鰩屬(Torpedo),球海膽屬(Strongylocentrotus),槍烏賊屬(Loligo),椎實螺屬(Lymnaea)或雨虎屬(Aplysia)。源於所述蛋白的適合的切割位點公開於EP1926744B1。
[0085]由BoNT/B蛋白酶識別的及切割的神經毒素切割位點，在本發明的一方面，源於敏感於由BoNT/B的切割的蛋白。在一方面，該蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/細胞短蛋白聚糖，牛VAMP-2，大鼠VAMP-2或VAMP-3，雞VAMP-1，VAMP-2或VAMP-3，電鰩屬(Torpedo) VAMP-1,球海膽屬(Strongylocentrotus) VAMP,果妮屬(Drosophila) sybA,synB, synC, synD 或 syn,水輕屬(Hirudo) VAMP,爪蟾屬(Xenopus) VAMP-2 或 VAMP-3,擔尼魚屬(Danio)VAMP-1 或 VAMP-2,槍烏賊屬(Loligo)VAMP,椎實螺屬(Lymnaea) VAMP,雨虎屬(Aplysia)VAMP或新小杆線蟲屬(Caenorhabditis) SNBl-樣或任何直系同原物,旁系同原物或其同源物。源於所述蛋白的適合的切割位點公開於，例如，EP1926744B1。
[0086]由BoNT/Cl蛋白酶識別的及切割的神經毒素切割位點，在本發明的一方面，源於敏感於由BoNT/Cl的切割的蛋白。在一方面，該蛋白是人和小鼠突觸融合蛋白1A，突觸融合蛋白IBl，突觸融合蛋白2-1，突觸融合蛋白2-2，突觸融合蛋白2-3，突觸融合蛋白3A或突觸融合蛋白1B2，牛或大鼠突觸融合蛋白1A，突觸融合蛋白IBl或突觸融合蛋白1B2，大鼠突觸融合蛋白2或大鼠突觸融合蛋白3，小鼠突觸融合蛋白1A，突觸融合蛋白IBl，突觸融合蛋白1B2，突觸融合蛋白2，突觸融合蛋白3A，突觸融合蛋白3B或突觸融合蛋白3C，雞突觸融合蛋白IA或突觸融合蛋白2 ;爪蟾屬(Xenopus)突觸融合蛋白IA或突觸融合蛋白1B，擔尼魚屬(Danio)突觸融合蛋白1A，突觸融合蛋白IB或突觸融合蛋白3，電鰩屬(Torpedo)突觸融合蛋白IA或突觸融合蛋白1B,球海膽屬(Strongylocentrotus)突觸融合蛋白IA或突觸融合蛋白1B,果蠅屬(Drosophila)突觸融合蛋白IA或突觸融合蛋白1B,水蛭屬(Hirudo)突觸融合蛋白IA或突觸融合蛋白1B，槍烏賊屬(Loligo)突觸融合蛋白IA或突觸融合蛋白1B，椎實螺屬(Lymnaea)突觸融合蛋白IA或突觸融合蛋白IB或任何直系同原物，旁系同原物或其同源物。源於蛋白的適合的切割位點公開於，例如，EP1926744B1。
[0087]由BoNT/D蛋白酶識別的及切割的神經毒素切割位點，在本發明的一方面，源於敏感於由BoNT/D的切割的蛋白。在一方面，該蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/細胞短蛋白聚糖，牛VAMP-2，大鼠VAMP-2或VAMP-3，雞VAMP-1，VAMP-2或VAMP-3，電鰩屬(Torpedo)VAMP-1,球海膽屬(Strongylocentrotus) VAMP,果妮屬(Drosophila) sybA,synB, synC, synD 或 syn,水輕屬(Hirudo) VAMP,爪蟾屬(Xenopus) VAMP-2 或 VAMP-3,擔尼魚屬(Danio)VAMP-1 或 VAMP-2,槍烏賊屬(Loligo) VAMP,椎實螺屬(Lymnaea) VAMP,雨虎屬(Aplysia)VAMP或新小杆線蟲屬(Caenorhabditis) SNBl-樣或任何直系同原物,旁系同原物或其同源物。源於蛋白的適合的切割位點公開於，例如，EP1926744B1。[0088]由BoNT/E蛋白酶識別的及切割的神經毒素切割位點，在本發明的一方面，源於敏感於由BoNT/E的切割的蛋白。在一方面，該蛋白是，該蛋白是人SNAP-25A或B或自下列物種的同源物，旁系同原物或其直系同原物:大鼠，小鼠，牛，擔尼魚屬(Danio)，鯽屬(Carassius)，爪蟾屬(Xenopus)，電耀屬(Torpedo)，球海膽屬(Strongylocentrotus)，槍烏賊屬(Loligo),椎實螺屬(Lymnaea)或雨虎屬(Aplysia)。源於蛋白的適合的切割位點公開於，例如，EP1926744B1。
