包含三聚體TNF家族配體的抗原結合分子的製作方法

2023-06-09 05:02:21 3

發明領域本發明涉及新的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，(b)包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域。本發明進一步涉及產生這些分子的方法和使用它們的方法。發明背景與tnf(腫瘤壞死因子)受體超家族分子相互作用的配體在免疫系統的組織和功能中具有關鍵作用。在調節正常功能如免疫應答，造血和形態發生的同時，tnf家族配體(也稱為細胞因子)在腫瘤發生，移植排斥，膿毒性休克，病毒複製，骨吸收，類風溼性關節炎和糖尿病中起作用(aggarwal，2003)。它們在免疫中的多樣且重要的作用使得它們對於癌症免疫治療劑的開發而言是感興趣的(bremer，2013)。tnf配體家族包括編碼19個ii型(即細胞內n末端和細胞外c末端)跨膜蛋白的18個基因，其特徵在於構成「tnf同源域」(thd)的保守c末端域的存在。這個域負責受體結合，因此對tnf配體家族成員的生物活性至關重要。家族成員之間的序列同一性約為20％-30％(bodmer，2002)。tnf配體家族的成員以自組裝非共價三聚體的形式而發揮其生物學功能(banner等人，1993)。因此，tnf家族配體形成能夠結合併激活tnfr超家族的相應受體的三聚體。tnf配體家族的一些成員對t細胞具有共刺激效果，這意味著它們在初始t細胞活化之後維持t細胞應答(watts，2005)。4-1bbl，ox40l，gitrl，cd70，cd30l和light屬於這組共刺激tnf家族配體。在數種共刺激分子中，腫瘤壞死因子(tnf)受體家族成員ox40(cd134)在效應和記憶t細胞的存活和穩態中發揮關鍵作用(croft等人，2009)。ox40(cd134)調節針對感染，腫瘤和自身抗原的免疫應答，而且已經證明它在t細胞，nkt細胞和nk細胞以及嗜中性粒細胞的表面上的表達(baumann等人，2004)且顯示出響應多種刺激信號而嚴格可誘導地或強烈地上調。與t細胞受體觸發組合，t細胞上由其天然配體或激動性抗體實現的ox40嚙合引起pi3k和nfκb信號傳導途徑的協同激活(song等人，2008)。繼而，這對活化的t細胞導致增強的增殖，升高的細胞因子受體和細胞因子生成及更好的存活。tnf受體超家族成員4-1bb(cd137)首先被鑑定為其表達經由t細胞活化誘導的分子(kwon和weissman，1989)。隨後的研究證實4-1bb在t和b淋巴細胞(snell等人，2011；zhang等人，2010)，nk細胞(lin等人，2008)，nkt細胞(kim等人)，單核細胞(kienzle和vonkempis，2000；schwarz等人，1995)，嗜中性粒細胞(heinisch等人，2000)，肥大細胞(nishimoto等人，2005)和樹突細胞以及非造血來源的細胞如內皮細胞和平滑肌細胞(broll等人，2001；olofsson等人，2008)中表達。4-1bb在不同細胞類型中的表達大多可由各種刺激信號誘導和驅動，例如t細胞受體(tcr)或b細胞受體觸發，以及通過共刺激分子或促炎細胞因子的受體誘導的信號轉導(diehl等人，2002；vonkempis等人，1997；zhang等人，2010)。4-1bb配體(4-1bbl或cd137l)的表達受到更多限制，在專職抗原呈遞細胞(apc)如b細胞，樹突細胞(dc)和巨噬細胞上觀察到表達。4-1bbl的誘導表達對於包括αβ和γδt細胞亞群在內的t細胞以及內皮細胞是特徵性的(shao和schwarz綜述，2011)。已知cd137信號轉導刺激nk細胞的ifnγ分泌和增殖(buechele等人，2012；lin等人，2008；melero等人，1998)以及促進dc活化(表現為其存活和分泌細胞因子的能力增加)，並上調共刺激分子(choi等人，2009；futagawa等人，2002；wilcox等人，2002)。然而，cd137最好被表徵為調節t細胞的cd4+和cd8+亞群的tcr誘導性活化的共刺激分子。與tcr觸發聯合，激動性4-1bb特異性抗體增強t細胞的增殖，刺激淋巴因子分泌並降低t淋巴細胞對活化誘導的細胞死亡的敏感性(snell等人綜述，2011)。與4-1bb抗體對體外t細胞的這些共刺激效應一致，在許多實驗性腫瘤模型中將其施用於荷瘤小鼠導致有效的抗腫瘤作用(melero等人，1997；narazaki等人，2010)。然而，4-1bb通常僅在與其他免疫調節化合物(curran等人，2011；guo等人，2013；morales-kastresana等人，2013；teng等人，2009年；wei等人，2013)，化療藥物(ju等人，2008；kim等人，2009)，腫瘤特異性疫苗接種(cuadros等人，2005；lee等人，2011)，或放射治療(shi和siemann，2006)聯合給予時才顯示其作為抗腫瘤劑的效力。體內消耗實驗證明，cd8+t細胞在4-1bb特異性抗體的抗腫瘤作用中起最關鍵的作用。然而，取決於腫瘤模型或包括抗4-1bb的聯合療法，已經報導了其他類型的細胞如dc，nk細胞或cd4+t細胞的作用(melero等人，1997；murillo等人，2009；narazaki等人，2010；stagg等人，2011)。除了4-1bb激動劑對不同淋巴細胞亞群的直接作用之外，通過4-1bb介導的細胞間粘附分子1(icam1)和腫瘤血管內皮上的血管細胞粘附分子1(vcam1)的上調，4-1bb激動劑還可以誘導腫瘤中活化t細胞的浸潤和保留(palazon等人，2011)。4-1bb觸發還可以逆轉由暴露於可溶性抗原誘導的t細胞無反應性的狀態，其可能有助於破壞腫瘤微環境中或慢性感染期間的免疫耐受性(wilcox等人，2004)。似乎4-1bb激動性抗體在體內的免疫調節特性需要在抗體分子上野生型fc部分的存在，從而提示fc-受體結合為此類試劑的藥理學活性所需的重要事件，所述試劑被描述為對tnfr超家族的其他的細胞凋亡誘導或免疫調節成員特異的激動性抗體(li和ravetch，2011；teng等人，2009)。然而，在小鼠中，具有功能活性fc域的4-1bb特異性激動性抗體的全身給藥也誘導了與肝毒性相關的cd8+t細胞擴增(dubrot等人，2010)，在不存在功能性fc受體的情況下，肝毒性減弱或顯著減輕。在人類臨床試驗(clinicaltrials.gov,nct00309023)中，每三周施用一次的有fc活性的4-1bb激動性抗體(bms-663513)持續12周誘導了黑素瘤，卵巢癌或腎細胞癌患者的病情穩定。然而，在另一項試驗(nct00612664)中給予的相同抗體引起4級肝炎，導致試驗終止(simeone和ascierto，2012)。總的來說，可用的臨床前和臨床數據清楚地表明，有效的4-1bb激動劑的臨床需求很高。然而，新一代候選藥物不僅會有效地使4-1bb接合在造血細胞和內皮細胞的表面上，而且還能通過除了與fc受體結合之外的機制來實現這種接合，以避免不可控制的副作用。後者可以通過對腫瘤特異性或腫瘤相關模塊的優先結合和寡聚化來實現。已經製造了由4-1bb配體的一個細胞外域和單鏈抗體片段(mueller等人，2008；hornig等人，2012；kermer等人，2014)或與重鏈c末端(zhang等，2007)融合的單個4-1bb配體組成的融合蛋白。ep1736482a1涉及包含天然4-1bbl的整個胞外域和可交聯肽域的重組4-1bbl多肽。wo2010/010051公開了由彼此連接並與抗體模塊融合的三個tnf配體胞外域組成的融合蛋白的產生。然而，需要新的抗原結合分子，其將能夠優選地與腫瘤特異性或腫瘤相關靶標結合的模塊與能夠形成共刺激的tnf家族配體三聚體的模塊組合，並且擁有足夠的藥學上有用的穩定性。本發明的抗原結合分子包含這兩者，並且因此可能能夠不僅有效觸發tnf受體，而且非常選擇性地在期望部位觸發tnf受體，由此減輕副作用。發明概述本發明提供了含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，(b)包含三個(任選通過肽接頭)彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域。在一個方面，本發明提供了含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，(b)包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域。在另一個方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，(b)包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域，其中該包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽融合至該fc域的兩個亞基之一的n或c端胺基酸，任選經由肽接頭。在一個特定方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，(b)包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域，其中該tnf配體家族成員共刺激人t細胞活化。因此，該tnf配體家族成員是共刺激性tnf家族配體。具體地說，該共刺激性tnf家族配體選自4-1bbl，ox40l，gitrl，cd70，cd30l和light，更具體地說，該共刺激性tnf家族配體選自4-1bbl和ox40l。在一個方面，該tnf配體家族成員是4-1bbl。在一個另外的方面，該tnf配體家族成員的胞外域包含選自seqidno:1，seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:99，seqidno:100，seqidno:101和seqidno:102的胺基酸序列，特別是seqidno:1或seqidno:99的胺基酸序列。在一個特定方面，tnf配體家族成員的胞外域或其片段包含選自seqidno:1，seqidno:2，seqidno:3，和seqidno:4的胺基酸序列，特別是seqidno:1的胺基酸序列。在又一個方面，本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，和(b)包含seqidno:5或seqidno:103的胺基酸序列的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域。更具體地說，該多肽包含seqidno:5的胺基酸序列。在另一個方面，該tnf配體家族成員是ox40l。在一個特定方面，該tnf配體家族成員的胞外域包含選自seqidno:6和seqidno:7的胺基酸序列，特別是seqidno:6的胺基酸序列。在又一個方面，本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，和(b)包含seqidno:8的胺基酸序列的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域。在一個方面，本發明涉及如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該包含三個tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽在c端胺基酸處融合至該fc域的亞基之一的n端胺基酸。具體地說，提供了含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，(b)包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域，其中該包含三個tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽在c端胺基酸處融合至該fc域中的ch2域的n端胺基酸。在另一個方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子是如下的，其中該包含三個tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽在n端胺基酸處融合至該fc域的亞基之一的c端胺基酸，例如該包含三個tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽在n端胺基酸處融合至該fc域中的ch3域的c端胺基酸。在另一個方面，本發明涉及含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，(b)包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域，其中該能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊沒有融合至該包含三個tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽。在一個另外的方面，本發明提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊選自抗體，抗體片段和支架抗原結合蛋白。在一個方面，本發明提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊是抗體。在另一個方面，本發明提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊是抗體片段。具體地說，抗體片段選自fab分子，交換fab分子，單鏈fab分子，fv分子，scfv分子，單域抗體，和vh。在又一個方面，本發明提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊是支架抗原結合蛋白。如此，在又一個方面，本發明涉及如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊選自抗體片段，fab分子，交換fab分子，單鏈fab分子，fv分子，scfv分子，單域抗體，vh和支架抗原結合蛋白。在一個特定方面，本發明與如上定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子有關，其中能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊是能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子。在另一個方面，提供了本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中靶細胞抗原選自成纖維細胞激活蛋白(fap)，癌胚抗原(cea)，黑素瘤關聯硫酸軟骨素蛋白聚糖(mcsp)，表皮生長因子受體(egfr)，cd19，cd20和cd33。在一個特定方面，靶細胞抗原是成纖維細胞激活蛋白(fap)。在一個方面，本發明提供了如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該能夠特異性結合fap的模塊包含vh域和vl域，(a)該vh域包含(i)包含seqidno:9的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:10的胺基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:11的胺基酸序列的cdr-h3，該vl域包含(iv)包含seqidno:12的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:13的胺基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:14的胺基酸序列的cdr-l3；或(b)該vh域包含(i)包含seqidno:104的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:105的胺基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:106的胺基酸序列的cdr-h3，該vl域包含(iv)包含seqidno:107的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:108的胺基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:109的胺基酸序列的cdr-l3。在一個方面，該能夠特異性結合fap的模塊包含vh域和vl域，該vh域包含(i)包含seqidno:9的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:10的胺基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:11的胺基酸序列的cdr-h3，該vl域包含(iv)包含seqidno:12的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:13的胺基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:14的胺基酸序列的cdr-l3。在另一個特定的方面，該能夠特異性結合fap的模塊包含vh域和vl域，該vh域包含(i)包含seqidno:104的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:105的胺基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:106的胺基酸序列的cdr-h3，該vl域包含(iv)包含seqidno:107的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:108的胺基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:109的胺基酸序列的cdr-l3。在又一個方面，能夠特異性結合fap的模塊包含包括seqidno:16的胺基酸序列的可變重鏈和包括seqidno:17的胺基酸序列的可變輕鏈，或其中能夠特異性結合fap的模塊包含包括seqidno:110的胺基酸序列的可變重鏈和包括seqidno:111的胺基酸序列的可變輕鏈。在另一個方面，靶細胞抗原是cea。在一個方面，本發明提供了如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該能夠特異性結合cea的模塊包含vh域和vl域，該vh域包含(i)包含seqidno:112的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:113的胺基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:114的胺基酸序列的cdr-h3，該vl域包含(iv)包含seqidno:115的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:116的胺基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:117的胺基酸序列的cdr-l3。具體地說，能夠特異性結合cea的模塊包含包括seqidno:118的胺基酸序列的可變重鏈和包括seqidno:119的胺基酸序列的可變輕鏈。在還有另一個方面，該靶細胞抗原是cd19。在一個方面，本發明提供了如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該能夠特異性結合cd9的模塊包含vh域和vl域，(a)該vh域包含(i)包含seqidno:120的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:121的胺基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:122的胺基酸序列的cdr-h3，該vl域包含(iv)包含seqidno:123的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:124的胺基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:125的胺基酸序列的cdr-l3；或(b)該vh域包含(i)包含seqidno:128的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:129的胺基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:130的胺基酸序列的cdr-h3，該vl域包含(iv)包含seqidno:131的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:132的胺基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:133的胺基酸序列的cdr-l3。具體地說，該能夠特異性結合cd19的模塊包含包含seqidno:126的胺基酸序列的可變重鏈和包含seqidno:127的胺基酸序列的可變輕鏈，或者其中該能夠特異性結合fap的模塊包含包含seqidno:134的胺基酸序列的可變重鏈和包含seqidno:135的胺基酸序列的可變輕鏈。在又一個方面，提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域是igg，特別是igg1fc域或igg4fc域。具體地說，該由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域是igg1fc域。在另一個方面，本發明涉及如前文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域，其中fc域包含一個或多個降低與fc受體尤其是fcγ受體結合的胺基酸替代。具體地說，fc域包含在位置234和235(eu編號方式)和/或329(eu編號方式)處的胺基酸替代。更具體地說，提供了根據本發明的含有三聚體tnf家族配體的抗原結合分子，其包含具有igg重鏈中的胺基酸替代l234a，l235a和p329g(eu編號方式)的fc域。在一個特定方面，本發明提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該fc域是igg1fc域且包含在igg重鏈的位置234和235(eu編號方式)和329(eu編號方式)處的胺基酸替代。在另一個方面，提供了單價的如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊。具體地說，本發明的包含(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子進一步包含(a)能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子，其中fab重鏈在c端處融合至該fc域中的ch2域的n端。而且，本發明提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(a)重鏈和輕鏈，二者構成能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子，和(b)融合蛋白，其包含seqidno:15的胺基酸序列。在另一個方面，提供了如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(a)重鏈和輕鏈，二者構成能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子，和(b)融合蛋白，其包含seqidno:20的胺基酸序列。在又一個方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子的vh域，(ii)輕鏈，其包含能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。在一個特定方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含包含seqidno:16的胺基酸序列的vh域或包含seqidno:110的胺基酸序列的vh域，(ii)輕鏈，其包含包含seqidno:17的胺基酸序列的vl域或包含seqidno:111的胺基酸序列的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。在另一個方面，含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含包含seqidno:118的胺基酸序列的vh域，(ii)輕鏈，其包含包含seqidno:119的胺基酸序列的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。在又一個方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含包含seqidno:126的胺基酸序列的vh域或包含seqidno:134的胺基酸序列的vh域，(ii)輕鏈，其包含包含seqidno:127的胺基酸序列的vl域或包含seqidno:135的胺基酸序列的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。在另一個方面，提供了二價的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含兩個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊。在一個方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子的vh域，(ii)兩條輕鏈，各自包含能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子的vh域和seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。在一個特定方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含包含seqidno:16的胺基酸序列的vh域或包含seqidno:110的胺基酸序列的vh域，(ii)兩條輕鏈，各自包含包含seqidno:17的胺基酸序列的vl域或包含seqidno:111的胺基酸序列的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含包含seqidno:16的胺基酸序列的vh域或包含seqidno:110的胺基酸序列的vh域和seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。在另一個方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含包含seqidno:118的胺基酸序列的vh域，(ii)兩條輕鏈，各自包含包含seqidno:119的胺基酸序列的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含包含seqidno:118的胺基酸序列的vh域和seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。在還有另一個方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含包含seqidno:126的胺基酸序列的vh域或包含seqidno:134的胺基酸序列的vh域，(ii)兩條輕鏈，其包含包含seqidno:127的胺基酸序列的vl域或包含seqidno:135的胺基酸序列的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含包含seqidno:126的胺基酸序列的vh域或包含seqidno:134的胺基酸序列的vh域和seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。在一個特定方面，提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)可變重鏈，其包含seqidno:16的胺基酸序列，(ii)可變輕鏈，其包含seqidno:17的胺基酸序列，和(iii)多肽，其包含seqidno:5的胺基酸序列。更加具體地說，提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)重鏈，其包含seqidno:18的胺基酸序列，(ii)輕鏈，其包含seqidno:19的胺基酸序列，和(iii)融合蛋白，其包含seqidno:15的胺基酸序列。在一個特定方面，提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)可變重鏈，其包含seqidno:16的胺基酸序列，(ii)可變輕鏈，其包含seqidno:17的胺基酸序列，和(iii)多肽，其包含seqidno:8的胺基酸序列。更加具體地說，提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)重鏈，其包含seqidno:18的胺基酸序列，(ii)輕鏈，其包含seqidno:19的胺基酸序列，和(iii)融合蛋白，其包含seqidno:20的胺基酸序列。根據本發明的另一個方面，提供了編碼如前文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的分離的多核苷酸。本發明進一步提供了包含本發明的分離的多核苷酸的載體，尤其是表達載體，和包含本發明的分離的多核苷酸或載體的宿主細胞。在一些實施方案中，宿主細胞是真核細胞，尤其是哺乳動物細胞。在另一個方面，提供了產生本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的方法，該方法包括以下步驟：(i)在適合於表達該抗原結合分子的條件下培養本發明的宿主細胞，以及(ii)回收抗原結合分子。本發明還涵蓋通過本發明的方法產生的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子。本發明進一步提供了包含本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子和至少一種藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物。本發明還涵蓋用作藥劑的本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，或本發明的藥物組合物。在一個方面，提供了用於治療有需要的個體中的疾病的本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，或本發明的藥物組合物。在具體的實施方案中，提供了用於治療癌症的本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，或本發明的藥物組合物。還提供了本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子在製造用於治療有需要的個體中的疾病的藥劑尤其是製造用於治療癌症的藥劑中的用途，以及治療個體疾病的方法，所述方法包括向所述個體施用治療有效量的藥學上可接受的形式的包含本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的組合物。在具體的實施方案中，該疾病是癌症。在任何上述實施方案中，個體優選為哺乳動物，尤其是人。附圖簡述圖1a和1b顯示了包含通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的三個胞外結構域或其片段的多肽。圖(1a)顯示了包含通過肽接頭彼此連接的4-1bbl的三個胞外結構域的多肽，圖(1b)顯示了包含通過肽接頭彼此連接的ox40l的三個胞外結構域的多肽。圖2a和2b示意性地示出了本發明的單價的含有tnf配體三聚體的抗原結合分子的變體(2a)和(2b)。三個tnf配體以具有白點的灰色區域表示。具有黑點的白色區域表示fc部分，粗黑點代表節入穴(knob-into-hole)修飾。本發明的含有tnf配體三聚體的抗原結合分子的代表性實例是如圖3a所示的fap靶向的三聚體4-1bb配體fc(kih)p329glala融合抗原結合分子。其製備描述於實施例1.1和1.3中。圖3b顯示了包含dp47fab分子和實施例2中製備的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)p329glala融合抗原結合分子的「非靶向」變體(對照1)。圖3c是實施例4中製備的單體4-1bbfc(kih)構建體的圖。本發明的含有tnf配體三聚體的抗原結合分子的另一個實例是如圖4a所示的fap靶向的三聚體ox40配體fc(kih)p329glala融合抗原結合分子。其製備描述於實施例6中。圖4b顯示了包含dp47fab分子和實施例7中製備的單鏈三聚體ox40配體fc(kih)p329glala融合分子的「非靶向」變體。圖4c是實施例8中製備的單體ox40fc(kih)構建體的圖。圖5顯示了通過表面等離子體共振評定的fap靶向的含有4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合分子(化合物s1)與重組4-1bbfc(kih)受體的結合。在圖5a中，顯示了測定的設置，4-1bbfc(kih)被固定在sa晶片上。圖5b顯示了與人4-1bbfc(kih)的結合，圖5c為與食蟹猴4-1bbfc(kih)的結合，圖5d為與鼠4-1bbfc(kih)的結合。含有dp47的含有4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(對照1)與重組4-1bbfckih受體的結合如圖6所示。4-1bbfc(kih)被固定在sa晶片上。圖6a顯示了與人4-1bbfc(kih)的結合，圖6b為與食蟹猴4-1bbfc(kih)的結合，圖6c為與鼠4-1bbfc(kih)的結合。圖7展示了重組人4-1bb與fap靶向的含有4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s1)的結合。在圖7a中示出了親合力測量的設置。圖7b和7c顯示了人4-1bbavi-his標籤與fap靶向的含有4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(fap靶向的單鏈三聚體4-1bbl)的結合，圖7d和7e顯示人4-1bbavi-his標籤與含有dp47的含有4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(含有dp47的單鏈三聚體4-1bbl分子)的結合。圖8顯示了通過表面等離子體共振評定的fap靶向的含有ox40配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s10)與重組ox40fc(kih)受體的結合。在圖8a中，顯示了測定的設置，ox40fc(kih)被固定在sa晶片上。圖8b顯示了與人ox40fc(kih)的結合，圖8c為與食蟹猴ox40fc(kih)的結合，圖8d為與鼠ox40fc(kih)的結合。在圖9中，證明了含有dp47的含有ox40配體三聚體的fc(kih)融合分子(對照3)與重組ox40fckih受體的結合。ox40fc(kih)被固定在sa晶片上。圖9a顯示了與人ox40fc(kih)的結合，圖9b為與食蟹猴ox40fc(kih)的結合，圖9c為與鼠ox40fc(kih)的結合。圖10顯示了重組人ox40與fap靶向的含有ox40配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s10)的結合。在圖10a中示出了親合力測量的設置。在圖10b中，顯示了人ox40avi-his標籤與fap靶向的含有ox40配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(fap靶向的單鏈ox40配體)的結合，圖10c展示了人4-1bbavi-his標籤與含有dp47的含有ox40配體三聚體的fc(kih)融合分子(含有dp47的單鏈三聚體ox40l)的結合。4-1bb和ox40在靜息(幼稚)的人pbmc上不表達(圖11a、11c、11e和11g，圖12a和12c)。人pbmc激活後，4-1bb和ox40在cd4+和cd8+t細胞上被上調，而人cd8+t細胞顯示的4-1bb上調高10倍(圖11b、11f、11k和11m以及12b)，但是比cd4+t細胞上的ox40上調低4倍(圖11d、11h、11j和11l以及12d)。如所示，fap靶向的單鏈三聚體4-1bbl或ox40lfc(kih)融合抗原結合分子(實心圓)和含有dp47的(「非靶向的」)單鏈三聚體4-1bbl和ox40l(空心圓，虛線)顯示出相似的與活化cd4+和cd8+t細胞的結合，但不與幼稚的人t細胞結合。因此，與fap結合或dp47結合無關，單鏈三聚體4-1bbl和單鏈三聚體ox40l兩者都顯示出相似的與表達人4-1bb或ox40的細胞的結合。在沒有表達表達人4-1bb或ox40的細胞的情況下，未能觀察到結合(靜息的幼稚細胞)。結合被顯示為用作第二檢測抗體的紅色大型藻類藻紅蛋白(r-pe)或異硫氰酸螢光素(fitc)綴合的抗人iggfcγ特異性山羊iggf(ab』)2片段的螢光強度中位值(mfi)。通過流式細胞術測量mfi，並通過減去空白對照的mfi來校正基線。x軸顯示含fap或dp47的單鏈三聚體4-1bbl或ox40lfc(kih)融合分子的濃度。圖11a至11d涉及fap靶向的含有4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s1，實心圓)或含有dp47的含有4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合分子(對照1，空心圓)與靜息(幼稚)或活化的人pmbc的結合。具體地說，分別在上部兩個圖中顯示與靜息(幼稚)或活化的人cd8+t細胞的結合，在下部兩個圖中顯示與靜止(幼稚)或活化的人cd4+t細胞的結合。圖11e至11h顯示了單價靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合抗原結合分子與靜息和活化的人t細胞的結合。4-1bb在從健康供體的血液分離的靜息(幼稚)cd4或cd8t細胞上不表達。激活後，4-1bb在cd4+(見右下圖)和cd8+(見右上圖)t細胞上被上調，而cd8+t細胞顯示的4-1bb表達比cd4+t細胞高5-10倍(取決於供體)。如所示，所有單價靶向的單鏈三聚體4-1bblfc(kih)融合分子都與4-1bb+人t細胞的結合相似，與它們的靶向無關。在y軸上顯示了r-pe綴合的抗人iggfcγ片段特異性f(ab')2山羊igg片段的平均螢光強度(mfi)。在x軸上指示了不同的靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s1、s3和s5)的測試濃度。通過減去空白對照的mfi將這些值進行基線校正。在圖11j至11m中，顯示了單價與二價靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合抗原結合分子與活化人t細胞的結合。激活後，4-1bb在cd4+(左手側)和cd8+(右手側)t細胞上被上調。如所示，所有單價與二價靶向的單鏈三聚體4-1bblfc(kih)融合抗原結合分子都與4-1bb+人t細胞的結合相似，與它們的靶向無關。在y軸上顯示了r-pe綴合的抗人iggfcγ片段特異性f(ab')2山羊igg片段的平均螢光強度(mfi)。在x軸上指示了不同的靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s1、s3、s2和s4)的測試濃度。通過減去空白對照的mfi將這些值進行基線校正。圖12a至12d顯示了fap靶向的含有ox40配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s10，實心圓)或含有dp47的含有ox40配體三聚體的fc(kih)融合分子(dp47單鏈ox40l三聚體，對照3，空心圓)與靜息(幼稚)或活化的人pmbc的結合。具體地說，分別在圖12a和12b中顯示與靜息(幼稚)或活化的人cd8+t細胞的結合，分別在圖12c和12d中顯示與靜止(幼稚)或活化的人cd4+t細胞的結合。dp47人igg1p329glala的結合以實心菱形(陰性對照)表示。圖13顯示了含有單鏈tnf配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(分別為化合物s1和s10)與轉基因修飾的小鼠胚胎成纖維細胞nih/3t3-hufap克隆39(圖13a)或與表達成纖維細胞激活蛋白(fap)的人wm266-4細胞系(圖13b)的結合。這些細胞表達高水平的人成纖維細胞激活蛋白(hufap)。結合被顯示為用作第二檢測抗體的異硫氰酸螢光素(fitc)標記的抗人iggfcγ特異性山羊iggf(ab`)2片段的螢光強度中位值(mfi)。