診斷和治療與人轉酮酶樣-1基因過表達有關的增殖異常的組合物和方法

2024-03-02 11:16:15

專利名稱：診斷和治療與人轉酮酶樣-1基因過表達有關的增殖異常的組合物和方法
診斷和治療與人轉酮酶樣-l基因過表達有關的增殖異常的組合物和方法
本申請是申請日為2003年4月12日的第03808810.X號發明專利申請的分案申請。
本發明涉及與治療和診斷與異常增殖細胞有關的病症的方法。 一方面本發明涉及方法，其根據生物樣品中人轉酮酶樣-l基因(transketolaselide-l gene)過表達的檢測，該方法特別用於胖瘤及其前兆期的診斷。另一方面本發明涉及用於治療與人轉酮酶樣-l基因過表達有關的病症的方法。治療方法可包括基因治療方法和抑制或降低轉酮酶樣-l多肽活性方法。
儘管有許多有意義的科學和醫學研究工作，腫瘤疾病仍然是人類致死的主要因素。例如在德國每年有超過34萬人發生癌症，超過21萬人死於癌症。上皮細胞腫瘤佔癌症的大多數肺癌是男性癌症死亡的主要原因，乳腺癌是女性癌症死亡的主要原因。結腸癌同時是男性和女性死亡的笫二個主要原因(Becker， N.和Wahrendorf, J. ， (1997) Atlas ofCancer Mortality in the Federal republic of Germany 1981-1990,Springer-Verlag， Berlin, Heidelberg )。
造成這種令人不滿意的局面的主要原因是，大多數肺瘤疾病要在很晚期才能診斷出來，這時分離的腫瘤細胞或小的腫瘤細胞聚集物已經從原發腫瘤釋放並且分布到宿主的整個有機體並且可能已經最終導致隱蔽的或明顯的轉移性疾病。早期癌特別是前期癌(precancers)通常不產生任何症狀並且不為患者所知。
為克服這種情況，需要更多的研究工作和臨床規劃來改進癌早期診斷技術，並且開發出真正的預防或治療用疫苗接種策略，在患者出現明確的癌之前或在癌或其前體切除之後進行免疫，以防止擴散的分離的癌細胞(DTC)存活，這些癌細胞可能是在最初手術幹預前或者手術過程中由腫瘤釋放的。
對少數癌而言，特別是子宮頸癌，可以建立有效的癌早期診斷方案。
5隨後的這些特殊腫瘤死亡率的降低令人信服地證實了早期診斷方案的有效性。
總之，不幸的是，迄今為止所用的診斷方法很不靈敏，並且由於缺乏特異性還有產生假陽性結果的風險。此外，使用當前的診斷方法不能精確預測任何與腫瘤惡性分級、腫瘤發展及其轉移可能性有關的結論。
因此，使用可靠的診斷分子標記物對於了解上皮腫瘤的分子基礎，例如結腸腫瘤，區分良性與惡性組織並對癌的分級和分段十分有益，特別是對於預後很差的轉移性癌患者而言。這種標記物還可望用於開發癌症治療的新途徑。
對正常細胞轉變成不同程度的侵襲性腫瘤細胞分子事件的了解，以及合適的選擇癌相關基因的實驗體系的有效性，絕對是識別此類新的診斷標記物和治療藥物靶的先決條件。
通常認為腫瘤發生是一個複雜的多階段過程，其中遺傳改變和環境因素被認為使控制細胞增殖和分化的細胞程序失控。結腸癌的例子很好地闡釋了這一多階段過程，結腸癌的發展通常超過幾十年且顯然需要多
個遺傳事件形成(見Kinzler和Vogelstein， 1996， Cell 87,159-170綜述)。該過程歸因於基因改變的可遺傳性(由一種明顯的誘因所致)和基因組不穩定性(由環境中基因毒劑引起)導致額外的體細胞突變。顯然，涉及腫瘤形成的決定性因素還很不周詳，並且明顯取決於不同的腫瘤類型。
因此，本發明的技術問題就是為上皮細胞腫瘤的診斷和治療提供手段，以克服現有診斷和治療方法的缺點。通過提供權利要求書中的實施方案描述了上述技術問題的解決方法。
本發明是基於發明者的發現，即SEQ.ID. 1 (cf.TKT-Ll, TKR:NM-012253 ; Accession number: X91817 )所示的人的轉酮酶樣-1基因在結腸癌、胰腺癌、肺癌和胃癌組織中，同各自的正常對照組織中的水平相比，高度過表達。這對診斷來說特別重要，因為轉酮酶在腫瘤組織中沒有類似的過表達。
因此，肺瘤診斷方法可以基於檢測在生物樣品中轉酮酶樣-1基因產物的過表達。根據檢測轉酮酶樣-1基因產物的有或無和/或其水平可預測疾病的過程、評價預後和為患者定製適當患者的治療方案。
此外，本發明可以為與轉酮酶樣-1基因產物過表達有關的病症提供可行的治療方法。 一方面，本發明提供用轉酮酶樣-l核酸或多肽治療病症的方法。另一方面，本發明提供基於降低轉酮酶樣-1基因多肽的酶活性的治療方法。因此本發明的一個方面提供以檢測患者樣品中轉酮酶樣-1基因產物為基礎的合理的腫瘤管理和定製與檢出的上述基因產物過表達相應的治療方案的方法。
最後，本發明涉及診斷和研究試劑盒以及用於完成此處公開方法的藥物組合物。
附圖簡述


圖1 :用RT-PCR方法檢測結腸癌中轉酮酶樣-1基因的過表達；圖中顯示與對照組織相比轉酮酶樣-1基因在結腸癌組織中的誘導表達。
圖2 :用RT-PCR方法檢測肺腺癌中轉酮酶樣-1基因的過表達；圖中顯示與對照組織相比轉酮酶樣-1基因在肺腺癌組織中的誘導表達。
圖3 :用RT - PCR方法檢測胃癌中轉酮酶樣-1基因的過表達；圖中顯示與對照組織相比轉酮酶樣-1基因在胃癌組織中的i秀導表達。
圖4 :用RT-PCR方法檢測結腸癌中轉酮酶的過表達；圖中顯示與對照組織相比轉酮酶在結腸癌組織中的誘導表達。
圖5 :用RT - PCR方法檢測肺腺癌中轉酮酶的過表達；圖中顯示與對照組織相比轉酮酶在肺腺癌組織中的誘導表達。
圖6 :用RT-PCR方法檢測胃癌中轉酮酶的過表達；圖中顯示與對照組織相比轉酮酶在胃癌組織中的誘導表達。
圖7 : tktll的DNA和胺基酸序列；用於免疫以產生抗體的蛋白質
部分以黑體字母表示；其它用於多肽免疫產生抗體的多肽以下劃線標記。
圖8 :用針對tktll的初級抗體對胃癌組織(B)和相應正常組織(A)的免疫組化分析。在1666號患者的癌症中檢測到tktll蛋白很強的過表達。
7圖9 :用針對tktll的初級抗體對1682號胃癌患者(A )和1697號 胃癌患者(B)的免疫組化分析。在1682號患者癌的細胞核與細胞質中 均檢測到tktll蛋白很強的過表達。在1697號患者癌的細胞核與細胞質 中均檢測到tktll蛋白極強的過表達。
圖10 :用針對tktll的初級抗體對1699號胃癌患者的免疫組化分 析。圖A顯示伴有正常組織的癌。其中在正常組織中檢測到tktll的低 表達而在癌腫瘤細胞中檢測到tktll的很強的過表達。圖B是正常和腫 瘤組織的邊界放大圖。可檢測到肺瘤特異性的顆粒狀染色。
圖11 :用針對tktll的初級抗體對1698號胃癌患者的免疫組化分 析。圖A顯示在胃腫瘤細胞的細胞核和細胞質中均檢測到tktll蛋白很 強的過表達。在周圍成纖維細胞可檢測到低表達或無表達。圖B是癌細 胞區和周圍結締組織的放大圖。可檢測到腫瘤特異性的顆粒狀染色。
本發明提供了特徵在於異常的細胞增殖的病症例如癌症的診斷和 治療方法。
本發明的第一個方面是提供基於測定生物學樣品中如SEQ.ID.l (cf.TKT-Ll，TKR:NM—012253;Accession number:X91817 )所示序列的 人轉酮酶樣-l基因的有無和/或其表達水平的特徵在於異常的細胞增殖 的病症例如癌症的i貪斷方法。
本發明的第二個方面是提供用人轉酮酶樣-l基因產物作為治療活 性劑的特徵在於異常的細胞增殖的病症例如癌症的治療方法。
本發明的第三個方面是研究或診斷用試劑盒，用於完成檢測人轉酮 酶樣-l基因的有無和/或過表達水平中涉及的反應。
本發明的第四個方面涉及可用於根據本發明的病症的治療的藥物 組合物。
本發明提及的轉酮酶樣-l基因產物可以包含多肽和轉酮酶樣-l基因 編碼的核酸。
完成根據本發明方法所用的多肽和多核苷酸是分離的。這意味著這 些分子從其原始環境中移出。如果天然存在的蛋白質與其自然環境下共 存的某些或所有材料分開，則所述天然存在的蛋白質是分離的。多核苷酸例如要克隆入栽體，則為分離的。