[0089]由BoNT/F蛋白酶識別的及切割的神經毒素切割位點，在本發明的一方面，源於敏感於由BoNT/F的切割的蛋白。在一方面，該蛋白是，該蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/ 細胞短蛋白聚糖，牛 VAMP-2，大鼠 VAMP-2 或 VAMPUl VAMP-1，VAMP-2 或 VAMP-3，電耀屬(Torpedo)VAMP-1,球海膽屬(Strongylocentrotus)VAMP,果妮屬(Drosophila)sybA, synB, synC, synD 或 syn,水輕屬(Hirudo) VAMP,爪蟾屬(Xenopus) VAMP-2 或 VAMP-3,擔尼魚屬(Danio) VAMP-1 或 VAMP-2,槍烏賊屬(Loligo) VAMP,椎實螺屬(Lymnaea) VAMP,雨虎屬(Aplysia) VAMP或新小杆線蟲屬(Caenorhabditis) SNBl-樣或任何直系同原物,旁系同原物或其同源物。源於蛋白的適合的切割位點公開於，例如，EP1926744B1。
[0090]由BoNT/G蛋白酶識別的及切割的神經毒素切割位點，在本發明的一方面，源於敏感於由BoNT/G的切割的蛋白。在一方面，該蛋白是，該蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/ 細胞短蛋白聚糖，牛 VAMP-2，大鼠 VAMP-2 或 VAMPUl VAMP-1，VAMP-2 或 VAMP-3，電耀屬(Torpedo)VAMP-1,球海膽屬(Strongylocentrotus)VAMP,果妮屬(Drosophila)sybA, synB, synC, synD 或 syn,水輕屬(Hirudo) VAMP,爪蟾屬(Xenopus) VAMP-2 或 VAMP-3,擔尼魚屬(Danio) VAMP-1 或 VAMP-2,槍烏賊屬(Loligo) VAMP,椎實螺屬(Lymnaea) VAMP,雨虎屬(Aplysia) VAMP或新小杆線蟲屬(Caenorhabditis) SNBl-樣或任何直系同原物,旁系同原物或其同源物。源於蛋白的適合的切割位點公開於，例如，EP1926744B1。[0091]由TeNT蛋白酶識別的及切割的神經毒素切割位點，在本發明的一方面，源於敏感於由TeNT的切割的蛋白。在一方面，該蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/細胞短蛋白聚糖，牛VAMP-2，大鼠VAMP-2或VAMP-3，雞VAMP-1，VAMP-2或VAMP-3，電鰩屬(Torpedo)VAMP-1,球海膽屬(Strongylocentrotus) VAMP,果妮屬(Drosophila) sybA,synB, synC, synD 或 syn,水輕屬(Hirudo) VAMP,爪蟾屬(Xenopus) VAMP-2 或 VAMP-3,擔尼魚屬(Danio)VAMP-1 或 VAMP-2,槍烏賊屬(Loligo) VAMP,椎實螺屬(Lymnaea) VAMP,雨虎屬(Aplysia)VAMP或新小杆線蟲屬(Caenorhabditis) SNBl-樣或任何直系同原物,旁系同原物或其同源物。源於蛋白的適合的切割位點公開於，例如，EP1926744B1。
[0092] 由BoNT蛋白酶識別的及切割的神經毒素切割位點，在本發明的另一方面，源於BoNT蛋白中發現的自動催化性切割位點。在一方面，待根據本發明使用及源於給定BoNT或TeNT的自動催化性切割位點的神經毒素切割位點包含至少6，至少8，至少10或至少15 個連續殘基，其包括:BoNT/A 殘基 250Tyr-251Tyr，BoNT/B 殘基 256Phe_257Phe，BoNT/Cl 殘基 257Phe-258Tyr，BoNT/D 殘基 257Phe_258Phe，BoNT/E 殘基 239Pro_240Leu，BoNT/F 殘基 254Pro-255Leu，BoNT/G 殘基 256Phe_257Phe，TeNT 殘基 259Ile_260Tyr，BoNT/A 殘基 Phe266-Gly267，BoNT/B 殘基 Phe272_Gly273，BoNT/C I 殘基 Phe273_Gly274，BoNT/D 殘基 Phe273-Gly274，BoNT/E 殘基 Phe255_Gly256，BoNT/F 殘基 Phe270_Gly271，BoNT/G 殘基Phe272-Gly273或TeNT殘基Phe275_Gly276。源於蛋白的適合的切割位點公開於，例如，EP1926744B1。
[0093]在本發明的一方面，BoNT和TeNT的上述神經毒素切割位點的切割可通過測定由上述的蛋白的切割獲得的一種或更多切割產物來檢定。源於蛋白的產物可由特異性結合所述的切割的產物，但不結合未切割的蛋白的抗體測定。該特異性結合抗體與產物的結合可通過在本文或在別處所述的技術測定。例如，特異性地結合的抗體可共價或非-共價連接於可檢測的標記物。該可檢測的標籤可為與特異性地結合的抗體共價連接的可檢測的部分或其可為檢測劑，諸如檢測抗體或特異性結合特異性地結合的抗體及允許，例如，經與之共價連接的可檢測的部分檢測的適體。各種類型的該免疫測定可以此方式用於測定切割的產物及，由此，用於檢定BoNT或TeNT的生物學活性。