通過流式細胞術測定mfi。x軸顯示fap靶向的或dp47靶向的(「非靶向的」)的單鏈三聚體4-1bbl或ox40l抗原結合分子的濃度。在圖13a中顯示，僅fap靶向的單鏈三聚體4-1bbl分子(化合物s1，實心圓)而不是含有dp47的單鏈三聚體4-1bbl抗原結合分子(空心圓，虛線)與nih/3t3-hufap克隆39細胞結合，圖13b顯示僅fap靶向的單鏈三聚體ox40l抗原結合分子(化合物s10，實心圓)而不是含有dp47的單鏈三聚體ox40抗原結合分子(空心圓，虛線)與wm266-4細胞結合。作為陰性對照，由實心菱形表示的dp47人igg1p329glala也沒有結合。在圖13c和13d中，顯示了單價與二價fap(4b9或28h1)靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合抗原結合分子與表達fap的腫瘤細胞的結合。如所示，fap(4b9)靶向的分子顯示最強的與fap的結合，具有更低的ec50值。使用強fap(4b9)結合劑，我們看到在單價與二價靶向的單鏈三聚體4-1bb配體(kih)融合抗原分子(分別為化合物s3和s2)之間的mfi或ec50僅有非常小的差異。對於較弱的fap結合劑28h1(化合物s1)，這是不同的。這裡，二價結合(顯示為二價結合的fap(28h1)靶向的huigg1p329glala)產生較低的mfi。dp47非靶向的分子不與fap+腫瘤細胞結合，因此是真正非靶向的。在y軸上顯示了r-pe綴合的抗人iggfcγ片段特異性f(ab')2山羊igg片段的平均螢光強度(mfi)。在x軸上指示了不同的靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合抗原結合分子的測試濃度。圖13e顯示了單價與二價cea靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合抗原結合分子與表達cea的腫瘤細胞系的結合。二價的cea靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s4)的結合產生比單價的cea靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s5)的結合更低的mfi。這可以通過在同一時間佔據腫瘤細胞表面上的兩個cea分子來解釋。dp47非靶向的分子(分別為對照1和2)不與cea+mkn45腫瘤細胞結合，因此是真正非靶向的。在y軸上顯示了pe綴合的抗人iggfcγ片段特異性f(ab')2山羊igg片段的平均螢光強度(mfi)。在x軸上指示了不同的靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合抗原結合分子的測試濃度。在圖14a和14b中，顯示了fap靶向的含有4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s1，實心圓)或含有dp47的含有4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(對照1，空心圓)不與表達小鼠4-1bb的活化的小鼠脾細胞結合。使用抗小鼠cd137特異性人igg1p329glala抗體(克隆lob12.3)作為陽性對照(三角形)。通過繪製用作第二檢測抗體的r-pe標記的抗人iggfcγ特異性山羊iggf(ab`)2片段的mfi來表徵結合，所述mfi是相對於測試的初級4-1bbl三聚體抗原結合分子的濃度nm而言的。通過流式細胞術測量mfi，並通過減去空白對照的mfi來校正基線。在圖15中的方案顯示了在實施例11.1.2中描述的使用報告細胞系的nfκb活性測定的一般原理。抗huigg1fcγ特異性抗體與含有人4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的比率為1到4。在圖16中，顯示了通過二級抗體交聯的fap靶向的單鏈三聚體4-1bbl抗原結合分子(化合物s1，實心圓)或二級抗體交聯的含有dp47的單鏈三聚體4-1bbl分子(對照1，空心圓，虛線)的報告細胞系中的nfκb信號通路的激活。在1到4比率的指定濃度的含有單鏈4-1bbl三聚體的抗原結合分子與交聯的二級多克隆抗huigg1fcγ特異性山羊iggf(ab)2片段的存在下，將報告細胞培養6小時。如實施例11.1.1中所述評估螢光素酶活性。通過在0.5秒內測量的釋放光的單位數(url)相對於測試的單鏈人4-1bbl三聚體抗原結合分子的nm濃度的印跡來表徵活性。url的發射是由於螢光素酶介導的螢光素氧化為氧化螢光素的緣故。在圖17中的方案顯示了在實施例11.1.3中描述的使用hela-hu4-1bb-nfκb-luc克隆26作為報告細胞系的nfκb介導的螢光素酶活性測定的一般原理。表達fap的腫瘤細胞與表達人4-1bb的報告細胞的使用比率為5比1。圖18a到18d顯示了通過表達fap的腫瘤細胞系交聯的fap靶向的單鏈三聚體4-1bblfc(kih)融合抗原結合分子(化合物s1，實心圓)的報告細胞中的nfκb信號通路的激活。未交聯的含有dp47的單鏈三聚體4-1bbl分子的數據顯示為陰性對照(對照1，空心圓，虛線)。在逐步滴加的fap靶向或含有dp47的單鏈三聚體4-1bbl分子和交聯fap+腫瘤細胞系的存在下，將報告細胞培養6小時。報告細胞與表達fap的腫瘤細胞的比率為1:5。通過在0.5秒內測量的釋放光的單位數(url)相對於測試的單鏈三聚體4-1bbl抗原結合分子的nm濃度的印跡來表徵nfκb介導的螢光素酶活性。url的發射是由於螢光素酶介導的螢光素氧化為氧化螢光素的緣故。通過減去空白對照的url將這些值進行基線校正。圖18a顯示了以mv3細胞系作為靶細胞的活化，在圖18b中使用細胞系nih/3t3-人fap克隆39作為靶細胞。圖18c顯示了以wm-266-4細胞系作為靶細胞的活化，圖18d顯示了如果不存在fap+靶向細胞的測量數據。圖19顯示了經由通過單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合抗原結合分子的fap靶向的交聯介導的4-1bb活化的nk-κb激活。顯示了通過表達fap的腫瘤細胞系交聯的fap靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合分子的hela-hu4-1bb-nfκb-luc克隆26報告細胞中的nfκb信號通路的激活。dp47非靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合分子不誘導nk-κb激活(對照1和2)。單價的fap靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s1和s3)比二價的fap靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合分子(化合物s2)誘導更強的nfκb激活。在逐步滴加的fap靶向的或dp47非靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合抗原結合分子和交聯fap+腫瘤細胞系的存在下，將hela-hu4-1bb-nf-κb-luc報告細胞培養6小時。報告細胞與表達fap的腫瘤細胞的比率為1:5。通過在0.5秒內測量的釋放光的單位數(url)相對於測試的單鏈三聚體4-1bb配體的nm濃度的印跡來表徵nfκb介導的螢光素酶活性。url的發射是由於螢光素酶介導的螢光素氧化為氧化螢光素的緣故。通過減去空白對照的url將這些值進行基線校正。圖19a顯示了以mv3細胞系作為靶細胞的活化，圖19b顯示了以wm-266-4細胞系作為靶細胞的活化。圖19c顯示了如果沒有fap+靶向細胞存在的測量數據。在圖20中，顯示了通過表達cea的腫瘤細胞系交聯的cea(sm9b)靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s4和s5)的hela-hu4-1bb-nfκb-luc克隆26報告細胞中的nfκb信號通路的激活。dp47非靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合分子不誘導nk-κb激活(對照1和2)。單價的cea(sm9b)靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合抗原分子(化合物s5)比二價的cea(sm9b)靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s4)誘導更強的n-κb激活。在逐步滴加的cea(sm9b)靶向的或dp47非靶向的單鏈三聚體4-1bb配體fc(kih)融合分子和交聯cea+mkn45腫瘤細胞系的存在下，將hela-hu4-1bb-nf-κb-luc報告細胞培養6小時。報告細胞與表達cea的mkn45腫瘤細胞的比率為1:5。通過在0.5秒內測量的釋放光的單位數(url)相對於測試的單鏈三聚體4-1bb配體的nm濃度的印跡來表徵nfκb介導的螢光素酶活性。url的發射是由於螢光素酶介導的螢光素氧化為氧化螢光素的緣故。通過減去空白對照的url將這些值進行基線校正。圖20a顯示了以mkn45細胞系作為靶細胞的活化，圖20b顯示了如果不存在cea+靶向細胞的測量數據。通過表達fap的wm266-4腫瘤細胞系交聯的fap靶向的單鏈三聚體ox40l分子(實心圓，化合物s10)的hela-huox40-nfκb-luc1報告細胞中的nfκb信號傳導通路的激活如圖21b中所示。未交聯的含有dp47的單鏈三聚體ox40l分子(空心圓，虛線，對照3)顯示為陰性對照。在逐步滴加的fap靶向或含有dp47的單鏈三聚體ox40l分子和交聯fap+腫瘤細胞系的存在下，將報告細胞培養6小時。報告細胞與表達fap的腫瘤細胞的比率為1:2.5。通過在0.5秒內測量的釋放光的單位數(url)相對於測試的單鏈三聚體ox40l抗原結合分子的nm濃度的印跡來表徵nfκb介導的螢光素酶活性。url的發射是由於螢光素酶介導的螢光素氧化為氧化螢光素的緣故。通過減去空白對照的url將這些值進行基線校正。如圖21a所示，如果在沒有fap+靶向細胞存在並且因此沒有發生交聯的情況下，fap靶向的單鏈三聚體ox40l分子(化合物s10，實心圓)和含有dp47的單鏈三聚體ox40l抗原結合分子(對照3)已經誘導了一定量的nfκb激活。圖22中的方案展示了實施例10.2.2中描述的抗原特異性cd8+t細胞活化測定的一般原理。圖23和24顯示了單鏈三聚體4-1bbl抗原結合分子對nlv特異性cd8+t細胞的cd137表達的影響(圖23)以及對nlv特異性cd8+t細胞的ifnγ分泌的影響(圖24)。nlv特異性cd8+t細胞的延長的ifnγ分泌和cd137表達嚴格依賴於通過nlv-hla-a2複合物(信號1，圖a和b)的識別以及藉助於fap靶向的單鏈三聚體4-1bbl抗原結合分子(信號2，圖c至f)的4-1bb觸發的t細胞同時激活。實心圓：fap靶向的單鏈三聚體4-1bbl分子(化合物s1)；空心圓：含有dp47的單鏈三聚體4-1bbl分子(對照3)。4-1bb上調的效應顯示在圖23a到23f中，而cd8+t細胞的infγ表達的效應呈現在圖24a到24f中。一直顯示總cd8+t細胞群中的螢光強度中位值(左圖)和陽性細胞的頻率百分比(右圖)。在圖25和26中，顯示了nlv特異性cd8+t細胞的延長的ifnγ分泌和cd137表達嚴格依賴於通過nlv-hla-a2複合物(信號1，圖a和b)的識別以及藉助於fap靶向的單鏈三聚體4-1bb配體(信號2，圖c至f)的4-1bb觸發的t細胞同時激活。4-1bb上調的效應顯示在圖25a到25f中，而infγ表達的效應呈現在圖26a到26f中。一直顯示總cd8+t細胞群中的螢光強度中位值(左圖)和陽性細胞的頻率百分比(右圖)，兩者是相對於單價或二價的fap(28h1或4b9)靶向的或dp47非靶向的單鏈三聚體4-1bb配體(kih)融合抗原結合分子的使用濃度而言的。圖27a至27f表明，在用抗人cd3抗體次最佳刺激的人cd4+(左側)和cd8+t細胞(右側)中，用含有dp47的三聚體單鏈ox40l分子(空心圓，虛線，對照3)共刺激僅略微促進增殖和誘導增強的活化表型(cd25表達)。通過當前的nih/3t3-hufap克隆39細胞，fap靶向的三聚體單鏈ox40l分子的超交聯強烈地增加了這種效應(實心圓，化合物s10)。顯示了事件計數、增殖(cfse-低)細胞的百分比或在有活力的cd4+和cd8+t細胞上的cd25-percpcy5.5的mfi。從測試化合物樣品中減去僅含有抗人cd3(克隆v9，huigg1)、靜息的人pbmc和nih/3t3-hufap克隆39的空白樣品的基線值。因此，這裡顯示了ox40l共刺激的增強作用，但不是次最佳抗cd3刺激本身的作用。圖28a顯示了包含通過肽接頭彼此連接的4-1bbl的三個胞外結構域的多肽。圖28b顯示了包含圖28a的多肽的本發明的含有二價tnf配體三聚體的抗原結合分子的代表性實例。三個tnf配體以底部的灰色區域表示。具有黑點的白色區域表示fc部分，粗黑點代表節入穴(knob-into-hole)修飾。發明詳述定義除非另外定義，本文中使用的技術術語和科學術語具有與本發明所屬領域中通常使用的相同的含義。出於解釋本說明書的目的，以下定義將適用，並且在適當時，以單數形式使用的術語也將包括複數形式，反之亦然。如本文中使用的，術語「抗原結合分子」在其最廣義上指的是特異性結合抗原決定簇的分子。抗原結合分子的實例是抗體，抗體片段和支架抗原結合蛋白。如本文中使用的，術語「能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊」是指與抗原決定簇特異性結合的多肽分子。在一個方面，抗原結合模塊能夠通過其靶細胞抗原激活信號轉導。在一個特定方面，抗原結合模塊能夠將與其連接的實體(例如，tnf家族配體三聚體)引導至靶位點，例如引導至具有抗原決定簇的特定類型的腫瘤細胞或腫瘤基質。能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊包括本文中進一步定義的抗體及其片段。另外，能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊包括本文中進一步定義的支架抗原結合蛋白，例如，基於設計的重複蛋白或設計的重複域的結合域(參見例如wo2002/020565)。關於抗體或其片段，術語「能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊」是指分子的包含與抗原的部分或全部特異性結合併與其互補的區域的部分。可以例如由一個或多個抗體可變域(也稱為抗體可變區)提供能夠進行特異性抗原結合的模塊。具體地說，能夠進行特異性抗原結合的模塊包含抗體輕鏈可變區(vl)和抗體重鏈可變區(vh)。在本文中以最廣義的方式使用術語「抗體」，其涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單克隆抗體，多克隆抗體，單特異性和多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們表現出期望的抗原結合活性即可。如本文中使用的術語「單克隆抗體」是指從基本上同質的抗體的群獲得的抗體，即包含該群的單獨的抗體是同一的和/或結合同一表位，除了可能的變體抗體之外，例如，含有天然存在的突變的或在單克隆抗體製劑的產生過程中產生的抗體，這樣變體通常以少量存在。與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體製劑相反，單克隆抗體製劑的每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。如本文中使用的術語「單特異性」抗體表示具有一個或多個結合位點的抗體，所述位點各自與相同抗原的相同表位結合。術語「雙特異性」意指抗原結合分子能夠特異性地與至少兩個不同的抗原決定簇結合。通常，雙特異性抗原結合分子包含兩個抗原結合位點，每個抗原結合位點對於不同的抗原決定簇是特異性的。在某些實施方案中，雙特異性抗原結合分子能夠同時結合兩個抗原決定簇，尤其是在兩個不同細胞上表達的兩個抗原決定簇。在本申請中使用的術語「價」意味著在抗原結合分子中特定數目的結合位點的存在。正因為因此，術語「二價」，「四價」和「六價」分別意味著在抗原結合分子中分別存在兩個結合位點，四個結合位點和六個結合位點。術語「全長抗體」，「完整抗體」和「全抗體」在本文中可互換使用，指的是具有與天然抗體結構基本相似的結構的抗體。「天然抗體」指的是具有不同結構的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然igg類抗體是約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由二硫鍵結合的兩條輕鏈和兩條重鏈組成。從n末端至c末端，每個重鏈具有可變區(vh)，也稱為可變重域或重鏈可變域，其後是三個恆定域(ch1，ch2，和ch3)，也稱為重鏈恆定區。類似地，從n末端至c末端，每個輕鏈具有可變區(vl)，也稱為可變輕域或輕鏈可變域，其後是輕鏈恆定域(cl)，也稱為輕鏈恆定區。抗體重鏈可被指定為五種類型中的一種，稱為α(iga)，δ(igd)，ε(ige)，γ(igg)，或μ(igm)，其中一些可以進一步分為亞類，例如γ1(igg1)，γ2(igg2)，γ3(igg3)，γ4(igg4)，α1(iga1)和α2(iga2)。基於其恆定域的胺基酸序列，抗體輕鏈可被指定為兩種類型之一，稱為卡帕(κ)和蘭布達(λ)。「抗體片段」指的是除了完整抗體之外的分子，其包含與完整抗體所結合的抗原結合的所述完整抗體的一部分。抗體片段的實例包括但不限於fv，fab，fab'，fab』-sh，f(ab')2；雙抗體，三抗體，四抗體，交叉fab片段；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scfv)；和單域抗體。關於某些抗體片段的綜述，參見hudson等人，natmed9,129-134(2003)。關於scfv片段的綜述，參見例如plückthun，引自thepharmacologyofmonoclonalantibodies,vol.113,rosenburgandmooreeds.,springer-verlag,newyork,pp.269-315(1994)；還參見wo93/16185；和美國專利nos.5,571,894和5,587,458。關於包含補救受體結合表位殘基並具有增加的體內半衰期的fab和f(ab')2片段的討論，參見美國專利no.5,869,046。雙抗體是具有兩個抗原結合位點的可以是二價或雙特異性的抗體片段，參見，例如ep404,097；wo1993/01161；hudson等人，natmed9,129-134(2003)；和hollinger等人，procnatlacadsciusa90,6444-6448(1993)。hudson等人在natmed9,129-134(2003)中也描述了三抗體和四抗體。單域抗體是包含抗體的全部或模塊重鏈可變域或全部或模塊輕鏈可變域的抗體片段。在某些實施方案中，單域抗體是人單域抗體(domantis,inc.,waltham,ma；參見例如美國專利no.6,248,516b1)。可以通過各種技術製造抗體片段，包括但不限於完整抗體的蛋白水解消化以及通過重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生，如本文中所述。完整抗體的木瓜蛋白酶消化產生兩個完全相同的抗原結合片段，稱為「fab」片段，其各自含有重鏈和輕鏈可變區以及輕鏈的恆定域和重鏈的第一恆定域(ch1)。因此，如本文中使用的，術語「fab片段」是指包含包括輕鏈的vl域和恆定域(cl)的輕鏈片段，和重鏈的vh域和第一恆定域(ch1)的抗體片段。fab'片段因在重鏈chl域的羧基末端增加了少數殘基而與fab片段有所不同，包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸。fab'-sh是其中恆定域的半胱氨酸殘基具有游離巰基的fab'片段。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合位點(兩個fab片段)和fc區的一部分的f(ab')2片段。術語「交叉fab片段」或「xfab片段」或「交換fab片段」是指其中重鏈和輕鏈的可變區或恆定區之間被交換的fab片段。交換fab分子的兩種不同鏈組成是可能的並且包含在本發明的雙特異性抗體中：一方面，fab重鏈和輕鏈的可變區被交換，即交換fab分子包含由輕鏈可變區(vl)和重鏈恆定區(ch1)組成的肽鏈，以及由重鏈可變區(vh)和輕鏈恆定區(cl)組成的肽鏈。這種交換fab分子也被稱為crossfab(vlvh)。另一方面，當fab重鏈和輕鏈的恆定區被交換時，交換fab分子包含由重鏈可變區(vh)和輕鏈恆定區(cl)組成的肽鏈，以及由輕鏈可變區(vl)和重鏈恆定區(ch1)組成的肽鏈。這種交換fab分子也被稱為crossfab(clch1)。「單鏈fab片段」或「scfab」是由抗體重鏈可變域(vh)，抗體恆定域1(ch1)，抗體輕鏈可變域(vl)，抗體輕鏈恆定域(cl)和接頭組成的多肽，其中所述抗體域和所述接頭在n末端至c末端方向具有以下順序之一：a)vh-ch1-接頭-vl-cl，b)vl-cl-接頭-vh-ch1，c)vh-cl-接頭-vl-ch1或d)vl-ch1-接頭-vh-cl；並且其中所述接頭是具有至少30個胺基酸，優選32至50個胺基酸之間的多肽。所述單鏈fab片段經由cl域和ch1域之間的天然二硫鍵而被穩定化。另外，通過插入半胱氨酸殘基(例如根據kabat編號在可變重鏈中的位置44和可變輕鏈中的位置100)產生鏈間二硫鍵，這些單鏈fab分子可以進一步被穩定化。「交換單鏈fab片段」或「x-scfab」是由抗體重鏈可變域(vh)，抗體恆定域1(ch1)，抗體輕鏈可變域(vl)，抗體輕鏈恆定域(cl)和接頭組成的多肽，其中所述抗體域和所述接頭在n末端至c末端方向具有以下順序之一：a)vh-cl-接頭-vl-ch1和b)vl-ch1-接頭-vh-cl；其中vh和vl一起形成與抗原特異性結合的抗原結合位點，並且其中所述接頭是具有至少30個胺基酸的多肽。另外，通過插入半胱氨酸殘基(例如根據kabat編號在可變輕鏈中的位置44和可變輕鏈中的位置100)產生鏈間二硫鍵，這些x-scfab分子可以進一步被穩定化。「單鏈可變片段(scfv)」是用具有10個至約25個胺基酸的短接頭肽連接的抗體的重鏈可變區(vh)和輕鏈可變區(vl)的融合蛋白。該接頭通常富含有關柔性的甘氨酸，以及有關溶解性的絲氨酸或蘇氨酸，並且可將vh的n末端與vl的c末端連接，或反之亦然。儘管去除了恆定區並引入了接頭，但該蛋白質保留了原始抗體的特異性。scfv抗體例如描述於houston,j.s.,methodsinenzymol.203(1991)46-96)。另外，抗體片段包含具有vh域特徵或vl域特徵的單鏈多肽，所述vh域特徵即能夠與vl域一起組裝到功能性抗原結合位點上，所述vl域特徵即能夠與vh域一起組裝到功能性抗原結合位點上，從而提供全長抗體的抗原結合特性。「支架抗原結合蛋白」在本領域中是已知的，例如，纖連蛋白和設計的錨蛋白重複蛋白(darpin)已被用作抗原結合域的替代支架，參見例如gebauer和skerra,engineeredproteinscaffoldsasnext-generationantibodytherapeutics.curropinchembiol13:245-255(2009)和stumpp等人，darpins:anewgenerationofproteintherapeutics.drugdiscoverytoday13:695-701(2008)。在本發明的一個方面，支架抗原結合蛋白選自ctla-4(evibody)，脂質運載蛋白(anticalin)，蛋白a衍生的分子，如蛋白a的z域(affibody)，a域(avimer/maxibody)，血清轉鐵蛋白(trans-body)；設計的錨蛋白重複蛋白(darpin)，抗體輕鏈或重鏈的可變域(單域抗體，sdab)，抗體重鏈的可變域(納米抗體，avh)，vnar片段，纖連蛋白(adnectin)，c型凝集素域(tetranectin)；新的抗原受體β-內醯胺酶的可變域(vnar片段)，人γ-晶體蛋白或泛素(affilin分子)；人蛋白酶抑制劑的kunitz型域，諸如來自knottin家族的蛋白質的微體，肽適體和纖連蛋白(adnectin)。ctla-4(細胞毒性t淋巴細胞相關抗原4)是主要在cd4+t細胞上表達的cd28家族受體。其細胞外域具有類似可變域的ig摺疊。可用異源序列取代對應於抗體的cdr的環，以賦予不同的結合特性。經過工程化而具有不同結合特異性的ctla-4分子也被稱為evibodies(例如，us7166697b1)。evibodies的大小與抗體(例如，域抗體)的分離可變區大約相同。進一步的詳情參見journalofimmunologicalmethods248(1-2),31-45(2001)。脂質運載蛋白為細胞外蛋白質家族，其轉運小的疏水性分子，如類固醇，膽紅素，類視黃醇和脂質。它們具有剛性β-片層二級結構，在錐形結構的開口端具有可被工程化以結合不同的靶抗原的多個環。anticalin的大小在160-180個胺基酸之間，並且衍生自脂質運載蛋白。進一步的詳情參見biochimbiophysacta1482:337-350(2000)，us7250297b1和us20070224633。親和體是衍生自金黃色葡萄球菌蛋白a的支架，其可被工程化以結合抗原。該域由具有約58個胺基酸的三螺旋束組成。通過表面殘基的隨機化生成了文庫。進一步的詳情參見proteineng.des.sel.2004,17,455-462和ep1641818a1。avimers是衍生自a域支架家族的多域蛋白。具有約35個胺基酸的天然域採用定義的二硫鍵結構。多樣性是通過改變a域家族所顯示的自然變異產生的。進一步的詳情參見naturebiotechnology23(12),1556-1561(2005)和expertopiniononinvestigationaldrugs16(6),909-917(june2007)。轉鐵蛋白是單體的血清轉運糖蛋白。可以通過在允許的表面環中插入肽序列將轉鐵蛋白工程化以結合不同的靶抗原。工程化轉鐵蛋白支架的實例包括trans-body。進一步的詳情參見j.biol.chem274,24066-24073(1999)。設計的錨蛋白重複蛋白(darpin)衍生自錨蛋白，錨蛋白是介導整合膜蛋白與細胞骨架附著的蛋白質家族。單個錨蛋白重複是由兩個α-螺旋和β-轉角組成的33個殘基的基序。通過隨機化每個重複的第一個α-螺旋和β-轉角中的殘基，它們可以被工程化以結合不同的靶抗原。通過增加模塊的數量(親和力成熟法)可以增加它們的結合界面。進一步的詳情參見j.mol.biol.332,489-503(2003),pnas100(4),1700-1705(2003)和j.mol.biol.369,1015-1028(2007)以及us20040132028a1。單域抗體是由單個單體的可變抗體域組成的抗體片段。第一個單域來源於來自駱駝科動物(camelids)抗體重鏈的可變域(納米抗體或vhh片段)。此外，術語單域抗體包括自主的人重鏈可變域(avh)或來源於鯊魚的vnar片段。纖連蛋白是一種可以被工程化為與抗原結合的支架。adnectin由人纖連蛋白iii型(fn3)的15個重複單元的第10個域的天然胺基酸序列的主鏈組成。可以將β-夾心一端的三個環工程化，使adnectin能夠特異性地識別感興趣的治療靶標。進一步的詳情參見proteineng.des.sel.18,435-444(2005)，us20080139791，wo2005056764和us6818418b1。肽適體是由恆定骨架蛋白組成的組合識別分子，所述骨架蛋白通常是含有在活性位點插入的約束可變肽環的硫氧還蛋白(trxa)。進一步的詳情參見expertopin.biol.ther.5,783-797(2005)。微體源自長度為25-50個胺基酸的天然存在的微蛋白，其含有3-4個半胱氨酸橋-微蛋白的實例包括kalatabi以及芋螺毒素和半胱氨酸結肽(knottin)。微蛋白具有可以工程化以包括多達25個胺基酸而不影響微蛋白的整體摺疊的環。工程化的半胱氨酸結肽域的更多詳情參見wo2008098796。就參考分子而言「結合相同表位的抗原結合分子」是指在競爭測定中阻斷參考分子與其抗原的結合的50％或以上的抗原結合分子，相反地，參考分子在競爭測定中阻斷抗原結合分子與其抗原的結合的50％或以上。術語「抗原結合域」是指抗原結合分子的模塊，其包含與抗原的部分或全部特異性地結合且互補的區域。在大抗原的情況下，抗原結合分子可能僅與該抗原的特定模塊結合，該模塊稱作表位。抗原結合域可以由例如一個或多個可變域(也稱為可變區)提供。優選地，抗原結合域包含抗體輕鏈可變區(vl)和抗體重鏈可變區(vh)。如本文中使用的，術語「抗原決定簇」與「抗原」和「表位」同義，並且是指在抗原結合模塊與其結合而形成抗原結合模塊-抗原複合物的多肽大分子上的位點(例如胺基酸的連續段或由不連續胺基酸的不同區域構成的構象構型)。有用的抗原決定簇可以例如在腫瘤細胞的表面上，病毒感染細胞的表面上，其他病變的細胞表面上，免疫細胞表面上發現，在血清中和/或細胞外基質(ecm)中游離。用作本文中的抗原的蛋白質可以是來自任何脊椎動物來源的蛋白質的任何天然形式，所述脊椎動物包括哺乳動物如靈長類動物(例如人)和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。在一個具體實施方案中，抗原是人蛋白質。在提及本文中的特定蛋白質的情況下，該術語包括「全長」未加工的蛋白質以及通過在細胞中加工產生的任何形式的蛋白質。該術語還涵蓋蛋白質的天然存在的變體，例如，剪接變體或等位基因變體。「特異性結合」意指結合對於抗原而言是選擇性的，並且可以與不需要的或非特異性的相互作用區別開。抗原結合分子與特異性抗原結合的能力可以通過酶聯免疫吸附測定(elisa)或本領域技術人員熟悉的其他技術來測量，例如，表面等離子體共振(spr)技術(在biacore儀器上分析)(liljeblad等人，glycoj17,323-329(2000))和傳統結合測定法(heeley,endocrres28,217-229(2002))。在一個實施方案中，抗原結合分子與不相關蛋白的結合程度小於該抗原結合分子與抗原結合的約10％，正如通過例如spr所測量的。在某些實施方案中，與抗原結合的分子具有≤1μm，≤100nm，≤10nm，≤1nm，≤0.1nm，≤0.01nm或≤0.001nm(例如10-8m或更小，例如10-8m至10-13m，例如10-9m至10-13m)的解離常數(kd)。「親和力」或「結合親和力」是指分子(例如抗體)的單一結合位點與其結合伴侶(例如抗原)之間的非共價相互作用的總和的強度。除非另外指明，如本文中使用的，「結合親和力」是指反映結合對的成員(例如抗體和抗原)之間的1:1相互作用的固有結合親和力。分子x對其伴侶y的親和力通常可以通過解離常數(kd)來表示，親和力是解離速率常數與結合速率常數(分別為koff和kon)的比率。因此，等同親和力可以包含不同的速率常數，只要速率常數的比率保持相同即可。可以通過本領域已知的常用方法測量親和力，包括本文所述的那些方法。用於測量親和力的特定方法是表面等離子體共振(spr)。如本文中使用的「靶細胞抗原」是指存在於靶細胞表面上的抗原決定簇，所述靶細胞例如腫瘤中的細胞，如癌細胞或腫瘤基質細胞。在某些實施方案中，靶細胞抗原是腫瘤細胞表面上的抗原。在一個實施方案中，靶細胞抗原選自成纖維細胞激活蛋白(fap)，癌胚抗原(cea)，黑素瘤關聯硫酸軟骨素蛋白聚糖(mcsp)，表皮生長因子受體(egfr)，cd19，cd20和cd33。具體地說，靶細胞抗原是成纖維細胞激活蛋白(fap)。術語「成纖維細胞激活蛋白(fap)」，也稱為脯氨醯內肽酶fap或分離酶(seprase)(ec3.4.21)，是指任何脊椎動物來源的任何天然fap，所述脊椎動物包括哺乳動物如靈長類動物(例如人)，非人靈長類動物(例如食蟹猴)和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。該術語包括「全長」未加工的fap以及通過在細胞中加工產生的任何形式的fap。該術語還涵蓋fap的天然存在的變體，例如，剪接變體或等位基因變體。在一個實施方案中，本發明的抗原結合分子能夠特異性結合人，小鼠和/或食蟹猴fap。人fap的胺基酸序列顯示在uniprot(www.uniprot.org)登錄號q12884(版本149，seqidno:21)，或ncbi(www.ncbi.nlm.nih.gov/)refseqnp_004451.2中。人fap的細胞外域(ecd)從胺基酸位置26延伸至760。帶his標籤的人fapecd的胺基酸和核苷酸序列分別顯示在seqidno:22和23中。小鼠fap的胺基酸序列顯示在uniprot登錄號p97321(版本126，seqidno:24)，或ncbi(www.ncbi.nlm.nih.gov/)refseqnp_032012.1中。小鼠fap的細胞外域(ecd)從胺基酸位置26延伸至761。seqidno:25和26分別顯示了帶his標籤的小鼠fapecd的胺基酸和核苷酸序列。seqidno:27和28分別顯示了帶his標籤的食蟹猴fapecd的胺基酸和核苷酸序列。優選地，本發明的抗fap結合分子與fap的細胞外域結合。示例性抗fap結合分子描述於國際專利申請no.wo2012/020006a2中。術語「癌胚抗原(cea)」，也稱為癌胚抗原相關細胞粘附分子5(ceacam5)，是指任何脊椎動物來源的任何天然cea，所述脊椎動物包括哺乳動物如靈長類動物(例如人)，非人靈長類動物(例如食蟹猴)和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人cea的胺基酸序列顯示在uniprot登錄號p06731(版本151，seqidno:29)中。cea早已被鑑定為腫瘤相關抗原(gold和freedman,jexpmed.,121:439-462,1965；berinsteinn.l.,jclinoncol.,20:2197-2207,2002)。最初分類為僅在胎兒組織中表達的蛋白質，現在已經在若干正常的成人組織中鑑定了cea。這些組織主要是起源於上皮，包括胃腸道，呼吸道和泌尿生殖道的細胞，以及結腸，子宮頸，汗腺和前列腺的細胞(nap等人，tumourbiol.,9(2-3):145-53,1988；nap等人，cancerres.,52(8):2329-23339,1992)。上皮起源的腫瘤及其轉移瘤含有作為腫瘤相關抗原的cea。雖然cea本身的存在不表明轉化為癌細胞，但cea的分布是指示性的。在正常組織中，cea通常在細胞的頂端表面上表達(s.,semincancerbiol.9(2):67-81(1999))，使血流中的抗體難以接近。與正常組織相反，cea傾向於在癌細胞的整個表面上表達(s.,semincancerbiol.9(2):67-81(1999))。這種表達模式的改變使cea在癌細胞中可與抗體結合。另外，cea表達在癌細胞中增加。此外，增加的cea表達促進細胞間粘附增加，這可能導致轉移(marshallj.,seminoncol.,30(asuppl.8):30-6,2003)。cea表達在各種腫瘤實體中的發生率通常很高。根據公開的數據，在組織樣品中進行的自身分析證實其高發生率，大約在結腸直腸癌(crc)中為95％，在胰腺癌中為90％，在胃癌中為80％，在非小細胞肺癌(nsclc，其與her3共表達)中為60％，在乳腺癌中為40％；發現在小細胞肺癌和膠質母細胞瘤中為低表達。cea容易從細胞表面裂解並直接或通過淋巴管從腫瘤脫落進入血流。由於這種特性，血清cea水平已被用作癌症診斷和篩選癌症特別是結腸直腸癌復發的臨床標誌物(goldenbergdm.,theinternationaljournalofbiologicalmarkers,7:183-188,1992；chaui.等人，jclinoncol.,22:1420-1429,2004；flamini等人，clincancerres；12(23):6985-6988,2006)。術語「黑素瘤關聯硫酸軟骨素蛋白聚糖(mcsp)」，也稱為硫酸軟骨素蛋白聚糖4(cspg4)，是指任何脊椎動物來源的任何天然mcsp，所述脊椎動物包括哺乳動物如靈長類動物(例如人)，非人靈長類動物(例如食蟹猴)和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人mcsp的胺基酸序列顯示在uniprot登錄號q6uvk1(版本103，seqidno:30)中。術語「表皮生長因子受體(egfr)」，也稱為原癌基因c-erbb-1或受體酪氨酸蛋白激酶erbb-1，是指任何脊椎動物來源的任何天然egfr，所述脊椎動物包括哺乳動物如靈長類動物(例如人)，非人靈長類動物(例如食蟹猴)和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人egfr的胺基酸序列顯示在uniprot登錄號p00533(版本211，seqidno:31)中。術語「cd19」是指b淋巴細胞抗原cd19，也稱為b淋巴細胞表面抗原b4或t細胞表面抗原leu-12，包括任何脊椎動物來源的任何天然cd19，所述脊椎動物包括哺乳動物如靈長類動物(例如人)，非人靈長類動物(例如食蟹猴)和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人cd19的胺基酸序列顯示在uniprot登錄號p15391(版本160，seqidno:32)中。該術語涵蓋「全長」未加工的人cd19以及通過在細胞中加工產生的任何形式的人cd19，只要本文中報導的抗體與其結合即可。cd19是在人b細胞表面上表達的結構上不同的細胞表面受體，所述細胞包括但不限於前b細胞，早期發育中的b細胞(即未成熟b細胞)，通過終末分化成漿細胞的成熟b細胞和惡性b細胞。由大多數前b型急性淋巴細胞白血病(all)，非霍奇金淋巴瘤，b細胞慢性淋巴細胞性白血病(cll)，前淋巴細胞性白血病，毛細胞白血病，常見急性淋巴細胞性白血病和一些無標誌型急性淋巴細胞性白血病表達cd19。cd19在漿細胞上表達進一步表明它可以在分化的b細胞腫瘤如多發性骨髓瘤中表達。因此，cd19抗原是用於治療非霍奇金淋巴瘤，慢性淋巴細胞白血病和/或急性淋巴細胞白血病的免疫治療的靶標。術語「cd20」是指b淋巴細胞抗原cd20，也稱為跨膜4域亞家族a成員1(ms4a1)，b淋巴細胞表面抗原b1或白細胞表面抗原leu-16，包括任何脊椎動物來源的任何天然cd20，所述脊椎動物包括哺乳動物如靈長類動物(例如人)，非人靈長類動物(例如食蟹猴)和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人cd20的胺基酸序列顯示在uniprot登錄號p11836(版本149，seqidno:33)中。術語「cd33」是指髓樣細胞表面抗原cd33，也稱為siglec3或gp67，包括任何脊椎動物來源的任何天然cd33，所述脊椎動物包括哺乳動物如靈長類動物(例如人)，非人靈長類動物(例如食蟹猴)和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。人cd33的胺基酸序列顯示在uniprot登錄號p20138(版本157，seqidno:34)中。術語「可變區」或「可變域」是指涉及抗原結合分子與抗原結合的抗體重鏈或輕鏈的域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變域(分別為vh和vl)通常具有相似的結構，每個域包含四個保守的框架區(fr)和三個高變區(hvr)。參見例如kindt等人，kubyimmunology,6thed.,w.h.freeman和co.,第91頁(2007)。單個vh或vl域可足以賦予抗原結合特異性。如本文中使用的術語「高變區」或「hvr」是指在序列上高變/或形成結構上定義的環(「高變環」)的抗體可變域的每個區域。通常，天然四鏈抗體包含六個hvr：三個在vh中(h1，h2，h3)中，三個在vl中(l1，l2，l3)中。hvr通常包含來自高變環和/或來自「互補決定區」(cdr)的胺基酸殘基，後者具有最高的序列變異性和/或涉及抗原識別。示例性的高變環發生在胺基酸殘基26-32(l1)，50-52(l2)，91-96(l3)，26-32(h1)，53-55(h2)，和96-101(h3)處。(chothia和lesk,j.mol.biol.196:901-917(1987).)示例性的cdr(cdr-l1，cdr-l2，cdr-l3，cdr-h1，cdr-h2，和cdr-h3)發生在l1的24-34，l2的50-56，l3的89-97，h1的31-35b，h2的50-65，和h3的95-102胺基酸殘基處。(kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(1991).)高變區(hvr)也被稱為互補決定區(cdr)，並且在提到形成抗原結合區的可變區的模塊時，這些術語在本文中可互換地使用。這個特定的區域已經由kabat等人在u.s.dept.ofhealthandhumanservices,"sequencesofproteinsofimmunologicalinterest"(1983)和chothia等人在j.mol.biol.196:901-917(1987)中描述，其中定義包括當針對彼此進行比較時的胺基酸殘基的重疊或子集。然而，提及抗體的cdr或其變體的任一定義的應用預期在本文中定義和使用的術語的範圍內。涵蓋如以上每一篇引用的參考文獻所定義的cdr的適當胺基酸殘基在以下表a中列出作為比較。