用於完成根據本發明方法的人轉酮酶樣-1核酸分子可以包含多核
苷酸或其片段。優選多核苷酸可包含至少20個連續核苷酸，優選至少 30個連續核苷酸，並且更優選至少45個連續核苷酸，其與野生型轉酮 酶樣-1多肽相同或具有序列同源性或編碼相同或同源性多肽，但不編碼 其它轉酮酶樣多肽或轉酮酶。根據本發明的核酸還可與4壬何所迷多核苷 酸互補或反向互補。例如多聚核苷酸可能包括單鏈(有義或反義)或雙 鏈分子，可以是DNA (基因組DNA， cDNA或合成DNA )或RNA。 RNA分子包括hnRNA (包含內含子)和mRNA (不包含內含子)。根 據本發明多核苷酸還可與任何其它分子相連接，例如支持材料或檢測標 記分子，並且可能但不必包含另外的編碼或非編碼序列。
根據本發明所用的人轉酮酶樣-1多核苷酸可以是天然序列或其變 體。變體可以包含一或多個置換、添加、刪除和/或插入，以使編碼的 多肽的免疫原性相對於天然腫瘤蛋白不至降低。變體例如是多核苷酸的 等位突異。這裡所說的等位變異是基因的另一種(alternative)形式， 可由核酸序列中至少一個突變引起。等位基因可能導致改變的mRNA 或多肽，其結構或功能可能改變也可能不變。任何給定基因可能沒有、 有一個或多個等位基因形式。出現在等位基因的常見突變一般是由核苷 酸的天然缺失、添加或置換所致。每種類型的改變可能單獨發生或與其 它改變一起發生，或在給定序列中發生一次或多次。根據本發明的變體 表現與此處公開的天然核酸分子優選70%、更優選至少80%、最優選 至少90 %的序列同 一 性。確定序列相似性的方法為本領域技術人員眾所 周知。
例如使用DKFZ Heidelberg的HUSAR伺服器提供的FastA和/或 BlastN生物信息學軟體，可以進行序列相似性測定。
本發明提及的核酸可能是全部多核苷酸，在嚴謹條件下，它們可以 與此處所用轉酮酶樣-l序列特異性的探針雜交。用於雜交反應的嚴謹條 件為本領域技術人員眾所周知，並且也可使用如在Sambrook等人的 Molecular cloning : A Laboratory Manual, 2nd Edition, 1989中描述的。本發明還包含多核苷酸，其編碼人轉酮酶樣-1核酸所天然編碼的多 肽，由於遺傳密碼的簡併性，其核酸序列不表現上述序列同源性的百分
生，從而製備合成的核酸。這種人工核酸序列的製備可用本領域技術人 員已知的方法完成。
根據本發明所用的人轉酮酶樣-1核苷酸序列可與多種其它核酸序
列用已知的重組DNA技術連接起來。例如序列可以被克隆入任何一種 克隆栽體，例如質粒、噬菌粒、人噬菌體衍生物和粘粒。而且，栽體例 如表達栽體、複製栽體、探針生成載體和測序載體均可和此處公開的序 列連接。
可以克隆根據本發明的核酸的序列包含編碼序列、非編碼序列、和 包括啟動子、增強子和終止子在內的調控序列。此處公開的人轉酮酶樣 -l核酸序列可以與其它編碼序列相連的形式存在。這些序列可能編碼多 種蛋白質例如酶、受體、抗原、免疫原性片段或表位、結合蛋白等等。 核酸序列可直接相連，或由一段編碼間隔子或連接子區域的核酸分開。 核酸序列可由一段轉錄後可去除的核酸分開。可與此處/>開序列相連的 非編碼序列例如可能是啟動子區、增強子、順式調控元件、5，非翻譯區、 終止子等等。
在一優選實施方案中可配製人轉酮酶樣-1多核苷酸以便其能夠進 入原核或真核細胞如哺乳動物細胞內，並在所述細胞中表達。這些配方 例如可用於治療目的。核酸序列在靶細胞中的表達可採用本領域技術人 員已知的方法來實現。例如核酸可以與使其適於在宿主細胞中表達的元 件相連。這些元件可能包含啟動子或增強子，諸如CMV-、 SV40-、 RSV-、 金屬石克蛋白I-或多角體蛋白的啟動子，如CMV或SV40的增強子。用 於表達的可能方法為例如將多核苷酸摻入病毒載體，包括腺病毒、腺伴 隨病毒、反轉錄病毒、牛痘病毒或痘病毒。以在哺乳動物宿主細胞中表 達核酸為目的的病毒栽體可能包含pcDNA3、 pMSX、 pKCR、 pEFBOS、 cDM8、 pCEV4等等。這些技術為本領域技術人員已知。
此處所用的人轉酮酶樣-1序列片段可以包含寡核苷酸例如用於雜
10交的核酸探針、用於擴增反應的引物或用於反義技術的反義核酸構建 體。根據本發明的核酸探針可能是任何核酸探針，該探針與人轉酮酶樣
-l基因核酸序列至少15個連續核苷酸部分至少80%相同，或與該序列 互補或反向互補，但不與其它轉酮酶或轉酮酶樣序列雜交。根據本發明 的核酸探針其特徵還在於，它們可以在嚴謹條件下與此處/>開的核酸序 列雜交。引物可以是適合進行特異性擴增反應的任何核苷酸。因此根據 本發明所用的引物可以是至少15個連續核苷酸與人轉酮酶樣-1基因核 酸序列至少80%序列相同的核酸寡聚體，或與其互補或反向互補。根據 本發明的引物，在適用於核酸擴增反應過程的條件下可以與此處公開的 序列或其部分特異性雜交，但不與其它轉酮酶或轉酮酶樣序列雜交。此
酸分子，它們可以通過鹼基配對與轉錄物結合因而抑制或降低該編碼序 列的表達。
根據本發明所用的核酸也可能是化學預處理的核酸。這些化學預處 理的核酸可包含此處公開的任何核酸，該核酸經適於在核酸分子產生修 飾的化學試劑處理。所謂修飾可包含例如核酸內特定鹼基的特異性修 飾。化學處理可以包含用例如亞疏酸氬鈉、肼或高錳酸鉀處理。採用化 學預處理核酸的實驗中特別的目的序列可以包含例如序列的編碼區或 非編碼區。可以被化學處理的非編碼區的實例包括啟動子區或5 'UTR 中的CpG島。
根據本發明所用的人轉酮酶樣-1多肽可以包含任意長度的胺基酸 鏈，包括全長蛋白質，其中胺基酸殘基通過共價肽鍵連接。因此，包含一 種上述人的轉酮酶樣-1蛋白質一部分的多肽，例如，包含人轉酮酶樣-1
額外序列的大的多肽中。額外序列可以來源於天然蛋白質或異源蛋白， 並且這種序列可以(但不一定)具有免疫活性和/或抗原性。如下面詳 述，該多肽可以從腫瘤組織分離或用合成或重組方法製備。
此處所用的顯示人轉酮酶樣-1多肽的生物學性質的多肽，理解為至 少具有一種下列活性，例如酶的活性(轉酮酶活性)、蛋白質之間相互作用活性、對硫胺素存在的酶活敏感性、或抗原性或免疫原性性質，例如與針對所述人類轉酮酶-1多肽的所述多肽(即包含免疫原性部分)的抗體的結合能力的多肽。
如此處所用的免疫原性部分是指可被B細胞和/或T細胞表面抗原受體識別的蛋白部分。免疫原性部分含有此處公開蛋白的至少5個胺基酸殘基，更優選至少IO胺基酸殘基，最優選至少15胺基酸殘基。在本發明一優選實施方案中，蛋白的特定結構域，例如跨膜區或N-末端的前導序列已被刪除。
根據本發明的免疫原性部分與抗血清或特異性抗體反應的強度與天然全長蛋白相同或幾乎相同。免疫原性部分通常使用本領域眾所周知的方法來鑑定。可能的方法例如對多肽與抗原特異性抗體、抗血清和/或T細胞系或克隆的反應能力進行篩選。
根據本發明人所用的類轉酮酶-1多肽還包含天然蛋白質的變體。這些變體可有一或多個改變如替換、缺失、添加和/或插入而不同於天然蛋白。根據本發明的變體的免疫反應性和/或生物活性與天然蛋白質相比基本沒有減低。與天然多肽相比，在本發明一優選的實施方案中免疫反應性和/或活性減低少於50%，在一更優選實施例中免疫反應性和/或活性減低少於20 %。在本發明另一優選實施方案中，多肽的變體可能發生變化以致天然蛋白質活性增加、減少或缺失。這些變體可用於例如與人轉酮酶樣-l基因過表達有關的病症的治療。在一優選的實施方案
中，變體可能缺少一或多個部分，例如N-末端前導序列、跨膜區或小的N和/或C末端序列。變體顯示與根據本發明公開的多肽優選70%、更優選至少90%並且最優選至少95°/ 的同一性。
根據本發明所用的變體優選包含保守性置換，以便改變的胺基酸為性質相似的胺基酸代替。涉及的性質可以包括極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性和/或胺基酸殘基的兩親性。