[0094]一方面，本文定義的具有神經毒素切割位點的蛋白的切割可通過蛋白印跡測定。在另一方面，所述切割可通過ELISA，RIA或其他免疫學檢定形式，包括在本文別處提及的那些測定。
[0095]在另一方面，可使用人工底物，其包含上述神經毒素切割位點，及在所述位點切割後，至少一種物理和/或化學性質改變。例如，該一方面涉及的底物可包含能彼此物理學和/或化學相互作用，且被具有神經毒素切割位點的接頭隔開的第I和第2部分。作為切割位點的切割的結果，2部分之間的上述的相互作用會改變。適合的部分是，例如，在未切割的狀態中呈現共振能量轉移的供體和受體螢光團，所述共振能量轉移在切割之後間斷。或者，可應用螢光團和猝滅劑，其中猝滅劑的淬滅效應在切割之後逆轉。所述種類的底物描述於，例如下列文獻中的任何一個:EP1438586B1，EP2208067A1, EP1543329A2, EP1869459B1,EP2293064B1, EP1920248B1, EP2264458A1, EP2332959A2, W02011/47241, EP1901069B1,EP2293064B1, EP1807698B1或EP2107112B1 ;各通過引用以其整體在本文合併。
[0096]在本發明的方法的仍一個特定方面，檢定通過通過使用第I抗體及，在一方面，特異性結合所述切割的SNAP-25的單克隆抗體測定切割的SNAP-25的量來測定存在於hiPS細胞來源的神經元細胞中的切割的SNAP-25的量來實施。而且，存在於細胞中的總SNAP-25，例如，切割的及未切割的SNAP-25，由第2抗體及，在一方面，結合所述總SNAP-25的多克隆抗體測定。在一方面，結合的第I抗體的量和結合的第2抗體的量可通過檢測劑，在一方面，由一種或更多允許區別結合的第I抗體的量和結合的第2抗體的量的檢測抗體來測定。例如，可使用偶聯於第I標記物及結合於第I抗體的第I檢測抗體和偶聯於第2標記物及結合於第2結合的抗體的第2檢測抗體。結合的第I抗體及結合的第2抗體的量及，由此，切割的及總SNAP-25的量可隨後源於測定的第I和第2標記物的量。在一方面，在本文涉及的第I標記物可為酶諸如辣根過氧化物酶。在另一方面，在本文涉及的第2標記物可為酶諸如鹼性磷酸酶。標記物可用於催化非-螢光底物向螢光產物的可檢測的轉變。
[0097]在本發明的方法的仍另一方面，檢定通過測定神經遞質釋放進，例如，培養基來實施。釋放的或非-釋放的神經遞質的量可通過在本文或在別處所述的技術測定。
[0098]有利地，由本發明涵蓋的方法基於非-動物資源，例如，hiPS細胞來源的神經元細胞，及，因此，避免動物測試。然而，hiPS細胞來源的神經元細胞允許測試需要的BoNT的全部生物學活性，例如，(a)受體結合，(b)內化，(C)跨內體膜轉位進胞質溶膠，和/或(d)突觸囊泡膜融合中涉及的蛋白的內源性蛋白分解性切割。因此，方法可用於安全性或質量控制措施以及具有修飾的生物學性質的BoNT的開發(通常需要，例如，大規模篩選方法)。
[0099]本發明也涉及測定包含有生物學活性的BoNT的製備物中有生物學活性的BoNT的量的方法，包括 下列步驟:(a)使hiPS細胞來源的神經元細胞與所述的製備物的樣品接觸；及(b)通過檢定樣品的BoNT的生物學活性來測定存在於製備物中的有生物學活性的BoNT的量。
[0100]本發明也涉及hiPS細胞來源的神經元細胞用於檢定組合物中BoNT活性的用途，如在本文別處特別說明。
[0101]在一方面，檢定包括測定BoNT活性和/或有生物學活性的BoNT的存在或缺失。用於有生物學活性的BoNT的定性測定可用於，例如，旨在風險評定的應用，以便防止由BoNT導致的任何傷害，例如，作為在BoNT的生產過程期間或在藥物或化妝品應用期間的安全性控制措施或用於防止基於BoNT的犯罪行為，諸如生物恐怖主義。
[0102]在另一方面，檢定包括測定BoNT活性和/或有生物學活性的BoNT的量。有生物學活性的BoNT的定量測定可在BoNT製備或調整用於化妝品或藥物應用的有生物學活性的BoNT的適當的劑量的過程期間使用。由此，該測定也可作為適當的藥物或化妝產品的質量控制或製劑的手段有用。
[0103]本發明也涉及hiPS細胞來源的神經元細胞用於測定包含所述有生物學活性的BoNT的製備物中有生物學活性的BoNT的量的用途，如在本文別處特別說明。
[0104]本說明書以上引用的參考文獻通過引用以它們的整個公開內容和此說明書中特別提及的公開內容併入本文。
[0105]【實驗】
[0106]提供下列實施例，以便展示及進一步例證本發明的特定優選的實施方式和方面，且不被解釋為限制其範圍。
[0107]【實施例】[0108]【實施例1】