涵蓋特定cdr的確切殘基數將取決於cdr的序列和大小而變化。考慮到抗體的可變區胺基酸序列，本領域技術人員可以常規地確定哪些殘基包含特定的cdr。表a.cdr定義1cdrkabatchothiaabm2vhcdr131-3526-3226-35vhcdr250-6552-5850-58vhcdr395-10295-10295-102vlcdr124-3426-3224-34vlcdr250-5650-5250-56vlcdr389-9791-9689-971表a中所有cdr定義的編號遵循kabat等人提出的編號規則(見下文)。2具有如表a中使用的小寫「b」的「abm」是指oxfordmolecular的「abm」抗體建模軟體所定義的cdr。kabat等人還定義了可應用於任何抗體的可變區序列的編號系統。本領域的普通技術人員可以將這個「kabat編號」系統明確地指定給任何可變區序列，而不依賴於序列本身以外的任何實驗數據。如本文中使用的，「kabat編號」是指由kabat等人在u.s.dept.ofhealthandhumanservices,"sequenceofproteinsofimmunologicalinterest"(1983)中提出的編號系統。除非另有說明，抗體可變區中特定胺基酸殘基位置編號的提及是根據kabat編號系統。除了vh中的cdr1之外，cdr通常包含形成高變環的胺基酸殘基。cdr還包含作為接觸抗原的殘基的「特異性測定殘基」或「sdr」。sdr被包含在稱為縮略cdr(或a-cdr)的cdr區域中。示例性的a-cdr(a-cdr-l1，a-cdr-l2，a-cdr-l3，a-cdr-h1，a-cdr-h2，和a-cdr-h3)發生在l1的31-34，l2的50-55，l3的89-96，h1的31-35b，h2的50-58，和h3的95-102胺基酸殘基處。(參見almagro和fransson,front.biosci.13:1619-1633(2008).)除非另外指明，在本文中根據上文kabat等人將可變域中的hvr殘基和其他殘基(例如fr殘基)編號。如本文中使用的，在抗原結合分子(例如，抗體)的背景下，術語「親和力成熟」是指例如通過突變而衍生自參考抗原結合分子的抗原結合分子與參考抗體結合相同的抗原，優選結合相同的表位；並且對抗原具有相比於對參考抗原結合分子更高的親和力。親和力成熟通常涉及抗原結合分子的一個或多個cdr中的一個或多個胺基酸殘基的修飾。通常，親和力成熟的抗原結合分子與初始參考抗原結合分子結合相同的表位。「框架」或「fr」是指除了高變區(hvr)殘基之外的可變域殘基。可變域的fr通常由fr1，fr2，fr3和fr4四個fr域組成。因此，hvr和fr序列通常在vh(或vl)中以下列順序出現：fr1-h1(l1)-fr2-h2(l2)-fr3-h3(l3)-fr4。出於本文的目的，「受體人框架」是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的輕鏈可變域(vl)框架或重鏈可變域(vh)框架的胺基酸序列的框架，如下所定義。「衍生自」人免疫球蛋白框架或人共有框架的受體人框架可以包含相同的胺基酸序列，或者其可以含有胺基酸序列變化。在一些實施方案中，胺基酸變化的數目為10個或更少，9個或更少，8個或更少，7個或更少，6個或更少，5個或更少，4個或更少，3個或更少，或2個或更少。在一些實施方案中，vl受體人框架在序列上與vl人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。術語「嵌合」抗體是指其中一部分重鏈和/或輕鏈衍生自特定來源或物種的抗體，同時重鏈和/或輕鏈的其餘模塊衍生自不同的來源或物種。抗體的「類」是指其重鏈所具有的恆定域或恆定區的類型。有五大類的抗體：iga，igd，ige，igg和igm，其中幾類可進一步分為亞類(同種型)，例如，igg1，igg2，igg3，igg4，iga1，和iga2。對應於不同類型免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱作α，δ，ε，γ，和μ。「人源化」抗體是指包含來自非人hvr的胺基酸殘基和來自人fr的胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施方案中，人源化抗體將包含至少一個(通常兩個)可變域中的基本上所有的可變域，其中所有或基本上所有的hvr(例如，cdr)對應於非人抗體的hvr，並且所有或基本上所有的fr對應於人抗體的fr。人源化抗體任選地可以包含衍生自人抗體的抗體恆定區的至少一部分。抗體例如非人抗體的「人源化形式」是指經過人源化的抗體。本發明涵蓋的其他形式的「人源化抗體」是其中恆定區已經基於原始抗體的恆定區另外加以修飾或改變以產生根據本發明的特性特別是關於c1q結合和/或fc受體(fcr)結合的那些抗體。「人」抗體是具有這樣的胺基酸序列的抗體，所述胺基酸序列對應於人或人細胞產生的抗體或衍生自利用人抗體庫或其他的人抗體編碼序列的非人來源的抗體的胺基酸序列。人抗體的這個定義明確排除包含非人抗原結合殘基的人源化抗體。本文中使用的術語「fc域」或「fc區」用於定義含有恆定區的至少一部分的抗體重鏈的c末端區。該術語包括天然序列fc區和變體fc區。iggfc區包含iggch2和iggch3域。人iggfc區的「ch2域」通常從約位置231的胺基酸殘基延伸至約位置340的胺基酸殘基。在一個實施方案中，碳水化合物鏈與ch2域附接。本文中的ch2域可以是天然序列ch2域或變體ch2域。「ch3域」包含在fc區中的c末端到ch2域的殘基段(即從igg的約位置341的胺基酸殘基到約位置447的胺基酸殘基)。本文中的ch3區可以是天然序列ch3域或變體ch3域(例如，具有在其一條鏈中引入的「突起」(「節」)和在其另一條鏈中相應的引入的「腔」(「穴」)的ch3域；參見美國專利5,821,333，將其明確地通過提述併入本文)。如本文中所述，這種變體ch3域可用於促進兩個不相同的抗體重鏈的異源二聚化。在一個實施方案中，人igg重鏈fc區從cys226或從pro230延伸到重鏈的羧基末端。然而，fc區的c末端賴氨酸(lys447)可能存在或可能不存在。除非在本文中另外說明，fc區或恆定區中胺基酸殘基的編號是根據eu編號系統也稱為eu索引進行的，如kabat等人在sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991中描述。「節入穴」技術例如描述於us5,731,168；us7,695,936；ridgway等人，proteng9,617-621(1996)和carter,jimmunolmeth248,7-15(2001)中。通常，該方法包括在第一多肽的界面處引入突起(「節」)並且在第二多肽的界面中引入相應的腔(「穴」)，使得該突起可以定位在該腔中，從而促進異二聚體形成並阻礙同二聚體形成。通過用較大的側鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換第一多肽的界面的小胺基酸側鏈而構建突起。通過用較小的胺基酸側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換大的胺基酸側鏈，在第二多肽的界面中產生與突起具有相同或相似大小的補償腔。可以通過改變編碼多肽的核酸，例如通過位點特異性誘變，或通過肽合成而產生突起和腔。在具體的實施方案中，節修飾包括fc域的兩個亞基之一中的胺基酸替代t366w，並且穴修飾包括fc域的兩個亞基中的另一個亞基中的胺基酸替代t366s，l368a和y407v。在一個另外的具體實施方案中，包含節修飾的fc域的亞基另外包含胺基酸替代s354c，並且包含穴修飾的fc域的亞基另外包含胺基酸替代y349c。引入這兩個半胱氨酸殘基導致在fc區的兩個亞基之間形成二硫橋，從而進一步穩定該二聚體(carter,jimmunolmethods248,7-15(2001))。編號是根據kabat等人在sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991中的eu索引進行的。「等同於免疫球蛋白fc區的區域」預期包括免疫球蛋白fc區的天然存在的等位基因變體，以及具有產生取代，添加或缺失的改變但不實質性地降低免疫球蛋白介導效應器功能(如抗體依賴性細胞毒性)的能力的變體。例如，可以從免疫球蛋白fc區的n末端或c末端缺失一個或多個胺基酸，而沒有生物學功能的實質性喪失。可以根據本領域已知的一般規則來選擇這些變體，以便對活性具有最小的影響(參見，例如bowie,j.u.等人，science247:1306-10(1990))。術語「效應器功能」是指可歸因於抗體fc區的那些生物活性，其隨抗體同種型而變化。抗體效應器功能的實例包括：c1q結合和補體依賴性細胞毒性(cdc)，fc受體結合，抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(adcc)，抗體依賴性細胞吞噬作用(adcp)，細胞因子分泌，免疫複合物介導的經由抗原呈遞細胞的抗原攝取，細胞表面受體(例如b細胞受體)的下調，和b細胞活化。「激活性fc受體」是被抗體fc區接合之後引出信號轉導事件的fc受體，所述事件刺激帶有該受體的細胞履行效應器功能。激活性fc受體包括fcγriiia(cd16a)，fcγri(cd64)，fcγriia(cd32)，和fcαri(cd89)。特定的激活性fc受體是人fcγriiia(參見uniprot登錄號p08637，版本141)。術語「tnf配體家族成員」或「tnf家族配體」是指促炎細胞因子。細胞因子，特別是tnf配體家族的成員，通常在免疫系統的刺激和協調中起關鍵作用。目前，根據序列，功能和結構相似性，已將19種細胞因子鑑定為tnf(腫瘤壞死因子)配體超家族的成員。所有這些配體都是具有c末端細胞外域(胞外域)，n末端胞內域和單個跨膜域的ii型跨膜蛋白。稱為tnf同源域(thd)的c末端細胞外域在超家族成員之間具有20-30％的胺基酸同一性，並且負責與受體的結合。tnf胞外域還負責tnf配體形成被其特異性受體識別的三聚體複合物。tnf配體家族的成員選自淋巴毒素α(也稱為lta或tnfsf1)，tnf(也稱為tnfsf2)，lt(也稱為tnfsf3)，ox40l(也稱為tnfsf4)，cd40l(也稱為cd154或tnfsf5)，fasl(也稱為cd95l，cd178或tnfsf6)，cd27l(也稱為cd70或tnfsf7)，cd30l(也稱為cd153或tnfsf8)，4-1bbl(也稱為tnfsf9)，trail(也稱為apo2l,cd253或tnfsf10)，rankl(也稱為cd254或tnfsf11)，tweak(也稱為tnfsf12)，april(也稱為cd256或tnfsf13)，baff(也稱為cd257或tnfsf13b)，light(也稱為cd258或tnfsf14)，tl1a(也稱為vegi或tnfsf15)，gitrl(也稱為tnfsf18)，eda-a1(也稱為外異蛋白a1)和eda-a2(也稱為外異蛋白a2)。該術語是指任何脊椎動物來源的任何天然tnf家族配體，包括哺乳動物，如靈長類動物(例如人)，非人靈長類動物(例如食蟹猴)和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)，除非另外指明。在本發明的具體實施方案中，tnf配體家族成員選自4-1bbl，ox40l，gitrl，cd70，cd30l，cd40l和light。在特定實施方案中，tnf配體家族成員選自4-1bbl和ox40l。可以從例如uniprot(www.uniprot.org)的可公開訪問的資料庫獲得tnf配體家族成員的更多信息，特別是序列。例如，人tnf配體具有以下胺基酸序列：人淋巴毒素α(uniprot登錄號p01374，seqidno:35)，人tnf(uniprot登錄號p01375，seqidno:36)，人淋巴毒素β(uniprot登錄號q06643，seqidno:37)，人ox40l(uniprot登錄號p23510，seqidno:38)，人cd40l(uniprot登錄號p29965，seqidno:39)，人fasl(uniprot登錄號p48023，seqidno:40)，人cd27l(uniprot登錄號p32970，seqidno:41)，人cd30l(uniprot登錄號p32971，seqidno:42)，4-1bbl(uniprot登錄號p41273，seqidno:43)，trail(uniprot登錄號p50591，seqidno:44)，rankl(uniprot登錄號o14788，seqidno:45)，tweak(uniprot登錄號o43508，seqidno:46)，april(uniprot登錄號o75888，seqidno:47)，baff(uniprot登錄號q9y275，seqidno:48)，light(uniprot登錄號o43557，seqidno:49)，tl1a(uniprot登錄號o95150，seqidno:50)，gitrl(uniprot登錄號q9ung2，seqidno:51)和外異蛋白a(uniprot登錄號q92838，seqidno:52)。「胞外域」是延伸到細胞外空間(即靶細胞外的空間)的膜蛋白的域。胞外域通常是引發與表面接觸的蛋白質模塊，導致信號轉導。因此，如本文中定義的tnf配體家族成員的胞外域是指延伸進入細胞外空間(細胞外域)的tnf配體蛋白的模塊，還包括負責三聚化和與相應tnf受體結合的較短部分或其片段。因此，術語「tnf配體家族成員的胞外域或其片段」是指形成細胞外域的tnf配體家族成員的細胞外域或其仍然能夠與受體結合的模塊(受體結合域)。術語「共刺激tnf配體家族成員」或「共刺激tnf家族配體」是指能夠共刺激t細胞的增殖和細胞因子產生的tnf配體家族成員亞型。這些tnf家族配體可以在與其相應的tnf受體相互作用時共刺激tcr信號，並且與其受體的相互作用導致tnfr相關因子(traf)的募集，其引發導致t細胞活化的信號級聯。共刺激tnf家族配體選自4-1bbl，ox40l，gitrl，cd70，cd30l和light，更特具體地說，共刺激tnf配體家族成員選自4-1bbl和ox40l。如前文中所述，4-1bbl是ii型跨膜蛋白，並且為tnf配體家族的一個成員。已經描述了在細胞表面上形成三聚體的具有胺基酸序列seqidno:43的完整或全長4-1bbl。通過4-1bbl的胞外域的特定基序而啟動三聚體形成。所述基序在本文中命名為「三聚化區域」。人4-1bbl序列的胺基酸50-254(seqidno:53)形成4-1bbl的細胞外域，但是即使其片段也能夠形成三聚體。在本發明的具體實施方案中，術語「4-1bbl的胞外域或其片段」是指具有選自seqidno:4(人4-1bbl的胺基酸52-254)，seqidno:1(人4-1bbl的胺基酸71-254)，seqidno:3(人4-1bbl的胺基酸80-254)，seqidno:2(人4-1bbl的胺基酸85-254)，seqidno:99(人4-1bbl的胺基酸71-248)，seqidno:100(人4-1bbl的胺基酸85-248)，seqidno:101(人4-1bbl的胺基酸80-248)和seqidno:102(人4-1bbl的胺基酸52-254)的胺基酸序列的多肽，但是能夠三聚化的胞外域的其他片段也包括在本文中。如前文中所述，ox40l是另一種ii型跨膜蛋白，並且為tnf配體家族的另一個成員。完整或全長的人ox40l具有seqidno:38的胺基酸序列。人ox40l序列的胺基酸51-183(seqidno:6)形成ox40l的細胞外域，但是即使其片段也能夠形成三聚體。在本發明的具體實施方案中，術語「ox40l的胞外域或其片段」是指具有選自seqidno:6(人ox40l的胺基酸51-183)或seqidno:7(人ox40l的胺基酸52-183)的胺基酸序列的多肽，但是能夠三聚化的胞外域的其他片段也包括在本文中。術語「肽接頭」是指包含一個或多個胺基酸的肽。肽接頭包含1-44個胺基酸，更加特別是2-20個胺基酸。肽接頭在本領域中是已知的或描述於本文中。適合的非免疫原性接頭肽例如是，(g4s)n，(sg4)n或g4(sg4)n肽接頭，其中「n」通常為1至10之間的數字，通常為2至4，特別是2，即，這些肽選自ggggs(seqidno:136)，ggggsggggs(seqidno:54)，sggggsgggg(seqidno:55)和ggggsggggsgggg(seqidno:56)，但也包括序列gspgssssgs(seqidno:57)，gsgsgsgs(seqidno:58)，gsgsgngs(seqidno:59)，ggsgsgsg(seqidno:60)，ggsgsg(seqidno:61)，ggsg(seqidno:62)，ggsgngsg(seqidno:63)，ggngsgsg(seqidno:64)和ggngsg(seqidno:65)。特別感興趣的肽接頭是(g4s)1或ggggs(seqidno:136)，(g4s)2或ggggsggggs(seqidno:54)和gspgssssgs(seqidno:57)，更具體地為(g4s)2或ggggsggggs(seqidno:54)和gspgssssgs(seqidno:57)。在本申請中使用的術語「胺基酸」表示包含丙氨酸(三字母代碼：ala，單字母代碼：a)，精氨酸(arg，r)，天冬醯胺(asn，n)，天冬氨酸(asp，d)，半胱氨酸(cys，c)，穀氨醯胺(gln，q)，穀氨酸(glu，e)，甘氨酸(gly，g)，組氨酸(his，h)，異亮氨酸(ile，i)，亮氨酸(leu，l)，賴氨酸(lys，k)，甲硫氨酸(met，m)，苯丙氨酸(phe，f)，脯氨酸(pro,p)，絲氨酸(ser，s)，蘇氨酸(thr，t)，色氨酸(trp，w)，酪氨酸(tyr，y)和纈氨酸(val，v)的天然存在的羧基α-胺基酸的組。如本文中使用的「單鏈融合蛋白」是指由與抗原結合模塊或fc部分的一部分融合的所述tnf配體家族成員的一個或兩個胞外域組成的單鏈多肽。通過經由肽接頭將抗原結合模塊的n末端或c末端胺基酸直接與所述tnf配體家族成員的胞外域的c末端或n末端胺基酸連接，可以進行融合。「融合」或「連接」意指組分(例如多肽和所述tnf配體家族成員的胞外域)通過肽鍵直接連接或經由一個或多個肽接頭連接。相對於參考多肽(蛋白質)序列的「胺基酸序列同一性百分比(％)」定義為在序列比對和引入空位(如果需要的話，達到最大序列同一性百分比，並且不考慮作為序列同一性的一部分的任何保守取代)之後候選序列中與參考多肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分比。以本領域技術人員熟知的各種方法可實現為了確定胺基酸序列同一性百分比的比對，例如，利用可公開獲得的計算機軟體，如blast，blast-2，align.sawi或megalign(dnastar)軟體。本領域技術人員可確定用於比對序列的適當參數，包括在所比較的序列的全長上實現最大比對所需要的任何算法。然而，出於本文的目的，通過使用序列比較電腦程式align-2生成了胺基酸序列同一性％值。align-2序列比較電腦程式由genentech公司創作，並且原始碼已在美國版權局(u.s.copyrightoffice,washingtond.c.,20559)與用戶文件一起備案，在美國版權局以美國版權登記號txu510087登記。align-2程序可從加利福尼亞州南舊金山的genentech公司公開獲得，或者可以從原始碼編譯。align-2程序應當編譯為供在包括數字unixv4.0d在內的unix作業系統上使用。所有序列比較參數均由align-2程序設定且沒有變化。在採用align-2進行胺基酸序列比較的情形下，給定胺基酸序列a相對於(與，或針對)給定胺基酸序列b的胺基酸序列同一性％(或者可表述為給定胺基酸序列a相對於(與，或針對)給定胺基酸序列b具有或包含一定的胺基酸序列同一性％)計算如下：100乘以分數x/y其中x為通過序列比對程序align-2在a與b的程序比對中評定為相同匹配的胺基酸殘基的數目，且其中y為b中的胺基酸殘基的總數。應當理解的是，在胺基酸序列a的長度不等於胺基酸序列b的長度的情況下，a相對於b的胺基酸序列同一性％不會等於b相對於a的胺基酸序列同一性％。除非另外特別說明，否則使用align-2電腦程式如前一段所述獲得在本文中使用的所有胺基酸序列同一性％值。在某些實施方案中，考慮了本文提供的含有tnf配體三聚體的抗原結合分子的胺基酸序列變體。例如，可能希望改善含有tnf配體三聚體的抗原結合分子的結合親和力和/或其他生物學性質。含有tnf配體三聚體的抗原結合分子的胺基酸序列變體可以通過向編碼所述分子的核苷酸序列引入適當的修飾，或通過肽合成來製備。這些修飾包括，例如，抗體胺基酸序列中的殘基的缺失和/或插入和/或取代。可以進行缺失，插入和取代的任何組合以得到最終的構建體，條件是最終構建體具有期望的特徵，例如抗原結合。取代型誘變的感興趣部位包括hvr和框架(fr)。在表b中的標題「優選取代」下提供了保守取代，並且在下文中參照胺基酸側鏈類別(1)至(6)進一步加以描述。可以將胺基酸替代引入感興趣的分子中，並篩選出具有期望活性的產物，所述活性例如保留/增強的抗原結合，降低的免疫原性，或增強的adcc或cdc。表b可以根據常見的側鏈性質將胺基酸分組：(1)疏水的：正亮氨酸，met，ala，val，leu，ile；(2)中性親水的：cys，ser，thr，asn，gln；(3)酸性的：asp，glu；(4)鹼性的：his，lys，arg；(5)影響鏈取向的殘基：gly，pro；(6)芳香族的：trp，tyr，phe。非保守取代需要將這些類之一的成員替換為另一類。術語「胺基酸序列變體」包括其中在親本抗原結合分子(例如人源化或人抗體)的一個或多個高變區殘基中存在胺基酸替代的實質性變體。通常，經過選擇用於進一步研究的所得變體相對於親本抗原結合分子在某些生物學特性(例如，增加的親和力，降低的免疫原性)方面將具有改變(例如提高)和/或將具有基本上保留的親本抗原結合分子的某些生物學特性。示例性的取代變體是親和力成熟抗體，可以方便地例如使用例如本文所述的那些基於噬菌體展示的親和力成熟技術來產生所述抗體。簡言之，將一個或多個hvr殘基突變，並且將變體抗原結合分子展示在噬菌體上並針對特定的生物活性(例如結合親和力)進行篩選。在某些實施方案中，取代，插入或缺失可以在一個或多個hvr內進行，只要這些改變基本上不降低抗原結合分子結合抗原的能力即可。例如，可以在hvr中進行基本上不降低結合親和力的保守改變(例如本文中提供的保守取代)。用於鑑定可能被靶向誘變的抗體殘基或區域的有用方法被稱為「丙氨酸掃描誘變」，如cunningham和wells(1989)science,244:1081-1085所述。在該方法中，鑑定殘基或一組靶殘基(例如，帶電殘基，如arg，asp，his，lys和glu)，並用中性或帶負電的胺基酸(例如丙氨酸或聚丙氨酸)替換，以確定抗體與抗原的相互作用是否受到影響。可以在針對初始取代顯示功能敏感性的胺基酸位置引入進一步的取代。替代地，或另外地，抗原-抗原結合分子複合物的晶體結構用於鑑定抗體和抗原之間的接觸點。這樣的接觸殘基和相鄰殘基可以作為取代候選物被靶向或消除。可以篩選變體以確定它們是否具備期望的特性。胺基酸序列插入包括長度從一個殘基到含有一百個或更多個殘基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及單個或多個胺基酸殘基的序列間插入。末端插入的實例包括具有n末端甲硫氨醯殘基的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子。分子的其他插入變體包括與多肽的n末端或c末端的融合，以增加含有tnf配體三聚體的抗原結合分子的血清半衰期。在某些實施方案中，改變本文中提供的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子以增加或降低抗體被糖基化的程度。通過改變胺基酸序列從而產生或去除一個或多個糖基化位點，可以方便地獲得分子的糖基化變體。當含有tnf配體三聚體的抗原結合分子包含fc區時，附著於其上的碳水化合物可能被改變。由哺乳動物細胞產生的天然抗體通常包含支鏈的雙觸角(biantennary)寡糖，其通常通過n鍵與fc區的ch2域的asn297連接。參見，例如wright等人，tibtech15:26-32(1997)。寡糖可以包括各種碳水化合物，例如甘露糖，n-乙醯氨基葡萄糖(glcnac)，半乳糖和唾液酸，以及與在雙觸角寡糖結構的「莖」中的glcnac附接的巖藻糖。在一些實施方案中，可以在含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子進行寡糖修飾，以產生具有某些改良特性的變體。在一個方面，提供了具有缺乏與fc區附接(直接或間接)的巖藻糖的碳水化合物結構的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的變體。這樣的巖藻糖基化變體可具有增強的adcc功能，參見，例如美國專利公開nos.us2003/0157108(presta,l.)或us2004/0093621(kyowahakkokogyoco.,ltd)。本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的其他變體包括具有二等分寡糖的那些，例如，其中與fc區附接的雙觸角寡糖被glcnac二等分。這些變體可以具有降低的巖藻糖基化和/或增強的adcc功能，參見例如wo2003/011878(jean-mairet等人)；美國專利no.6,602,684(umana等人)；和us2005/0123546(umana等人)。還提供了與fc區附接的寡糖中具有至少一個半乳糖殘基的變體。這樣的抗體變體可以具有增強的cdc功能，並被描述於例如wo1997/30087(patel等人)；wo1998/58964(raju,s.)；和wo1999/22764(raju,s.)中。在某些實施方案中，可能希望產生本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的半胱氨酸工程化的變體，例如「thiomab」，其中該分子的一個或多個殘基被半胱氨酸殘基取代。在特定實施方案中，取代的殘基出現在分子的可接近位置。通過用半胱氨酸取代那些殘基，由此反應性硫醇基團被定位在抗體的可接近位點，並且可以用於將抗體與其他模塊(例如藥物模塊或接頭-藥物模塊)綴合以產生免疫綴合物。在某些實施方案中，任何一個或多個以下殘基可以被半胱氨酸取代：輕鏈的v205(kabat編號)；重鏈的a118(eu編號)；和重鏈fc區的s400(eu編號)。可以按照例如美國專利no.7,521,541中的描述產生半胱氨酸工程化的抗原結合分子。在某些方面，本文中提供的含有tnf家族的配體三聚體的抗原結合分子可進一步被修飾，以含有另外的本領域已知並且易於獲得的非蛋白質模塊。適用於抗體衍生化的模塊包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(peg)，乙二醇/丙二醇共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1,3-二氧戊環，聚-1,3,6-三噁烷，乙烯/馬來酸酐共聚物，聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物，聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)，聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由於其在水中的穩定性而具有在製造方面的優點。聚合物可以具有任何分子量，並且可以是支鏈或非支鏈的。與抗體附接的聚合物的數量可以變化，並且如果附接一種以上的聚合物的話，它們可以是相同或不同的分子。通常，用於衍生化的聚合物的數量和/或類型可以基於以下考慮事項來確定，包括但不限於，待改進的抗體的特定性質或功能，是否將雙特異性抗體衍生物在限定的條件下用於治療中，等等。在另一個方面，提供了可通過暴露於輻射而選擇性加熱的抗體與非蛋白質模塊的綴合物。在一個實施方案中，非蛋白質模塊是碳納米管(kam,n.w.等人，proc.natl.acad.sci.usa102(2005)11600-11605)。輻射可以具有任何波長，並且包括但不限於不損害普通細胞的波長，但所述波長將非蛋白質模塊加熱到殺死抗體-非蛋白質模塊附近的細胞的溫度。在另一個方面，可以獲得本文中提供的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的免疫綴合物。「免疫綴合物」是與包括但不限於細胞毒性劑在內的一個或多個異源分子綴合的抗體。術語「多核苷酸」是指分離的核酸分子或構建體，例如，信使rna(mrna)，病毒來源的rna或質粒dna(pdna)。多核苷酸可以包含常規的磷酸二酯鍵或非常規鍵(例如，可見於肽核酸(pna)中的醯胺鍵)。術語「核酸分子」是指任何一個或多個核酸區段，例如，存在於多核苷酸中的dna或rna片段。關於「分離的」核酸分子或多核苷酸，意指已經從其天然環境中移出的核酸分子，dna或rna。例如，編碼包含在載體中的多肽的重組多核苷酸出於本發明的目的被認為是分離的。分離的多核苷酸的另外的例子包括保持在異源宿主細胞中的重組多核苷酸或溶液形式的純化的(部分地或基本上純化的)多核苷酸。分離的多核苷酸包括通常含有多核苷酸分子的細胞中所含的多核苷酸分子，但多核苷酸分子在染色體外存在或在與其天然染色體位置不同的染色體位置處存在。分離的rna分子包括本發明的體內或體外rna轉錄物，以及正鏈和負鏈形式以及雙鏈形式。根據本發明的分離的多核苷酸或核酸還包括合成產生的此類分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括調節元件，例如啟動子，核糖體結合位點或轉錄終止子。關於具有至少例如與本發明的參考核苷酸序列95％「相同」的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，意指除了該多核苷酸序列可以包括至多該參考核苷酸序列的每100個核苷酸的5個點突變之外，所述多核苷酸的核苷酸序列與參考序列相同。換句話說，為了獲得具有與參考核苷酸序列至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，參考序列中至多5％的核苷酸可以被缺失或被另一個核苷酸取代，或者，在參考序列中，總核苷酸的至多5％的多個核苷酸可被插入參考序列。參考序列的這些改變可以發生在參考核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之間的任何位置，獨立散布在參考序列的殘基之間或在參考序列內的一個基團或多個連續的基團中。實際情況是，使用例如上面針對多肽所討論的已知的電腦程式(例如align-2)，可以常規地確定任何特定的多核苷酸序列是否與本發明的核苷酸序列具有至少80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％同一性。術語「表達盒」是指重組或合成產生的多核苷酸，其具有一系列允許特定核酸在靶細胞中轉錄的特定核酸元件。重組表達盒可以摻入質粒，染色體，線粒體dna，質體dna，病毒或核酸片段中。通常，除了其他序列之外，表達載體的重組表達盒部分包括待轉錄的核酸序列和啟動子。在某些實施方案中，本發明的表達盒包含編碼本發明的雙特異性抗原結合分子或其片段的多核苷酸序列。術語「載體」或「表達載體」與「表達構建體」是同義的，並且是指用於將與其可操作地相關聯的特定基因引入靶細胞中並且指導所述特定基因的表達的dna分子。該術語包括作為自身複製核酸結構的載體以及組入其已被引入的宿主細胞中的基因組中的載體。本發明的表達載體包括表達盒。表達載體允許大量穩定的mrna的轉錄。一旦表達載體進入靶細胞內，則通過細胞轉錄和/或翻譯機制產生由該基因編碼的核糖核酸分子或蛋白質。在一個實施方案中，本發明的表達載體包括編碼本發明的雙特異性抗原結合分子或其片段的多核苷酸序列的表達盒。術語「宿主細胞」，「宿主細胞系」和「宿主細胞培養物」可互換使用，並且是指在其中引入了外源核酸的細胞，包括這些細胞的後代。宿主細胞包括「轉化體」和「轉化細胞」，其包括初級轉化細胞和從其衍生的後代，而不考慮傳代次數。後代在核酸含量方面與親本細胞可能不完全相同，而可能含有突變。在本文中包括具有與在原始轉化細胞中所篩選或選擇相同的功能或生物活性的突變體後代。宿主細胞是可用於產生本發明的雙特異性抗原結合分子的任何類型的細胞系統。宿主細胞包括培養的細胞，例如培養的哺乳動物細胞，例如cho細胞，bhk細胞，ns0細胞，sp2/0細胞，yo骨髓瘤細胞，p3x63小鼠骨髓瘤細胞，per細胞，per.c6細胞或雜交瘤細胞，酵母細胞，昆蟲細胞和植物細胞，在此僅列舉少數，還有包括在轉基因動物，轉基因植物或培養的植物或動物組織內的細胞。藥劑的「有效量」是指導致其所施用的細胞或組織的生理變化所必需的量。藥劑(例如藥物組合物)的「治療有效量」是指在劑量和時間段方面有效實現期望的治療或預防結果所需的量。例如，治療有效量的藥劑消除，減少，延遲，最小化或預防疾病的不利影響。「個體」或「受試者」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養動物(例如母牛，綿羊，貓，狗和馬)，靈長類動物(例如人類和非人靈長類動物如猴子)，兔，和齧齒動物(例如小鼠和大鼠)。具體地說，個體或受試者是人。術語「藥物組合物」是指其為這樣的形式的製劑，所述形式允許其中所含的活性成分的生物活性是有效的，並且所述製劑不含另外的對該製劑所施用的受試者具有不可接受的毒性的組分。「藥學上可接受的賦形劑」是指藥物組合物中除了活性成分以外的對受試者無毒的成分。藥學上可接受的賦形劑包括但不限於緩衝劑，穩定劑或防腐劑。術語「包裝說明書」用於指通常包括在治療產品的商業包裝中的說明書，其包含關於使用這種治療產品的適應症，用法，劑量，給藥，聯合療法，禁忌症和/或警告的信息。如本文中使用的，「治療」(「treatment」)(及其語法變化例如「治療」(「treat」)或「治療」(「treating」))是指試圖改變被治療個體的自然病程的臨床幹預，所述臨床幹預可用於預防或在臨床病理過程中進行。期望的治療效果包括但不限於預防疾病的發生或復發，症狀減輕，疾病的任何直接或間接病理結果的削減，預防轉移，降低疾病進展速度，改善或減輕疾病狀態，以及緩解或改善預後。在一些實施方案中，本發明的分子用於延緩疾病的發展或減緩疾病的進展。如本文中使用的術語「癌症」是指增殖性疾病，例如淋巴瘤，癌，淋巴瘤，母細胞瘤，肉瘤，白血病，淋巴細胞性白血病，肺癌，非小細胞肺癌(nscl)，支氣管肺泡細胞肺癌，骨癌，胰腺癌，皮膚癌，頭頸癌，皮膚或眼內黑素瘤，子宮癌，卵巢癌，直腸癌，肛門區癌，胃癌，胃癌，結腸直腸癌(crc)，胰腺癌，乳腺癌，三陰性乳腺癌，子宮癌，輸卵管癌，子宮內膜癌，子宮頸癌，陰道癌，外陰癌，霍奇金病，食道癌，小腸癌，內分泌系統的癌症，甲狀腺癌，甲狀旁腺癌，腎上腺癌，軟組織肉瘤，尿道癌，陰莖癌，前列腺癌，膀胱癌，腎癌或輸尿管癌，腎細胞癌，腎盂癌，間皮瘤，肝細胞癌，膽道癌，中樞神經系統(cns)腫瘤，脊索瘤，腦幹神經膠質瘤，多形性膠質母細胞瘤，星形細胞瘤，神經鞘瘤，室管膜瘤，成神經管細胞瘤，腦膜瘤，鱗狀細胞癌，垂體腺瘤和尤文氏肉瘤，黑素瘤，多發性骨髓瘤，b細胞癌(淋巴瘤)，慢性淋巴細胞性白血病(cll)，急性淋巴細胞性白血病(all)，毛細胞白血病，慢性髓細胞性白血病，包括任何上述癌症的難治性形式，或上述一種或多種癌症的組合。本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子本發明提供了具有特別有利的性質的含有新型tnf家族配體三聚體抗原結合分子，所述性質例如可生產性、穩定性、結合親和力、生物活性、靶向效率和降低的毒性。如此，本發明涉及含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，(b)包含三個(任選通過肽接頭)彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域。在一個方面，本發明提供了含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，(b)包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域。在另一個方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，(b)包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域，其中該包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽融合至該fc域的兩個亞基之一的n或c端胺基酸，任選經由肽接頭。在一個特定方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，(b)包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域，其中該tnf配體家族成員共刺激人t細胞活化。因此，該tnf配體家族成員是共刺激性tnf家族配體。具體地說，該共刺激性tnf家族配體選自4-1bbl，ox40l，gitrl，cd70，cd30l和light，更具體地說，該共刺激性tnf家族配體選自4-1bbl和ox40l。在一個方面，該tnf配體家族成員是4-1bbl。在一個另外的方面，該tnf配體家族成員的胞外域包含選自seqidno:1，seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:99，seqidno:100，seqidno:101和seqidno:102的胺基酸序列，特別是seqidno:1或seqidno:99的胺基酸序列。在一個特定方面，tnf配體家族成員的胞外域或其片段包含選自seqidno:1，seqidno:2，seqidno:3，和seqidno:4的胺基酸序列，特別是seqidno:1的胺基酸序列。在又一個方面，本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，和(b)包含seqidno:5或seqidno:103的胺基酸序列的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域。更具體地說，該多肽包含seqidno:5的胺基酸序列。在另一個方面，該tnf配體家族成員是ox40l。在另一個方面，該tnf配體家族成員的胞外域包含選自seqidno:6和seqidno:7的胺基酸序列，特別是seqidno:6的胺基酸序列。在又一個方面，本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，和(b)包含seqidno:8的胺基酸序列的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域。在一個方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，(b)包含三個彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域，其中該三個tnf配體家族成員的胞外域或其片段直接或用合適的化學接頭，諸如二硫化物，酯或醚橋彼此連接。在另一個方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，(b)包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域，其中該三個tnf配體家族成員的胞外域或其片段通過肽接頭彼此連接，該肽接頭是相同的或不同的且選自ggggsggggs(seqidno:54)，sggggsgggg(seqidno:55)和ggggsggggsgggg(seqidno:56)，但是還包括序列gspgssssgs(seqidno:57)，gsgsgsgs(seqidno:58)，gsgsgngs(seqidno:59)，ggsgsgsg(seqidno:60)，ggsgsg(seqidno:61)，ggsg(seqidno:62)，ggsgngsg(seqidno:63)，ggngsgsg(seqidno:64)和ggngsg(seqidno:65)。具體地說，該肽接頭是相同的且選自(g4s)2(seqidno:54)和gspgssssgs(seqidno:57)。更具體地說，本發明涉及如上文定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該三個tnf配體家族成員的胞外域或其片段通過(g4s)2接頭彼此連接。在另一個方面，本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，(b)包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域，其中該包含三個tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽在c端胺基酸處融合至該fc域的亞基之一的n端胺基酸。在一個特定方面，該包含三個tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽在c端胺基酸處融合至該fc域中的ch2域的n端胺基酸。在又一個方面，該包含三個tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽在c端胺基酸處通過肽接頭連接至該fc域的n端胺基酸。