根據發明所用的變體可能還包含額外的末端前導序列、接頭或序
列，使得多肽的合成、純化或穩定簡單而輕鬆<
12備(見如Sambrook等，1989，分子克隆實驗操作指南，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY )。例如有可能將不同的突 變引入本發明的核酸分子內。結果可能合成生物學性質有可能改良的人 轉酮酶樣-1多肽。 一種可能是產生缺失突變體，其核酸分子通過從編 碼DNA序列的5 '或3 '末端連續刪除而產生，結果合成相應縮短的多肽。
置上，引入單點突變。通過這種方法可以產生突變蛋白質，例如具有改 變的Km值或不再遵守細胞中正常的調控機制(例如與變構調節或共價 修飾有關的調控機制)的蛋白質。這種突變蛋白質例如可用作治療用化 合物，例如拮抗劑。
在原核細胞中通過基因工程操作，可將本發明方法所用的核酸分子 或這些分子的某部分導入質粒中，通過DNA序列重組獲得序列突變或 修飾。採用傳統的方法(參照，Sambrook等，上文)，可置換鹼基並 加入天然或合成的序列。要使DNA片段互相連接，可在片段上加上連 接物或接頭。此外，可進行操作以提供適當的切割位點或去除多餘的 DNA或切割位點。如果可能插入、刪除或置換，則可能進行體外突變、 引物修復，限制性酶切或連接反應。作為分析方法，常用的序列分析、 限制性酶切分析和其它生物化學或分子生物學的分析方法均可使用。
多肽可以包含融合或嵌合的包含此處公開的序列的多肽。融合蛋白 包含發明多肽或其部分或發明多肽的變體或其部分，連同任何第二個和 更多個多肽，例如另一個發明多肽或其部分或發明多肽的變體或其部 分，和/或任何異源多肽。異源多肽可以包含酶、受體分子、抗原、抗 原性或免疫原性表位或其片段、抗體或其片段、信號多肽或信號轉導多 肽等等。免疫原性蛋白例如能夠引起記憶反應的蛋白。這種蛋白的實例 包括破傷風、肺結核和肝炎蛋白(見，例如,Stoute等New Engl. J. Med., 336:8691(1997))。本發明 一個實施方案中可能構建融合肽以提高多肽的 檢測或純化。為純化可將標籤，例如his-標籤、myc-標籤等加到多肽上。為檢測，抗原性部分、酶、生色序列等可融合到多肽上。本發明的融合 蛋白可能(但不必須)在第一和第二個多肽之間包括接頭肽。
編碼本發明所用的融合蛋白的核酸序列利用已知重組DNA技術構 建，將分別編碼第一和第二多肽的核酸序列組裝入適當的表達栽體中。 編碼第一多肽的核酸序列的3'端，用或不用肽接頭，與編碼第二多肽的 核酸序列5'端連接，以保證合適的序列閱讀框使兩個核酸序列mRNA翻 譯成單一的融合蛋白，其同時保留第一和第二多肽的生物活性。
肽接頭序列可用來使第一和第二個多肽分開足夠的距離以保證各 個多肽摺疊成其二級和三級結構。這種肽接頭序列利用本領域眾所周知 的標準技術引入融合蛋白。可根據下列因素選擇適當的肽接頭序列 (1)其採取柔韌性伸展構象的能力；(2 )其不能採取可能與第一和 第二個多肽功能性抗原表位相互作用的二級結構的能力；和(3 )沒有 與多肽功能性抗原表位起反應的疏水性或帶電荷的殘基。優選肽接頭序 列包含甘Gly、 Asn和Ser殘基。其它接近中性的胺基酸，例如Thr和Ala 也可用於接頭序列中。可用作接頭的胺基酸序列包括公開於Maratea等， Gene 40:39-46， 1985; Murphy等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262,1986; U.S.Pat. No.4，935， 233和U.S.Pat.No.4，751 ， 180 的序列。接頭序列可長1到約50個胺基酸。當第一和第二個多肽有可使 功能域分開和防止位阻影響的非必須N-端胺基酸部位時，不需要肽序 列。
用於根據本發明方法的人轉酮酶樣-l多肽和編碼這種多肽的核酸， 可利用本領域眾所周知的任何方法從腫瘤組織中分離。編碼本發明腫瘤 多肽之一的基因(或其一部分)相應的核酸序列，可利用消減技術從肺 瘤cDNA文庫中分離。這樣獲得的部分的核酸序列可用作設計聚合酶鏈 反應(PCR)的寡核苷酸引物，利用本領域眾所周知的技術(見，例如， Mullis等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol. 51:263, 1987; Eriiched.， PCR技術，Stockton Press, NY， 1989)從人類基因組核酸文庫或腫瘤 cDNA文庫中，擴增全長核酸序列。這種方法所用的序列特異性引物可 根據此處提供的核苷酸序列設計、購買或合成。
14此處公開的方法中所用的人轉酮酶樣-l多肽還可通過合成的方法
產生。特別地，合成的多肽少於大約100個胺基酸，通常少於大約50氨基 酸，可利用本領域技術人員眾所周知的技術產生。例如這種多肽可利
到增長的胺基酸鏈上(見，例如，merrifield， J.Am.Chem.Soc. 85:2149-2146， 1963 )。多肽自動化合成設備可向供應商諸如Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, Calif.)購買，並可才艮據 廠家說明書進行操作。
此處公開方法所用的已連接的編碼多肽的核酸序列，與本技術領域 技術人員已知的適當的轉錄或翻譯調控元件相連。負責核酸表達的調控 元件可位於例如編碼第一個多肽的核酸序列的5，端、編碼序列內部或編 碼第一個或任何增加的多肽的核酸序列的3'端。翻譯和轉錄終止信號需 要的終止密碼子位於編碼第二個多肽的核酸序列的3'端。
根據本發明方法所用的多肽可以是分離的。這意味著這些分子可從 其原始環境中除去。如果其與自然環境下共存的某些或所有材料分開， 天然存在的蛋白就是分離的。多核苷酸例如要克隆入載體，則是分離的。
在以下將更詳細地描述的某些優選實施方案中，此處公開的方法所 用多肽可採用分離的、基本純的形式製備(即多肽經胺基酸組成和基本 序列分析測定是均質的)。優選地，多肽純度至少在大約90。/。，更優選 至少在大約95%，最優選至少在大約99%。基本純的多肽可以用作例如 藥用組合物。
此外本發明使用特異性結合人轉酮酶樣-l蛋白的結合因子。這些結 合因子可以包含例如抗體和抗原結合片段、雙功能的雜合抗體、包含最
小的抗原結合表位的肽模擬物(p印tidomimetic )等等。
如果所述抗體或抗原結合因子與此處所用蛋白以可檢測水平反應， 且基本不與其它蛋白反應，則稱為特異性的反應。根據本發明的抗體可 以是單克隆或多克隆抗體。此處所用抗體或單克隆抗體術語意味著包括 完整分子和能特異性地結合蛋白的抗體片段(例如，Fab和F(ab')2片段)。 Fab和F(ab')2片段沒有完整抗體的Fc片段,更迅速地從循環系統清除，並(wahl等.J. Nucl. Med. 24:316-325(1983)。因此，同Fab或其它免疫球蛋白表達文庫的產物 一樣，這些片段是更優選的。此外，本發明所用抗體包括嵌合、單鏈和 人源化的抗體。
根據本發明結合因子可單獨或結合使用。通過結合使用可獲得高靈 敏度。抗體術語優選涉及，基本上由不同表位特異性的單克隆抗體和不 同的單克隆抗體製劑組合而成。
單克隆抗體採用任何本領域技術人員已知的技術(見，例如，Harlow 和Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 )，由本發明所用的包含多肽片段的抗原製成。在一種 該類技術中，包含抗原性多肽或合成的其部分的免疫原，最初注射到多 種哺乳動物任一種體內(例如小鼠、大鼠、家兔、綿羊和山羊)。在該 步驟中，本發明的多肽不經修飾即可作為免疫原。作為選擇，特別是對 於較短的多肽，如果將多肽連接到栽體蛋白，例如牛血清白蛋白或匙孔 血藍蛋白上，可引起較高的免疫應答。把免疫原注入到動物宿主內，優 選根據預定時間表合併一或多次加強免疫，並對動物定期採血。針對多 肽的特異性多克隆抗體可從抗血清中純化，例如通過用偶聯在適當固體 支持物上的多肽進行親和層析純化。