[0109]【Α.方法】
[0110]神經元細胞:由Cellular Dynamics Inc.(Madison, WI)供給冷凍的人iPS來源的神經元。將神經元根據Cellular Dynamics的使用說明解凍，及由錐蟲藍排除測定進行活細胞計數。除非另外指示，將細胞以40，000細胞/孔的密度接種於包被了 0.01 %聚-L-鳥氨酸(SIGMA)和 8.3 μ g/cm2 基質膠(BD Biosciences)的 96-孔皿(TPP, MidSci)，並在神經元培養基(補充B27及glutamax的Neurobasal,全部來自Invitrogen並由0)1供給)於37 C ,5% CO2中溫育指定的成熟時間。在接種之後24h,完全更換培養基，然後每2~3天更換一半的培養基。
[0111]原代大鼠脊髓(RSC)細胞如之前描述(Pellett等人，2007和2010)製備，並以75，000細胞/孔的密度接種於 基質膠-包被的96-孔板。
[0112]肉毒桿菌神經毒素:從之前描述的肉毒梭菌(C.botulinum)株Hall A hyper,OkraB, Brazil C 和 Beluga E 製備純肉毒神經毒素(BoNT)A, B, C 和 E(150kDa)和 BoNT/A 複合物(Malizio et al., (2000)Methods Mol Biol 145:27-39 ；Prabakaran et al., (2001)Toxicon39:1515-1531)，其中由Malizio等人(2000)的方法，用在硫酸銨沉澱之前向培養物添加0.2mg/ml的酵母RNA(SIGMA)的另外的步驟實施BoNT/C純化。將毒素溶於磷酸鹽緩衝液，PH7.4和40%甘油，並存儲於_20°C直到使用。通過小鼠生物測定(HathewayCL(1988), supra ；Schantz EJ&Kautter DA(1978)J Assoc Off Anal Chem61:96-99)測定BoNT/A, /B, /C, /E和BoNT/A-複合製備物的活性，及比毒性是7 X IO7小鼠LD50單位/mg (BoNT/AI)，7.7X107LD50 單位 /mg (BoNT/AI 複合物)，I X IO8LD50 單位 /mg (BoNT/B)，1.1 X IO7LD50 單位 /mg (BoNT/C)，及 7.6 X IO7LD50 單位 /mg (BoNT/E)。
[0113]神經元毒性測定:除非另外說明，對於全部神經元毒性測定，在50 μ I的神經元培養基中使iPS神經元暴露於BoNT的系列稀釋。如在結果中所示，在一些測定中將原代大鼠脊髓細胞用作對照細胞。以最少三個重複測試全部樣品，且總是包括無毒素的陰性對照。在特定的曝露時間之後，移出毒素溶液，並使細胞在50 μ I的IXLDS樣品緩衝劑(Invitrogen)中裂解。就SNAP-25，或VAMP2切割，由蛋白印跡分析細胞裂解物，如之前描述(Pellett等人，(2007)，見上；Pellett等人，(2010)，見上)。由光密度測定法，使用Foto/Analyst FX系統和TotalLab Quant軟體(Fotodyne)定量切割的及未切割的條帶。製備數據標繪圖及通過使用PRISM軟體導出EC5tl。
[0114]基質選擇:為了選擇最佳表面基質，將神經元接種於7個不同基質。基質由下列組成:包被了 1.0 μ g/cm2層粘連蛋白(PDL層粘連蛋白)或8.3 μ g/cm2基質膠(PDL基質膠)的聚-D-賴氨酸包被的板(BD bioscience)，包被了 0.01 %聚-L-鳥氨酸之後包被了 1.0 μ g/cm2層粘連蛋白(PL0層粘連蛋白)或8.3 μ g/cm2基質膠(PL0基質膠)的板，自BD Biosciences購買的PLO-層粘連蛋白包被的板(PL0-層粘連蛋白(BD))，來自BDBiosciences 的 PDL 包被的板(PDL (BD))，或 0.01 % PLO 包被的板(PLO(CDI))。使神經元成熟14天，並通過使神經元暴露於毒素的系列稀釋48h來測定對BoNT/A的敏感性。使一些神經元維持6周，並如上再次測試。
[0115]受體表達分析:為受體表達分析，將iPS神經元以0.75ml的體積，以210，000細胞/孔的密度平鋪在24-孔板上。在75μ IlXLDS樣品緩衝劑(Invitrogen)中平鋪之後4，7，10，14和21天分別自3孔收穫細胞。細胞裂解物由用於SV2A，B和C同種型，突觸結合蛋白I和II，SNAP-25, VAMP的表達的蛋白印跡進行分析，其中使用識別VAMP2的抗體或識別VAMP1，2和3同種型，及突觸融合蛋白的抗體。將β-肌動蛋白用作裝載對照，及將原代大鼠脊髓細胞用作陽性對照。SV2C抗體(Janz R&Sudhof TC(1999)Neuroscience94:1279-1290)由Roger Janz慷慨地提供。全部其他抗體來自Synaptic Systems (哥廷根，德國)。全部抗體識別人蛋白。