在另一個方面，本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，(b)包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域，其中該包含三個tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽在n端胺基酸處融合至該fc域的c端胺基酸。在一個特定方面，該包含三個tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽在n端胺基酸處融合至該fc域中的ch3域的c端胺基酸。在又一個方面，該包含三個tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽在n端胺基酸處通過肽接頭連接至該fc域的c端胺基酸。在另一個方面，含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，(b)包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域，其中該能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊沒有融合至該包含三個tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽。在一個另外的方面，本發明提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊選自抗體，抗體片段和支架抗原結合蛋白。在一個方面，本發明提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊是抗體。在另一個方面，本發明提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊是抗體片段。具體地說，抗體片段選自fab分子，交換fab分子，單鏈fab分子，fv分子，scfv分子，單域抗體，和vh。在又一個方面，本發明提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊是支架抗原結合蛋白。如此，在又一個方面，本發明涉及如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊選自抗體片段，fab分子，交換fab分子，單鏈fab分子，fv分子，scfv分子，單域抗體，vh和支架抗原結合蛋白。如此，在一個特定方面，本發明提供了含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的抗體片段，其選自fab分子，交換fab分子，單鏈fab分子，fv分子，scfv分子，單域抗體，vh和支架抗原結合蛋白，(b)包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域。在一個方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(a)一個能夠特異性結合靶細胞抗原的抗體片段，其選自fab分子，交換fab分子，單鏈fab分子，fv分子，scfv分子，單域抗體，vh和支架抗原結合蛋白。在一個特定方面，本發明與如上定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子有關，其中能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊是能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子。如此，本發明提供了含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子的，(b)包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域。在另一個方面，提供了本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中靶細胞抗原選自成纖維細胞激活蛋白(fap)，癌胚抗原(cea)，黑素瘤關聯硫酸軟骨素蛋白聚糖(mcsp)，表皮生長因子受體(egfr)，cd19，cd20和cd33。在又一個方面，提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域是iggfc域，特別是igg1fc域或igg4fc域。具體地說，該由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域是igg1fc域。在一個特定方面，該fc域包含促進fc域的第一和第二亞基聯合的修飾。降低fc受體結合和/或效應器功能的fc結構域修飾本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的fc結構域由包含免疫球蛋白分子的重鏈結構域的一對多肽鏈組成。例如，免疫球蛋白g(igg)分子的fc結構域是二聚體，其每個亞基包含igg重鏈恆定結構域ch2和ch3。fc結構域的兩個亞基能夠彼此穩定聯合。fc結構域對本發明的抗原結合分子賦予有利的藥代動力學特性，包括有助於靶組織中良好積聚的長血清半衰期和有利的組織-血液分配比。如此，fc域有利地促進抗原結合分子的藥代動力學參數(pk數據)，諸如清除率、分布容積或消除半衰期(t1/2)。然而，與此同時，可能導致本發明的雙特異性抗體不期望地靶向表達fc受體的細胞而不是優選的抗原攜帶細胞。因此，在特定方面，與天然igg1fc結構域相比，本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的fc結構域表現出降低的對fc受體的結合親和力和/或降低的效應器功能。在一個方面，該fc基本上不與fc受體結合和/或不誘導效應器功能。在一個特定方面，該fc受體是fcγ受體。在一個方面，該fc受體是人fc受體。在一個具體方面，該fc受體是激活性人fcγ受體，更具體地說是人fcγriiia、fcγri或fcγriia，最具體地說是人fcγriiia。在一個方面，該fc結構域不誘導效應器功能。降低的效應器功能可以包括但不限於以下一者或多者：降低的補體依賴性細胞毒性(cdc)、降低的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(adcc)、降低的抗體依賴性細胞吞噬作用(adcp)、細胞因子分泌減少、免疫複合物介導的經由抗原呈遞細胞的抗原攝取減少、與nk細胞的結合減少、與巨噬細胞的結合減少、與單核細胞的結合減少、與多形核細胞的結合減少、直接信號轉導誘導性細胞凋亡減少、降低的樹突細胞成熟、或減少的t細胞引發。在某些方面，可以在本文中提供的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的fc區中引入一個或多個胺基酸修飾，從而產生fc區變體。fc區變體可以包含在一個或多個胺基酸位置上含有胺基酸修飾(例如取代)的人fc區序列(例如人igg1、igg2、igg3或igg4fc區)。在一個方面，本發明涉及如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含：(a)至少一個能夠與靶細胞抗原特異性結合的模塊，(b)包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc結構域，其中fc結構域包含一個或多個降低與fc受體尤其是fcγ受體結合的胺基酸替代。在一個方面，本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的fc結構域包含一個或多個降低fc結構域與fc受體的結合親和力和/或效應器功能的胺基酸突變。通常，在fc結構域的兩個亞基的每一個中存在相同的一個或多個胺基酸突變。具體地說，fc結構域包含在位置e233、l234、l235、n297、p331和p329(eu編號)處的胺基酸替代。具體地說，fc結構域包含在igg重鏈的位置234和235(eu編號)和/或329(eu編號)處的胺基酸替代。更具體地說，提供了根據本發明的含有三聚體tnf家族配體的抗原結合分子，其包含具有在igg重鏈中的胺基酸替代l234a、l235a和p329g(「p329glala」，eu編號)的fc結構域。胺基酸替代l234a和l235a是指所謂的lala突變。胺基酸替代的「p329glala」組合幾乎完全消除了人igg1fc結構域的fcγ受體結合，並被描述於國際專利申請公開no.wo2012/130831a1中，該文獻還描述了製備這種突變體fc結構域的方法以及用於確定其特性諸如fc受體結合或效應器功能的方法。「eu編號」是指根據kabat等人在sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,1991中的eu索引的編號。具有降低的fc受體結合和/或效應器功能的fc結構域還包含具有一個或多個fc結構域殘基238、265、269、270、297、327和329的取代的fc結構域(美國專利no.6,737,056)。這樣的fc突變體包括具有在兩個或多個胺基酸位置265、269、270、297和327處的取代的fc突變體，包括所謂的「dana」fc突變體，其殘基265和297被替代為丙氨酸(美國專利no.7,332,581)。在另一個方面，fc結構域為igg4fc結構域。與igg1抗體相比，igg4抗體展現出對fc受體的降低的結合親和力和降低的效應器功能。在更具體的方面，fc結構域是包含在位置s228(kabat編號)處的胺基酸替代具體地為胺基酸替代s228p的igg4fc結構域。在更具體的方面，fc結構域是包含胺基酸替代l235e和s228p和p329g(eu編號)的igg4fc結構域。這樣的igg4fc結構域突變體及其fcγ受體結合特性也描述於wo2012/130831中。可以使用本領域熟知的遺傳學或化學方法通過胺基酸缺失、取代、插入或修飾來製備突變體fc結構域。遺傳學方法可包括編碼dna序列的位點特異性誘變、pcr、基因合成等。可以通過例如測序來驗證正確的核苷酸變化。可以例如通過elisa或通過使用諸如biacore儀(gehealthcare)的標準儀器的表面等離子體共振(spr)容易地確定與fc受體的結合，並且可以例如通過重組表達獲得fc受體。適合的此類結合測定描述於本文中。或者，可以使用已知表達特定fc受體的細胞系例如表達fcγiiia受體的人nk細胞來評估fc結構域或包含fc結構域的細胞活化性雙特異性抗原結合分子針對fc受體的結合親和力。可以通過本領域已知的方法測量fc結構域或包含fc結構域的本發明的雙特異性抗體的效應器功能。適合的用於測量adcc的測定法描述於本文中。評估感興趣分子的adcc活性的體外測定法的其他實例描述於美國專利no.5,500,362；hellstrom等人，proc.natlacadsciusa83,7059-7063(1986)和hellstrom等人，procnatlacadsciusa82,1499-1502(1985)；美國專利no.5,821,337；bruggemann等人，jexpmed166,1351-1361(1987)。或者，可以採用非放射性測定方法(參見，例如actitmnon-radioactivecytotoxicityassayforflowcytometry(celltechnology,inc.mountainview,ca)；cytotoxnon-radioactivecytotoxicityassay(promega,madison,wi))。用於這種測定法的有用的效應細胞包括外周血單核細胞(pbmc)和自然殺傷(nk)細胞。替代地，或另外地，可以在體內，例如，在clynes等人，procnatlacadsciusa95,652-656(1998)中公開的動物模型中評估感興趣分子的adcc活性。在一些實施方案中，fc結構域與補體成分特別是c1q的結合減少。因此，在其中將fc結構域工程化以具有降低的效應器功能的一些實施方案中，所述降低的效應器功能包括降低的cdc。可以進行c1q結合測定以確定本發明的雙特異性抗體是否能夠與c1q結合併因此具有cdc活性。參見，例如wo2006/029879和wo2005/100402中的c1q和c3c結合elisa。為了評估補體激活，可以進行cdc測定(參見，例如gazzano-santoro等人，jimmunolmethods202,163(1996)；cragg等人，blood101,1045-1052(2003)；以及cragg和glennie,blood103,2738-2743(2004))。在一個特定方面，fc結構域包含促進fc結構域的第一和第二亞基聯合的修飾。促進異源二聚化的fc結構域修飾fc域包含與fc結構域的兩個亞基中的一個或另一個融合的不同模塊，所述亞基通常包含在兩個不相同的多肽鏈(「重鏈」)中。這些多肽的重組共表達和隨後的二聚化導致兩個多肽的若干可能的組合。為了在重組生產中提高含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的產率和純度，因此在本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的fc結構域中引入促進期望多肽的聯合的修飾將是有利的。因此，本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的fc結構域包含促進fc結構域的第一和第二亞基的聯合的修飾。人iggfc結構域的兩個亞基之間最廣泛的蛋白質-蛋白質相互作用的位點在fc結構域的ch3結構域中。因此，所述修飾具體地在fc結構域的ch3結構域中。在一個具體方面，所述修飾是所謂的「節入穴」修飾，包括在fc結構域的兩個亞基之一中的「節」修飾和fc結構域的兩個亞基的另一個中的「穴」修飾。因此，在一個特定方面，本發明涉及如前文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包括igg分子，其中第一重鏈的fc模塊包含第一個二聚化模塊，並且第二重鏈的fc模塊包含允許igg分子的兩條重鏈異二聚化的第二個二聚化模塊；根據節入穴技術，第一個二聚化模塊包括節，第二個二聚化模塊包括穴。「節入穴」技術例如描述於us5,731,168；us7,695,936；ridgway等人proteng9,617-621(1996)andcarter,jimmunolmeth248,7-15(2001)中。通常，該方法包括在第一多肽的界面處引入突起(「節」)並且在第二多肽的界面中引入相應的腔(「穴」)，使得該突起可以定位在該腔中，從而促進異二聚體形成並阻礙同二聚體形成。通過用較大的側鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換第一多肽的界面的小胺基酸側鏈而構建突起。通過用較小的胺基酸側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換大的胺基酸側鏈，在第二多肽的界面中產生與突起具有相同或相似大小的補償腔。因此，在特定方面，在本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的fc結構域的第一亞基的ch3結構域中，將胺基酸殘基替換為具有較大側鏈體積的胺基酸殘基，由此在第一亞基的ch3結構域內產生可定位於第二亞基的ch3結構域內的腔中的突起；並且在fc結構域的第二亞基的ch3結構域中，將胺基酸殘基替換為具有較小側鏈體積的胺基酸酸殘基，由此在第二亞基的ch3結構域內產生可將第一亞基的ch3結構域內的突起定位在其中的腔。可以通過改變編碼多肽的核酸，例如通過位點特異性誘變、或通過肽合成而產生突起和腔。在一個具體方面，在fc結構域的第一亞基的ch3結構域中，第366位的蘇氨酸殘基替換為色氨酸殘基(t366w)，而在fc結構域的第二亞基的ch3結構域中，第407位酪氨酸殘基替換為纈氨酸殘基(y407v)。更具體地說，在fc結構域的第二亞基中，另外將366位的蘇氨酸殘基替換為絲氨酸殘基(t366s)，將368位的亮氨酸殘基替換為丙氨酸殘基(l368a)。更具體地說，在fc結構域的第一亞基中，另外將第354位的絲氨酸殘基替換為半胱氨酸殘基(s354c)，而在fc結構域的第二亞基中，第349位酪氨酸殘基替換為半胱氨酸殘基(y349c)。引入這兩個半胱氨酸殘基導致在fc結構域的兩個亞基之間形成二硫橋。二硫橋進一步使該二聚體穩定(carter,jimmunolmethods248,7-15(2001))。在一個替代方面，促進fc結構域的第一和第二亞基的聯合的修飾包括介導靜電操縱效應的修飾，例如，如pct公開wo2009/089004中所述。通常，這種方法包括通過將兩個fc結構域亞基的界面處的一個或多個胺基酸殘基替換為帶電胺基酸殘基，使得在靜電方面不利於同二聚體形成，但在靜電方面有利於異二聚化。特定的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子在另一個方面，提供了單價的如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊。具體地說，本發明的包含(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子進一步包含(a)能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子，其中fab重鏈在c端處融合至該fc域中的ch2域的n端。而且，本發明提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(a)重鏈和輕鏈，二者構成能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子，和(b)融合蛋白，其包含seqidno:15的胺基酸序列。在又一個方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子的vh域，(ii)輕鏈，其包含能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。在一個特定方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含包含seqidno:16的胺基酸序列的vh域或包含seqidno:110的胺基酸序列的vh域，(ii)輕鏈，其包含包含seqidno:17的胺基酸序列的vl域或包含seqidno:111的胺基酸序列的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。在另一個方面，含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含包含seqidno:118的胺基酸序列的vh域，(ii)輕鏈，其包含包含seqidno:119的胺基酸序列的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。在又一個方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含包含seqidno:126的胺基酸序列的vh域或包含seqidno:134的胺基酸序列的vh域，(ii)輕鏈，其包含包含seqidno:127的胺基酸序列的vl域或包含seqidno:135的胺基酸序列的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。在另一個方面，提供了二價的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含兩個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊。在一個方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子的vh域或vl域，(ii)兩條輕鏈，各自包含能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子的vl域或vh域，和(iii)第二重鏈，其包含能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子的vh域或vl域和seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。在一個方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子的vh域，(ii)兩條輕鏈，各自包含能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子的vh域和seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。在一個特定方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含包含seqidno:16的胺基酸序列的vh域或包含seqidno:110的胺基酸序列的vh域，(ii)兩條輕鏈，各自包含包含seqidno:17的胺基酸序列的vl域或包含seqidno:111的胺基酸序列的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含包含seqidno:16的胺基酸序列的vh域或包含seqidno:110的胺基酸序列的vh域和seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。在另一個方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含包含seqidno:118的胺基酸序列的vh域，(ii)兩條輕鏈，各自包含包含seqidno:119的胺基酸序列的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含包含seqidno:118的胺基酸序列的vh域和seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。在還有另一個方面，該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含包含seqidno:126的胺基酸序列的vh域或包含seqidno:134的胺基酸序列的vh域，(ii)兩條輕鏈，其包含包含seqidno:127的胺基酸序列的vl域或包含seqidno:135的胺基酸序列的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含包含seqidno:126的胺基酸序列的vh域或包含seqidno:134的胺基酸序列的vh域和seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。在一個方面，提供了依照本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(a)重鏈和輕鏈，該重鏈包含vh域，該vh域包含(i)包含seqidno:9的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:10的胺基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:11的胺基酸序列的cdr-h3，該輕鏈包含vl域，該vl域包含(iv)包含seqidno:12的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:13的胺基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:14的胺基酸序列的cdr-l3，和(b)融合蛋白，其包含seqidno:15的胺基酸序列。在又一個方面，本發明提供依照本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(a)能夠特異性結合fap的模塊，其包含包含seqidno:16的胺基酸序列的vh域和包含seqidno:17的胺基酸序列的vl域，和(b)融合蛋白，其包含seqidno:15的胺基酸序列。在一個特定方面，提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)可變重鏈，其包含seqidno:16的胺基酸序列，(ii)可變輕鏈，其包含seqidno:17的胺基酸序列，和(iii)多肽，其包含seqidno:5的胺基酸序列。在一個特定方面，提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)重鏈，其包含seqidno:16的胺基酸序列，(ii)輕鏈，其包含seqidno:17的胺基酸序列，和(iii)融合蛋白，其包含seqidno:15的胺基酸序列。在另一個方面，提供了如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(a)重鏈和輕鏈，二者構成能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子，和(b)融合蛋白，其包含seqidno:20的胺基酸序列。在一個方面，提供了依照本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(a)重鏈和輕鏈，該重鏈包含vh域，該vh域包含(i)包含seqidno:9的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:10的胺基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:11的胺基酸序列的cdr-h3，該輕鏈包含vl域，該vl域包含(iv)包含seqidno:12的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:13的胺基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:14的胺基酸序列的cdr-l3，和(b)融合蛋白，其包含seqidno:20的胺基酸序列。在又一個方面，本發明提供了依照本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(a)能夠特異性結合fap的模塊，其包含包含seqidno:16的胺基酸序列的vh域和包含seqidno:17的胺基酸序列的vl域，和(b)融合蛋白，其包含seqidno:20的胺基酸序列。在一個特定方面，提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)可變重鏈，其包含seqidno:16的胺基酸序列，(ii)可變輕鏈，其包含seqidno:17的胺基酸序列，和(iii)多肽，其包含seqidno:8的胺基酸序列。在一個特定方面，提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)重鏈，其包含seqidno:16的胺基酸序列，(ii)輕鏈，其包含seqidno:17的胺基酸序列，和(iii)融合蛋白，其包含seqidno:20的胺基酸序列。含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中靶細胞抗原是fap在一個特定方面，靶細胞抗原是成纖維細胞激活蛋白(fap)。在一個方面，本發明提供了如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該能夠特異性結合fap的模塊包含vh域和vl域，(a)該vh域包含(i)包含seqidno:9的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:10的胺基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:11的胺基酸序列的cdr-h3，該vl域包含(iv)包含seqidno:12的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:13的胺基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:14的胺基酸序列的cdr-l3；或(b)該vh域包含(i)包含seqidno:104的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:105的胺基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:106的胺基酸序列的cdr-h3，該vl域包含(iv)包含seqidno:107的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:108的胺基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:109的胺基酸序列的cdr-l3。在一個方面，該能夠特異性結合fap的模塊包含vh域和vl域，該vh域包含(i)包含seqidno:9的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:10的胺基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:11的胺基酸序列的cdr-h3，該vl域包含(iv)包含seqidno:12的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:13的胺基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:14的胺基酸序列的cdr-l3。在另一個特定的方面，該能夠特異性結合fap的模塊包含vh域和vl域，該vh域包含(i)包含seqidno:104的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:105的胺基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:106的胺基酸序列的cdr-h3，該vl域包含(iv)包含seqidno:107的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:108的胺基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:109的胺基酸序列的cdr-l3。在又一個方面，能夠與fap特異性結合的模塊包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含與seqidno:16的胺基酸序列具有至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的胺基酸序列，所述輕鏈可變區包含與seqidno:17的胺基酸序列具有至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的胺基酸序列。在一個特定方面，能夠與fap特異性結合的模塊包含：包含seqidno:16的胺基酸序列的重鏈可變區和包含seqidno:17的胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個具體方面，能夠與fap特異性結合的模塊包含：由seqidno:16的胺基酸序列組成的vh結構域和由seqidno:17的胺基酸序列組成的vl結構域。在又一個特定方面，本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含：包含seqidno:18的胺基酸序列的重鏈和包含seqidno:19的胺基酸序列的輕鏈。在一個具體方面，含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子包含：由seqidno:18的胺基酸序列組成的重鏈和由seqidno:19的胺基酸序列組成的輕鏈。在另一個方面，能夠與fap特異性結合的模塊包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含與seqidno:110的胺基酸序列具有至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的胺基酸序列，所述輕鏈可變區包含與seqidno:111的胺基酸序列具有至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的胺基酸序列。在一個特定方面，能夠與fap特異性結合的模塊包含：包含seqidno:110的胺基酸序列的重鏈可變區和包含seqidno:111的胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個具體方面，能夠與fap特異性結合的模塊包含：由seqidno:110的胺基酸序列組成的vh結構域和由seqidno:111的胺基酸序列組成的vl結構域。在一個方面，提供了單價的如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含一個能夠與fap特異性結合的模塊。在一個特定方面，提供了如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)可變重鏈，其包含seqidno:18的胺基酸序列，(ii)可變輕鏈，其包含seqidno:19的胺基酸序列，和(iii)融合蛋白，其包含seqidno:15的胺基酸序列。在又一個特定方面，提供了如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)可變重鏈，其包含seqidno:140的胺基酸序列，(ii)可變輕鏈，其包含seqidno:142的胺基酸序列，和(iii)融合蛋白，其包含seqidno:15的胺基酸序列。在另一個特定方面，提供了如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)可變重鏈，其包含seqidno:18的胺基酸序列，(ii)可變輕鏈，其包含seqidno:19的胺基酸序列，和(iii)融合蛋白，其包含seqidno:20的胺基酸序列。在另一個方面，提供了二價的如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含兩個能夠與fap特異性結合的模塊。在一個特定方面，提供了如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)可變重鏈，其包含seqidno:140的胺基酸序列，(ii)可變輕鏈，其包含seqidno:142的胺基酸序列，和(iii)融合蛋白，其包含seqidno:141的胺基酸序列。含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中靶細胞抗原是cea在另一個方面，靶細胞抗原是cea。在一個方面，本發明提供了如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該能夠特異性結合cea的模塊包含vh域和vl域，該vh域包含(i)包含seqidno:112的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:113的胺基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:114的胺基酸序列的cdr-h3，該vl域包含(iv)包含seqidno:115的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:116的胺基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:117的胺基酸序列的cdr-l3。在又一個方面，能夠與cea特異性結合的模塊包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含與seqidno:118的胺基酸序列具有至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的胺基酸序列，所述輕鏈可變區包含與seqidno:119的胺基酸序列具有至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的胺基酸序列。在一個特定方面，能夠與cea特異性結合的模塊包含：包含seqidno:118的胺基酸序列的重鏈可變區和包含seqidno:119的胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個具體方面，能夠與fap特異性結合的模塊包含：由seqidno:118的胺基酸序列組成的vh結構域和由seqidno:119的胺基酸序列組成的vl結構域。在一個方面，提供了單價的如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含一個能夠與cea特異性結合的模塊。在一個特定方面，提供了如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)可變重鏈，其包含seqidno:146的胺基酸序列，(ii)可變輕鏈，其包含seqidno:148的胺基酸序列，和(iii)融合蛋白，其包含seqidno:15的胺基酸序列。在另一個方面，提供了二價的如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含兩個能夠與cea特異性結合的模塊。在一個特定方面，提供了如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)可變重鏈，其包含seqidno:146的胺基酸序列，(ii)可變輕鏈，其包含seqidno:148的胺基酸序列，和(iii)融合蛋白，其包含seqidno:147的胺基酸序列。含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中靶細胞抗原是cd19在還有另一個方面，該靶細胞抗原是cd19。在一個方面，本發明提供了如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該能夠特異性結合cd9的模塊包含vh域和vl域，(a)該vh域包含(i)包含seqidno:120的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:121的胺基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:122的胺基酸序列的cdr-h3，該vl域包含(iv)包含seqidno:123的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:124的胺基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:125的胺基酸序列的cdr-l3；或(b)該vh域包含(i)包含seqidno:128的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:129的胺基酸序列的cdr-h2，和(iii)包含seqidno:130的胺基酸序列的cdr-h3，該vl域包含(iv)包含seqidno:131的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:132的胺基酸序列的cdr-l2，和(vi)包含seqidno:133的胺基酸序列的cdr-l3。在又一個方面，能夠與cd19特異性結合的模塊包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含與seqidno:126的胺基酸序列具有至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的胺基酸序列，所述輕鏈可變區包含與seqidno:127的胺基酸序列具有至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的胺基酸序列。在另一個方面，能夠與cd19特異性結合的模塊包含重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區包含與seqidno:134的胺基酸序列具有至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的胺基酸序列，所述輕鏈可變區包含與seqidno:135的胺基酸序列具有至少約95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的胺基酸序列。在一個特定方面，能夠與cd19特異性結合的模塊包含：包含seqidno:126的胺基酸序列的重鏈可變區和包含seqidno:127的胺基酸序列的輕鏈可變區。在一個具體方面，能夠與fap特異性結合的模塊包含：由seqidno:118的胺基酸序列組成的vh結構域和由seqidno:119的胺基酸序列組成的vl結構域。在另一特定方面，能夠與cd19特異性結合的模塊包含：包含seqidno:134的胺基酸序列的可變重鏈和包含seqidno:135的胺基酸序列的可變輕鏈。在一個具體方面，能夠與fap特異性結合的模塊包含：由seqidno:134的胺基酸序列組成的vh結構域和由seqidno:135的胺基酸序列組成的vl結構域。