目的抗原性多肽的特異性單克隆抗體，可利用K(ihler和 Milstein(Eur. J. Immunol. 6: 511-519， 1976)以及其改良的才支術製備。簡 要地，這些方法包括製備能產生具有目的特異性(即與目的多肽的反應 性)抗體的永生細胞系。這些細胞系可例如由從上述免疫動物中獲得的 脾細胞產生。脾細胞通過例如與骨髄瘤細胞融合配偶體融合，優選與免 疫動物同系的骨髓瘤細胞融合配偶體融合以永生化。可應用多種融合技 術。例如，脾細胞和骨髄瘤細胞可用非離子型去汙劑合併幾分鐘，然後
優選選擇技術運用HAT (次黃噪呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶脫氧核苷)選 擇。足夠時間後，通常大約l到2周，可觀察到雜合的克隆。選擇單克隆 並測定針對多肽的結合活性。優選高反應性和特異性的雜交瘤。可從雜交瘤克隆生長上清中分離單克隆抗體。另外，可使用各種技術 提高產量，例如將雜交瘤細胞系注射入適當的脊推動物宿主例如小鼠的 腹膜腔內。然後可從腹水液或血液中收穫單克隆抗體。可採用傳統方法 例如層析法、凝膠過濾、沉澱和萃取，除去雜質。人轉酮酶樣-l多肽可 被用於例如親和層析步驟的純化過程。
根據本發明所用的人轉酮酶樣-l的特異性抗體可以包含另外的結 合位點，以結合治療劑或其它多肽，或可偶聯到所述治療劑或多肽上。 治療劑可以包含藥物、毒素、放射性核素及其衍生物。試劑可例如通過 接頭或者載體基團，直接或間接地偶聯到結合因子上。接頭基團可起例 如能使結合因子與治療劑或其它因子發生偶聯反應的作用，或作為融合 分子不同部分間的間隔物。在一定條件下接頭還可被切除，並因此在該
條件下釋放出結合因子。治療劑可直接或通過接頭基團與載體基團共價 偶聯。治療劑也可與栽體非共價偶聯。根據本發明可使用例如白蛋白、 多肽、多糖或脂質體作為栽體。
根據本發明所用的人轉酮酶樣-l特異性抗體可與一或多個因子
(agent)偶聯。偶聯在一種抗體上的多個因子可能完全相同，或幾種 不同的因子與一種抗體結合。
此處公開的方法適用於所有受到與轉酮酶樣-l基因過表達有關的 病症侵襲的真核生物。本發明所用的個體可以包含例如哺乳動物，例如 農業效益動物(奶牛、綿羊、馬、豬等等)、寵物(貓、狗等等)、研 究常用動物(大鼠、小鼠、倉鼠等等)或人類。
本發明提及的診斷可包含某樣品中人轉酮酶樣-l基因產物水平的 測定。根據測定的樣品中人轉酮酶樣-l基因產物的水平，可將個體分成 幾個亞群。亞群可根據與樣品中測定的轉酮酶樣-l基因產物的特定水平 有關的臨床資料產生，例如存活率、疾病復發、轉移頻率等等。
根據這些亞群可進行預後的評定。根據亞群可為受腫瘤侵襲的個體 定製治療方案。
例如轉酮酶樣-l基因的過表達及其在結腸、胃、胰腺和肺腫瘤中磷 酸戊糖循環中增強的活性，表明疏胺素(維生素B1)經非氧化的轉酮酶
17途徑促進核酸核糖合成和腫瘤細胞增殖的機制。因此癌症患者的硫胺素 的攝入與腫瘤生長率和轉酮酶樣-l基因過表達有直接的因果關係。這同 時提供了背景資料，有助於研究出臨床情況下用抗硫胺素轉酮酶抑制劑 的選擇治療指南。臨床和實驗數據表明人腫瘤對硫胺素利用的增加及其
對化療實驗的幹擾作用。RNA核糖分析顯示在培養的宮頸癌和胰腺癌細 胞中核糖合成的90%以上由葡萄糖碳原子貢獻，且核糖主要通過疏胺素 依賴轉酮酶依賴途徑(>70%)合成。在幾個肺瘤模型中，抗疏胺素化 合物顯著抑制體外和體內的核酸合成和腫瘤細胞增殖。醫學文獻很少報
糖的產生是核酸從頭合成和嘌呤補救途徑的中心過程。
途徑，過度的硫胺素補充可能會導致終止癌細胞增殖的治療嘗試的失 敗。對轉酮酶樣-l基因過表達的結腸和肺肺瘤亞型的檢測，為肺瘤個性 化治療提供了重要的一步，並且限制硫胺素的給藥和採用轉酮酶抑制劑 伴隨治療成為治療癌症更為合理的的方法。
因此，基於對TKT-L1過表達的檢測，可針對磷酸戊糖循環的特異 性生化反應來定製新的治療策略，通過葡萄糖代謝相關激素、控制疏胺 素攝入、非氧化的轉酮酶磷酸戊糖循環反應的輔助因子，或用抗硫胺素 類似物來治療癌症患者。
因此本發明一個實施方案中特徵在於人轉酮酶樣-l過表達的病症， 可根據轉酮酶樣-l基因過表達水平進行治療。用非氧化的磷酸戊糖循環 反應抑制葡萄糖利用途徑有選擇地產生核酸，通過對細胞周期的強調控 作用，提供了腫瘤治療的新把點。
在一個實施方案中，與轉酮酶樣-l基因過表達有關的病症的治療可 能包含對受侵襲個體限制給予硫胺素。在另一個實施方案中，治療可能 包含給予轉酮酶抑制劑，例如抗硫胺素化合物。
監測可能包括對不同的時間點所取樣品中人轉酮酶樣-1基因產物 水平的檢測，以及上述水平變化的檢測。根據所述變化可跟蹤疾病病程。 疾病病程可用來為特定個體選擇治療方案。根據本發明診斷和疾病病程的監測的另一方面可能包含檢測輕微 後遺症。這可能包含例如某一個體開始治療後， 一或幾個時間點的一個 或多個身體樣品中人轉酮酶樣-1基因產物水平的檢測。根據樣品中檢測 到的人轉酮酶樣-l基因產物的水平，可為特定個體選擇適當的治療方 案。
在另 一個優選實施方案中，執行診斷方法檢測生物樣品中彌散性腫
瘤細胞，作為輕微後遺症的診斷(MRD)。
本發明提及的特徵在於異常的細胞增殖的病症，可能包含例如腫 瘤，諸如良性和惡性腫瘤，癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤或發育不良。腫 瘤可能包含頭頸部腫瘤、呼吸道腫瘤、胃腸道腫瘤、泌尿系腫瘤、生殖 系統胖瘤、內分泌系統腫瘤、中樞和周圍神經系腫瘤、皮膚及其附屬物 腫瘤、軟組織和骨腫瘤、淋巴和造血系統腫瘤等等。
在一優選實施方案中，腫瘤為例如頭頸癌、呼吸道癌、胃腸道癌、 皮膚及其附屬物癌、中樞和周圍神經系統癌、泌尿系癌、生殖系統癌、 內分泌系統癌、軟組織和骨癌、淋巴和造血系統癌。在本發明最優選的 實施方案中，癌為頸癌、結腸癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌等等。
根據本發明的腫瘤可能包含有可檢出的淋巴結受累腫瘤(淋巴結陽 性腫瘤)和沒有可檢出的波及到淋巴結的(淋巴結陰性腫瘤)腫瘤。本 發明的一個實施方案中，胃腸肺瘤為沒有可檢出的波及到淋巴結的腫 瘤。
根據本發明方法的樣品可能包含任何含有細胞或細胞碎片的樣品。 樣品可能包含臨床相關樣品，例如分泌物，諸如胃液、膽汁或胰液、塗 片，體液，諸如血清、血液、血漿尿、精液、大便、活組織檢查或細胞
和組織樣本。本發明提及的活組織檢查可能包含腫瘤切除樣本、通過內 窺鏡方法製備的組織樣本或器官穿刺的活檢組織。此外任何可能包含欲 被檢測的標記分子的樣本都可作為根據本發明的樣品。
這些樣品可能包含例如完整細胞、裂解細胞或任何舍有蛋白、肽或 核酸的液體。甚至細胞、細胞碎片或標記分子(例如人轉酮酶樣-l核酸 或人轉酮酶樣-l蛋白)可附著其上的固體都可能作為根據本發明的樣品。此類固體可能包含例如薄膜、載玻片、小珠等等。
樣品的製備可能包含例如來自患者的組織樣品、體液樣品、細胞樣品、細胞碎片樣品的獲得。根據本發明樣品的製備可能還包含樣品的幾個進一步預加工步驟，例如解剖標本的製備、裂解細胞的製備、組織陣列的製備、多肽或核酸的分離、固定的肽或核酸的固相製備，或與待測分子共價或非共價偶聯的珠、薄膜或載片的製備。
根據本發明的人轉酮酶樣-l基因產物水平的檢測方法是任何 一種適於檢測生物樣品中微量的特異性生物學活性分子的方法。根據本發明的檢測反應是在核酸水平或多肽水平的檢測。
檢測可在溶液中或使用固定到固相的試劑進行。 一種或多種分子標記物，例如多肽或核酸的檢測可在單一反應混合物或兩個或分開的反應混合物中進行。作為選擇，幾個標記分子的檢測反應可例如同時在多孔反應皿中進行。人轉酮酶樣-l基因產物的特徵標記物可用特異性識別這些分子的試劑檢測。標記分子的檢測反應可包含一或多個與檢測試劑的反應，檢測試劑識別初始標記分子或識別用來識別其它分子前一分子。