[0116]為了由實時qPCR進行mRNA分析，使iPS神經元的3個獨立培養物分別維持指示的時間。使細胞在板上直接裂解，並通過使用RNeasy Mini試劑盒和RNA酶-游離的DNA酶套件(Qiagen，Valencia, CA)純化RNA。為了陽性對照，購買人成年總腦 RNA (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)。對於全部樣品，通過使用SuperScript VILO cDNA 合成試劑盒(Life Technologies, Carlsbad, CA)產生 cDNA。在
Light Cycler? 480II (Roche, Basel, Switzerland)上，使用 Taq Mail? Gene 表達
Master Mix和以下TaqMan人Gene表達測定來實施實時qPCR擴增:SNAP25 (Hs00938962_ml) ；STX1A (Hs00270282_ml) ；STXIB(HsO 1041 3 I5_ml) ；VAMPl(Hs0024991 1_ml) ；VAMP2 (Hs00360269_ml) ；VAMP3(Hs00922166_ml) ；SV2A(Hs00372069_ml)；SV2B(Hs00208178_ml) ；SV2C(Hs00392676_ml) ；SYT1(Hs00194572_ml) ；SYT2(Hs00980604_ml)和人GAPDH內源性對照引物組(全部自Life Technologies)。對全部樣品實施AbsQuant/第2衍生分析，並經標準化為內源性GAPDH表達的Cp來將Cp值轉化為相對倍數變化。在3個生物學重複內，為各基因計算平均值和標準偏差。為各基因實施技術性四重PCR反應。
[0117]活性-依賴性BoNT/Al攝取測定:將BoNT/Al稀釋至55或275U/50 μ I的細胞-刺激(含有 2.2mM CaCl 和 5 6mM KCl,補充 B27 及 glutamax 的 Invitrogen 自定義 Neurobasal培養基)或神經元培養基的濃度，並添加到成熟4天的⑶I iPS神經元和RSC細胞。將細胞與毒素溫育分別1，5，10和15min。關於陰性對照，將無毒素的相應培養基加入細胞。移出毒素，並將細胞立即用200 μ I的神經元培養基洗滌兩次，隨後在200 μ I的新鮮神經元培養基中溫育24h。以一式四份樣品收集。
[0118]為了確定用於5min之內BoNT/Al的活性-依賴性攝取的最小需要的毒素濃度，將毒素稀釋至1.72~55U之間/50 μ I的細胞-刺激培養基的濃度。使4天成熟的iPS神經元暴露於毒素稀釋5min，之後移出毒素，並用神經元培養基2次洗滌，和在神經元培養基中溫育24h。以一式四份測試全部稀釋。
[0119]抗體-保護分析:ΒοΝΤ/Α1特異性抗體根據Johnson等人，1993製備。通過使用2種不同方法分析iPS神經元中的BoNT/Al活性被中和抗體的抑制。為第I測定，將55U的BoNT/A I與連續稀釋的抗體在細胞-刺激培養基中組合，並於37°C溫育lh，以使抗體-毒素相互作用。使成熟4天的iPS神經元暴露於毒素-抗體混合物5分鐘,之後移出毒素-抗體混合物，並用神經元培養基進行2次洗滌步驟，並在神經元培養基中溫育24h。為第2測定，將1.5U的BoNT/A與抗體的系列稀釋在神經元培養基中組合，並於37°C溫育lh。使iPS神經元暴露於毒素-抗體混合物24h。與小鼠生物測定的比較使用與5~10U的BoNT/Al，在環境溫度，在167 μ L的體積中預溫育1.5h的抗體的系列稀釋。將體積調整至500 μ 1，並每稀釋注射進4隻小鼠。[0120]【B.結果】
[0121]iPS神經元表達對於BoNT中毒重要的受體:為了測定是否人iPS來源的神經元可用於檢測BoNT活性，分別由蛋白印跡和定量PCR(qPCR)分析對於BoNT細胞進入和催化性活性必需的受體和酶促靶的表達(圖1)。蛋白印跡導致SV2A，SV2B (模糊條帶)，突觸結合蛋白1，突觸融合蛋白，SNAP-25，VAMP2和β -肌動蛋白的信號，其在細胞平鋪之後21天的時期未變化(圖1Α)。儘管VAMP2用VAMP2特異性抗體檢測，識別全部3種VAMP同種型的抗體導致無信號，表明VAMP2在iPS神經元中是主要VAMP同種型。將原代大鼠脊髓細胞裂解物用作用於抗體檢測的陽性對照，且iPS神經元對比RSC細胞的條帶中的不同強度可由於由抗體的差異識別或由於不同表達水平。由qPCR的相同的蛋白的mRNA水平的分析指示分析的全部蛋白的表達(圖2B)包括SV2B和C同種型，突觸結合蛋白2，及VAMPl和3，這些未由蛋白印跡檢測到。但是，那些同種型的mRNA水平至少200倍少於由蛋白印跡檢測的同種型的那些(SV2A，突觸結合蛋白1，及VAMP2)。由此，qPCR數據確證蛋白印跡數據，並指示，iPS神經元主要表達SV2A，突觸結合蛋白I和這些蛋白的VAMP2同種型，這與代表前腦神經兀的神經兀一致(Janz R&Sudhof TC(1999)Neuroscience94:1279-1290)。全部蛋白的表達水平貫穿研究時期未變化，表明細胞在平鋪之後4天完全成熟，並保持穩定至少21天。