在一個方面，提供了單價的如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含一個能夠與cd19特異性結合的模塊。在一個特定方面，提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)可變重鏈，其包含seqidno:152的胺基酸序列，(ii)可變輕鏈，其包含seqidno:154的胺基酸序列，和(iii)融合蛋白，其包含seqidno:15的胺基酸序列。在又一個特定方面，提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)可變重鏈，其包含seqidno:158的胺基酸序列，(ii)可變輕鏈，其包含seqidno:160的胺基酸序列，和(iii)融合蛋白，其包含seqidno:15的胺基酸序列。在另一個方面，提供了二價的如上文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含兩個能夠與cd19特異性結合的模塊。在一個特定方面，提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)可變重鏈，其包含seqidno:152的胺基酸序列，(ii)可變輕鏈，其包含seqidno:154的胺基酸序列，和(iii)融合蛋白，其包含seqidno:153的胺基酸序列。在又一個特定方面，提供了如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)可變重鏈，其包含seqidno:158的胺基酸序列，(ii)可變輕鏈，其包含seqidno:160的胺基酸序列，和(iii)融合蛋白，其包含seqidno:159的胺基酸序列。多核苷酸類本發明進一步提供了編碼如本文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的分離的多核苷酸或其片段。編碼本發明的含有tnf配體三聚體的抗原結合分子的分離的多核苷酸可以表述為編碼整個抗原結合分子的單個多核苷酸或共表達的多個(例如兩個或更多個)多核苷酸。由共表達的多核苷酸編碼的多肽可以通過例如二硫鍵或其他手段聯合以形成功能性抗原結合分子。例如，免疫球蛋白的輕鏈模塊可以由與免疫球蛋白的重鏈模塊分開的多核苷酸編碼。重鏈多肽將在共表達時與輕鏈多肽聯合以形成免疫球蛋白。在一些方面，分離的多核苷酸編碼如本文中描述的根據本發明的完整的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子。在其它實施方案中，分離的多核苷酸編碼包含在如本文中描述的根據本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子中的多肽。在一個方面，本發明涉及編碼含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)編碼能夠與靶細胞抗原特異性結合的模塊的序列，(b)編碼包含通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的三個胞外域或其片段的多肽的序列，和(c)編碼由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域的序列。在另一個方面，提供了編碼含有4-1bb配體三聚體的抗原結合分子的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)編碼能夠與靶細胞抗原特異性結合的模塊的序列，(b)編碼包含通過肽接頭彼此連接的4-1bb的三個胞外域或其片段的多肽的序列，和(c)編碼由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域的序列。在又一個方面，本發明涉及分離的多核苷酸，其包含編碼包含三個4-1bbl片段的多肽的序列，所述4-1bbl片段包含與seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:99、seqidno:100、seqidno:101或seqidno:102所示胺基酸序列具有至少約90％、95％、98％或100％同一性的胺基酸序列。在一個方面，提供了分離的多核苷酸，其包含編碼包含seqidno:5或seqidno:103的胺基酸序列的多肽的序列。在另一個方面，提供了編碼含有ox40配體三聚體的抗原結合分子的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(a)編碼能夠與靶細胞抗原特異性結合的模塊的序列，(b)編碼包含通過肽接頭彼此連接的ox40l的三個胞外域或其片段的多肽的序列，和(c)編碼由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域的序列。在又一個方面，本發明涉及分離的多核苷酸，其包含編碼包含三個ox40l片段的多肽的序列，所述ox40l片段包含與seqidno:6或seqidno:7所示胺基酸序列具有至少約90％、95％、98％或100％同一性的胺基酸序列。在一個方面，提供了分離的多核苷酸，其包含編碼包含seqidno:8的胺基酸序列的多肽的序列。在另一個方面，提供了分離的多核苷酸，其編碼含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該多核苷酸包含(a)編碼能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊的序列，(b)編碼包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段且在c端胺基酸處融合至該fc域中的ch2域的n端胺基酸的多肽的序列，(c)編碼由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域的序列。在又一個方面，提供了分離的多核苷酸，其編碼含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該多核苷酸包含(a)編碼能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊的序列，(b)編碼包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段且在n端胺基酸處融合至該fc域中的ch3域的c端胺基酸的多肽的序列，和(c)編碼由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域的序列。在一個方面，本發明涉及分離的多核苷酸，其包含編碼igg1fc域的序列。在一個特定方面，該分離的多核苷酸包含編碼在位置234，235和/或329(eu編號方式)處具有胺基酸替代的fc域的序列。在另一個方面，本發明涉及分離的多核苷酸，其包含與seqidno:66所示核酸序列具有至少約80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的序列。在又一個方面，提供了分離的多核苷酸，其包含與seqidno:87所示核酸序列具有至少約80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的序列。在又一個方面，本發明涉及分離的多核苷酸，其編碼含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該多核苷酸包含編碼重鏈和輕鏈的序列，該重鏈和輕鏈二者構成能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子，和seqidno:66的核酸序列。在又一個方面，本發明涉及分離的多核苷酸，其編碼含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該多核苷酸包含編碼重鏈和輕鏈的序列，該重鏈和輕鏈二者構成能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子，和seqidno:87的核酸序列。在一個方面，提供了編碼含有4-1bbl三聚體的抗原結合分子的分離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼下述各項的序列：(a)重鏈和輕鏈，該重鏈包含vh域，該vh域包含(i)包含seqidno:9的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:10的胺基酸序列的cdr-h2和(iii)包含seqidno:11的胺基酸序列的cdr-h3，該輕鏈包含vl域，該vl域包含(iv)包含seqidno:12的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:13的胺基酸序列的cdr-l2和(vi)包含seqidno:14的胺基酸序列的cdr-l3，和(b)包含seqidno:5的胺基酸序列的多肽。在另一個方面，提供了編碼含有4-1bbl三聚體的抗原結合分子的分離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼下述各項的序列：(a)重鏈和輕鏈，該重鏈包含vh域，該vh域包含(i)包含seqidno:104的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:105的胺基酸序列的cdr-h2和(iii)包含seqidno:106的胺基酸序列的cdr-h3，該輕鏈包含vl域，該vl域包含(iv)包含seqidno:107的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:108的胺基酸序列的cdr-l2和(vi)包含seqidno:109的胺基酸序列的cdr-l3，和(b)包含seqidno:5的胺基酸序列的多肽。在又一個方面，提供了編碼含有4-1bbl三聚體的抗原結合分子的分離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼下述各項的序列：(a)重鏈和輕鏈，該重鏈包含vh域，該vh域包含(i)包含seqidno:112的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:113的胺基酸序列的cdr-h2和(iii)包含seqidno:114的胺基酸序列的cdr-h3，該輕鏈包含vl域，該vl域包含(iv)包含seqidno:115的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:116的胺基酸序列的cdr-l2和(vi)包含seqidno:117的胺基酸序列的cdr-l3，和(b)包含seqidno:5的胺基酸序列的多肽。在還有另一個方面，提供了編碼含有4-1bbl三聚體的抗原結合分子的分離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼下述各項的序列：(a)重鏈和輕鏈，該重鏈包含vh域，該vh域包含(i)包含seqidno:120的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:121的胺基酸序列的cdr-h2和(iii)包含seqidno:122的胺基酸序列的cdr-h3，該輕鏈包含vl域，該vl域包含(iv)包含seqidno:123的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:124的胺基酸序列的cdr-l2和(vi)包含seqidno:125的胺基酸序列的cdr-l3，和(b)包含seqidno:5的胺基酸序列的多肽。在又一個方面，提供了編碼含有4-1bbl三聚體的抗原結合分子的分離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼下述各項的序列：(a)重鏈和輕鏈，該重鏈包含vh域，該vh域包含(i)包含seqidno:128的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:129的胺基酸序列的cdr-h2和(iii)包含seqidno:130的胺基酸序列的cdr-h3，該輕鏈包含vl域，該vl域包含(iv)包含seqidno:131的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:132的胺基酸序列的cdr-l2和(vi)包含seqidno:133的胺基酸序列的cdr-l3，和(b)包含seqidno:5的胺基酸序列的多肽。在又一個方面，本發明提供編碼含有4-1bbl三聚體的抗原結合分子的分離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼下述各項的序列：(a)能夠特異性結合fap的模塊，其包含由seqidno:16的胺基酸序列組成的vh域和由seqidno:17的胺基酸序列組成的vl域，和(b)包含seqidno:5的胺基酸序列的多肽。在一個特定方面，本發明提供編碼含有4-1bbl三聚體的抗原結合分子的分離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼下述各項的序列：(i)重鏈，其包含seqidno:16的胺基酸序列，(ii)輕鏈，其包含seqidno:17的胺基酸序列，和(iii)包含seqidno:15的胺基酸序列的融合蛋白。在又一個方面，本發明提供編碼含有4-1bbl三聚體的抗原結合分子的分離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼下述各項的序列：(a)能夠特異性結合fap的模塊，其包含由seqidno:110的胺基酸序列組成的vh域和由seqidno:111的胺基酸序列組成的vl域，和(b)包含seqidno:5的胺基酸序列的多肽。在一個特定方面，本發明提供編碼含有4-1bbl三聚體抗原結合分子的分離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼下述各項的序列：(i)重鏈，其包含seqidno:110的胺基酸序列，(ii)輕鏈，其包含seqidno:111的胺基酸序列，和(iii)包含seqidno:15的胺基酸序列的融合蛋白。在另一個方面，提供了編碼含有ox40l三聚體的抗原結合分子的分離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼下述各項的序列：(a)重鏈和輕鏈，該重鏈包含vh域，該vh域包含(i)包含seqidno:9的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:10的胺基酸序列的cdr-h2和(iii)包含seqidno:11的胺基酸序列的cdr-h3，該輕鏈包含vl域，該vl域包含(iv)包含seqidno:12的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:13的胺基酸序列的cdr-l2和(vi)包含seqidno:14的胺基酸序列的cdr-l3，和(b)包含seqidno:8的胺基酸序列的多肽。在又一個方面，本發明提供編碼含有ox40l三聚體的抗原結合分子的分離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼下述各項的序列：(a)能夠特異性結合fap的模塊，其包含由seqidno:16的胺基酸序列組成的vh域和由seqidno:17的胺基酸序列組成的vl域，和(b)包含seqidno:8的胺基酸序列的多肽。在一個特定方面，本發明提供了編碼含有ox40l三聚體的抗原結合分子的分離的多核苷酸，其中該多核苷酸包含編碼下述各項的序列：(i)重鏈，其包含seqidno:16的胺基酸序列，(ii)輕鏈，其包含seqidno:17的胺基酸序列，和(iii)融合蛋白，其包含seqidno:20的胺基酸序列。在某些實施方案中，多核苷酸或核酸是dna。在其他實施方案中，本發明的多核苷酸是rna，例如呈信使rna(mrna)的形式。本發明的rna可以是單鏈或雙鏈的。重組方法可以例如通過固態肽合成(例如merrifield固相合成)或重組生產獲得本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子。對於重組生產，分離一個或多個編碼例如上文所述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子或其多肽片段的多核苷酸，並將其插入到一個或多個載體中用於進一步在宿主細胞中克隆和/或表達。可以使用常規程序容易地分離這樣的多核苷酸並將其測序。在本發明的一個方面，提供了包含一個或多個本發明的多核苷酸的載體，優選表達載體。可使用本領域技術人員熟知的方法構建包括含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子(片段)的編碼序列以及適當的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組dna技術、合成技術和體內重組/遺傳重組。參見，例如描述於maniatis等人，molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory,n.y.(1989)；和ausubel等人，currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingassociatesandwileyinterscience,n.y.(1989)中的技術。表達載體可以是質粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表達載體包括將編碼含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子或其多肽片段的多核苷酸(即，編碼區)與啟動子和/或其他轉錄或翻譯控制元件以可操作地關聯的方式克隆到其中的表達盒。如本文中使用的，「編碼區」是由翻譯成胺基酸的密碼子組成的核酸模塊。雖然「終止密碼子」(tag、tga或taa)不翻譯成胺基酸，但如果存在的話，它可被認為是編碼區的一部分，但任何側翼序列，例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、5'和3'非翻譯區等不是編碼區的一部分。在單個多核苷酸構建體中，例如，在單個載體上，或在單獨的多核苷酸構建體中，例如，在單獨的(不同的)載體上可以存在兩個或更多個編碼區。此外，任何載體可以包含單個編碼區，或者可以包含兩個或更多個編碼區，例如本發明的載體可以編碼一個或多個多肽，其通過蛋白水解切割在翻譯後或以共翻譯方式分離成最終的蛋白質。另外，本發明的載體、多核苷酸或核酸可以編碼異源編碼區，所述異源編碼區與編碼本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子或其多肽片段或其變體或衍生物的多核苷酸融合或未融合。異源編碼區包括但不限於專門的元件或基序，例如分泌信號肽或異源功能結構域。可操作地關聯是指這樣一種方式：基因產物例如多肽的編碼區與一個或多個調節序列相關聯以使基因產物的表達在調節序列的影響或控制下進行。如果啟動子功能的誘導導致編碼所需基因產物的mrna的轉錄，並且如果兩個dna片段之間的連接性質不幹擾表達調控序列指導基因產物表達的能力或不幹擾dna模板被轉錄的能力，則所述兩個dna片段(例如多肽編碼區和與其關聯的啟動子)是「可操作地關聯的」。因此，如果啟動子能夠影響編碼多肽的核酸的轉錄，則啟動子區與該核酸可操作地關聯。啟動子可以是僅在預定細胞中指導實質性dna轉錄的細胞特異性啟動子。除了啟動子之外，其他轉錄控制元件例如增強子、操縱子、阻抑物和轉錄終止信號，可與多核苷酸可操作地關聯以指導細胞特異性轉錄。本文中公開了適合的啟動子和其他轉錄控制區。許多轉錄控制區是本領域中的技術人員已知的。這些包括但不限於在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，例如但不限於來自巨細胞病毒(例如立即早期啟動子，與內含子a結合)、猿猴病毒40(例如早期啟動子)和逆轉錄病毒(如，例如勞斯肉瘤病毒)的啟動子和增強子區段。其他轉錄控制區包括衍生自脊椎動物基因如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素和兔α珠蛋白的那些轉錄控制區，以及能夠控制真核細胞中基因表達的其他序列。另外的適合的轉錄控制區包括組織特異性啟動子和增強子以及誘導型啟動子(例如四環素誘導型啟動子)。類似地，許多翻譯控制元件是本領域普通技術人員已知的。這些包括但不限於核糖體結合位點、翻譯起始和終止密碼子以及衍生自病毒系統的元件(特別是內部核糖體進入位點或ires，也稱為cite序列)。表達盒還可以包括諸如複製起點的其他特徵、和/或諸如逆轉錄病毒長末端重複序列(ltr)或腺相關病毒(aav)反向末端重複序列(itr)的染色體整合元件。本發明的多核苷酸和核酸編碼區可以與另外的編碼分泌肽或信號肽的編碼區相關聯，所述分泌肽或信號肽指導由本發明的多核苷酸編碼的多肽的分泌。例如，如果希望分泌含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子或其多肽片段，則編碼信號序列的dna可以位於編碼本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子或其多肽片段的核酸的上遊。根據信號假說，由哺乳動物細胞分泌的蛋白質具有信號肽或分泌前導序列，所述信號肽或分泌前導序列在起始生長蛋白質鏈輸出穿過粗面內質網後被從成熟蛋白質切割下來。本領域普通技術人員知道，脊椎動物細胞分泌的多肽通常具有與多肽的n末端融合的信號肽，其被從翻譯的多肽切割下來以產生多肽的分泌或「成熟」形式。在某些實施方案中，使用了天然信號肽例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽、或該序列的功能衍生物，所述衍生物保留了指導與其可操作地相關聯的多肽分泌的能力。或者，可以使用異源哺乳動物信號肽或其功能衍生物。例如，野生型前導序列可以替代為人組織纖溶酶原激活物(tpa)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前導序列。編碼可用於促進後續純化(例如組氨酸標籤)或輔助標記融合蛋白的短蛋白質序列的dna可以包括在編碼本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子或其多肽片段的多核苷酸的內部或末端。在本發明的一個另外的方面，提供了包含一個或多個本發明的多核苷酸的宿主細胞。在某些實施方案中，提供了包含一個或多個本發明的載體的宿主細胞。多核苷酸和載體可分別摻入關於核苷酸和載體的單一或組合地在本文中描述的任何特徵。在一個方面，宿主細胞包含(例如已經轉化或轉染)包含編碼本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的(一部分)的多核苷酸的載體。如本文中使用的，術語「宿主細胞」是指可以被工程化以產生本發明的融合蛋白或其片段的任何種類的細胞系統。適合於複製和支持抗原結合分子表達的宿主細胞是本領域熟知的。可以使用特定的表達載體適當地轉染或轉導這樣的細胞，並且可以培養大量含有載體的細胞用於接種大規模發酵罐以獲得足夠量的用於臨床應用的抗原結合分子。適合的宿主細胞包括原核微生物，如大腸桿菌，或各種真核細胞，如中國倉鼠卵巢細胞(cho)、昆蟲細胞等。例如，尤其是在不需要糖基化時，可以在細菌中產生多肽。表達後，可以從菌體糊分離出作為可溶性級分的多肽，並可將其進一步純化。除了原核生物之外，諸如絲狀真菌或酵母的真核微生物是編碼多肽的載體的適合克隆或表達宿主，包括其糖基化途徑已被「人源化」的導致產生具有部分或完全人糖基化樣式的多肽的真菌和酵母菌株。參見gerngross,natbiotech22,1409-1414(2004)，和li等人，natbiotech24,210-215(2006)。用於表達(糖基化)多肽的適合宿主細胞也源自多細胞生物(無脊椎動物和脊椎動物)。無脊椎動物細胞的實例包括植物和昆蟲細胞。已經鑑定了可以與昆蟲細胞結合使用尤其是用於轉染草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda)細胞的許多杆狀病毒株。植物細胞培養物也可以用作宿主。參見例如美國專利nos.5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978、和6,417,429(描述了用於在轉基因植物中產生抗體的plantibodiestm技術)。脊椎動物細胞也可以用作宿主。例如，適於在懸液中生長的哺乳動物細胞系可能是有用的。有用的哺乳動物宿主細胞系的其他實例是經sv40(cos-7)轉化的猴腎cv1系；人胚胎腎細胞系(例如，在graham等人，jgenvirol36,59(1977))中描述的293或293t細胞；倉鼠嬰腎細胞(bhk)；小鼠sertoli細胞(如在mather,biolreprod23,243-251(1980)所述的tm4細胞)；猴腎細胞(cv1)；非洲綠猴腎細胞(vero-76)；人宮頸癌細胞(hela)；犬腎細胞(mdck)；buffalo大鼠肝細胞(brl3a)；人肺細胞(w138)；人肝細胞(hepg2)；小鼠乳腺腫瘤細胞(mmt060562)；tri細胞(如在mather等人，annalsn.y.acadsci383,44-68(1982)中描述)；mrc5細胞和fs4細胞。其他有用的哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(cho)細胞，包括dhfr-cho細胞(urlaub等人，procnatlacadsciusa77,4216(1980))；和骨髓瘤細胞系如yo、ns0、p3x63和sp2/0。對於適用於蛋白質產生的某些哺乳動物宿主細胞系的綜述，參見例如yazaki和wu,methodsinmolecularbiology,vol.248(b.k.c.lo,ed.,humanapress,totowa,nj),pp.255-268(2003)。宿主細胞包括培養的細胞，例如培養的哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞和植物細胞，在此僅列舉少數，還有包括在轉基因動物、轉基因植物或培養的植物或動物組織內的細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是真核細胞，優選哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(cho)細胞，人胚胎腎(hek)細胞或淋巴樣細胞(例如y0、ns0、sp20細胞)。在這些系統中表達外源基因的標準技術在本領域中是已知的。可以將表達包含免疫球蛋白重鏈或輕鏈的多肽的細胞工程化，以便也表達另一個免疫球蛋白鏈，使得所表達的產物是具有重鏈和輕鏈兩者的免疫球蛋白。在一個方面，提供了產生本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子或其多肽片段的方法，其中所述方法包括在適於表達本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子或其多肽片段的條件下培養在本文中提供的包含編碼本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子或其多肽片段的多核苷酸的宿主細胞，並從宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子或其多肽片段。在本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子中，多個組分(能夠與靶細胞抗原特異性結合的至少一個模塊，一個多肽包含tnf配體家族成員的三個胞外域或其片段，和fc域)在遺傳上不全部彼此融合。多肽被設計成使得其組分(tnf配體家族成員的三個胞外域或其片段和其他成分如fc域的ch2和ch3)直接地或通過接頭序列彼此融合。可以根據本領域熟知的方法測定接頭的組成和長度，並且可以測試其效果。本發明的抗原結合分子的不同組分之間的接頭序列的實例見本文中提供的序列。如果需要的話，還可以包括另外的序列，例如內肽酶識別序列，以便組入切割位點來分離融合蛋白的各個組分。在某些實施方案中，形成抗原結合分子的一部分的能夠與靶細胞抗原特異性結合的模塊(例如fab片段)至少包含能夠與抗原結合的免疫球蛋白可變區。可變區可以形成天然或非天然存在的抗體及其片段的一部分並且自其衍生。產生多克隆抗體和單克隆抗體的方法是本領域熟知的(參見例如harlow和lane,"antibodies,alaboratorymanual",coldspringharborlaboratory,1988)。非天然存在的抗體可以使用固相肽合成來構建，可以重組產生(例如，如美國專利no.4,186,567中所述)，或者可以通過例如篩選包含可變重鏈和可變輕鏈的組合文庫而獲得(參見授予mccafferty的美國專利no.5,969,108)。任何動物物種的免疫球蛋白都可用於本發明。可用於本發明的非限制性免疫球蛋白可以是鼠、靈長類、或人來源的。如果預期融合蛋白用於人類使用，則可以使用免疫球蛋白的嵌合形式，其中免疫球蛋白的恆定區域來自人。還可以根據本領域熟知的方法製備免疫球蛋白的人源化或完全人形式(參見例如授予winter的美國專利no.5,565,332)。人源化可以通過各種方法來實現，包括但不限於(a)將非人(例如，供體抗體)cdr移植到人(例如受體抗體)框架和具有或不具有關鍵框架殘基(例如，對於保留良好的抗原結合親和力或抗體功能重要的殘基)保留的恆定區，(b)僅將非人特異性決定區(sdr或a-cdr；對於抗體-抗原相互作用關鍵的殘基)移植到人框架和恆定區，或(c)移植整個非人可變結構域，但通過替換表面殘基用類似於人的區段將其「遮蓋」。人源化抗體及其製備方法綜述於，例如，almagro和fransson,frontbiosci13,1619-1633(2008)中，並且進一步描述於例如riechmann等人，nature332,323-329(1988)；queen等人，procnatlacadsciusa86,10029-10033(1989)；美國專利no.5,821,337、7,527,791、6,982,321、和7,087,409；jones等人，nature321,522-525(1986)；morrison等人，procnatlacadsci81,6851-6855(1984)；morrison和oi,advimmunol44,65-92(1988)；verhoeyen等人，science239,1534-1536(1988)；padlan,molecimmun31(3),169-217(1994)；kashmiri等人，methods36,25-34(2005)(描述sdr(a-cdr)移植)；padlan,molimmunol28,489-498(1991)(描述「表面重塑」)；dall』acqua等人，methods36,43-60(2005)(描述「fr改組」)；以及osbourn等人，methods36,61-68(2005)和klimka等人，brjcancer83,252-260(2000)(描述用於fr改組的「導向選擇」辦法)。根據本發明的特定免疫球蛋白是人免疫球蛋白。可以使用本領域已知的各種技術來產生人抗體和人可變區。人抗體通常描述於vandijk和vandewinkel,curropinpharmacol5,368-74(2001)以及lonberg,curropinimmunol20,450-459(2008)中。人可變區可以形成通過雜交瘤方法製備的人單克隆抗體的一部分並且可以從其衍生(參見，例如，monoclonalantibodyproductiontechniquesandapplications,pp.51-63(marceldekker,inc.,newyork,1987))。人抗體和人可變區還可以通過向轉基因動物施用免疫原加以製備，所述轉基因動物已經被修飾以產生響應抗原攻擊的完整人抗體或具有人可變區的完整抗體(參見，例如，lonberg,natbiotech23,1117-1125(2005)。也可以通過分離選自人衍生的噬菌體展示文庫的fv克隆可變區序列來產生人抗體和人可變區(參見，例如，hoogenboom等人，引自methodsinmolecularbiology178,1-37(o』brien等人編輯，humanpress,totowa,nj,2001)；和mccafferty等人，nature348,552-554；clackson等人，nature352,624-628(1991))。噬菌體通常以單鏈fv(scfv)片段或fab片段的形式展示抗體片段。在某些方面，根據例如pct公開wo2012/020006(參見有關親和力成熟的實例)或美國專利申請公開no.2004/0132066中公開的方法，將包含在本發明的抗原結合分子中的能夠與靶細胞抗原特異性結合的模塊(例如fab片段)工程化，以具有增強的結合親和力。本發明抗原結合分子與特異性抗原決定簇結合的能力可以通過酶聯免疫吸附測定(elisa)或本領域技術人員熟悉的其他技術來測量，例如，表面等離子體共振技術(liljeblad等人，glycoj17,323-329(2000)))和傳統結合測定法(heeley,endocrres28,217-229(2002))。可使用競爭測定法鑑定與參考抗體競爭結合特定抗原的抗原結合分子。在某些實施方案中，這種競爭性抗原結合分子結合的表位(例如線性或構象表位)與參考抗原結合分子結合的相同。用於抗原結合分子所結合的表位作圖的詳細的示例性方法提供於morris(1996)「epitopemappingprotocols」,inmethodsinmolecularbiologyvol.66(humanapress,totowa,nj)中。在示例性競爭測定中，將固定抗原在包含與抗原結合的第一經標記的抗原結合分子和第二未標記的抗原結合分子的溶液中溫育，測試第二未標記的抗原結合分子與第一抗原結合分子競爭結合該抗原的能力。第二抗原結合分子可以存在於雜交瘤上清液中。作為對照，將固定抗原在包含第一經標記的抗原結合分子但不包含第二未標記的抗原結合分子的溶液中溫育。在允許第一抗體與抗原結合的條件下溫育之後，除去過量未結合的抗體，並測量與固定抗原結合的標記物的量。如果在測試樣品中與固定抗原結合的標記物的量相對於對照樣品顯著降低，則表明第二抗原結合分子與第一抗原結合分子競爭結合該抗原。參見harlow和lane(1988)antibodies:alaboratorymanualch.14(coldspringharborlaboratory,coldspringharbor,ny)。可以通過本領域已知的技術如高效液相色譜法、離子交換色譜法、凝膠電泳、親和色譜法、尺寸排阻色譜法等來純化如本文中描述製備的本發明的含有tnf配體三聚體的抗原結合分子。用於純化特定蛋白質的實際條件將部分地取決於諸如淨電荷、疏水性、親水性等因素，並且對於本領域技術人員將是顯而易見的。對於親和色譜法純化，可以使用與含有tnf配體三聚體的抗原結合分子結合的抗體、配體、受體或抗原。例如，為了本發明的融合蛋白的親和色譜法純化，可以使用具有蛋白a或蛋白g的基質。可以基本上如實施例中描述依次使用蛋白a或g親和色譜法和尺寸排阻色譜法分離抗原結合分子。含有tnf配體三聚體的抗原結合分子或其片段的純度可以通過各種熟知的分析方法中的任何一種加以測定，包括凝膠電泳、高壓液相色譜法等。例如，正如通過還原和非還原性sds-page證實，如通過實施例中描述表達的含有tnf配體三聚體的抗原結合分子被顯示為是完整且正確組裝的。測定法可以通過本領域已知的各種測定法來鑑定、篩選或通過其物理/化學性質和/或生物活性來表徵在本文中提供的抗原結合分子。1.親和力測定根據實施例中提出的通過表面等離子體共振(spr)的方法，使用標準儀器如biacore儀器(gehealthcare)、以及可以通過諸如重組表達獲得的受體或靶蛋白，可以測定在本文中提供的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子與相應的tnf受體的親和力。通過表面等離子體共振(spr)，使用標準儀器如biacore儀器(gehealthcare)、以及可以通過諸如重組表達獲得的受體或靶蛋白，也可以測定含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子與靶細胞抗原的親和力。在實施例4中描述了用於測量結合親和力的具體的說明性和示例性實施方案。根據一個方面，使用t100儀(gehealthcare)通過表面等離子體共振在25℃測量kd。2.結合測定和其他測定例如通過流式細胞術(facs)，使用表達特定受體或靶抗原的細胞系，可以評價在本文中提供的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子與相應的受體表達細胞的結合。在一個方面，在結合測定中使用表達tnf受體的新鮮外周血單核細胞(pbmc)。在分離後(幼稚pmbc)或刺激後(活化的pmbc)直接使用這些細胞。在另一個方面，使用活化的小鼠脾細胞(表達tnf受體分子)來證明本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子與相應的tnf受體表達細胞的結合。在又一個方面，使用表達靶細胞抗原(例如fap)的癌細胞系來證明抗原結合分子與靶細胞抗原的結合。在另一個方面，可以使用競爭測定來鑑定與特異性抗體或抗原結合分子分別競爭結合靶標或tnf受體的抗原結合分子。在某些實施方案中，這種競爭性抗原結合分子結合的表位(例如線性或構象表位)與特異性抗靶標抗體或特異性抗tnf受體抗體結合的相同。用於抗體所結合的表位的作圖的詳細示例性方法提供於morris(1996)「epitopemappingprotocols,」inmethodsinmolecularbiologyvol.66(humanapress,totowa,nj)中。3.活性測定在一個方面，提供了用於鑑定與特異性靶細胞抗原和具有生物活性的特異性tnf受體結合的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的測定法。生物活性可以包括例如通過表達靶細胞抗原的細胞上的tnf受體的激動性信號轉導。還提供了通過測定法鑑定為具有這樣的體外生物活性的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子。在某些方面，測試了本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的這種生物活性。用於檢測本發明分子的生物活性的測定法是實施例6中所述的那些。此外，用於檢測細胞裂解的測定法(例如通過測量ldh釋放)、誘導的凋亡動力學(例如通過測量半胱天冬酶3/7活性)或凋亡(例如使用tunel測定)是本領域熟知的。另外，可以通過評估複合物對各種淋巴細胞亞群如nk細胞、nkt細胞或γδt細胞的存活、增殖和淋巴因子分泌的影響，或評估其調節抗原呈遞細胞如樹突細胞、單核細胞/巨噬細胞或b細胞的表型和功能的能力來評估此類複合物的生物活性。藥物組合物、製劑和給藥途徑在又一個方面，本發明提供了包含本文中提供的任一種含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的藥物組合物，以供例如在任何下列治療方法中使用。在一個實施方案中，藥物組合物包含本文中提供的任一種含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子和至少一種藥學上可接受的賦形劑。在另一個實施方案中，藥物組合物包含本文中提供的任一種含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子和至少一種另外的例如如下文所述的治療劑。本發明的藥物組合物包含治療有效量的一種或多種溶解或分散在藥學上可接受的賦形劑中的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子。短語「藥學的或藥學上可接受的」是指在採用的劑量和濃度下通常對接受者無毒的分子實體和組合物，即在適當施用於動物時例如人時不產生不利的、過敏的或其他不良的反應。根據本公開內容，包含至少一種含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子和任選地另外的活性成分的藥物組合物的製備將是本領域技術人員已知的，如remington'spharmaceuticalsciences第18版，mackprintingcompany,1990所例示，通過提述將其併入本文。具體地說，組合物是凍幹製劑或水溶液。如本文中使用的，正如本領域普通技術人員已知，「藥學上可接受的賦形劑」包括溶劑、緩衝劑、分散介質、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、鹽、穩定劑中任一種和全部及其組合。腸胃外組合物包括通過注射給藥而設計的那些，例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌內、鞘內或腹膜內注射。為了注射，可以將本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子配製在水溶液中，優選在生理學相容的緩衝液如漢克斯溶液、林格氏溶液或生理鹽水緩衝液中。