檢測反應還可能包含指示人轉酮酶樣-l基因標記物存在與否和/或其水平的報告反應。報告反應可以是例如生成有色化合物的反應、生物發光反應、螢光反應，通常的放射發射反應等等。在一優選實施方案中，不同的標記分子可被生成不同報告信號的物質所識別，結杲指示標記分子的信號可以被區分開來。
根據本發明檢測反應的適當形式可以是印跡技術例如Western印跡、Southern印跡、Northern印跡。印跡技術為本領域技術人員眾所周知，可採用例如電印跡、半乾印跡、真空印跡或斑點印跡法進行。擴增反應也可應用於如核酸分子的檢測。此外還可應用免疫學方法進行分子檢測，例如免疫沉澱或免疫學測定，諸如ELISA、 RIA、側流測定(lateralflow assay)、免疫細胞化學法等等。
本發明的一個優選的實施方案中，人轉酮酶樣-l基因產物水平的檢測通過檢測存在於樣品中的編碼人轉酮酶樣-l基因產物的核酸或它的片段水平來完成。核酸分子的檢測方法為本領域技術人員眾所周知。核與互補的核酸探針、特異性結合核酸的蛋白，或任何其它特異性識別和結合上述核酸的實體的結合反應來完成。這些方法可在體外也可直接在原位完成，例如在染色反應過程中的檢測。根據本發明的方法，另一種在核酸水平檢測樣品中人轉酮酶樣-1基因產物的方法為核酸擴增反應，可採用定量的方式，例如聚合酶鏈反
應來完成。本發明的一優選的實施方案中，實時RT-PCR可用來定量測定腫瘤樣品中的轉酮酶樣-1 RNA水平。
本發明的另 一個優選實施方案中，通過測定蛋白表達水平來檢測人轉酮酶樣-l基因產物水平。在蛋白水平上測定人轉酮酶樣-l基因產物可由例如包含特異性檢測人轉酮酶樣-l蛋白的抗體的反應來完成。抗體可被用於多種不同的檢測技術例如在Western印跡、ELISA或免疫沉澱中。通常基於抗體的檢測可在體外也可直接在原位進行，例如在免疫組化染色反應過程中進行。根據本發明任何其它測定生物樣品中特定多肽數量的方法均可使用。
本發明的一個優選實施方案中，人轉酮酶樣-l基因產物的水平與對照試驗樣品相比顯著升高。在這種情況下樣品中人轉酮酶樣-l基因過表達。
一個診斷與人轉酮酶樣-l基因表達有關的病症的實例，可能包含檢測針對由人轉酮酶樣-l基因編碼的多肽的自身抗體。根據本發明方法所用的多肽，可用於使用本領域技術人員已知的方法檢測體液中有或沒有這種抗體。
在一個優選實施方案中，對表達轉酮酶樣-l基因產物的組織的檢測可以分子成像方法的形式進行。有關的方法為本領域技術人員已知。本發明文中所用的成像方法可能包含例如MRI、 SPECT、 PET和其它適於活體內成像的方法。
一個實施方案中的方法可能基於，在分子成像方法過程中通過轉酮酶樣-l分子將惰性的或標記的化合物酶促轉變成可檢測分子。在另 一個實施方案中，分子成像方法可能基於使用攜帶適當的用於體內分子成像的標記化合物諸如放射性同位素、金屬離子等等，在體內特異性地與轉酮
21酶樣-l分子結合。
本發明一優選實施方案中，這些化合物是無毒化合物，並可在一定時間內從生物體例如人的循環中清除，從而允許對過表達轉酮酶樣-l基因的腫瘤組織內累積的標記進行檢測。本發明的另一個優選實施方案中，用於分子成像的化合物從循環清除與分子成像反應無關。逸可能由於例如由循環分子等等產生的低背景所致。分子成像方法中所用的化合物以藥物學容許的形式在組合物中給予，組合物可能還包含任何其它適當的物質例如其它診斷用材料、治療用材料、載體材料等等。
本發明的另 一方面是進行根據本發明的方法的試劑盒。試劑盒可以是例如診斷試劑盒或研究試劑盒。
根據本發明的試劑盒包含至少 一種適合檢測此處公開的分子的試
劑。此外根據本發明試劑盒可能包含a)用於檢測人轉酮酶樣-l基因產物的試劑；b)通常用來進行檢測反應的試劑和緩沖液，例如緩衝液、檢測標記物、載體材料等等；c)作為陽性對照反應的人轉酮酶樣-l樣品。
檢測人轉酮酶樣-l基因的試劑可能包括任何能夠與人轉酮酶樣-l分子結合的試劑。這種試劑可能包括蛋白、多肽、核酸、肽核酸、糖蛋白、蛋白聚糖、多糖或脂類。
作為陽性對照的人轉酮酶樣-l樣品可能包含例如適當形式的人轉酮酶樣-l核酸或多肽或其片段，例如溶液或鹽形式的，適當形式的肽、組織切片樣品或陽性細胞。
本發明一優選實施方案中，人轉酮酶樣-l基因產物的檢測在多肽水平上進行。在該實施方案中，結合試劑可以是例如人轉酮酶樣-l或其片段的特異性抗體。
本發明試劑盒另一優選實施方案中，人轉酮酶樣-l的檢測在核酸水平上進行。在該發明實施方案中，檢測試劑可以是例如核酸探針或上述的人類轉酮酶樣-l核酸的反向-互補引物。
另 一方面，本發明涉及用於根據本發明方法的 一種或多種化合物的用途，例如核酸分子、重組栽體、多肽、反義RNA序列、核酶或抗體，
22用於製備治療癌症，優選結腸癌、胰腺癌、胃癌、肺癌的藥物組合物。用於根據本發明方法的多肽、多核苦酸和結合試劑，可摻入藥物或
免疫原性組合物。該藥物組合物包含上述的化合物和生理學可接受的栽體。
藥物組合物或疫苗可能包含例如編碼一種或多種根據本發明的多
肽的DNA。該DNA可以允許原位產生多肽的方式引入。適當的表達系統為本領域技術人員眾所周知。多肽的表達可能是例如永久性或瞬時性的。在藥物組合物和/或疫苗中，為提供多肽的原位表達，核酸可存在於本領域技術人員已知的任何適當的運栽系統中，包括核酸表達系統、細菌和病毒表達系統。適當的核酸表達系統包含在患者體內表達必需的核酸調控序列，例如適當的啟動子、終止子等等。細菌運載系統可能使用例如引入在細胞表面表達細胞抗原表位的細菌。在一優選實施方案中，核酸可由病毒表達系統引入，例如痘苗病毒、逆轉錄病毒或腺病毒，可能包括使用無致病性、有複製能力的病毒。適當的系統公開於，例如Fisher曙Hoch等,PNAS 86317-321,1989; Flexner等，Ann. N.Y. Acad Sci.569:86-103,1989; Flexner等Vaccine 8:17-21，1990; U.S.Pat.Nos.4，603，112， 4,769,330，和5，017，487; WO89/01973; U.S.Pat.No. 4，777，127;GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO91/02805; Berkner， Biotechniques6:616-627，1988; Rosenfeld等，Scienee 252: 431-434， 1991; Kolls等，PNAS91: 215-219,1994; Kass-Eisler等，PNAS 90:11498-11502,1993; Guzman等，Circulation 88:2838-2848， 1993;和Guzman等，Cir.Res.73:1202-1207,1993。在另一個實施方案中，轉基因哺乳動物細胞可能被用來運送和/或表達核酸。適合於多肽原位表達多肽的核酸構建體的產生方法為本領域技術人員眾所周知。
本發明的另一個實施方案中核酸可能是例如反義構建體。核酸也可以棵核酸形式給予。在這種情況下可使用適當的促進核酸攝取的運栽系統，例如將核酸包被於生物可降解的小珠上，該小珠能有效地運送到細胞內。棵核酸的給予可能例如有助於在宿主或宿主細胞內的瞬時表達。做為選擇，藥物組合物可能包含一種或多種多肽。引入藥物組合物 的多肽可能是人轉酮酶樣-l多肽，結合一種或多種其它已知的多肽，例 如酶、抗體，調節因子諸如細胞周期蛋白、細胞周期蛋白-依賴的激酶
或CKI或毒素。
藥物組合物可用任何本領域技術人員已知的適當方法給藥。所述給 藥可能包括例如注射，諸如皮內、肌肉、靜脈或皮下注射，鼻內給藥例 如吸入，或口服給藥。應根據本領域技術人員已知的參數，諸如患者年 齡、性別、體重等等，選擇適當的劑量以保證治療的藥物療效。