[0122]表面基質不影響用於BoNT/Al測定的細胞的質量:為了測定是否平鋪基質影響對BoNT的敏感度，就BoNT/Al敏感度測試將神經元平鋪在7個不同基質上。神經元附接於全部基質及在全部基質上成熟，形成軸突及樹突的增加的網絡。在有或無層粘連蛋白或基質膠的板上生長的細胞之間觀察到顯著形態學差異。在H)L(BD Biosciences)層粘連蛋白或基質膠板上或在PLO(Cellular Dynamics)層粘連蛋白或基質膠板上生長的細胞通常以單層生長，但主要沿板的周界形成具有自它們延伸的長軸突的一些聚集物。相反，在PLO或PDL板上生長的細胞保持在具有在細胞網絡之間延伸的軸突及樹突的細胞的單個單層。在PLO層粘連蛋白(BD Biosciences)上生長的細胞類似於在PLO或PDL板上生長的細胞。
[0123]在14天的成熟之後，使神經元暴露於BoNT/A的系列稀釋，及細胞裂解物的蛋白印跡分析指示，對於全部測試的底物，SNAP-25切割幾乎相同(圖2)。檢測限是0.05小鼠LD5tl單位，及在1.75和3.5U之間切割完全。EC50S為0.21~0.31。
[0124]這些數據指示，細胞可平鋪在用於此測定的任何測試的表面基質上。全部以下實驗在PLO-基質膠包被的板上實施。為了減少細胞聚集，使用TPP板(MidSci)，其具有更平的表面區域。此完全消除了孔周界周圍的聚集。
[0125]4~14天的細胞成熟時間提供優良和敏感的BoNT/Al測試平臺:為了測定是否細胞成熟時間影響iPS神經元的BoNT敏感度，就BoNT/Al敏感度，在平行平鋪之後4和7天，使用相同的毒素稀釋分析細胞。也平行測試原代大鼠脊髓細胞(RSC細胞)，以比較iPS神經元與RSC細胞(目前就BoNT檢測描述的最敏感細胞)的敏感度(Pellet etal., 2007, supra ；Pellett et al., (2010) J Pharmacol Toxicol Methods)。得到的數據一貫地顯示成熟4或7天的細 胞的敏感度上無統計學地顯著差異，EC50是~0.3U(圖3)。此近似於以上對第14天細胞(圖2)及對RSC細胞觀察到的EC5(i。iPS神經元的劑量-應答曲線相比RSC細胞顯著地更陡，及以1.75U達到100%切割，而在RSC細胞中以使用的毒素濃度未達到100%切割。此可能是由於iPS神經元的高純度。由此，成熟4~14天的細胞提供用於BoNT/Al檢測和定量的可再現和高度敏感的基於細胞的模型。此外，4個不同iPS細胞批的測試指示在BoNT/Al敏感度上無主要差異。
[0126]iPS神經元的敏感度隨更長曝露時間而增加:通過使細胞暴露於系列BoNT/Al稀釋及在毒素添加之後6，16，24和48h收穫樣品來檢查iPS神經元中BoNT檢測的時間依賴性。得到的數據一貫地指示，48h暴露產生最高敏感度，相比24h測定~3-倍數增加和相比16h測定~6-倍數增加(圖4)。6h毒素暴露導致敏感度~130倍減小，約40單位的EC5(I。
[0127]iPS神經元相比RSC細胞具有更快的BoNT/Al攝取速度:通過使iPS神經元和RSC細胞平行暴露於82U的BoNT/Al及評定在2，4，6，8和IOh的SNAP-25切割來檢查BoNT/Al到iPS神經元(相比RSC細胞)的攝取速度。將2種不同培養基用於區分活性-依賴性和活性-獨立性毒素攝取，由於神經元活性已被報導導致BoNT的更快的攝取(Keller等人，(2004)，見上)。第I培養基是神經元培養基(NM)，及第2培養基是細胞-刺激培養基(CSM)，其是用以化學刺激神經元細胞活性的含有56mM KCl和2.2mM CaCl2的神經元培養基的修飾的版本。
[0128]iPS神經元相比RSC細胞導致顯著地更早和更完全的SNAP-25切割。在iPS神經元中，在8h達到100%的SNAP-25切割，和在~4h達到50% SNAP-25切割(圖5)。相反，RSC細胞在IOh之後達到僅~70~80% SNAP-25切割，及在6h觀察到~50%的SNAP-25切割。對於任一 細胞類型，在神經元和細胞-刺激培養基之間未觀察到差異，指示在時間範圍內測試的神經元活性不影響BoNT攝取入細胞。這些數據指示，iPS神經元相比RSC細胞顯著地更敏感於BoNT/A，且以更快的速度攝取毒素，儘管此測定不區分SNAP-25的更快的毒素攝取和更快的切割。