溶液可以含有配製劑，例如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。或者，融合蛋白在使用前可處於粉末形式以與適合的載體(例如無菌無熱原水)組構。根據需要，通過將在適當溶劑中的本發明融合蛋白以所要求的量併入下文列舉的多種其他成分中來製備無菌注射溶液。可以例如通過無菌過濾膜進行過濾而容易地實現無菌性。通常，通過將各種滅菌的活性成分併入無菌載體中來製備分散體，所述無菌載體含有基礎分散介質和/或其他成分。在用於製備無菌注射溶液，懸浮液或乳狀液的無菌粉末的情況下，優選製備方法為真空乾燥和冷凍乾燥技術，從而產生來自其先前無菌過濾的液體介質的活性成分加上任何其他期望的成分的粉末。必要時應該適當緩衝該液體介質並且在注射之前首先用足夠鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑變得等張。在製造和儲存條件下該組合物必須是穩定的，並且保持對抗微生物諸如細菌和真菌的汙染作用。應當理解，內毒素汙染應該最低限度地保持在安全水平，例如低於0.5ng/mg蛋白質。適合的藥學上可接受的賦形劑包括但不限於：諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、和其他有機酸的緩衝劑；包括抗壞血酸和甲硫氨酸在內的抗氧化劑；防腐劑(如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯扎氯銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苄醇；烷基對羥基苯甲酸酯，如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸、或賴氨酸；單糖類、二糖類、和其他碳水化合物類，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑，如edta；糖類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子，如鈉；金屬複合物(例如，zn-蛋白質複合物)；和/或非離子型表面活性劑，如聚乙二醇(peg)。水性注射懸液可含有增加該懸液粘度的化合物，例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、或葡聚糖等。任選地，懸液還可以含有適合的穩定劑或增加化合物的溶解度以允許製備高度濃縮的溶液的藥劑。另外，這些活性化合物的懸液可製備為適當的油性注射懸液。適合的親脂性溶劑或載體包括脂肪油(如芝麻油)、合成脂肪酸酯(如ethylcleats或甘油三酯)、或脂質體。可以例如通過凝聚技術或通過界面聚合將活性成分包埋在製備的微膠囊中，例如分別在膠體藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠囊)或在粗乳液中的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚甲基丙烯酸甲酯微膠囊。這樣的技術公開於remington'spharmaceuticalsciences(18thed.mackprintingcompany,1990)中。可以製備持續釋放製劑。持續釋放製劑的適合實例包括含有該多肽的固體疏水聚合物的半透性基質，所述基質呈成形物品的形式，例如薄膜、或微膠囊。在特定實施方案中，通過在組合物中使用延遲吸收的藥劑，例如單硬脂酸鋁、明膠或其組合，可延長注射組合物的吸收。本文中的示例性藥學上可接受的賦形劑還包括諸如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白(shasegp)的間質藥物分散劑，例如人可溶性ph-20透明質酸酶糖蛋白，例如rhuph20(baxterinternational,inc.)。在美國專利公開no.2005/0260186和2006/0104968中描述了包括rhuph20的某些示例性的shasegp和使用方法。在一個方面，將shasegp與一種或多種另外的糖胺聚糖酶如軟骨素酶組合。示例性的凍幹抗體配製劑描述於美國專利no.6,267,958中。水性抗體配製劑包括美國專利no.6,171,586和wo2006/044908中描述的那些，後一種配製劑包括組氨酸-乙酸鹽緩衝液。除前述組合物之外，融合蛋白還可配製為貯庫製劑。此類長效配製劑可通過植入(例如皮下或肌內)或通過肌內注射給予。因此，例如，融合蛋白可以用適合的聚合材料或疏水材料(例如作為可接受的油中的乳液)或離子交換樹脂配製，或配製為微溶的衍生物，例如微溶鹽。包含本發明融合蛋白的藥物組合物可以通過常規的混合、溶解、乳化、包封、包埋或凍幹過程進行製造。可以使用有利於將蛋白質加工成藥學上可使用的製劑的一種或多種生理學上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或助劑以常規方式配製藥物組合物。適當的配製劑取決於所選擇的給藥途徑。可以將含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子配製成游離酸或鹼、中性或鹽形式的組合物。藥學上可接受的鹽是基本保留游離酸或鹼的生物活性的鹽。這些鹽包括酸加成鹽，例如由蛋白質組合物的游離氨基形成的或與無機酸例如鹽酸或磷酸形成的那些，或與諸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸的有機酸形成的那些。與游離羧基形成的鹽也可以衍生自無機鹼，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或諸如異丙胺、三甲胺、組氨酸或普魯卡因的有機鹼。與相應的游離鹼形式相比，藥物鹽在水性溶劑和其他質子溶劑中的溶解度更高。在被治療的特殊適應症需要時，本文中的組合物還可含有一種以上的活性成分，優選地，所述活性成分具有彼此無不良影響的互補活性。這樣的活性成分以對預期目的有效的量適當地組合存在。用於體內給藥的製劑通常是無菌的。可以例如通過無菌過濾膜進行過濾而容易地實現無菌性。治療方法和組合物本文中提供的任何含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子均可在治療方法中使用。為了在治療方法中使用，本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子可以以符合良好醫學實踐的方式配製、給藥和施用。在這種情況下考慮的因素包括正在治療的具體紊亂、被治療的具體哺乳動物、個體患者的臨床狀況、紊亂的原因、藥劑的遞送部位、給藥方法、給藥方案、以及執業醫師已知的其他因素。在一個方面，提供了用作藥劑的本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子。在另外的方面，提供了在治療疾病中使用尤其是在癌症治療中使用的本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子。在某些方面，提供了在治療方法中使用的本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子。在一個方面，本發明提供了用於治療有需要的個體中的疾病的如本文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子。在某些方面，本發明提供了在治療患有疾病的個體的方法中使用的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，所述方法包括向個體施用治療有效量的融合蛋白。在某些方面，待治療的疾病是癌症。癌症的實例包括實體瘤、膀胱癌、腎細胞癌、腦癌、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、骨癌、腎癌、黑素瘤、b細胞淋巴瘤、b細胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴細胞白血病。因此，提供了在癌症治療中使用的如本文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子。需要治療的受試者、患者或「個體」通常是哺乳動物，更具體地說是人。在另一個方面，提供了用於治療感染性疾病尤其是治療病毒感染的如本文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子。在又一個方面，提供了用於治療自身免疫病例如狼瘡病的如本文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子。在一個方面，提供了根據本發明的用於治療頭頸鱗狀細胞癌(hnscc)、乳腺癌、結腸直腸癌(crc)、胰腺癌(pac)、胃癌、非小細胞肺癌(nsclc)和間皮瘤的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中靶細胞抗原為fap。在又一個方面，本發明涉及含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子在製造或製備用於治療有需要的個體中的疾病的藥劑中的用途。在一個方面，所述藥劑用於在治療疾病的方法中使用，所述方法包括向患有疾病的個體施用治療有效量的藥劑。在某些實施方案中，待治療的疾病是增殖性紊亂，具體地是癌症。因此，在一個方面，本發明涉及本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子在製造或製備用於治療癌症的藥劑中的用途。癌症的實例包括實體瘤、膀胱癌、腎細胞癌、腦癌、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前列腺癌、血癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、骨癌、腎癌、黑素瘤、b細胞淋巴瘤、b細胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和急性淋巴細胞白血病。可以使用本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子進行治療的其他細胞增殖紊亂包括但不限於位於腹部、骨骼、乳腺、消化系統、肝臟、胰腺、腹膜、內分泌腺(腎上腺、甲狀旁腺、垂體、睪丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭頸部、神經系統(中樞和外周)、淋巴系統、盆腔、皮膚、軟組織、脾臟、胸部、和泌尿生殖系統的腫瘤。還包括癌前狀態或病變和癌症轉移。在某些實施方案中，癌症選自腎細胞癌、皮膚癌、肺癌、結腸直腸癌、乳腺癌、腦癌、頭頸癌。技術人員可以認識到，在一些情況下，含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子可能不能提供治癒，而可能僅提供部分益處。在一些方面，具有一些益處的生理變化也被認為是治療有益的。因此，在一些方面，提供生理變化的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的量被認為是「有效量」或「治療有效量」。在又一個方面，本發明涉及如本文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子在製造或製備用於治療感染性疾病尤其是治療病毒感染或治療自身免疫病例如狼瘡病的藥劑中的用途。在又一個方面，本發明提供了治療個體中的疾病的方法，所述方法包括向所述個體施用治療有效量的本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子。在一個方面，向所述個體施用呈藥學上可接受的形式的包含本發明融合蛋白的組合物。在某些方面，待治療的疾病是增殖性紊亂。在一個特定方面，該疾病是癌症。在另一個方面，該疾病是感染性疾病或自身免疫病。在某些方面，該方法進一步包括向個體施用治療有效量的至少一種另外的治療劑，例如，如果待治療的疾病是癌症，則為抗癌劑。根據任何上述實施方案的「個體」可以是哺乳動物，優選人。為了預防或治療疾病，本發明的含有tnf家族配體三聚體抗原結合分子的適當劑量(當單獨使用或與一種或多種其他另外的治療劑組合使用時)將取決於待治療疾病的類型、給藥途徑、患者的體重、融合蛋白的類型、疾病的嚴重程度和病程、給予融合蛋白是用於預防還是治療目的、先前或同時的治療幹預、患者的臨床病史、和對融合蛋白的反應、和主治醫師的決定。在任何情況下，負責給藥的醫師將決定組合物中活性成分的濃度和個體受試者的適當劑量。本文中考慮到各種給藥方案，包括但不限於在各個時間點上的單次或多次給藥、推注給藥和脈衝輸注。一次性地或以一系列治療的方式適當地向患者施用含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子。根據疾病的類型和嚴重程度，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子可以是向患者施用的初始候選劑量，例如無論是通過一次或多次分開給藥，還是通過連續輸注。取決於上面提到的因素，一個典型的日劑量可能在約1μg/kg至100mg/kg或更高的範圍內。對於數天或更長時間的反覆給藥，根據病情，治療通常將持續到出現期望的疾病症狀的抑制時為止。融合蛋白的一個示例性劑量將在約0.005mg/kg至約10mg/kg的範圍內。在其他實例中，劑量還可以包含每次給藥從約1μg/kg體重、約5μg/kg體重、約10μg/kg體重、約50μg/kg體重、約100μg/kg體重、約200μg/kg體重、約350μg/kg體重、約500μg/kg體重、約1mg/kg體重、約5mg/kg體重、約10mg/kg體重、約50mg/kg體重、約100mg/kg體重、約200mg/kg體重、約350mg/kg體重、約500mg/kg體重、至約1000mg/kg體重或更多，以及其中可推導的任何範圍。在本文中所列數字的可推導範圍的實例中，可以基於上述數字以約5mg/kg體重至約100mg/kg體重、約5μg/kg體重至約500mg/kg體重等範圍進行施用。因此，可向患者施用約0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg或10mg/kg(或其任何組合)的一個或多個劑量。這樣的劑量可以間歇施用，例如，每周或每三周一次(例如使得患者接受約2個至約20個，或例如約6個劑量的融合蛋白)。可以施用初始較高的負荷劑量，然後施用一個或多個較低的劑量。然而，其他劑量方案可能是有用的。通過常規技術和測定法易於監測這種療法的進展。通常以有效實現預期目的的量使用本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子。為了用於治療或預防疾病狀況，以治療有效量施用或應用本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子或其藥物組合物。治療有效量的確定完全在本領域技術人員的能力範圍內，尤其是在根據本文中提供的詳細公開內容的情況下。對於全身給藥，可以根據體外測定法(例如細胞培養物測定法)初步估計治療有效劑量。然後可以在動物模型中配製劑量以達到包括在細胞培養中確定的ic50在內的循環濃度範圍。這類信息可以用來更精確地確定用於人的劑量。也可以使用本領域熟知的技術根據體內數據(例如，動物模型)估計初始劑量。根據動物數據，本領域普通技術人員可以容易地優化對人的給藥。可以單獨調整劑量和間隔以提供足以維持治療效果的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的血漿水平。通常注射給藥的患者劑量通常為約0.1至50mg/kg/天，一般為約0.5至1mg/kg/天。可以通過每天施用多個劑量來實現治療有效的血漿水平。可以例如通過hplc測量血漿中的水平。在局部給藥或選擇性吸收的情況下，含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的有效局部濃度可能與血漿濃度無關。本領域技術人員將能夠優化治療有效的局部劑量而無需過度實驗。本文中描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的治療有效劑量通常將提供治療益處而不引起實質性毒性。可以通過細胞培養或實驗動物中的標準藥物程序來確定融合蛋白的毒性和治療效果。可使用細胞培養物測定法和動物研究來確定ld50(對群體的50％致死的劑量)和ed50(在50％的群體中治療有效的劑量)。毒性與療效之間的劑量比為治療指數，它可以被表示為比率ld50/ed50。表現出較大治療指數的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子是優選的。在一個實施方案中，根據本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子表現出高治療指數。從細胞培養物測定法和動物研究中獲得的數據可以在配製適合於在人類中使用的劑量範圍中加以使用。劑量優選地處在循環濃度範圍內，其包括具有很小或沒有毒性的ed50。取決於多種因素，例如採用的劑型、所用給藥途徑、受試者的狀況等，劑量可以在這個範圍內變化。考慮到患者的狀況，個體醫師可以選擇確切的配方、給藥途徑和劑量(參見，例如fingl等人，1975,in:thepharmacologicalbasisoftherapeutics,ch.1,p.1，通過提述將其完整併入本文)。用本發明的融合蛋白治療患者的主治醫師知道如何並且何時由於毒性、器官功能障礙等而終止、中斷或調整給藥。相反，如果臨床反應不足(排除毒性)，主治醫師也會知道將治療調整到更高水平。在感興趣紊亂的管理中，施用劑量的大小將隨著待治療病症的嚴重程度、給藥途徑等而變化。可以例如部分地通過標準預後評價方法來評價病症的嚴重程度。此外，劑量和劑量頻率也將根據個體患者的年齡、體重和反應而變化。其他藥劑和治療本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子可以在治療中與一種或多種其他藥劑聯合給藥。例如，本發明融合蛋白可以與至少一種另外的治療劑共同給藥。術語「治療劑」涵蓋可用於治療需要這種治療的個體中的症狀或疾病的任何藥劑。這種另外的治療劑可包含任何適合於被治療的特定適應症的任何活性成分，優選地，所述活性成分具有彼此無不良影響的互補活性。在某些實施方案中，另外的治療劑是另一種抗癌劑。此類其他藥劑以對預期目的有效的量適當地組合存在。此類其他藥劑的有效量取決於所使用的融合蛋白的量、紊亂或治療的類型、以及以上討論的其他因素。通常以與本文中所述相同的劑量和給藥途徑，或本文中所述劑量的約1％至99％，或以在經驗/臨床上確定為適當的任何劑量並通過任何途徑使用含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子。上述此類聯合療法涵蓋聯合給藥(其中兩種或更多種治療劑包括在同一個或分開的組合物中)和分開給藥，在分開給藥的情況下，本發明的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的給藥可以發生在給予另外的治療劑和/或佐劑之前、同時和/或之後。製品在本發明的另一個方面，提供了含有用於治療、預防和/或診斷上述紊亂的物質的物品。製品包括容器和標籤或在容器上或與容器相關聯的包裝說明書。適合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、iv溶液袋等。可以由各種材料如玻璃或塑料形成容器。容器容納組合物本身或連同另一種有效治療、預防和/或診斷病症的組合物，並且可以具有無菌進入口(例如，該容器可以是靜脈溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。組合物中至少一種活性劑是本發明的含有tnf配體三聚體的抗原結合分子。標籤或包裝說明書指示該組合物用於治療選擇的病症。而且，製品可以包括(a)其中含有組合物的第一容器，其中該組合物包含本發明的含有tnf配體三聚體的抗原結合分子；和(b)其中含有組合物的第二容器，其中該組合物包含另外的細胞毒性治療劑或其他治療劑。在本發明的這個實施方案中的製品可以進一步包括指示組合物可用於治療特定病症的包裝說明書。替代地或另外，製品可以進一步包括第二(或第三)容器，其包含藥學上可接受的緩衝劑，例如抑菌性注射用水(bwfi)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它還可以包括立足於商業和用戶立場所需的其他物品，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針頭和注射器。表c(序列)：下面列出本發明的具體實施方案：·一種含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，(b)包含三個彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，任選通過肽接頭，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域。·該含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，(b)包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，(b)包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域，其中該包含三個通過肽接頭彼此連接的tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽融合至該fc域的兩個亞基之一的n或c端胺基酸，任選經由肽接頭。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該tnf配體家族成員共刺激人t細胞活化。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該tnf配體家族成員選自4-1bbl和ox40l。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該tnf配體家族成員是4-1bbl。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該tnf配體家族成員的胞外域包含選自seqidno:1，seqidno:2，seqidno:3，seqidno:4，seqidno:99，seqidno:100，seqidno:101和seqidno:102的胺基酸序列，特別是seqidno:1或seqidno:99的胺基酸序列。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該tnf配體家族成員的胞外域包含選自seqidno:1，seqidno:2，seqidno:3和seqidno:4的胺基酸序列，特別是seqidno:1的胺基酸序列。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，和(b)包含seqidno:5或seqidno:103的胺基酸序列的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，和(b)包含seqidno:5的胺基酸序列的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該tnf配體家族成員是ox40l。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該tnf配體家族成員的胞外域包含選自seqidno:6和seqidno:7的胺基酸序列，特別是seqidno:6的胺基酸序列。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含(a)至少一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊，和(b)包含seqidno:8的胺基酸序列的多肽，和(c)由能夠穩定聯合的第一和第二亞基構成的fc域。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該包含三個tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽在c端胺基酸處融合至該fc域的亞基之一的n端胺基酸。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該包含三個tnf配體家族成員的胞外域或其片段的多肽在n端胺基酸處融合至該fc域的亞基之一的c端胺基酸。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊選自抗體片段，fab分子，交換fab分子，單鏈fab分子，fv分子，scfv分子，單域抗體，vh和支架抗原結合蛋白。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊是能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該靶細胞抗原選自成纖維細胞激活蛋白(fap)，黑素瘤關聯硫酸軟骨素蛋白聚糖(mcsp)，表皮生長因子受體(egfr)，癌胚抗原(cea)，cd19，cd20和cd33。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該靶細胞抗原是成纖維細胞激活蛋白(fap)。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該能夠特異性結合fap的模塊包含vh域和vl域，該vh域包含(i)包含seqidno:9的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:10的胺基酸序列的cdr-h2和(iii)包含seqidno:11的胺基酸序列的cdr-h3，該vl域包含(iv)包含seqidno:12的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:13的胺基酸序列的cdr-l2和(vi)包含seqidno:14的胺基酸序列的cdr-l3。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該能夠特異性結合fap的模塊包含vh域和vl域，該vh域包含(i)包含seqidno:104的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:105的胺基酸序列的cdr-h2和(iii)包含seqidno:106的胺基酸序列的cdr-h3，該vl域包含(iv)包含seqidno:107的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:108的胺基酸序列的cdr-l2和(vi)包含seqidno:109的胺基酸序列的cdr-l3。·如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該能夠特異性結合fap的模塊包含包含seqidno:16的胺基酸序列的可變重鏈和包含seqidno:17的胺基酸序列的可變輕鏈，或其中該能夠特異性結合fap的模塊包含包含seqidno:110的胺基酸序列的可變重鏈和包含seqidno:111的胺基酸序列的可變輕鏈。·權利要求1至15任一項的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該靶細胞抗原是cea。·如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該能夠特異性結合cea的模塊包含vh域和vl域，該vh域包含(i)包含seqidno:112的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:113的胺基酸序列的cdr-h2和(iii)包含seqidno:114的胺基酸序列的cdr-h3，該vl域包含(iv)包含seqidno:115的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:116的胺基酸序列的cdr-l2和(vi)包含seqidno:117的胺基酸序列的cdr-l3。·如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該能夠特異性結合cea的模塊包含包含seqidno:118的胺基酸序列的可變重鏈和包含seqidno:119的胺基酸序列的可變輕鏈。·如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該靶細胞抗原是cd19。·如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該能夠特異性結合cd19的模塊包含(a)vh域和vl域，該vh域包含(i)包含seqidno:120的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:121的胺基酸序列的cdr-h2和(iii)包含seqidno:122的胺基酸序列的cdr-h3，該vl域包含(iv)包含seqidno:123的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:124的胺基酸序列的cdr-l2和(vi)包含seqidno:125的胺基酸序列的cdr-l3，或(b)vh域和vl域，該vh域包含(i)包含seqidno:128的胺基酸序列的cdr-h1，(ii)包含seqidno:129的胺基酸序列的cdr-h2和(iii)包含seqidno:130的胺基酸序列的cdr-h3，該vl域包含(iv)包含seqidno:131的胺基酸序列的cdr-l1，(v)包含seqidno:132的胺基酸序列的cdr-l2和(vi)包含seqidno:133的胺基酸序列的cdr-l3。·如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該能夠特異性結合cd19的模塊包含包含seqidno:126的胺基酸序列的可變重鏈和包含seqidno:127的胺基酸序列的可變輕鏈，或其中該能夠特異性結合fap的模塊包含包含seqidno:134的胺基酸序列的可變重鏈和包含seqidno:135的胺基酸序列的可變輕鏈。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該fc域是igg，特別是igg1fc域或igg4fc域。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該fc域是igg1fc域且包含在igg重鏈的位置234和235(eu編號方式)和/或329(eu編號方式)處的胺基酸替代。·如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含一個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊。·如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子的vh域，(ii)輕鏈，其包含能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。·如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含包含seqidno:16的胺基酸序列的vh域或包含seqidno:110的胺基酸序列的vh域，(ii)輕鏈，其包含包含seqidno:17的胺基酸序列的vl域或包含seqidno:111的胺基酸序列的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。·如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含包含seqidno:118的胺基酸序列的vh域，(ii)輕鏈，其包含包含seqidno:119的胺基酸序列的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。·如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含包含seqidno:126的胺基酸序列的vh域或包含seqidno:134的胺基酸序列的vh域，(ii)輕鏈，其包含包含seqidno:127的胺基酸序列的vl域或包含seqidno:135的胺基酸序列的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。·如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其包含兩個能夠特異性結合靶細胞抗原的模塊。·如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子的vh域，(ii)兩條輕鏈，各自包含能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子的vh域和seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。·如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含包含seqidno:16的胺基酸序列的vh域或包含seqidno:110的胺基酸序列的vh域，(ii)兩條輕鏈，各自包含包含seqidno:17的胺基酸序列的vl域或包含seqidno:111的胺基酸序列的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含包含seqidno:16的胺基酸序列的vh域或包含seqidno:110的胺基酸序列的vh域和seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。·如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含包含seqidno:118的胺基酸序列的vh域，(ii)兩條輕鏈，各自包含包含seqidno:119的胺基酸序列的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含包含seqidno:118的胺基酸序列的vh域和seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。·如上文中定義的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)第一重鏈，其包含包含seqidno:126的胺基酸序列的vh域或包含seqidno:134的胺基酸序列的vh域，(ii)兩條輕鏈，其包含包含seqidno:127的胺基酸序列的vl域或包含seqidno:135的胺基酸序列的vl域，和(iii)第二重鏈，其包含包含seqidno:126的胺基酸序列的vh域或包含seqidno:134的胺基酸序列的vh域和seqidno:5或seqidno:103或seqidno:8的胺基酸序列。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(a)重鏈和輕鏈，二者構成能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子，和(b)融合蛋白，其包含fc域和包含seqidno:5的胺基酸序列的多肽。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(a)重鏈和輕鏈，二者構成能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子，和(b)融合蛋白，其包含seqidno:15的胺基酸序列。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)可變重鏈，其包含seqidno:16的胺基酸序列，(ii)可變輕鏈，其包含seqidno:17的胺基酸序列，和(iii)多肽，其包含seqidno:5的胺基酸序列。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(a)重鏈和輕鏈，二者構成能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子，和(b)融合蛋白，其包含fc域和包含seqidno:8的胺基酸序列的多肽。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(a)重鏈和輕鏈，二者構成能夠特異性結合靶細胞抗原的fab分子，和(b)融合蛋白，其包含seqidno:20的胺基酸序列。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含(i)可變重鏈，其包含seqidno:16的胺基酸序列，(ii)可變輕鏈，其包含seqidno:17的胺基酸序列，和(iii)多肽，其包含seqidno:8的胺基酸序列。·一種分離的多核苷酸，其編碼如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子。·一種載體，特別是表達載體，其包含如前文描述的分離的多核苷酸。·一種宿主細胞，其包含如前文描述的分離的多核苷酸或如前文描述的載體。·一種用於生成如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的方法，其包括以下步驟：(i)在適合於表達該抗原結合分子的條件下培養如前文描述的宿主細胞，並(ii)回收該抗原結合分子。·一種藥物組合物，其包含如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子和至少一種藥學上可接受的賦形劑。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，或如前文描述的藥物組合物，其作為藥物使用。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子，或如前文描述的藥物組合物，其在治療癌症中使用。·如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子製造用於治療癌症的藥物的用途。·一種在個體中治療疾病的方法，其包括對所述個體施用治療有效量的藥學上可接受形式的包含如前文描述的含有tnf家族配體三聚體的抗原結合分子的組合物。·如前文描述的治療疾病的方法，其中所述疾病是癌症。實施例以下是本發明的方法和組合物的實施例。應當理解，根據上面提供的一般描述，可以實踐各種其他實施方案。重組dna技術使用標準方法操作dna，如sambrook等人在molecularcloning:alaboratorymanual；coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989中所述。按照製造商的說明使用分子生物試劑。關於人免疫球蛋白輕鏈和重鏈的核苷酸序列的一般信息見：kabat,e.a.等人，(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthed.,nih公開no91-3242。dna測序通過雙鏈測序確定dna序列。基因合成使用適當的模板通過pcr生成或由geneartag(regensburg,germany)從合成的寡核苷酸和pcr產物通過自動基因合成來合成期望的基因區段。在沒有可用的確切基因序列的情況下，基於來自最近同源物的序列設計寡核苷酸引物，並且通過rt-pcr從源自適當組織的rna分離基因。將側翼為單個限制性核酸內切酶切割位點的基因區段克隆到標準克隆/測序載體中。從轉化的細菌中純化質粒dna，並通過紫外光譜法測定濃度。通過dna測序證實亞克隆基因片段的dna序列。設計具有適合的限制性位點的基因區段，以允許亞克隆到對應的表達載體中。所有構建體均被設計為具有編碼前導肽的5'端dna序列，所述前導肽靶向在真核細胞中分泌的蛋白質。細胞培養技術使用如currentprotocolsincellbiology(2000),bonifacino,j.s.,dasso,m.,harford,j.b.,lippincott-schwartz,j.和yamada,k.m.(eds.),johnwiley&sons,inc.中所述的標準細胞培養技術。蛋白質純化參考標準方案，從過濾的細胞培養物上清液中純化蛋白質。簡言之，將抗體施加到蛋白a瓊脂糖凝膠柱(gehealthcare)上並用pbs洗滌。在ph2.8實現抗體的洗脫，然後立即中和樣品。通過尺寸排阻色譜法(superdex200,gehealthcare)在pbs或在20mm組氨酸、150mmnacl(ph6.0)中從單體抗體分離聚集的蛋白質。合併單體抗體級分，使用例如milliporeamiconultra(30mwco)離心濃縮機進行濃縮(如果需要的話)，在-20℃或-80℃冷凍並儲存。提供部分樣品用於隨後例如通過sds-page、尺寸排阻色譜法(sec)或質譜法進行蛋白質分析和分析表徵。sds-page根據製造商的說明使用pre-cast凝膠系統(invitrogen)。具體地說，使用10％或4-12％的bis-trispre-cast凝膠(ph6.4)和mes(還原凝膠，具有抗氧化劑運行緩衝液添加劑)或mops(非還原凝膠)運行緩衝液。