本發明藥物組合物中使用的載體的類型，依給藥方式變化。對於腸 胃外給藥，例如皮下注射，載體優選包含水、鹽水、酒精、脂類、蠟和 /或緩衝液。對於口服給藥，任何上述栽體或固相載體，例如甘露醇、 乳糖、澱粉、硬脂酸鏷、糖鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、和/或
碳酸鎂，均可能使用。生物可降解的微球體(如polylacticglycolide)也 可能用作本發明藥物組合物的載體。適當的生物可降解的微球體公開於
例如U.S.Pat.Nos.4，897，268和5，075,109。
本發明的化合物還可能摻入免疫原性組合物。
免疫原性組合物的成分可能包含疫苗、抗原、抗原性片段或編碼原 位表達的抗原或抗原性片段的核酸。該化合物可能以多肽或允許多肽原 位表達的核酸形式存在。免疫原性組合物包含上述的化合物和另外的免 疫刺激劑或免疫原性佐劑。
本發明的多肽或其片段，包含人轉酮酶樣-l蛋白的免疫原性部分， 可用作免疫原性組合物，其中多肽能刺激患者對腫瘤細胞的自身免疫反 應。患者可能受疾病折磨也可能沒有可診斷的疾病。因此此處公開的化 合物可用於治療癌症或抑制癌症發展。化合物可在腫瘤常規治療之前或 之後給藥，常規治療如手術切除原發肺瘤，施行放療、傳統的化療或任 何對相應癌或其前體的其他形式的治療。
免疫原性組合物例如疫苗，可能包含一種或多種多肽和非特異性的 免疫應答增強劑，其中非特異性免疫應答增強劑能夠引起或提高對外原 性抗原的免疫應答。非特異性免疫應答增強劑的實例包括佐劑、生物可降解的孩t球體(如polylactic galactide )和例如可摻入多肽的脂質體。藥 物組合物和疫苗可能還包含其它的腫瘤抗原表位，或摻入上述融合蛋 白內(即包含多個表位的單一多肽)或存在單獨的多肽內。
任何適當的免疫應答增強劑可應用於本發明的疫苗。例如可包括 佐劑。大多數佐劑包含保護抗原免遭快速分解的材料，例如氫氧化鋁或 礦物油，和非特異性的免疫應答刺激物，例如類脂A，百日咳博德特氏杆 菌 (Bordetella pertussis )、 或結核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)。這種佐劑是商品化的，例如弗氏不完全佐劑和完全佐 劑(Difco實驗室，Detroit, Mich.)和Merck Adjuvant65 ( Merck and Company,Inc.，Rahway N.J.)。
為治療目的，多肽、多核苷酸或結合劑可以通過各種途徑給藥。可 能的途徑例如包含皮內、肌肉、靜脈內或皮下注射，例如通過吸入來鼻 內給藥或口服給藥。
本發明的另一個方面是提供治療和/或接種方法。根據本發明可以 用人的轉酮酶樣-l多肽和/或多核苷酸來治療細胞增生性病症。治療例如
可以是免疫治療或體細胞基因治療。
根據本發明人轉酮酶樣-l多肽和/或多核苷酸可用於疫苗接種預防 細胞增生性病症。根據本發明的疫苗接種可以包含給予個體一種免疫原 性化合物，以刺激針對該免疫化合物的免疫應答，並因此免疫該個體以 對抗該免疫原性化合物。刺激免疫應答可包含誘導針對上述化合物的抗 體的產生和刺激細胞毒性T-細胞。為疫苗接種目的，根據本發明的多肽、 核酸和結合試劑可以生理學可接受的形式給藥。引入個體內的組合物可 以包含一種或多種抗原性成分、生理學可接受的栽體材料或緩衝溶液、 免疫刺激劑和/或佐劑。佐劑可以包含例如弗氏不完全佐劑或弗氏完全 佐劑或其它為本領域眾所周知的佐劑。
組合物可以任何可使用的方法例如靜脈、皮下、肌肉等等方式給藥。 組合物的劑量取決於具體的病案和接種疫苗的目的。需要根據治療個體 的參數，例如年齡、重量、性別等等進行調整。此外還要考慮引起的免 疫應答的類型。通常優選個體接受100ug-lg根據本發明的多肽，10、10"MOI含有可原位表達形式的根據本發明核酸的重組核酸。
疫苗接種的個體可以是任何包含轉酮酶樣-l蛋白並可受細胞增生 性病症的侵襲的生物體。
例如，在與細胞增生性病症相關的標記分子的發生變化的、非野生 型序列或結構的情況下，個體接種疫苗可能是有益的。
此處公開的多肽還可用於過繼性免疫療法治療癌症。過繼性免疫療 法廣義上可劃分為主動或被動免疫療法。在主動免疫療法中，治療依賴 於通過給予免疫應答調節劑(例如，腫瘤疫苗、細菌佐劑、和/或細胞 因子)刺激內源性宿主免疫系統以對抗腫瘤。
在被動免疫療法中，治療涉及具有確定的腫瘤免疫反應性的生物試 劑(例如效應細胞或抗體)的運送，它們可直接或間接地介導抗腫瘤效 應並且不必依賴整個宿主免疫系統。效應細胞的實例包括表達公開抗原 的T淋巴細胞(例如CD8+細胞毒性T-淋巴細胞、CD4+輔助T細胞、腫 瘤-浸潤性淋巴細胞)、殺傷細胞(例如自然殺傷細胞，淋巴因子激活 性殺傷細胞)、B細胞、或抗原提呈細胞(例如樹突狀細胞和巨噬細胞)。
專利號4，918，164)。
外生長。將單個抗原特異性的T細胞擴增到幾十億並保持其識別體內抗 原的培養條件為本領域所周知。這些體外培養條件一般使用抗原間歇刺 激，經常是在細胞因子，例如IL-2和非分化滋養細胞存在的情況下。如上 所述，此處描述的免疫反應性多肽可以用來快速地培養擴增抗原特異 性的T細胞以產生足量的免疫治療細胞。特別地，抗原提呈細胞、例如 樹突細胞巨噬細胞或B細胞，可使用本領域眾所周知的標準技術，由免 疫反應性多肽脈衝刺激或轉染核酸序列。例如抗原提呈細胞可轉染核 酸序列，該序列含有適於增加表達的啟動子區，可以表達為重組病毒或 其它表達系統的一部分。為培養有效治療用的T細胞，培養的T細胞必 須能夠生長、分布廣泛且能在體內長期存活。研究表明通過反覆用添加 IL-2的抗原刺激，可誘導培養T細胞在體內的生長並大量長期地存活(見例如Cheever M.等"Therapy With Cultured T Cells: Principles Revisited" immunological Reviews, 157 : 177,1997 )。
此處公開的多肽還可能用於產生和/或分離腫瘤反應性T細胞，以給 患者使用。在一種方法中，可通過用公開多肽的免疫原性部分相應的短 肽在體內免疫產生抗原特異性T細胞系。產生的抗原特異的CD8+CTL 克隆可從患者體內分離出來，用標準組織培養技術擴增並返回患者體 內。
或者，可使用本發明多肽免疫原性部分相應的肽，可產生腫瘤反應 性的T細胞亞群，通過選擇性體外刺激和自體T細胞擴增，提供抗原特 異性T細胞，隨後轉入患者體內，例如Chang等描述的(Crit. Rev. oncol. hemato， 22 ( 3 ) ， 213、 1996)。免疫系統細胞，例如T細胞，可使 用商業化細胞分離體系，例如CellPro 乂>司的(Bothell，Wash.) CEPRATE.tm.系統(見U.S.Pat.No. 5,240,856; U.S.Pat.No.5，215，926; WO89/06280; WO91/16116和WO92/07243)從患者外周血中分離。分離 的細胞用包含於栽體例如微球中的一種或多種免疫反應性多肽刺激，以 提供抗原特異性T細胞。然後使用標準技術擴增腫瘤抗原特異性T細胞 群，並將細胞返回給患者。
在另一個實施方案中，多肽特異性的T細胞和/或抗體受體可被克 隆、擴增，並轉入其它載體或效應細胞內用於過繼性免疫療法。
在另一個實施方案中，同源的或自體的樹突細胞可用相當於至少此 處公開多肽的免疫原性部分的肽進行脈衝刺激。產生的抗原特異性樹突 細胞可轉入患者體內，或用於刺激T細胞以提供抗原特異性T細胞，然 後給予患者。Cheever等闡述了在小鼠模型中，利用肽脈衝樹突細胞產 生抗原特異性T細胞，隨後用這種抗原特異性T細胞消除腫瘤(Cheever 等,Immunological Reviews，157:177，1997 )。