[0129]在活性-依賴性測定中，iPS神經元攝取BoNT/Al相比RSC細胞顯著地更快:為了進一步檢查是否iPS神經元以活性-依賴性樣式攝取BoNT，使4天成熟的iPS神經元和RSC細胞在細胞-刺激培養基中分別暴露於55和275U的BoNT/Al。使細胞暴露於毒素1，5，10或15min,之後是完全毒素移出和在神經元培養基中溫育24h,以使進行SNAP-25切割。在暴露於55U的BoNT/Al之後早至lmin，在iPS神經元中觀察到顯著SNAP-25切割(圖6A)。在5min之後，約75%的SNAP-25被切割，且隨著更久毒素暴露無顯著變化，指示5分鐘之內完成的攝取。暴露於275U在測試的全部曝露時間導致完全SNAP-25切割(圖6A)。相反，RSC細胞暴露於55單位的BoNT/Al在達15min曝露時間之後未導致顯著SNAP-25切割，且在暴露於275U至少IOmin後僅約30~40%的SNAP-25被切割(圖6A)。此指示iPS神經元以活性-依賴性樣式攝取BoNT/Al，且指示相比在RSC細胞中，此攝取顯著地更有效和更快發生。
[0130]為了確認iPS神經元中的快速攝取是活性-依賴性的，使神經元在細胞-刺激培養基或神經元培養基中暴露於55U的BoNT/A經1，5或lOmin。在用細胞-刺激培養基處理的細胞中有顯著地更多的SNAP-25切割，在Imin之後觀察到50%的SNAP-25的切割和在5min後觀察到70%切割(圖6B)。相反，在神經元培養基中，在10分鐘後僅約20%的SNAP-25被切割(圖6B)。此指示BoNT/Al快速攝取進iPS神經元是活性-依賴性的。
[0131]為了測定由iPS神經元的活性-依賴性BoNT/Al攝取的濃度依賴性，使細胞在細胞-刺激培養基中暴露於1.7~55U的BoNT/Al經5min。在毒素移出之後，將細胞溫育24h，以使SNAP-25切割發生。隨增加毒素濃度觀察到SNAP-25切割的濃度依賴性增加，以約30U發生50% SNAP-25切割(圖6C)。
[0132] BoNT/A I特異性抗體保護iPS神經元免於被BoNT/Al進行SNAP-25切割:由抗體保護測定使用2種不同檢定形式確認iPS BoNT測定的特異性。在第I測定中，使細胞暴露於毒素抗體混合物經24h，使用達到幾乎完全SNAP-25切割所需要的最小量的毒素(1.5單位)。在第2測定中，使細胞在細胞-刺激培養基中暴露於55U BoNT/A和連續稀釋的抗體的混合物5min，之後是毒素移出和溫育24h。第I測定在抗體檢測中產生了顯著地更高敏感度。神經元用少至0.0025 μ I的抗體完全被保護免於SNAP-25的切割。降至0.000625 μ I的抗體還觀察到顯著的部分保護(圖7Α)。當使用0.5U的BoNT/Al和48h暴露，在RSC細胞中測試抗體時，之前觀察到相同的保護模式。由小鼠生物測定測試相同的抗體稀釋指示相比小鼠生物測定，基於細胞的測定的至少~10倍更大敏感度，如之前數據也顯示。+RSC測定已顯示相比小鼠生物測定，在中和抗體檢測中更敏感(Pellett，S.2007，見上)。第2 (活性-依賴性)測定是約10倍欠敏感，為全保護每50 μ I需要0.016 μ I的抗體，及用
0.004 μ I觀察到部分保護(圖7Β)。
[0133]此確認此測定的特異性，且指示iPS神經元提供用於中和抗體檢測的優良的和高度敏感的測定，且指示用更少毒素更久暴露相比需要更多毒素但較短曝露時間的活性-依賴性測定更敏感。活性-依賴性測定對於一些目的有用，諸如可具有細胞毒性的或需要溶於可經時傷害神經元的溶劑的化合物或抗毒素的篩選。
[0134]在其天然的複合物中的BoNT/Al毒素的檢測相比純化的毒素的檢測更敏感:在梭菌中作為與幾種其他蛋白(非毒性非血細胞凝集素蛋白(NTNH)和在BoNT/A的情況中是血細胞凝集素(HA))的複合物表達 BoNT(Johnson EA&Bradshaw M(2001)Toxicon39:1703-1722的綜述)。非-毒性複合蛋白被認為保護毒素免於消化道的降解pH (Oguma etal., (2000)Microbial Foodborne Diseases:Mechanisms of Pathogenesis and Toxin
Synthesis273-293)。BoNT/A 的最通常使用的醫療製備物(BOTOX?和 Dysportd)製備)由整個毒素複合物組成，儘管FDA現在已批准含有僅純化的BoNT的較新製劑(Xeomin?製備)。為了測定是否在其天然的複合物中的BoNT/Al被檢測為具有與iPS神經元中純BoNT/Al等同靈敏度，使細胞平行暴露於等同量的BoNT/Al複合物或純化的BoNT/A 10複合物由約24% BoNT/A I和76%其他非毒性關聯的蛋白組成，如由光密度測定法測定(圖8A)。純化的BoNT/Al製備物和BoNT/Al複合物具有近似比活性(7X 107U/mg和7.3X107U/mg)。在直接比較中，複合物的組分中需要顯著地少的毒素，以達到全SNAP-25切割(圖SB)。此發現指示，在此測定中，複合物的非-毒性蛋白增加BoNT/lA活性，這可能是由於神經元培養基中的保護性效應。