分析尺寸排阻色譜法通過hplc色譜法進行尺寸排阻色譜法(sec)，用於測定抗體的聚集和寡聚狀態。簡言之，將蛋白a純化的抗體施加到在agilenthplc1100系統上的300mmnacl、50mmkh2po4/k2hpo4(ph7.5)中的tosohtskgelg3000sw柱上，或者在dionexhplc系統上的2xpbs中的superdex200柱(gehealthcare)上。通過uv吸光度和峰面積的積分將洗脫的蛋白質定量。以biorad凝膠過濾標準151-1901作為標準。質譜法本節描述了具有vh/vl交換(vh/vlcrossmabs)的多特異性抗體的表徵，重點在於它們的正確裝配。通過去糖基化的完整crossmabs和去糖基化的/纖溶酶消化的或替代地去糖基化的/限制性lysc消化的crossmabs的電噴霧電離質譜法(esi-ms)分析預期的一級結構。在37℃下以1mg/ml的蛋白質濃度將vh/vlcrossmabs用磷酸鹽或tris緩衝液中的n-糖苷酶f進行去糖基化達17個小時。用tris緩衝液(ph8)中的100μg去糖基化的vh/vlcrossmabs，分別在室溫下進行120小時和在37℃下進行40分鐘的纖溶酶或限制性lysc(roche)消化。在進行質譜分析之前，將樣品通過hplc在sephadexg25柱(gehealthcare)上脫鹽。在裝備有triversananomate來源(advion)的maxis4guhr-qtofms系統(brukerdaltonik)上，通過esi-ms測定總質量。實施例1靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc融合抗原結合分子的製備和純化1.1單價的fap(28h1)靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s1)根據uniprot登錄號p41273(seqidno:43)，合成了編碼人4-1bb配體的胞外結構域部分(胺基酸71-254或71-248)的dna序列。克隆了包含各自被(g4s)2接頭分開的4-1bb配體的三個胞外結構域的多肽(seqidno:54)，如圖1a中描述：人4-1bb配體、(g4s)2接頭、人4-1bb配體、(g4s)2接頭、人4-1bb配體。使用具有seqidno:57的接頭(gspgssssgs)，將編碼單鏈三聚體4-1bb配體的多肽與節上的人igg1重鏈ch2和ch3結構域進行框內亞克隆(merchant,zhu等人，1998)。將編碼對成纖維細胞激活蛋白(fap)(克隆28h1)特異的結合劑的重鏈和輕鏈dna序列的可變區與穴(carter,2001)的恆定重鏈或人igg1的恆定輕鏈進行框內亞克隆。fap結合劑的生成和製備描述於wo2012/020006a2中，通過提述將其併入本文。根據國際專利申請公開no.wo2012/130831a1中描述的方法，將pro329gly、leu234ala和leu235ala突變引入節和穴重鏈的恆定區中，以消除與fcγ受體的結合。含有s354c/t366w突變的單鏈配體-fc節鏈與含有y349c/t366s/l368a/y407v突變的靶向的抗fap-fc穴鏈和抗fap輕鏈的結合允許產生異二聚體，其包括單鏈4-1bb配體三聚體和結合fap的fab(圖3a)。表1分別顯示了fap(28h1)靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的cdna和胺基酸序列。表1：fap(28h1)靶向的含有人4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合分子(fap單鏈4-1bbl三聚體)的序列(化合物s1)將靶向的含有單鏈tnf配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子編碼序列克隆到質粒載體中，所述質粒載體驅動來自mpsv啟動子的插入片段的表達，並含有位於cds3'端的合成polya序列。另外，該載體含有用於質粒的附加體維持的ebvorip序列。通過使用聚乙烯亞胺以哺乳動物表達載體共轉染hek293-ebna細胞產生靶向的含有單鏈4-1bbl的fc(kih)融合抗原結合分子。用1:1:1比率(「載體節鏈」:「載體穴鏈」:「載體輕鏈」)的相應表達載體轉染細胞。為了在500ml搖瓶中生產，在轉染前24小時接種4億個hek293ebna細胞。為了轉染，細胞在210xg下離心5分鐘，並將上清液替換為預熱的cdcho培養基。將表達載體在20mlcdcho培養基中混合至dna最終量為200μg。加入540μlpei後，將溶液渦旋15秒，並在室溫下溫育10分鐘。然後，將細胞與dna/pei溶液混合，轉移到500ml搖瓶中，並在5％co2氣氛的培養箱中於37℃溫育3小時。溫育後，加入160ml的f17培養基，將細胞培養24小時。轉染後1天，加入1mm丙戊酸和7％的含有補充劑的補料。培養7天後，通過在210xg下離心15分鐘收集上清液。將溶液無菌過濾(0.22μm過濾器)，補充疊氮化鈉至終濃度為0.01％(w/v)，並保持在4℃。通過使用蛋白a的親和色譜從細胞培養上清液中純化靶向的含有4-1bbl三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子，然後進行尺寸排阻色譜。對於親和色譜，將上清液上樣到hitrap蛋白ahp柱(cv＝5ml,gehealthcare)上，並且用含有20mm磷酸鈉、20mm檸檬酸鈉、0.5m氯化鈉、0.01％(v/v)tween-20的緩衝液(ph7.5)加以平衡。通過用至少10個柱體積的相同緩衝液洗滌除去未結合的蛋白質。用20個以上柱體積到100％的含有20mm檸檬酸鈉、0.5m氯化鈉、0.01％(v/v)吐溫20的緩衝液(ph2.5)，利用線性ph梯度洗脫結合的蛋白質。然後將柱用10個柱體積的20mm檸檬酸鈉、0.5m氯化鈉、0.01％(v/v)吐溫20緩衝液(ph2.5)洗滌。通過加入1/40(v/v)的2mtris(ph8.0)調節收集級分的ph。將蛋白質濃縮，然後上樣到用20mm組氨酸、150mm氯化鈉、0.01％(v/v)吐溫/20的溶液(ph6.0)平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)上。使用基於胺基酸序列計算的摩爾消光係數，通過測量280nm處的光密度(od)來確定蛋白質濃度。在存在和不存在還原劑(5mm1,4-二硫蘇糖醇)並用coomassiesimplebluetmsafestain(invitrogenusa)染色的情況下通過sds-page來分析靶向的含有tnf配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的純度和分子量。使用在25mmk2hpo4、125mmnacl、200mml-精氨酸一氫氯化物、0.02％(w/v)nan3的運行緩衝液(ph6.7)中平衡的tskgelg3000swxl分析尺寸排阻柱(tosoh)在25℃分析樣品的聚集物含量。表2總結了fap靶向的含有4-1bbl三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的產率和最終單體含量。表2：fap靶向的含有4-1bbl三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的產生的總結1.2二價的fap(4b9)靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s2)將含有被(g4s)2接頭分開的4-1bb配體(71-254或71-248，根據p41273合成)的三個胞外結構域的多肽與人igg1fc節鏈的c末端進行框內亞克隆(merchant,zhu等人，1998)，如圖28a描繪：人igg1fc節、(g4s)2接頭、人4-1bb配體、(g4s)2接頭、人4-1bb配體、(g4s)2接頭、人4-1bb配體。將編碼對成纖維細胞激活蛋白(fap)(克隆4b9)特異的結合劑的重鏈和輕鏈dna序列的可變區與穴的恆定重鏈、節、或人igg1的恆定輕鏈進行框內亞克隆。fap結合劑的生成和製備描述於wo2012/020006a2中，通過提述將其併入本文。已經將pro329gly、leu234ala和leu235ala突變引入節和穴重鏈的恆定區中，以消除與fcγ受體的結合，如wo2012/130831a1中描述。含有y349c/t366s/l368a/y407v突變的抗faphuigg1穴鏈、含有s354c/t366w突變的抗faphuigg1節三聚體配體鏈和抗fap輕鏈的結合允許產生異二聚體，其包括組裝的三聚體的4-1bb配體和兩個結合fap的fab(圖28b)。表3分別顯示了二價的fap靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的cdna和胺基酸序列。表3：二價的fap(4b9)靶向的含有單鏈4-1bbl(71-254)三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s2)的序列1.3單價的fap(4b9)靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s3)將含有被(g4s)2接頭分開的4-1bb配體(71-254或71-248，根據p41273合成)的三個胞外結構域的多肽亞克隆，如圖1a描繪：人4-1bb配體、(g4s)2接頭、人4-1bb配體、(g4s)2接頭、人4-1bb配體。使用具有seqidno:57的接頭(gspgssssgs)，將編碼單鏈三聚體4-1bb配體的多肽與節上的人igg1重鏈ch2和ch3結構域進行框內亞克隆(merchant,zhu等人，1998)。將編碼對成纖維細胞激活蛋白(fap)(克隆4b9)特異的結合劑的重鏈和輕鏈dna序列的可變區與穴的恆定重鏈、節、或人igg1的恆定輕鏈進行框內亞克隆。fap結合劑的生成和製備描述於wo2012/020006a2中，通過提述將其併入本文。已經將pro329gly、leu234ala和leu235ala突變引入節和穴重鏈的恆定區中，以消除與fcγ受體的結合，如wo2012/130831a1中描述。含有s354c/t366w突變的單鏈配體-fc節鏈與含有y349c/t366s/l368a/y407v突變的靶向的抗fap-fc穴鏈和抗fap輕鏈的組合允許產生異二聚體，其包括單鏈4-1bb配體三聚體和結合fap的fab(圖3a)。表4分別顯示了單價的fap(4b9)靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的cdna和胺基酸序列。表4：單價的fap(4b9)靶向的含有單鏈4-1bbl(71-254)三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s3)的序列seqidno:描述序列137抗fap(4b9)fc穴鏈的核苷酸序列參見表366三聚體hu4-1bbl(71-254)-fc節鏈的核苷酸序列參見表1139抗fap(4b9)輕鏈的核苷酸序列參見表3140抗fap(4b9)fc穴鏈參見表315三聚體hu4-1bbl(71-254)fc節鏈參見表1142抗fap(4b9)輕鏈參見表31.4二價的cea靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s4)如1.2中所述製備二價的fap(4b9)靶向的構建體分子，唯一的區別是抗fap結合劑被抗cea結合劑代替。將編碼對癌胚抗原cea(克隆sm9b)特異的結合劑的重鏈和輕鏈dna序列的可變區與穴的恆定重鏈、節或人igg1的恆定輕鏈進行框內亞克隆。由graff等人2004年在2005/0147614中以及在wo2014/004694a1中進一步描述了克隆sm9b，通過提述將這些文獻併入本文。已經將pro329gly、leu234ala和leu235ala突變引入節和穴重鏈的恆定區中，以消除與fcγ受體的結合，如wo2012/130831a1中描述。含有y349c/t366s/l368a/y407v突變的抗ceahuigg1穴鏈、含有s354c/t366w突變的抗ceahuigg1節三聚體配體鏈和抗cea輕鏈的組合允許產生異二聚體，其包括組裝的三聚體的4-1bb配體和兩個結合cea的fab(圖28b)。表5分別顯示了二價的cea(sm9b)靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的cdna和胺基酸序列。表5：二價的cea(sm9b)靶向的含有單鏈4-1bbl(71-254)三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s4)的序列1.5單價的cea(sm9b)靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s5)如1.3中所述製備單價的fap靶向的構建體分子，唯一的區別是抗fap結合劑被抗cea結合劑代替。將編碼對成纖維細胞激活蛋白(cea)(克隆sm9b)特異的結合劑的重鏈和輕鏈dna序列的可變區與穴(carter,2001)的恆定重鏈或人igg1的恆定輕鏈進行框內亞克隆。含有y349c/t366s/l368a/y407v突變的抗ceahuigg1穴鏈、含有s354c/t366w突變的單鏈配體huigg1節鏈和抗cea輕鏈的結合允許產生異二聚體，其包括組裝的三聚體的4-1bb配體和一個結合cea的fab(圖2a)。表6分別顯示了單價的cea(sm9b)靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的cdna和胺基酸序列。表6：單價的cea(sm9b)靶向的含有單鏈4-1bbl(71-254)三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s5)的序列seqidno:描述序列143抗cea(sm9b)fc穴鏈的核苷酸序列參見表566三聚體hu4-1bbl(71-254)-fc節鏈的核苷酸序列參見表1145抗cea(sm9b)輕鏈的核苷酸序列參見表5146抗cea(sm9b)fc穴鏈參見表515三聚體hu4-1bbl(71-254)fc節鏈參見表1148抗cea(sm9b)輕鏈參見表51.6二價的cd19靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s6和s7)如1.2中所述製備二價的fap(4b9)靶向的構建體分子，唯一的區別是抗fap結合劑被抗cd19結合劑代替。在實施例1.8中描述了cd19克隆的生成。將編碼對cd19特異的結合劑的重鏈和輕鏈dna序列(即,克隆8b8-018和8b8-2b11)的可變區與穴的恆定重鏈、節或人igg1的恆定輕鏈進行框內亞克隆。含有y349c/t366s/l368a/y407v突變的抗cd19huigg1穴鏈、含有s354c/t366w突變的抗cd19huigg1節三聚體配體鏈和抗cd19輕鏈的結合允許產生異二聚體，其包括組裝的三聚體的4-1bb配體和兩個結合cd19的fab(圖28b)。將pro329gly、leu234ala和leu235ala突變引入節和穴重鏈的恆定區中，以消除與fcγ受體的結合，如wo2012/130831a1中描述。表7分別顯示了二價的cd19(8b8-018)靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的cdna和胺基酸序列。表7：二價的cd19(8b8-018)靶向的含有單鏈4-1bbl(71-254)三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s6)的序列表8分別顯示了二價的cd19(8b8-2b11)靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的cdna和胺基酸序列。表8：二價的cd19(8b8-2b11)靶向的含有單鏈4-1bbl(71-254)三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s7)的序列1.7單價的cd19靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s8和s9)如1.3中所述製備單價的fap靶向的構建體分子，唯一的區別是抗fap結合劑被抗cd19結合劑代替。將編碼對cd19特異的結合劑的重鏈和輕鏈dna序列(即,克隆8b8-018或8b8-2b11)的可變區與穴(carter,2001)的恆定重鏈或人igg1的恆定輕鏈進行框內亞克隆。含有y349c/t366s/l368a/y407v突變的抗cd19huigg1穴鏈、含有s354c/t366w突變的單鏈配體huigg1節鏈和抗cd19輕鏈的結合允許產生異二聚體，其包括組裝的三聚體的4-1bb配體和一個結合cd19的fab(圖2a)。表9分別顯示了單價的cd19(8b8-018)靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的cdna和胺基酸序列。表9：單價的cd19(8b8-018)靶向的含有單鏈4-1bbl(71-254)三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s8)的序列seqidno:描述序列149抗cd19(8b8-018)fc穴鏈的核苷酸序列參見表766三聚體hu4-1bbl(71-254)-fc節鏈的核苷酸序列參見表1151抗cd19(8b8-018)輕鏈的核苷酸序列參見表7152抗cd19(8b8-018)fc穴鏈參見表715三聚體hu4-1bbl(71-254)fc節鏈參見表1154抗cd19(8b8-018)輕鏈參見表7表10分別顯示了單價的cd19(8b8-2b11)靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的cdna和胺基酸序列。表10：單價的cd19(8b8-2b11)靶向的含有單鏈4-1bbl(71-254)三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s9)的序列seqidno:描述序列155抗cd19(8b8-2b11)fc穴鏈的核苷酸序列參見表866三聚體hu4-1bbl(71-254)-fc節鏈的核苷酸序列參見表1157抗cd19(8b8-2b11)輕鏈的核苷酸序列參見表8158抗cd19(8b8-2b11)fc穴鏈參見表815三聚體hu4-1bbl(71-254)fc節鏈參見表1160抗cd19(8b8-2b11)輕鏈參見表81.8抗cd19結合劑8b8-018和8b8-2b11的生成1.8.1抗cd19克隆8b8-018的生成a)小鼠抗人cd19抗體(雜交瘤)的免疫和生成將balb/c小鼠免疫6次，並用cd19轉染的hek293細胞(平均受體密度為每細胞35,000)加強。利用人cd19轉染的nih-3t3細胞上的cd19細胞elisa，通過檢測血清樣品來監測免疫應答。使用具有足夠的抗人cd19抗體滴度的小鼠的脾細胞通過與小鼠骨髓瘤細胞系p3x63ag8.653融合進行永生化。進行三次融合，通過對人cd19轉染的nih-3t3細胞進行細胞elisa並且使用daudi(cd19+)和cd19-細胞進行facs結合測定來篩選雜交瘤上清液的抗人cd19特異性抗體(參見wo2011/147834的實施例1)。b)雜交瘤篩選和抗cd19抗體的細胞生物學功能評價應用細胞elisa篩選雜交瘤，並鑑定分泌抗人cd19抗體的雜交瘤。使用人cd19轉染的nih3t3細胞作為陽性細胞；使用未轉染的nih3t3細胞作為陰性對照細胞。為了評估陽性雜交瘤，將轉染和未轉染的nih3t3細胞之間的od比值進行定量。培養基：dmem高糖型(4.5mg/ml)、10％fcs、丙酮酸鈉、neaa、穀氨醯胺抗體陽性對照：抗cd19單克隆抗體(igg1)pharmingen目錄號555409c＝1mg/ml檢測抗體：山羊抗小鼠igg(h+l)hrp綴合物bio-rad目錄號170-06516稀釋度1：在1xelisa封閉劑中2000倍其他試劑：纖連蛋白roche目錄號838039c＝1mg/ml戊二醛：25％原液//gradeagarscientific#r102終濃度：pbs中0.05％elisa封閉劑：10x原液//roche目錄號1112589tmb底物：roche目錄號11432559終止液：1mh2so4biorad目錄號170-6516稀釋度1：在1xelisa封閉劑中2000倍第1天：纖連蛋白包被：pbs中5μg/cm2；96孔板＝32cm2；160μg/板6mlpbs，50μl/孔在室溫下溫育45分鐘，吸出包被溶液以1.25x104個細胞/孔接種於96孔板中的50μl培養液中在37℃下溫育40小時向板的上半部加入：表達cd19的nih3t3細胞向板的下半部加入：未轉染的nih3t3細胞第3天：在50μl培養基中加入陽性對照抗體或樣品(上清液或小鼠血清)在4℃下溫育2小時除去培養基，用100μl戊二醛(在pbs中，0.05％)固定細胞用200μlpbs洗滌兩次加入檢測抗體1:2000，50μl/孔在室溫下溫育2小時用200μlpbs洗滌三次加入50μltmb，在室溫下溫育30分鐘，通過加入25μl1mh2so4進行終止；讀取在450nm/620nm處的消光結果計算：nih3t3cd19的od:未轉染nih3t3的od的比值與未轉染的nih3t3細胞相比，選擇的抗體顯示出與cd19轉染的nih3t3細胞特異性結合(參見wo2011/147834的實施例2)。c)抗cd19抗體的人源化將鼠抗體的cd19結合特異性轉移到人接納體框架上以消除由於被人體識別為外來物的序列段引起的潛在免疫原性問題。這是通過將鼠(供體)抗體的整個互補決定區(cdr)移植到人(接納體)抗體框架上完成的，稱為cdr移植或抗體人源化。將鼠胺基酸序列與人種系抗體v基因的集合進行比對，並根據序列同一性和同源性進行分選。在選擇一個特定的接納體序列之前，必須確定供體抗體的所謂規範環結構(morea,v.等人，methods,vol20,issue3(2000)267-279)。通過存在於所謂的規範位置處的殘基的類型來確定這些規範環結構。這些位置位於(部分地)cdr區之外，並且必須在最終構建體中保持功能等效性，以便保留親本(供體)抗體的cdr構象。選擇人種系序列vbase_vh1_1作為重鏈的接納體，並且選擇序列vbase_vk2_5作為輕鏈的接納體。發現野生型人源化抗人cd19抗體8b8在hvr-l1中具有三個脫醯胺熱點：nsngnt(seqidno:161)。另外發現hvr-h2中存在另一個脫醯胺熱點：kfng(seqidno:162)。為了處理hvr-h2中的脫醯胺熱點，在位置64(根據kabat編號)處引入了n(asn)到q(gln)點突變。為了處理輕鏈中的脫醯胺熱點並獲得具有改進的脫醯胺穩定性的人源化抗人cd19抗體，在位置27e處(根據kabat編號)引入了從s(絲氨酸)到p(脯氨酸)的單個突變。因此，生成具有如下表18所示的cdr的克隆8b8-018。表11：8b8-018與人源化野生型cd19抗體8b8的比較另外，8b8-018保持對食蟹猴cd19的交叉反應性，如下表12所示。ec50[μg/ml]wt8b88b8-018hucd19ecd0.0870.084cycd19ecd0.3130.2551.8.2用於噬菌體展示活動的cd19抗原fc融合物的製備、純化和表徵為了以單體狀態(人cd19參見seqidno:32)表達和純化人和食蟹猴cd19胞外結構域，將各個dna片段與包含「節」突變的人igg1fc基因區段融合(人：seqidno:163；食蟹猴：seqidno:165)，並用「fc穴」(seqidno:76)對應物進行轉染(merchant等人，1998)。在抗原胞外結構域和fc節鏈之間引入iga切割位點(ptpptp)。在抗原fc節鏈的c末端引入用於定向生物素化的avi標籤，並出於純化目的將突變h435r和y436f引入fc穴中(jendebergl.等人，j.immunologicalmethods,1997)。含有s354c/t366w突變的抗原-fc節鏈(人：seqidno:164；食蟹猴：seqidno:166)與含有y349c/t366s/l368a/y407v突變的fc穴鏈(seqidno:80)的組合允許產生包括cd19胞外結構域的單拷貝的異二聚體fc融合片段(類似於圖3c中的4-1bb構建體)。表13列出了抗原fc融合構建體的cdna和胺基酸序列。表13：單體的人和食蟹猴cd19抗原fc(kih)融合分子的cdna和胺基酸序列為了產生單體抗原/fc融合分子，使用標準方法，用編碼融合蛋白的兩種成分(節鏈和穴鏈)的兩個質粒共轉染指數生長的懸浮cho細胞。通過使用蛋白a的親和色譜從細胞培養物上清液中純化分泌的蛋白質，然後進行尺寸排阻色譜。對於親和色譜，將上清液上樣到用磷酸鈉(20mm)、檸檬酸鈉(20mm)、0.5m氯化鈉緩衝液(ph7.5)平衡的mabselectsure柱(柱體積cv＝5-15ml，來自gehealthcare的樹脂)上。通過用至少6個柱體積的相同緩衝液洗滌除去未結合的蛋白質。使用線性梯度洗脫結合的蛋白質；步驟1，10個cv的0％至60％的洗脫緩衝液(20mm檸檬酸鈉、500mm氯化鈉緩衝液(ph2.5))；步驟2，2個cv的60％至100％的洗脫緩衝液。對於線性梯度，應用另外2個柱體積的100％的洗脫緩衝液進行分步洗脫。通過加入1/40(v/v)的2mtris(ph8.0)調節收集級分的ph。將蛋白質濃縮並過濾，然後上樣到用2mmmops、150mm氯化鈉、0.02％(w/v)疊氮化鈉的溶液(ph7.4)平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)上。表14總結了單體的人和食蟹猴cd19抗原fc(kih)融合蛋白的產率和最終單體含量。表14-單體的人和食蟹猴cd19抗原fc(kih)融合蛋白的生物化學分析構建體單體[％](sec)產率[mg/l]單體的人cd19fc(kih)融合蛋白910.2單體的食蟹猴cd19fc(kih)融合蛋白953.56根據製造商的說明書，使用bira生物素-蛋白質連接酶標準反應試劑盒(avidity，目錄號bira500)將部分純化抗原體外生物素化。相對於相應的食蟹猴cd19構建體的生物素化程度100％，含有人cd19的融合物的生物素化程度為94％。然後將生物素化的蛋白質用於選擇、篩選和表徵缺乏脫醯胺化熱點n27d和n28的親和力成熟的8b8衍生克隆。生成了2個噬菌體展示文庫，其中a)在位置27d和28處的兩個天冬醯胺殘基都被消除，並且b)重鏈和輕鏈的其他cdr被隨機化，以便選擇具有親和力提高的8b8變體。1.8.3缺乏cdr-l1熱點的8b8親和力成熟文庫的生成使用標準方案，通過噬菌體展示進行親和力成熟的8b8衍生的抗體的生成，所述抗體沒有位於cdr-l1中的脫醯胺化位點n27d和n28(silacci等人，2005)。在第一步，將人源化親本克隆8b8的vl和vhdna序列(seqidno:169和seqidno:170)克隆到噬菌粒中，然後將其用作隨機化的模板。在下一步，生成了兩個文庫，用於通過噬菌體展示選擇有利的克隆。為了消除上述熱點位置，對於兩個文庫，使用在位置27d和28處僅允許胺基酸stqe的lcdr1隨機化引物(seqidno:171)。成熟文庫1在輕鏈和重鏈兩者的cdr1和cdr2中都被隨機化，而成熟文庫2在輕鏈的cdr1和cdr3以及重鏈的cdr3中被隨機化。為了生成成熟文庫1，在輕鏈和重鏈的cdr1和cdr2中都加以隨機化，通過「重疊延伸剪接」(soe)pcr組裝三個片段並克隆到噬菌體載體中。使用以下引物組合生成文庫片段：片段1(lmb3(seqidno:176)和cd19l1反向隨機(seqidno:171)、片段2(cd19l2正向隨機(seqidno:172)和cd19h1反向隨機(seqidno:173)、和片段3(cd19h2正向隨機(seqidno:174)和cd19h3反向恆定(seqidno:175)(表15)。在裝配足夠量的全長隨機片段後，與相同處理的接納體噬菌粒載體一起用ncoi/nhei進行消化。將3倍摩爾過量的文庫插入物與10μg噬菌粒載體連接。純化的連接物用於20次轉化，得到2×10exp9個轉化體。通過peg/nacl純化挽救並純化展示8b8親和力成熟文庫的噬菌粒顆粒，以備用於選擇。類似地進行在輕鏈的cdr1和cdr3中以及重鏈的cdr3中被隨機化的第二個文庫的生成。使用以下引物組合生成文庫片段：片段1(lmb3(seqidno:176)和cd19l1反向隨機(seqidno:171)、片段2(cd19l1正向恆定(seqidno:177)和cd19l3反向隨機(seqidno:178)、和片段3(cd19l3正向恆定(seqidno:179)和cd19h3反向隨機(seqidno:180)(表16)。在裝配足夠量的全長隨機片段後，與相同處理的接納體噬菌粒載體一起用ncoi/kpni進行消化。將3倍摩爾過量的文庫插入物與20μg噬菌粒載體連接。純化的連接物用於40次轉化，得到2×10exp9個轉化體。通過peg/nacl純化挽救並純化展示8b8親和力成熟文庫的噬菌粒顆粒，以備用於選擇。表15：用於8b8親和力成熟和熱點去除文庫l1_l2/h1_h2的引物表16：用於8b8親和力成熟和熱點去除文庫l1_l3/h3的引物1.8.4缺乏cdr-l1熱點n27d和n28的親和力成熟的8b8衍生克隆的選擇為了選擇缺乏cdr-l1熱點n27d和n28的親和力成熟的克隆，通過噬菌體展示進行了兩種選擇方法：在第一種方法中，使用兩種噬菌體展示文庫對人cd19-fc融合蛋白實施選擇。根據以下模式在溶液中進行各輪淘選：1.約1012個噬菌粒顆粒與30nm生物素化的cd19-fc蛋白質以總體積1ml結合0.5小時；2.通過加入5.4×107個鏈黴親和素包被的磁珠捕獲生物素化的cd19-fc蛋白和特異性結合的噬菌體顆粒10分鐘；3.使用5x1mlpbs/吐溫20和5x1mlpbs洗滌珠子；4.通過加入1ml100mmtea洗脫噬菌體顆粒10分鐘，並通過加入500μl1mtris/hclph7.4進行中和；5.指數生長的大腸桿菌tg1細菌的再感染；以及6.用輔助噬菌體vcsm13感染以及隨後的噬菌粒顆粒的peg/nacl沉澱，所述噬菌粒顆粒用於隨後的選擇輪中。使用遞減的抗原濃度(30x10-9m、10x10-9m、和3x10-9m)進行3輪以上的選擇。在第2和第3輪中，使用中性親和素板代替鏈黴親和素珠進行抗原:噬菌體複合物的捕獲。用5xpbs/吐溫20和5xpbs洗滌中性親和素板。在第3輪中，將中性親和素板在2升pbs中溫育過夜進行「解離速率」選擇，然後從板上洗脫噬菌體。此外，在第2輪中使用食蟹猴cd19-fc蛋白來富集交叉反應性結合劑。在第二種選擇方法中，對在細胞表面上瞬時表達人或食蟹猴cd19ecd的細胞實施噬菌體淘選。為了hek細胞的瞬時轉染，生成包含以下蛋白質區段的dna序列(5'至3')的表達質粒：flag標籤、snap標籤、人或食蟹猴來源的cd19ecd、以及血小板衍生生長因子受體(pdgfr)的跨膜區(seqidno:227和228)。使用用於檢測的抗flag抗體，通過流式細胞術證實細胞表面上對應蛋白質(seqidno:229和230)的表達。在第一選擇輪中，兩個文庫都暴露於表達含有人或食蟹猴cd19ecd的融合蛋白的細胞。對於後續的淘選輪，適當地交替使用cd19ecd的種類。用無關膜蛋白瞬時轉染的細胞用於預清除。根據以下模式進行各輪淘選：1.根據前述標準程序，用表達cd19ecd或無關跨膜蛋白的構建體轉染hek細胞；2.在5％co2氣氛的培養箱中在37℃下溫育細胞總共48h；3.通過離心分離細胞(在250×g下3分鐘)，分別將1×10e7cd19ecd陽性細胞和1×10e7陰性細胞重懸於pbs/5％bsa中；4.通過使用輕輕旋轉的管旋轉器在4℃下用1×107個cd19陰性細胞溫育噬菌體文庫60分鐘，預先清除非特異性噬菌體；5.將細胞在250×g下離心3分鐘，將上清液轉移到新鮮管中，加入1×10e7cd19陽性細胞，並通過輕輕旋轉管旋轉器在4℃下溫育60分鐘；6.通過在250×g下離心1分鐘洗滌細胞，吸出上清液，重懸於1mlpbs(8倍)中；7.用1ml100mmtea進行噬菌體洗脫，在室溫下溫育5分鐘，用500μl1mtris-hcl(ph7.6)中和洗脫液；8.指數生長的大腸桿菌tg1細菌的再感染；和9.用輔助噬菌體vcsm13感染以及隨後的噬菌粒顆粒的peg/nacl沉澱，所述噬菌粒顆粒用於隨後的選擇輪中。進行3輪以上的選擇。對於兩種選擇方法，通過elisa如下鑑定特異性結合劑：將100μl30nm生物素化cd19-fc蛋白/孔包被在中性親和素板上。加入含fab的細菌上清液，使用抗flag/hrp二抗通過其flag標籤檢測結合性fab。使用經過用含有人cd19ecd的表達質粒(seqidno:227)瞬時轉染的細胞，在基於細胞的elisa中進一步測試在重組人cd19方面為elisa陽性的克隆。該分析如下進行：轉染後48h，收穫hek細胞，在250xg下離心5分鐘。然後將細胞重懸於冰冷的pbsbsa2％中至4x106個細胞/ml，在冰上溫育20分鐘以阻斷非特異性結合位點。將100μl中的4×105個細胞分配到96孔板的每個孔中，並在250xg和4℃下離心3分鐘。吸出上清液，將含有可溶性fab片段的50μl細菌上清液用50μl冰冷的pbs/bsa2％稀釋，加入板中，與細胞混合，在4℃下溫育1小時。然後，將細胞用冰冷的pbs洗滌3次，然後每孔加入100μl含有1:2000稀釋的抗fab-hrp抗體的pbs2％bsa。溫育1小時後，用冰冷的pbs反覆洗滌細胞3次。為了顯色，每孔加入100μl「1步超tmb-elisa」底物。在溫育10分鐘之後，將上清液轉移到每孔含有40μlh2so41m的新的96孔板中，測量在450nm下的吸光度。使用proteonxpr36，藉助於spr分析，對顯示超過背景的顯著信號的克隆進行動力學篩選實驗。1.8.5通過spr鑑定親和力成熟的8b8衍生變體為了進一步表徵elisa陽性克隆，通過表面等離子體共振測定解離速率，並與親本人源化克隆8b8進行比較。對於該實驗，通過胺偶聯(naacetateph4.5，25μl/min，240s)將7000ru的多克隆抗人fab抗體固定在glm晶片的所有6個通道上(垂直取向)。將每種含抗體的細菌上清液過濾並用pbs稀釋2倍，然後以25μl/分鐘注入360s，以實現垂直取向為100-400響應單位(ru)的固定水平。單體cd19-fc的注入：對於一步法動力學測量，將注入方向改變為水平取向，同時以50μl/min沿分開的通道1-4注入純化的單體cd19-fc的三倍稀釋系列(在150和6nm之間的不同濃度範圍)，其中結合時間為180秒，解離時間為300秒。在通道5中注入人iggfc片段(150nm)，作為與親和力成熟的cd19變體特異性結合的陰性對照，所述變體與pbs一起注入第6通道，以提供用於參考的「並列」空白。通過以90μl/min(水平取向)進行30秒的10mm甘氨酸ph1.5和50mmnaoh的兩次脈衝進行再生。使用proteonmanagerv3.1軟體中的簡單的一對一langmuir結合模型，通過同時擬合傳感圖來計算解離速率常數(koff)。鑑定出具有最慢解離速率常數的表達fab的克隆。對相應噬菌粒的可變結構域進行測序。重要的是，dr-l1中的兩個天冬醯胺殘基(位置27d和28)都被絲氨酸或蘇氨酸替換，表明兩個脫醯胺位點都被去除。表17：在用細菌上清液的篩選分析中獲得的親本8b8和選定克隆2b11的解離常數克隆解離常數kd(1/s)親本8b83.01e-42b114.37e-6表18分別顯示了克隆8b8-018和8b8-2b11的cdr以及可變區vh和vl的胺基酸序列。表18：克隆8b8-018和8b8-2b11的cdr以及可變區vh和vl的序列實施例2「非靶向的」含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc融合抗原結合分子的製備和純化編碼單鏈三聚體配體的多肽鏈(圖1a)用於製備非靶向的(種系對照，dp47)含有4-1bb配體三聚體的fc融合抗原結合分子(例如圖3b所示的單價對照)，如以上針對fap靶向的構建體所述。將fap結合劑的重鏈和輕鏈dna序列的可變區用種系對照(dp47)的可變區替換，並與穴的恆定重鏈或人igg1的恆定輕鏈進行框內亞克隆。如上文對於fap靶向的構建體的描述，產生非靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子。用1:1:1比率(「載體三聚體配體節鏈」:「載體dp47fab-穴鏈」:「載體dp47輕鏈」)的相應表達載體轉染細胞。表19分別顯示了單價的含有dp47的含有4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的cdna和胺基酸序列。表19：單價的含有dp47的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(dp47單鏈4-1bbl三聚體)(對照1)的序列表20總結了含有dp47的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合分子的產率和最終單體含量。表20：含有dp47的含有4-1bbl三聚體的fc(kih)融合分子的產生的總結表21分別顯示了二價的含有dp47的含有4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(對照2)的cdna和胺基酸序列。表21：二價的含有dp47的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(dp47單鏈4-1bbl三聚體)(對照2)的序列實施例3靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子及其對照的產生將如本文中之前所述的靶向和非靶向的三聚體的4-1bb配體fc(kih)融合抗原結合分子的編碼序列克隆到質粒載體中，所述質粒載體驅動來自mpsv啟動子的插入片段的表達，並含有位於cds3'端的合成polya序列。另外，該載體含有用於質粒的附加體維持的ebvorip序列。通過使用聚乙烯亞胺以哺乳動物表達載體共轉染hek293-ebna細胞產生靶向的和非靶向的單鏈三聚體的4-1bb配體的fc(kih)融合抗原結合分子。用1:1:1比率(「載體節鏈」:「載體穴鏈」:「載體輕鏈」)的相應表達載體轉染細胞。為了在500ml搖瓶中生產，在轉染前24小時接種3億個hek293ebna細胞。為了轉染，細胞在210xg下離心10分鐘，並將上清液替換為20ml預熱的cdcho培養基。在20mlcdcho培養基中混合表達載體(200μg的總dna)。加入540μlpei後，將溶液渦旋15秒，並在室溫下溫育10分鐘。然後，將細胞與dna/pei溶液混合，轉移到500ml搖瓶中，並在5％co2氣氛的培養箱中於37℃溫育3小時。溫育後，加入160ml補充有6mml-穀氨醯胺、5g/lpepsoy和1.2mm丙戊酸的excell培養基，將細胞培養24小時。轉染後一天，加入12％補料。培養7天後，通過在至少400xg下離心30-40分鐘收集上清液。將溶液無菌過濾(0.22μm過濾器)，補充疊氮化鈉至終濃度為0.01％(w/v)，並保持在4℃。通過使用蛋白a的親和色譜從細胞培養物上清液中純化分泌的蛋白質，然後進行尺寸排阻色譜。對於親和色譜，將上清液上樣到用磷酸鈉(20mm)、檸檬酸鈉(20mm)緩衝液(ph7.5)平衡的mabselectsure柱(cv＝5-15ml，來自gehealthcare的樹脂)上。通過用至少6個柱體積的相同緩衝液洗滌除去未結合的蛋白質。使用20mm檸檬酸鈉、100mm氯化鈉、100mm甘氨酸緩衝液(ph3.0)的線性梯度(20cv)或分步洗脫(8cv)洗脫結合的蛋白質。對於線性梯度，應用另外4個柱體積的分步洗脫。通過加入1/10(v/v)的0.5m磷酸鈉(ph8.0)調節收集級分的ph。將蛋白質濃縮，然後上樣到用20mm組氨酸、140mm氯化鈉、0.01％(v/v)吐溫20的溶液(ph6.0)平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)上。使用基於胺基酸序列計算的摩爾消光係數，通過測量280nm處的光密度(od)來確定蛋白質濃度。在存在和不存在還原劑(5mm1,4-二硫蘇糖醇)並用coomassiesimplebluetmsafestain(invitrogenusa)染色的情況下通過sds-page或使用caliperlabchipgxii(perkinelmer)的ce-sds來分析靶向的三聚體的4-1bb配體fc(kih)融合物的純度和分子量。使用在25mmk2hpo4、125mmnacl、200mml-精氨酸一氫氯化物、0.02％(w/v)nan3的運行緩衝液(ph6.7)中平衡的tskgelg3000swxl分析尺寸排阻柱(tosoh)在25℃分析樣品的聚集物含量。表22總結了靶向的和非靶向的單鏈三聚體的4-1bbl配體fc(kih)融合抗原結合分子的產率和最終單體含量。表22：靶向的和非靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的生物化學分析實施例44-1bb的製備、純化和表徵將編碼人、小鼠或食蟹猴4-1bb(表23)的胞外結構域的dna序列與節上的人igg1重鏈ch2和ch3結構域進行框內亞克隆(merchantetal.,1998)。在抗原胞外結構域和人igg1的fc之間引入actev蛋白酶切割位點。將用於定向生物素化的avi標籤引入抗原-fc節的c末端。含有s354c/t366w突變的抗原-fc節鏈與含有y349c/t366s/l368a/y407v突變的fc穴鏈的組合允許產生異二聚體，其包括單拷貝的含有4-1bb胞外結構域的鏈，從而產生單體形式的fc連接的抗原(圖3c)。