另外，可將表達公開的核酸的載體引入取自患者的幹細胞，在體外 克隆增殖後返回相同患者進行自體移植。
本發明單克隆抗體還可用作減少或消除腫瘤的治療性化合物。抗體 可獨自使用(例如抑制轉移性病灶)或與一種或多種治療劑一起使用。
27合適的治療劑包括放射性核素、分化誘導物、藥物、毒素和其衍生物。
優選的放射核素包括90Y、 1231、 1251、 1311、 186Re、 186Re，211At和 212Bi。優選的藥物包括氨甲蝶呤、嘧啶和嘌呤類似物。優選的分化誘 導物包括佛波醇酯和丁酸。優選的毒素包括蓖麻毒、相思豆毒素、白喉 毒素(diotheria toxin)、霍亂毒素、gelonin、假單胞菌外毒素、志賀 氏菌屬毒素和美洲商陸抗病毒蛋白。
此外治療與轉酮酶樣-l基因有關的病症的方法可以包含任何適於 在個體或個體細胞內降低轉酮酶樣-1多肽活性的方法。這些方法可以包 含通過降低基因表達或降低酶活性來降低轉酮酶樣-l多肽活性。實例可 包含給予反義構建體、核酶、酶抑制劑、給予轉酮酶樣-l多肽輔助因子 拮抗劑，例如抗硫胺素化合物，或減少酶活性必需輔助因子(如硫胺素) 的給予。
給予核酶或反義構建體的方法為本領域技術人員眾所周知，給予可 以釆用給予棵核酸或給予適於原位表達相應活性產物的核酸。
一個優選的實施方案中，治療與轉酮酶樣-l基因過表達有關的病症 包含給予抗硫胺素化合物，或減少特徵在於轉酮酶樣-l基因過表達的病 症的個體對硫胺素的攝取。
在另一實施方案中，本發明涉及鑑別和獲得治療結腸癌、胃癌、胰 腺癌或肺癌的候選藥物的方法，包括以下步驟在存在能夠提供響應轉 酮酶活性或細胞增殖調控的改變的可檢測信號組分時，接觸用於本發明 方法的TKT-L1多肽或表達該多肽的細胞；檢測由轉酮酶活性或細胞增 殖調控改變產生的信號的有無或增加，其中信號的缺失或減少為推定藥 物的指示。
候選藥物可以是單一化合物或多個化合物。本發明的方法中術語" 多個化合物"可理解為可能相同或不同多個物質。
樣品例如植物、動物或微生物中提取的細胞內。此外，所述化合物可能 為本領域已知的，但迄今不了解其能否抑制或激活TKT-L1多肽。反應 混合物可以是無細胞提取物或包含細胞或組織培養物。本發明方法適當
28的方法為本領域眾所周知，且通常在Albert等Nolecular Biology of the Cell,第三版(1994)及附錄實例中描述。多個化合物可能例如加入到 反應混合物、培養基中，注入到細胞中或應用到轉基因動物。可用於本 發明的方法的細胞或組織優選本發明實施方案描述的宿主細胞、哺乳動 物細胞或非人類轉基因動物。
如果本發明的方法中鑑定包含一種化合物或多個化合物的樣品，則 可能從確定含有能夠抑制或激活TKT-L1的化合物的原始樣品中分離 該化合物，或者將原始樣品再分離，例如如果樣品由多個不同的化合物 組成，以降低每個樣品中不同物質的數目，並重複該分離原始樣品的方 法。根據樣品複雜性，上述步驟可以進行多次，優選直至根據本發明方 法鑑定的樣品只包含限定數目的或唯一的物質為止。優選所述樣品包含 具有相似的化學和/或物理特性的物質，最優選所述物質相同。
根據本發明方法可以試驗和鑑定的化合物可以是肽、蛋白質、核酸、 抗體、小的有機化合物、激素、肽模擬物、PNAs等等。
用上述方法分離的化合物還可作為前導化合物(lead compound) 來研製類似物化合物。類似物有穩定的電子構型和分子構象，允許關鍵 的功能基團以同前導複合物基本相同的方式呈現於TKT-L1。具體的， 該類似物具有同結合區域相當的空間電子性質，但可以是比前導化合物 更小的分子，通常分子量低於大約2kD並且優選低於大約lkD。可以 通過使用例如self-consistent field (SCF)分析、構型相互作用(CI) 分析和正常方式的動態分析技術來鑑定類似物。可用電腦程式完成這 些分析；例如Rein的受體配體相互作用的計算機輔助模建(Alan Liss， 紐約，1989 )。化學衍生物和類似物的製備方法為本領域眾所周知，在 例如Beilstein的《有機化學手冊》，Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y 10010 U.S.A和《有機合成》，Wiley， New York, USA中也有描述。此外，上述衍生物和類似物可才艮據本領域已知 方法測定其效應(亦見上) 此外，例如根據上述方法，可使用肽模擬 物和/或計算機輔助設計的適當衍生物和類似物。
所述化合物一經鑑別和獲得，即優選以治療可用形式提供。本發明提供診斷和治療特徵為細胞增殖異常的病症(例如癌症)的 方法。本發明的一個方面提供基於生物樣品中人轉酮酶樣-l基因的有無 和/或其表達水平的測定的、特徵在於異常的細胞增殖的病症例如癌症 的檢測方法。本發明的第二個方面提供特徵在於異常的細胞增殖的病症 的治療方法，例如癌症，用人轉酮酶樣-l基因產物作為治療活性劑。本 發明還提供了基於降低轉酮酶樣-1基因多肽酶活性的治療方法。本發明 的一個方面是基於患者樣本中轉酮酶樣-1基因產物的檢測，提供合理的 腫瘤處置並定製相應於檢測到的基因產物過表達的治療方案的方法。此 外本發明提供研究或診斷用試劑盒，用於完成人轉酮酶樣-l基因的有無 和/或過表達水平檢測涉及的反應。最後本發明涉及用於根據本發明的 治 療病症的藥物組合物。
以下實施例的目的僅為說明而非限制此處公開的發明範圍。
實施例1 :測定結腸癌組織中人的轉酮酶樣-l mRNA水平。
通過原位染色反應，可半定量地分析腫瘤活檢解剖物中人的轉酮酶 樣-l基因mRNA的水平。染色反應如下進行
將組織解剖物在濃度遞增直到100%的乙醇中溫育。在乙醇揮發後 解剖物在lOmM檸檬酸鹽緩衝液(pH6，0)中煮沸以進行組織預處理。 將50 jil即用雜交緩衝液(DAKO A/S， Glostrup， Danmark )與約5-10 pmol的探針混合製備雜交混合物。探針為螢光標記的如下序列寡核苷 酸TCTCATCACAAGCAGCACAGGAC
雜交混合物加熱到95。C然後平衡到37。C。解剖標本煮沸後與50jil 雜交混合物一起在37。C溫育2小時。解剖物用過量洗滌緩衝液2xSSC 溶液在室溫下洗兩次各15分鐘，再用1 x SSC在50。C洗一次15分鐘。 然後解剖物在室溫下用2xSSC漂洗兩次。洗滌後解剖物和封閉緩衝液 (NEN， Blockingpugger ) —起在室溫溫育30分鐘。然後和1 : 100稀釋 (用封閉緩衝液，見上)的抗爽光素-AP (DAKO A/S) —起溫育1小 時。解剖物在室溫用lx PBS/0.1%Triton x 100洗滌兩次各10分鐘，再 用1 x PBS， 50 niM MgCl2 ( pH 9.2)在室溫洗一次10分鐘。
室溫下用NBT/BCIP(Sigma)進行染色反應大約30分鐘。染色反應通過與含l mM EDTA的PBS—起短暫溫育來終止。最後把解剖物浸 入H20dest中並用AquaTex (Merck)固定。染色的解剖物可進行顯微 分析。
結果顯示，與正常結腸組織相比，人的轉酮酶樣-l基因在結腸癌組 織中過表達。
實施例2.:用半定量RT- PCR方法測定癌組織和對照組織中人轉 酮酶樣-1基因和轉酮酶水平。
用半定量RT- PCR方法測定結腸癌樣品、肺腺癌樣品和胃癌樣品 中人轉酮酶樣-1 inRNA和人轉酮酶mRNA的水平。本研究使用肺瘤活 檢標本。
採集腫瘤、速凍並保存於-80'C。它們經組織病理學分析證實主要 由腫瘤細胞組成。用Qiagen試劑(Qiagen， Hilden， Germany)從患者 的腫瘤和相應正常組織中分離mRNA ，用 SuperscriptII ( Life Technologies，Inc )合成單鏈cDNA。定量PCR 4吏用7700序列測定儀 (TaqmanTM)和SYBR Green PCR Master - Mix,按廠家操作手冊 (Applied Biosystems， Foster City, CA )進行。