[0135]iPS神經元是用於BoNT血清型B，C和E的檢測的高度敏感的細胞模型=BoNT受體分析指示，iPS神經元表達SNARE蛋白和全部BoNT血清型的細胞進入所需要的受體(圖1)。BoNT/A 及 /E 切割 SNAP-25，BoNT/B 切割 VAMP，及 BoNT/C 切割 SNAP-25 和突觸融合蛋白(Humeau等人，(2000)Biochimie82:427~446)。為了測試神經元對不同血清型的敏感度，將BoNT/B，C或E的系列稀釋平行加入iPS神經元或RSC細胞經48h，並為它們的相應神經元底物的切割而經蛋白印跡檢定細胞裂解物。iPS神經元以相比RSC細胞等同或更大敏感度一貫地檢測到全部BoNT血清型(圖9)。iPS神經元和RSC細胞的EC5tl值是，對於BoNT/B 是 15.7IU 和 29.22U (圖 9A)，對於 BoNT/C 是 0.4U 和 0.36U (圖 9B)，及在 iPS 神經元中BoNT/E是1.79U(圖9C)。RSC細胞中BoNT/E的EC5tl值無法用PRISM軟體推導，但估計近似於iPS神經元的EC5tl值(圖9C)。[0136]以上說明書中提及的全部出版物，專利，專利申請和登錄號通過引用以它們的整體在本文合併。儘管本發明已關聯特定實施方式描述，但應明白，要求保護的發明應不過度地被限制於該特定實施方式。事實上，本發明的描述的組合物和方法的各種修飾和變異對於本領域普通技術人員會是顯而易見的，及旨在落入以下權利要求的範圍之內。
【權利要求】
1.檢定肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)神經毒素(BoNT)活性的方法,包括:(a)使人誘導的多能幹細胞(hiPS)來源的神經元細胞與包含BoNT的組合物接觸；以及 (b)檢定所述BoNT的生物學活性。
2.權利要求1的方法，其中所述BoNT具有選自下列的血清型:A，B,C，E及所述BoNT的修飾的變體。
3.權利要求1的方法，其中所述生物學活性選自:SNAP-25的切割，VAMP2的切割和神經遞質釋放。
4.權利要求1的方法，其中所述測定是定性測定。
5.權利要求1的方法，其中所述測定是定量測定。
6.權利要求1的方法,其中所述BoNT經純化。
7.權利要求1的方法，其中所述BoNT在複合物中。
8.權利要求1的方法，還包括在接觸所述hPS來源的神經元細胞之前,使所述BoNT與測試化合物接觸的步驟。
9.權利要求8的方法，其中所述測試化合物是抗體。
10.權利要求9的方法，其中所述抗體是中和抗體。
11.權利要求10的方法，其中所述中和抗體在選自下列的樣品中:純化的抗體，血清和抗毒素。
12.檢定肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)神經毒素(BoNT)活性的方法,包括: (a)使人誘導的多能幹(hiPS)細胞來源的神經元細胞與包含(i)BoNT及(ii)中和抗體的組合物接觸；以及 (b)檢定所述BoNT的生物學活性。
13.權利要求12的方法，其中所述BoNT具有選自下列的血清型:A，B，C，E及所述BoNT的修飾的變體。
14.權利要求12的方法，其中所述生物學活性選自:SNAP-25的切割，VAMP2的切割和神經遞質釋放。
15.權利要求12的方法，其中所述測定是定性測定。
16.權利要求12的方法，其中所述測定是定量測定。
17.權利要求12的方法，其中所述BoNT經純化。
18.權利要求1的方法，其中所述BoNT在複合物中。
19.權利要求12的方法，其中所述中和抗體在選自下列的樣品中:純化的抗體，血清和抗毒素。
20.測定包含有生物學活性的BoNT的製備物中有生物學活性的BoNT的量的方法，所述方法包括下列步驟:(a)使hiPS細胞來源的神經元細胞與包含有生物學活性的BoNT的製備物的樣品接觸；以及 (b)通過檢定所述樣品的BoNT的生物學活性來測定存在於製備物中的有生物學活性的BoNT的量。
21.人誘導的多能幹(hiPS)細胞來源的神經元細胞用於檢定BoNT的活性的用途。
【文檔編號】C12Q1/02GK103958747SQ201280053513
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年9月28日 優先權日:2011年9月29日
【發明者】E·A·詹森, S·佩萊特, W·H·特普, R·C·M·懷特瑪詩 申請人:塞爾斯納普有限責任公司