PCR反應的體積為25^1,每種引物的終濃度為300 nmol, 95°C 15 秒，60。C60秒，40個循環。下列引物用於定量PCR:
轉酮酶樣陽l:引物A : CACCTTGGGATTCTGTGTGC
引物B: TCTCATCACAAGCAGCACAG
轉酮酶 引物A: TGTGTCCAGTGCAGTAGTGG
引物B: ACACTTCATACCCGCCCTAG。
通過凝膠電泳(數據未列出)驗證PCR產物特異性。
結果顯示，同正常對照組織相比，人的轉酮酶樣-l基因在結腸癌中 有1/10、肺腺癌中有2/5和胃癌中有3/5高度過表達。
特別是轉酮酶樣-1基因在樣品中的過表達程度很顯著。合計6/20 的癌症中顯示TKT-L1基因8倍以上的過表達。相反沒有病例顯著地過 表達轉酮酶基因。
結果顯示，在不同來源的癌症亞型中轉酮酶樣-l基因都過表達。相反轉酮酶基因在試驗腫瘤組織中的表達沒有差異。
實施例3:免疫化學法檢測tktll在癌症樣品中的過表達
用針對tktll的抗體對福馬林固定、石蠟包埋的胃組織樣品切片 進行免疫細胞化學染色。
切片通過與二甲苯和分級的乙醇一起溫育再水合後轉移到Aqua bidest。用lOmM的檸檬酸鹽緩衝液(pH 6.0)進行抗原恢復。因此切 片在95。C水浴中加熱40分鐘，冷卻至室溫20分鐘，再轉到洗滌緩沖液 (PBS/0.1% T畫n20)中。
要滅活內源性過氧化物酶，樣品與3%的11202—起在室溫溫育10 分鐘，然後用PBS/0.1% Tween20洗10分鐘。
切片與初級抗體，即鼠抗tktll抗體(1 : 300 )在室溫下溫育1小 時，然後用洗滌緩沖液漂洗，再置於新鮮緩沖液浴中5分鐘。所用抗體 針對如圖7中粗體字所示的人tktll蛋白序列。
隨後切片與第二抗體即羊抗鼠(1 : 500 )抗體一起於室溫溫育1小 時。洗3次，每次5分鐘。切片用200^1的生色底物溶液(DAB)覆蓋 IO分鐘。然後切片用如前所述的方法漂洗，再在蘇木精中復染2分鐘， 用蒸餾水漂洗殘留的蘇木精，固定標本並用液態的封固劑封蓋。
切片顯微檢查顯示，經顯微鑑定為胃癌的樣品中可發現tktll免疫 反應性細胞。在癌症細胞核和細胞質中可見tktll特異染色。此外在腫 瘤細胞中可觀察到顆粒狀染色形式。
還將上述免疫組化染色方法用在來自乳腺癌、肺癌、子宮頸癌 (CINIII)、胃癌、食道癌、子宮內膜癌和卵巢癌的組織上。在所有這 些實例中，均可以〗現察到癌細胞中核和細胞質的tktll染色。
此外，用上述免疫化學的方法分析了結腸直腸癌到肝內的轉移性病 灶。結果表明tktll蛋白有很強的過表達。
3權利要求
1.一種檢測個體中特徵在於異常的細胞增殖的病症的方法，包括a.對從所述個體獲得的生物樣品中人轉酮酶樣-1基因表達的有無和/或表達水平進行檢測；b.從所述的表達有無和/或表達水平進行診斷評價，其中過表達是特徵在於異常的細胞增殖的病症的指徵。
2. 根據權利要求1的方法，其中特徵在於異常的細胞增殖的病症為癌症。
3. 根據權利要求2的方法，其中癌症為結腸癌、肺癌、胃癌或胰腺癌。
4. 根據權利要求l-3任一項的方法，其中生物樣品為體液、分泌物、 塗片、活組織檢查、含有細胞、裂解細胞、細胞碎片、肽或核酸的液體。
5. 根據權利要求4的方法，其中的樣品為血清、尿、精液、大便、 膽汁、活組織檢查或細胞樣品或組織樣品。
6. 根據權利要求l-5任一項的方法，其中人轉酮酶樣-l基因表達的 檢測在多肽水平上進行。
7. 根據權利要求1-5任一項的方法，其中人轉酮酶樣-1基因表達的 檢測在核酸水平上進行。
8. 根據權利要求6的方法，其中使用針對人轉酮酶樣-1多肽的結合 劑進行多肽水平上的檢測。
9. 根據權利要求8的方法，其中所述的結合劑是抗體、抗體片段、 包含抗原結合表位的肽模擬物或微小抗體。
10. 根據權利要求6、 8或9任一項的方法，其中檢測是指免疫細胞 化學檢測方法。
11. 根據權利要求7的方法，其中至少 一種與人轉酮酶樣-1核酸雜交 的核酸探針用於檢測。
12. 根據權利要求11的方法，其中探針是可檢測標記的。
13.根據權利要求12的方法，其中標記選自放射性同位素、生物發光化合物、化學發光化合物、螢光化合物、金屬螯合物或酶。
14. 根據權利要求7或11-13任一項的方法，其中檢測反應包括核酸擴增反應。
15. 根據權利要求11-13任一項的方法，其中擴增反應是PCR、 LCR 或NASBA。
16. 根據權利要求7或11-13任一項的方法，該方法用於原位雜交。
17. 根據前面權利要求中任一項的方法，該方法用於體內或體外分子 成像方法過程中。
18. —種試劑盒，用於完成權利要求1-17中任一項的方法，該試劑 盒是研究試劑盒或診斷試劑盒。
19. 權利要求18中的試劑盒，包含a.至少一種用於檢測生物樣品中 人轉酮酶樣-1基因表達產物的探針；b.用作陽性對照反應的人轉酮酶樣 -l基因產物樣品。
20. 權利要求19中的試劑盒，其中探針是一種核酸探針，與人轉酮 酶樣-l核酸特異性雜交；或是一種抗體，與人轉酮酶樣-l蛋白特異性結 合。
21. —種治療特徵在於異常的細胞增殖的病症的方法，該方法基於給 予呈藥物可接受形式的含有人轉酮酶樣-1基因或基因產物的藥物組合 物。
22. 根據權利要求21的方法，其中人轉酮酶樣-1基因或基因產物是 核酸的有義鏈或反義鏈或多肽。
23. 根據權利要求22的方法，其中藥物組合物包含含有人轉酮酶樣 -1核酸或其片段的嵌合核酸，或含有人轉酮酶樣-1多肽或其片段的融合 多肽。
24. 根據權利要求21-23任一項的方法，其中特徵在於異常的細胞增 殖的病症為癌症。
25. 根據權利要求24的方法，其中的癌症是結腸癌、肺癌、胃癌或 胰腺癌。
26. 根據權利要求21-25任一項的方法，其中治療方法為免疫治療。
27. 根據權利要求21-26任一項的方法，其中治療方法為疫苗接種治療。
28. 人轉酮酶樣-1多肽或人轉酮酶樣-1核酸用於製備治療癌症的藥 物組合物的用途。
29. —種鑑別和獲得用於結腸腫瘤、肺腫瘤、胰腺腫瘤或胃腫瘤治療 的候選藥物的方法，包括以下步驟a.在能夠提供響應轉酮酶活性或細 胞增殖調控的改變的可檢測信號的組分存在下，接觸用於本發明方法的 TKT-L1多肽或表達上述多肽的細胞；和b，檢測由轉酮酶活性或細胞增 殖調控改變產生的信號的有無或增加，其中信號的缺失或減少指示為推 定藥物。
30. —種治療結腸腫瘤、肺腫瘤、胰腺腫瘤或胃腫瘤的藥物組合物， 包含根據權利要求29的方法可鑑別的化合物、抗硫胺素化合物、轉酮 酶活性抑制劑、轉酮酶樣-1活性抑制劑、轉酮酶樣-1多肽或人轉酮酶樣 -1核酸。
31. —種合理的腫瘤處理方法，包括a.檢測生物樣品中轉酮酶樣-l 基因的有無和/或過表達的水平，b.根據轉酮酶樣-l基因的有無和/或水 平建立亞群，c.根據亞群定製一種合適的療法，包括降低個體或個體細 胞中轉酮酶樣-1的活性。
32. 根據權利要求31的方法，其中可以通過給予抗硫胺素化合物、 權利要求31的藥物組合物、轉酮酶酶活性抑制劑、轉酮酶樣-l反義核 酸構建物、轉酮酶樣-1特異性核酶，或通過減少硫胺素的給予，實現轉 酮酶樣-1活性的降低.
33. 根據權利要求30的藥物組合物，用於根據權利要求31或32的 方法中。
全文摘要
本發明涉及治療和診斷與異常增殖細胞有關的病症的方法。一方面本發明涉及方法，根據生物樣品中人轉酮酶樣-1基因過表達的檢測，該方法特別用於腫瘤及其前兆期的診斷。另一方面本發明涉及用於治療與人轉酮酶樣-1基因過表達有關的病症的方法。治療方法可包括基因治療方法和抑制或降低轉酮酶樣-1多肽活性方法。
文檔編號G01N21/78GK101684499SQ20091016747
公開日2010年3月31日 申請日期2003年4月12日 優先權日2002年4月19日
發明者約翰內斯·科伊 申請人:約翰內斯·科伊