表24列出了如圖3c中描繪的單體抗原fc(kih)融合分子的cdna和胺基酸序列。表23：抗原胞外結構域(ecd)的胺基酸編號及其起源seqidno:構建體起源ecd73人4-1bbecd根據q07011合成aa24-18674食蟹猴4-1bbecd從食蟹猴血中分離aa24-18675鼠4-1bbecd根據p20334合成aa24-187表24：單體抗原fc(kih)融合分子(通過一個fc穴鏈與一個抗原fc節鏈的組合產生)的cdna和胺基酸序列將所有4-1bb-fc-融合物編碼序列克隆到質粒載體中，所述質粒載體驅動來自mpsv啟動子的插入片段的表達，並含有位於cds3'端的合成polya信號序列。另外，該載體含有用於質粒的附加體維持的ebvorip序列。為了製備生物素化的單體抗原/fc融合分子，用編碼融合蛋白的兩種成分(節鏈和穴鏈)以及生物素化反應所必需的酶bira的三個載體共轉染指數生長的懸液hek293ebna細胞。以2:1:0.05的比率使用相應的載體(「抗原ecd-actev-fc節」:「fc穴」:「bira」)。為了在500ml搖瓶中生產蛋白質，在轉染前24小時接種4億個hek293ebna細胞。為了轉染，細胞在210g下離心5分鐘，並將上清液替換為預熱的cdcho培養基。將表達載體重懸於含有200μg載體dna的20ml的cdcho培養基中。加入540μl聚乙稀亞胺(pei)後，將溶液渦旋15秒，並在室溫下溫育10分鐘。然後，將細胞與dna/pei溶液混合，轉移到500ml搖瓶中，並在5％co2氣氛的培養箱中於37℃溫育3小時。溫育後，加入160ml的f17培養基，將細胞培養24小時。轉染後1天，向培養物中加入1mm丙戊酸和7％的補料。培養7天後，通過將細胞在210g下離心15分鐘收集細胞上清液。將溶液無菌過濾(0.22μm過濾器)，補充疊氮化鈉至終濃度為0.01％(w/v)，並保持在4℃。通過使用蛋白a的親和色譜從細胞培養物上清液中純化分泌的蛋白質，然後進行尺寸排阻色譜。對於親和色譜，將上清液上樣到用40ml的20mm磷酸鈉、20mm檸檬酸鈉緩衝液(ph7.5)平衡的hitrap蛋白ahp柱(cv＝5ml,gehealthcare)上。通過用至少10個柱體積的含有20mm磷酸鈉、20mm檸檬酸鈉、0.5m氯化鈉的緩衝液(ph7.5)洗滌除去未結合蛋白質。使用在20個柱體積的20mm檸檬酸鈉、0.01％(v/v)吐溫20(ph3.0)上產生的氯化鈉的線性ph梯度(0至500mm)洗脫結合的蛋白質。然後將柱用10個柱體積的20mm檸檬酸鈉、500mm氯化鈉、0.01％(v/v)吐溫20(ph3.0)洗滌。通過加入1/40(v/v)的2mtris(ph8.0)調節收集級分的ph。將蛋白質濃縮並過濾，然後上樣到用2mmmops、150mm氯化鈉、0.02％(w/v)疊氮化鈉的溶液(ph7.4)平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)上。為了測定對人受體的親和力，還將人4-1bb的胞外結構域與avi(glndifeaqkiewhe,seqidno:84)和六組氨酸標籤進行框內亞克隆。如上對fc融合蛋白所描述進行蛋白質生產。通過螯合色譜從細胞培養物上清液中純化分泌的蛋白質，然後進行尺寸排阻色譜。第一個色譜步驟在20mm磷酸鈉、500nm氯化鈉(ph7.4)中平衡的nintasuperflowcartridge(5ml,qiagen)上進行。通過施加超過12個柱體積的5％到45％梯度的洗脫緩衝液(20mm磷酸鈉、500nm氯化鈉、500mm咪唑，ph7.4)進行洗脫。將蛋白質濃縮並過濾，然後上樣到用2mmmops、150mm氯化鈉、0.02％(w/v)疊氮化鈉的溶液(ph7.4)平衡的hiloadsuperdex75柱(gehealthcare)上。表25：單體人4-1bbhis分子的序列實施例5通過表面等離子體共振對fap靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc融合抗原結合分子的生物化學表徵通過表面等離子體共振(spr)評估fap靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子與重組4-1bb的結合。所有spr實驗均在25℃下在biacoret100上進行，使用hbs-ep作為運行緩衝液(0.01mhepesph7.4、0.15mnacl、3mmedta、0.005％表面活性劑p20，biacore,freiburg/germany)。如圖5a所示測定fap靶向的或「非靶向的」含有4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子與重組4-1bb(人、食蟹猴和鼠)之間的相互作用的親合力。數據表明，含有4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的所有變體(參見例如圖5中fap(28h1)單鏈4-1bbl三聚體(化合物s1)、以及圖6中的「非靶向的」dp47單鏈4-1bbl三聚體(對照a)的曲線)都與人和食蟹猴4-1bb具有相當的親合力，但與小鼠同源物的親合力可忽略不計。使用標準偶聯指導(biacore,freiburg/germany)將重組生物素化的人、食蟹猴和鼠4-1bbfc(kih)融合分子直接偶聯在sa晶片上。固定化水平為約30個共振單位(ru)。使fap靶向的含有4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s1)或含有dp47的對照以0.9至500nm的濃度範圍以30μl/分鐘的流速經180秒通過流動池。監測解離180秒。通過減去在空的參考流動池上獲得的響應來校正本體折射率差異。對於親和力測量(圖7)，使用標準胺偶聯試劑盒(gehealthcare)，在ph5.0的cm5晶片上進行約7200個共振單位(ru)的抗人fc特異性抗體的直接偶聯。在流動池2上以30μl/min的流速捕獲50nm的fap靶向或非靶向的含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子持續60秒。使hu4-1bbavihis的稀釋系列(1.95至1000nm)以30μl/min在兩個流動池上通過120秒來記錄結合相。監測解離相180秒，並通過從樣品溶液切換到hbs-ep進行觸發。在每次循環後，使用3mmgcl2雙重注射60秒使晶片表面再生。通過減去在參考流動池1上獲得的響應來校正本體折射率差異。對於靶向的單鏈三聚體的4-1bb配體fc(kih)融合抗原結合分子與hu4-1bbavihis之間的相互作用，通過使用biaeval軟體(gehealthcare)擬合至1:1langmuir結合，從速率常數推導出親和常數。解離常數可見表26。表26：對1:1langmuir結合的擬合和親和常數實施例6靶向的含有單鏈ox40配體三聚體的fc融合抗原結合分子的製備和純化根據uniprot登錄號p23510(seqidno:38)，合成了編碼人ox40配體的胞外結構域部分(胺基酸51-183)的dna序列。通過誘變將兩個asn連接的糖基化位點(n90和n114)替換為天冬氨酸(asp)。將含有被(g4s)2接頭分開的ox40配體的三個胞外結構域的多肽進行克隆，如圖1b中描繪：人ox40配體、(g4s)2接頭、人ox40配體、(g4s)2接頭、人ox40配體。使用具有seqidno:57的接頭(gspgssssgs)，將編碼單鏈三聚體ox40配體的多肽與節上的人igg1重鏈ch2和ch3結構域進行框內亞克隆(merchant,zhu等人，1998)。將編碼對成纖維細胞激活蛋白(fap)特異的結合劑的重鏈和輕鏈dna序列的可變區與穴(carter,2001)的恆定重鏈或人igg1的恆定輕鏈進行框內亞克隆。根據國際專利申請公開no.wo2012/130831a1中描述的方法，已經將pro329gly、leu234ala和leu235ala突變引入節和穴重鏈的恆定區中，以消除與fcγ受體的結合。含有s354c/t366w突變的單鏈配體-fc節鏈與含有y349c/t366s/l368a/y407v突變的靶向的抗fap-fc穴鏈和抗fap輕鏈的結合允許產生異二聚體，其包括單鏈三聚體ox40配體和結合fap的fab(圖4a)。表27分別顯示了fap靶向的含有單鏈ox40配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的cdna和胺基酸序列。使用具有seqidno:57的接頭(gspgssssgs)，將編碼單鏈三聚體ox40配體的多肽與節(merchant,zhuetal.1998)上的人igg1重鏈ch2和ch3結構域進行框內亞克隆。表27：fap(28h1)靶向的含有人ox40配體三聚體的fc(kih)融合分子(fap單鏈ox40l三聚體)(化合物s10)的序列將靶向的含有單鏈ox40配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子編碼序列克隆到質粒載體中，所述質粒載體驅動來自mpsv啟動子的插入片段的表達，並含有位於cds3'端的合成polya序列。另外，該載體含有用於質粒的附加體維持的ebvorip序列。通過使用聚乙烯亞胺以哺乳動物表達載體共轉染hek293-ebna細胞產生靶向的單鏈三聚體的ox40配體fc(kih)融合抗原結合分子。用1:1:1比率(「載體節鏈」:「載體穴鏈」:「載體輕鏈」)的相應表達載體轉染細胞。為了在500ml搖瓶中生產，在轉染前24小時接種4億個hek293ebna細胞。為了轉染，細胞在210xg下離心5分鐘，並將上清液替換為預熱的cdcho培養基。將表達載體在20mlcdcho培養基中混合至dna最終量為200μg。加入540μlpei後，將溶液渦旋15秒，並在室溫下溫育10分鐘。然後，將細胞與dna/pei溶液混合，轉移到500ml搖瓶中，並在5％co2氣氛的培養箱中於37℃溫育3小時。溫育後，加入160ml的f17培養基，將細胞培養24小時。轉染後1天，加入1mm丙戊酸和7％的含有補充劑的補料。培養7天後，通過在210xg下離心15分鐘收集上清液。將溶液無菌過濾(0.22μm過濾器)，補充疊氮化鈉至終濃度為0.01％(w/v)，並保持在4℃。通過使用蛋白a的親和色譜從細胞培養上清液中純化靶向的含有單鏈ox40配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子，然後進行尺寸排阻色譜。對於親和色譜，將上清液上樣到hitrap蛋白ahp柱(cv＝5ml,gehealthcare)上，所述柱用含有20mm磷酸鈉、20mm檸檬酸鈉、0.5m氯化鈉、0.01％(v/v)tween-20的緩衝液(ph7.5)加以平衡。通過用至少10個柱體積的相同緩衝液洗滌除去未結合的蛋白質。用20個以上柱體積到100％的含有20mm檸檬酸鈉、0.5m氯化鈉、0.01％(v/v)吐溫20的緩衝液(ph2.5)，利用線性ph梯度洗脫結合的蛋白質。然後將柱用10個柱體積的20mm檸檬酸鈉、0.5m氯化鈉、0.01％(v/v)吐溫20緩衝液(ph2.5)洗滌。通過加入1/40(v/v)的2mtris(ph8.0)調節收集級分的ph。將蛋白質濃縮，然後上樣到用20mm組氨酸、150mm氯化鈉、0.01％(v/v)吐溫/20的溶液(ph6.0)平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)上。使用基於胺基酸序列計算的摩爾消光係數，通過測量280nm處的光密度(od)來確定蛋白質濃度。在存在和不存在還原劑(5mm1,4-二硫蘇糖醇)並用coomassiesimplebluetmsafestain(invitrogenusa)染色的情況下通過sds-page來分析靶向的含有ox40配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的純度和分子量。使用在25mmk2hpo4、125mm氯化鈉、200mml-精氨酸一氫氯化物、0.02％(w/v)nan3的運行緩衝液(ph6.7)中平衡的tskgelg3000swxl分析尺寸排阻柱(tosoh)在25℃分析樣品的聚集物含量。得到靶向的含有單鏈ox40配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物sc-10)，產率為9.1mg/ml，最終單體含量為87％(sec)。實施例7「非靶向的」含有單鏈ox40配體三聚體的fc融合抗原結合分子的製備和純化該「非靶向的」構建體由上述ox40配體-fc節鏈、dp47種系對照-fc穴鏈和dp47輕鏈組成(圖4b)，將這些鏈以1:1:1的比率(「載體節鏈」:「載體穴鏈」:「載體輕鏈」)進行共轉染。如上所述進行靶向的含有單鏈ox40配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的產生和純化。將fap結合劑的重鏈和輕鏈dna序列的可變區用種系對照(dp47)的可變區替換，並與穴的恆定重鏈或人igg1的恆定輕鏈進行框內亞克隆。表28分別顯示了含有dp47的含有4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的cdna和胺基酸序列。表28：含有dp47的含有單鏈ox40配體三聚體的fc(kih)融合分子(dp47單鏈ox40l三聚體)(對照3)的序列得到含有dp47的含有單鏈ox40配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(對照3)，產率為7mg/ml，最終單體含量為100％(sec)。實施例8ox40的製備、純化和表徵將編碼人、小鼠或食蟹猴ox40(表11)的胞外結構域的dna序列與節上的人igg1重鏈ch2和ch3結構域進行框內亞克隆(merchantetal.,1998)。在抗原胞外結構域和人igg1的fc之間引入actev蛋白酶切割位點。將用於定向生物素化的avi標籤引入抗原-fc節的c末端。含有s354c/t366w突變的抗原-fc節鏈與含有y349c/t366s/l368a/y407v突變的fc穴鏈的組合允許產生異二聚體，其包括單拷貝的含有ox40胞外結構域的鏈，從而產生單體形式的fc連接的抗原(圖4c)。表29顯示了各個ox40胞外結構域的胺基酸序列。表30顯示了如圖4c中描繪的單體抗原fc(kih)融合分子的cdna和胺基酸序列。表29：抗原胞外結構域(ecd)的胺基酸編號及其起源seqidno:構建體起源ecd88人ox40ecd根據p43489合成aa29-21489食蟹猴ox40ecd從食蟹猴血中分離aa29-21490鼠ox40ecd根據p47741合成aa10-211表30：單體抗原fc(kih)融合分子(通過一個fc穴鏈與一個抗原fc節鏈的組合產生)的cdna和胺基酸序列將所有ox40-fc-融合物編碼序列克隆到質粒載體中，所述質粒載體驅動來自mpsv啟動子的插入片段的表達，並含有位於cds3'端的合成polya信號序列。另外，該載體含有用於質粒的附加體維持的ebvorip序列。為了製備生物素化的單體抗原/fc融合分子，用編碼融合蛋白的兩種成分(節鏈和穴鏈)以及生物素化反應所必需的酶bira的三個載體共轉染指數生長的懸液hek293ebna細胞。以2:1:0.05的比率使用相應的載體(「抗原ecd-actev-fc節」:「fc穴」:「bira」)。為了在500ml搖瓶中生產蛋白質，在轉染前24小時接種4億個hek293ebna細胞。為了轉染，細胞在210g下離心5分鐘，並將上清液替換為預熱的cdcho培養基。將表達載體重懸於含有200μg載體dna的20ml的cdcho培養基中。加入540μl聚乙稀亞胺(pei)後，將溶液渦旋15秒，並在室溫下溫育10分鐘。然後，將細胞與dna/pei溶液混合，轉移到500ml搖瓶中，並在5％co2氣氛的培養箱中於37℃溫育3小時。溫育後，加入160ml的f17培養基，將細胞培養24小時。轉染後1天，向培養物中加入1mm丙戊酸和7％的補料。培養7天後，通過將細胞在210g下離心15分鐘收集細胞上清液。將溶液無菌過濾(0.22μm過濾器)，補充疊氮化鈉至終濃度為0.01％(w/v)，並保持在4℃。通過使用蛋白a的親和色譜從細胞培養物上清液中純化分泌的蛋白質，然後進行尺寸排阻色譜。對於親和色譜，將上清液上樣到hitrap蛋白ahp柱(cv＝5ml,gehealthcare)上，並且用含有20mm磷酸鈉、20mm檸檬酸鈉、0.5m氯化鈉、0.01％(v/v)tween-20的緩衝液(ph7.5)加以平衡。通過用至少10個柱體積的相同緩衝液洗滌除去未結合的蛋白質。用12個以上柱體積到100％的含有20mm檸檬酸鈉、0.5m氯化鈉、0.01％(v/v)吐溫20的緩衝液(ph2.5)，利用線性ph梯度洗脫結合的蛋白質。然後將柱用10個柱體積的20mm檸檬酸鈉、0.5m氯化鈉、0.01％(v/v)吐溫20緩衝液(ph2.5)洗滌。通過加入1/40(v/v)的2mtris(ph8.0)調節收集級分的ph。將蛋白質濃縮並過濾，然後上樣到用2mmmops、150mm氯化鈉、0.02％疊氮化鈉的溶液(ph7.4)平衡的hiloadsuperdex200柱(gehealthcare)上。為了測定對人受體的親和力，還將人ox40的胞外結構域與avi(glndifeaqkiewhe,seqidno:84)和六組氨酸標籤進行框內亞克隆。序列顯示在表31中。如上對fc融合蛋白所描述進行蛋白質生產。通過螯合色譜從細胞培養物上清液中純化分泌的蛋白質，然後進行尺寸排阻色譜。第一個色譜步驟在用具有20mm磷酸鈉和500nm氯化鈉的溶液(ph7.4)平衡的nintasuperflowcartridge(5ml,qiagen)上進行。通過施加超過12個柱體積的5％到45％梯度的含有20mm磷酸鈉、500nm氯化鈉和500mm咪唑的洗脫緩衝液(ph7.4)進行洗脫。將蛋白質濃縮並過濾，然後上樣到用具有2mmmops、150mm氯化鈉和0.02％(w/v)疊氮化鈉的溶液(ph7.4)平衡的hiloadsuperdex75柱(gehealthcare)上。表31：單體人ox40his分子的序列實施例9通過表面等離子體共振對fap靶向的含有單鏈ox40配體三聚體的fc融合抗原結合分子的生物化學表徵通過表面等離子體共振(spr)評估fap靶向的含有單鏈ox40配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子與重組ox40的結合。所有spr實驗均在25℃下在biacoret100上進行，使用hbs-ep作為運行緩衝液(0.01mhepesph7.4、0.15mnacl、3mmedta、0.005％表面活性劑p20，biacore,freiburg/germany)。如圖8a所示測定fap靶向的或非靶向的含有ox40配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子與重組ox40(人、食蟹猴和鼠)之間的相互作用的親合力。數據表明，含有ox40配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的兩種變體(fap單鏈ox40三聚體(圖8中的化合物s10、和圖9中的含有dp47的單鏈ox40三聚體(對照3))都以相當的親合力與人和食蟹猴ox40結合，但與小鼠同源物的親合力可忽略不計。使用標準偶聯指導(biacore,freiburg/germany)將重組生物素化的人、食蟹猴和鼠ox40fc(kih)融合分子直接偶聯在sa晶片上。固定化水平為約600個共振單位(ru)。使fap靶向的含有ox40配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子或含有dp47的對照以0.2至500nm的濃度範圍以30μl/分鐘的流速經120秒通過流動池。監測解離220秒。通過減去在空的參考流動池上獲得的響應來校正本體折射率差異。對於親和力測量(圖10)，使用標準胺偶聯試劑盒(gehealthcare)，在ph5.0的cm5晶片上進行約7200個共振單位(ru)的抗人fc特異性抗體的直接偶聯。在流動池2上以30μl/min的流速捕獲200nm的fap靶向或非靶向的單鏈三聚體的ox40配體fc(kih)融合分子持續60秒。使huox40avihis的稀釋系列(31至2000nm)以30μl/min在兩個流動池上通過120秒來記錄結合相。監測解離相180秒，並通過從樣品溶液切換到hbs-ep進行觸發。在每次循環後，使用3mmgcl2雙重注射60秒使晶片表面再生。通過減去在參考流動池1上獲得的響應來校正本體折射率差異。對於靶向的單鏈三聚體的ox40配體fc(kih)融合分子與huox40avihis之間的相互作用，通過使用biaeval軟體(gehealthcare)擬合至1:1langmuir結合，從速率常數推導出親和常數。解離常數可見表32。表32：對1:1langmuir結合的擬合和親和常數實施例10靶向的含有4-1bb配體或ox40配體三聚體的fc融合抗原結合分子的功能表徵10.1fap靶向的含有4-1bb配體或ox40配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子在幼稚的人pbmc與活化的人pbmc上的結合從zürich獻血中心獲得血沉棕黃層。為了分離新鮮的外周血單核細胞(pbmc)，用相同體積的dpbs(gibcobylifetechnologies，目錄號14190326)稀釋血沉棕黃層。向50ml聚丙烯離心管(tpp,目錄號91050)中提供15mlhistopaque1077(sigmalifescience，目錄號10771、聚蔗糖和泛影酸鈉，調節至1.077g/ml密度)並且使該血沉棕黃層溶液在histopaque1077上分層。離心管在450xg下離心30分鐘。從界面收集pbmc，用dpbs洗滌三次，重懸於由rpmi1640培養基(gibcobylifetechnology，目錄號42401-042)組成的t細胞培養基中，所述rpmi1640培養基補充有10％胎牛血清(fbs,gibcobylifetechnology,目錄號16000-044，批號941273，γ照射的，無支原體且在56℃熱滅活35分鐘)、1％(v/v)glutamax-i(gibcobylifetechnologies，目錄號35050038)、1mm丙酮酸鈉(sigma，目錄號s8636)、1％(v/v)mem非必需胺基酸(sigma，目錄號m7145)和50μmβ-巰基乙醇(sigma，m3148)。在分離後直接使用pbmc(幼稚的、靜息的pbmc)或如下刺激pbmc以誘導在t細胞(活化的pbmc)的細胞表面上的4-1bb和ox40表達：在6孔組織培養板中將幼稚的pbmc在補充有200u/ml普留淨和2μg/mlpha-l的t細胞培養基中培養四天。為了再激活，用在補充有200u/ml普留淨的t細胞培養基中的10μg/ml抗人cd3(克隆okt3)和2μg/ml抗人cd28(克隆cd28.2)包被的6孔組織培養板上，在37℃和5％co2下使細胞進一步活化1天。為了檢測4-1bb結合，將0.1x106個幼稚或活化的pbmc加入到圓底懸浮細胞96孔板(greinerbio-one,cellstar，目錄號650185)的每個孔中。為了檢測ox40，將幼稚的人pbmc和活化的人pbmc混合。為了能夠鑑別幼稚的人pbmc和活化的人pbmc，使用efluor670細胞增殖染料(ebioscience，目錄號65-0840-85)在結合測定之前標記幼稚細胞。為了用efluor670細胞增殖染料進行標記，收穫細胞，用預熱的(37℃)dpbs洗滌，並在dpbs中調節至1x107個細胞/ml的細胞密度。將efluor670細胞增殖染料(ebioscience，目錄號65-0840-85)加入到幼稚的人pbmc中，終濃度為在dpbs中的2.5mm，最終細胞密度為0.5x107個細胞/ml。然後將細胞在室溫下在黑暗中溫育10分鐘。為了停止標記反應，加入2mlfbs，用t細胞培養基洗滌細胞三次。然後將1x105個幼稚的efluor670標記的人pbmc和未標記的活化人pbmc的1比1混合物加入到圓底懸浮細胞96孔板(greinerbio-one,cellstar，目錄號650185)的每個孔中。將培養板在400xg下在4℃離心4分鐘並拂去上清液。用200μl的4℃冷facs緩衝液(補充有2％fbs、5mmedtaph8(amresco，目錄號e177)和7.5mm疊氮化鈉(sigma-aldrich目錄號s2002)的dpbs)將細胞洗滌一次。在50μl/孔的含有逐步滴加的fap靶向的或dp47非靶向的含有單鏈4-1bb或含ox40配體三聚體的fc融合抗原結合分子的4℃冷facs中，將細胞在4℃下溫育120分鐘。將培養板用200μl/孔的4℃facs緩衝液洗滌四次。為了檢測4-1bb結合，將細胞重懸於含有0.125μg/ml抗人cd4-bv421(克隆rpa-t4，小鼠igg1k，biolegend，目錄號300532)、20μl/ml抗人cd3-percp/cy5.5(克隆sk7，小鼠igg1k，bdbioscience，目錄號332771)、0.25μg/ml抗人cd8a-apc(克隆rpa-t8，小鼠igg1k，biolegend，目錄號301014)、0.25μg/ml抗人cd56-af488(克隆hcd56，小鼠igg1κ，bdpharmingen，目錄號338310)、2.5μg/ml抗人fcγ特異性山羊iggf(ab)2片段-pe(jacksonimmunoresearch，目錄號109116098或109-116-170)的50μl/孔4℃冷facs緩衝液中，並在4℃下在黑暗中溫育30分鐘。為了檢測ox40結合，將細胞重懸於含有0.255μg/ml抗人cd4-bv421(克隆rpa-t4，小鼠igg1κ，biolegend，目錄號300532)、0.250μg/ml抗人cd8-bv711(克隆rpa-t8，小鼠igg1k，bdbioscience，目錄號3010441)、0.250μg/ml抗人cd45-percpcy5.5(克隆hi30，小鼠igg1k，biolegend，目錄號304028)、和30μg/ml異硫氰酸螢光素(fitc)綴合的affinipure抗人iggfcγ片段特異性山羊iggf(ab`)2片段(jacksonimmunoresearch，目錄號109096098)的50μl/孔4℃冷facs緩衝液中，並在4℃下在黑暗中溫育30分鐘。然後將板用200μl/孔的4℃facs緩衝液洗滌兩次，最後將細胞重懸於含有0.2μg/mldapi(santacruzbiotec，目錄號sc-3598)的80μl/孔facs緩衝液中，並在當日使用5雷射lsr-fortessa(bdbioscience，diva軟體)收穫細胞。在某些情況下，細胞在第二天被固定和收穫。對於這種方法，在與一級抗體一起溫育之前，另外用含有1:1000稀釋的用於uv激發的live/deadfixablebluedeadcellstainkit(lifetechnologies,molecularprobes，目錄號l-23105)的100μl/孔的dpbs在4℃在黑暗中染色30分鐘。用二級抗體混合物溫育後，用200μl/孔的4℃facs緩衝液將板洗滌兩次，用含有1％甲醛(sigma,ht501320-9.5l)的50μl/孔dpbs固定，並在4℃溫育過夜。對於流式細胞術分析，將細胞重懸於80μl/孔的facs緩衝液中。如圖11a至11d和圖12a至12d所示，fap靶向的和含有dp47的這兩種含有單鏈4-1bbl和含ox40l三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子都不與靜息的人cd4+t細胞或cd8+t細胞結合。相比之下，所有構建體都與活化的cd8+或cd4+t細胞強結合。與cd8+t細胞相比，含有單鏈4-1bbl三聚體的分子顯示出與cd4+t細胞的結合大約低10倍。相反，與cd8+t細胞相比，含有單鏈ox40l三聚體的分子與cd4+t細胞結合時顯示出大約高4倍的特異性螢光強度。這些差異與下列情況相當一致：cd8+人t細胞與cd4+t細胞相比，其上的4-1bb表達水平高10-20倍，而後者的ox40表達水平與cd8+亞群相比高約4倍。如圖11e至11h中所示，單價和二價的fap(28h1或4b9)靶向或cea(sm9b)靶向或dp47非靶向的單鏈三聚體的4-1bb配體fc(kih)融合分子不與靜息的人cd4+或cd8+t細胞結合，但與活化的cd8+t細胞強結合，而較少涉及活化的cd4+t細胞。如圖11j至11m可以看出，結合與靶向或二價無關，例如，與單鏈三聚體4-1bb配體的融合位置無關。10.2與表達fap的腫瘤細胞結合對於表達fap的細胞上的結合測定，使用表達人成纖維細胞激活蛋白(hufap)的細胞nih/3t3-hufap克隆39或wm266-4細胞(atcc，目錄號crl-1676)。通過用表達載體petr4921轉染小鼠胚胎成纖維細胞nih/3t3細胞系(atcc，目錄號crl-1658)生成了nih/3t3-hufap克隆39，用於在1.5μg/ml嘌呤黴素選擇下表達hufap。將dpbs中的0.1x106個nih/3t3-hufap克隆39(4-1bbl)或5x104個wm266-4細胞(ox40l)加入到圓底懸浮細胞96孔板的每個孔中。將培養板在400xg下在4℃離心4分鐘並拂去上清液。細胞用200μl的dpbs洗滌一次，並通過短暫且輕柔的渦旋將沉澱重懸。對於含有4-1bbl三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子的結合分析，加入100μl/孔的含有1:5000稀釋的fixableviabilitydyeefluor450(ebioscience，目錄號65086318)的4℃冷dpbs緩衝液，將平板在4℃下溫育30分鐘。將細胞用200μl4℃冷dpbs緩衝液洗滌一次。將所有樣品重懸於50μl/孔的含有指定濃度範圍的fap靶向或含有dp47的含有單鏈4-1bbl或含ox40l三聚體的分子的4℃冷facs緩衝液中，在4℃下溫育1小時。然後，將細胞用200μl4℃facs緩衝液洗滌5次，並通過短暫渦旋重懸。用50μl/孔的含有30μg/ml異硫氰酸螢光素(fitc)綴合的affinipure抗人iggfcγ片段特異性山羊iggf(ab`)2片段(jacksonimmunoresearch，目錄號109096098)的4℃冷facs緩衝液將細胞在4℃下進一步染色30分鐘。將細胞用200μl4℃facs緩衝液洗滌兩次。最後將用含有ox40l三聚體的分子染色的細胞重懸於含有0.2μg/mldapi(santacruzbiotec，目錄號sc-3598)的80μl/孔的facs緩衝液中，並在當日使用5雷射lsr-fortessa(bdbioscience，diva軟體)收穫細胞。用含有4-1bbl三聚體的抗原結合分子將細胞染色，通過重懸於含有1％甲醛的50μl/孔的dpbs中將細胞固定。次日，將細胞重懸於100μlfacs緩衝液中，並使用5雷射lsr-fortessa(bdbioscience，diva軟體)收穫細胞。如圖13中所示，含有單鏈三聚體的4-1bbl(化合物s1，圖13a)或ox40l的fap靶向的分子(化合物s10，圖13b)與表達人fap的細胞高效結合。相比之下，其含有dp47抗體的對應物(對照1和3)未顯示這種結合(圖13a和13b)。因此，只有fap靶向的含有單鏈三聚體的4-1bbl或含ox40l的分子才顯示出腫瘤靶向特性。如圖13c和13d中所示，單價和二價的fap(28h1或4b9)靶向的(但不是dp47非靶向的)單鏈三聚體的4-1bblfc(kih)融合抗原結合分子可以與表達fap的人黑色素瘤細胞系mv-3和wm-266-4結合。對於表達fap的腫瘤細胞，fap結合克隆4b9顯示出最強的結合，而克隆28h1顯示出較低親和力。由於親和力較低，單價的fap(28h1)靶向的單鏈三聚體的4-1bbl(kih)融合分子與二價的結合性fap(28h1)靶向的huigg1p329glala對照分子之間的差異變得更加明顯。二價結合性fap(28h1)靶向的huigg1p329glala對照分子顯示出較低的mfi(fap分子的二價佔用)和較低的ec50值。10.3與表達cea的腫瘤細胞結合對於在表達cea的腫瘤細胞上的結合測定，使用以下表達人cea的腫瘤細胞系：從肝轉移癌mkn45收穫的人胃癌(胃)細胞系(dmsz，編號acc409)。如實施例10.2中針對表達fap的mv-3和wm-266-4腫瘤細胞系所述進行測定。如圖13e中所示，單價和二價的cea(sm9b)靶向的(但不是dp47非靶向的)含有單鏈4-1bb配體三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子可以與表達cea的人胃癌細胞系mkn45結合。單價的cea(sm9b)靶向的單鏈三聚體的4-1bblfc(kih)融合分子(化合物s5)與二價的cea(sm9b)靶向的單鏈三聚體的4-1bblfc(kih)融合分子(化合物s4)之間的差異顯示為較低的mfi(cea分子的二價佔用)。10.4與表達小鼠4-1bb的活化小鼠脾細胞結合將小鼠脾臟收集在3mlpbs中，並使用gentlemacs管(miltenyibiotec目錄號130-096-334)和gentlemacsoctodissociator(miltenyibiotec)產生單細胞懸液。然後，將脾細胞通過70μm預分離過濾器(miltenyibiotec目錄號130-041-407)過濾，並在350xg和4℃下離心7分鐘。吸出上清液並將細胞重懸於補充有10％(v/v)fbs、1％(v/v)glutamaxi、1mm丙酮酸鈉、1％(v/v)mem非必需胺基酸、50μmβ-巰基乙醇和10％青黴素-鏈黴素(sigma，目錄號p4333)的rpmi1640培養基中。以106個細胞/ml在6孔組織培養板上培養2天，所述組織培養板包被有10μg/ml的抗小鼠cd3ε亞美尼亞倉鼠igg(克隆145-2c11，biolegend，目錄號100331)和2μg/ml的抗小鼠cd28敘利亞倉鼠igg(克隆37.51，biolegend，目錄號102102)。收集活化的小鼠脾細胞，在dpbs中洗滌，計數，將0.1x106個細胞轉移到非組織培養物處理的u型底96孔板的每個孔中。除去上清液，將細胞在含有1:5000稀釋的可固定活力染料ef660(bioscience，目錄號65-0864-18)的100μl/孔的dpbs中在4℃下染色30分鐘。用dpbs洗滌細胞，並在含有不同濃度的fap靶向或dp47靶向的單鏈三聚體的4-1bbl抗原結合分子或抗小鼠cd137人igg1p329glalamab(克隆lob.12.3)的50μlfacs緩衝液中染色。細胞在4℃下溫育60分鐘。然後將細胞用facs緩衝液洗滌四次，並在50μl/孔的facs緩衝液中在4℃下染色30分鐘，所述緩衝液含有10μg/ml純化的抗小鼠cd16/cd32大鼠igg-fc-block(bdpharmingen，目錄號553142，克隆2.4g2)、5μg/ml抗小鼠cd8b大鼠igg2bκ-fitc(biolegend，目錄號126606，克隆yts156.7.7)、0.67μg/ml抗小鼠cd3大鼠igg2bκ-apc-cy7(biolegend，目錄號100222，克隆17a2)、0.67μg/ml抗小鼠cd4大鼠igg2bκ-pe-cy7(biolegend，目錄號100422，克隆gk1.5)、2μg/ml抗小鼠nk1.1小鼠(c3hxbalb/c)igg2aκ-percp-cy5.5(biolegend，目錄號1082728，克隆pk136)和10μg/mlpe綴合的affinipure多克隆f(ab`)2片段山羊抗人igg(其為fcγ片段特異性的，與牛、小鼠和兔血清蛋白(jacksonimmunoresearch，目錄號109-116-170)交叉反應最小。細胞用200μl/孔的冷facs緩衝液洗滌兩次，用含有1％甲醛的50μl/孔的dpbs固定並在4℃下保存過夜。次日，將細胞重懸於facs緩衝液中，並使用3雷射cantoii流式細胞儀(bdbioscience，diva軟體)收穫細胞。如圖14所示，fap靶向的或含有dp47的單鏈三聚體的人4-1bbl分子(化合物s1和對照1)不與小鼠4-1bb結合。因此，不能在有免疫能力的小鼠中測試它們的活性。對於體內作用模式研究，必須使用人源化小鼠模型或含有單鏈三聚體的小鼠4-1bbl的替代物。實施例11靶向的含有4-1bb配體或ox40配體三聚體的fc融合抗原結合分子的生物活性11.1在表達人4-1bb或ox40的hela細胞中的nfκb活化11.1.1在nfκb增強子區控制下表達人4-1bb和螢光素酶的的hela細胞的生成用表達載體petr10829轉導人乳頭瘤病毒18誘導的宮頸癌細胞系hela(atcc，目錄號ccl-2)，所述表達載體含有在cmv啟動子控制下的人4-1bb序列(uniprot登錄號q07011,seqidno:99)和嘌呤黴素抗性基因。將細胞在提供有10％fbs、1％glutamax-i和3μg/ml嘌呤黴素(invivogen，目錄號ant-pr)的dmem培養基中培養。通過流式細胞術檢測4-1bb轉導的hela細胞的4-1bb表達：將0.2x106個活細胞重懸於100μlfacs緩衝液中，所述緩衝液含有0.1μgpercp/cy5.5綴合的抗人4-1bb小鼠igg1κ克隆4b4-1(biolegend目錄號309814)或其同種型對照(percp/cy5.5綴合的小鼠igg1κ同種型對照抗體克隆mopc21，biolegend目錄號400150)，在4℃下溫育30分鐘。細胞用facs緩衝液洗滌兩次，重懸於含有0.06μgdapi的300μlfacs緩衝液中，並在當日使用5雷射lsr-fortessa收穫細胞。通過有限稀釋產生單個克隆。為此，將人4-1bb轉導的hela細胞重懸於培養基中達到10個、5個和2.5個細胞/ml的密度，將200μl細胞懸液轉移到組織培養物處理的圓底96孔板(6個板/細胞濃度，tpp目錄號92697)中。如上所述收穫單個克隆，擴增並檢測4-1bb表達。選擇具有最高4-1bb表達的克隆(克隆5)，以備進一步用roche生產的nfκb螢光素酶表達載體5495ptranlucenthygb進行轉染。表達載體5495ptranlucenthygb將潮黴素b抗性結合到nfκb(1)螢光素酶報告載體(panomics，目錄號lr0051)中。培養人4-1bbhela克隆5細胞至70％匯合。將50μg(40μl)線性化(限制酶asei和sali)5495ptranlucenthygb表達載體dna加入到無菌的0.4cmgenepulser/micropulser電擊杯(biorad，目錄號165-2081)中。加入400μl無補充劑的dmem中的2.5x106個人4-1bbhela克隆5細胞，與質粒溶液仔細混合。將電擊杯應用到genepulserxcell總系統(biorad，目錄號1652660)中，在以下設置下進行電穿孔轉染：指數脈衝，電容500μf，電壓160v，電阻∞。在脈衝轉染細胞之後立即轉移到具有15ml的37℃溫熱dmem培養基的75cm2的組織培養瓶(tpp，目錄號90075)中，所述培養基補充有10％fbs和1％glutamaxi。接種24小時後，加入含有3μg/ml嘌呤黴素和200μg/ml潮黴素b(roche，目錄號10843555001)的選擇培養基。然後，將存活的細胞擴增並且如上所述進行有限稀釋以產生單個克隆。如上所述檢測克隆的4-1bb表達並且如下檢測克隆的nf-κb-螢光素酶活性：在選擇培養基中收穫克隆，並使用cellcountervi-cellxr2.03(beckmancoulter，目錄號731050)進行計數。將細胞設定為0.33x106個細胞/ml的細胞密度，並將150μl該細胞懸液轉移到具有蓋的無菌白色96孔平底組織培養板(greinerbioone，目錄號655083)的每個孔中並且轉移到常規的96孔平底組織培養板(tpp目錄號92096)作為對照，次日檢測存活和細胞密度。細胞在37℃和5％co2下溫育過夜。次日，將50μl含有不同濃度的重組人腫瘤壞死因子α(rhtnfα,peprotech，目錄號30001a)的培養基加入到白色96孔板的每個孔中，得到100、50、25、12.5、6.25和0ng/孔的rhtnfα終濃度。將細胞在37℃和5％co2下溫育6小時，然後用200μl/孔的dpbs洗滌3次。向每個孔中加入30μl新鮮製備的報告子裂解緩衝液(promega，目錄號e3971)，並將板在-20℃下保存過夜。次日將冷凍的細胞板和檢測緩衝液(luciferase1000assaysystem，promega，目錄號e4550)解凍至室溫。將100μl的檢測緩衝液加入每個孔中，使用spectramaxm5/m5e酶標儀和softmaxprosoftware(moleculardevices)立即檢測所述板，其中設置如下：對於螢光素酶(rlu)，500ms積分時間，無濾光片，收集所有波長和頂部讀數。取測得的高於對照(未添加rhtnfα)的url作為螢光素酶活性。選擇顯示出最高螢光素酶活性和明顯4-1bb表達的nf-κb-luc-4-1bb-hela克隆26以備進一步使用。11.1.2與交聯抗人igg1fcγ片段特異性山羊iggf(ab`)2片段共培養的表達人4-1bb的hela細胞中的nfκb活化收穫nf-κb-螢光素酶人4-1bbhela細胞並重懸於補充有10％胎牛血清和1％glutamaxi的dmem培養基中，濃度為0.8x106個細胞/ml。將100μl(8x104個細胞)的該細胞懸液轉移到具有蓋子的無菌白色96孔平底組織培養板(greinerbioone，目錄號655083)的每個孔中，並將平板在37℃和5％co2下溫育過夜。次日，加入50μl/孔的含有逐步滴加的fap或dp47靶向的單鏈三聚體的人4-1bbl抗原結合分子的培養基。為了交聯，以1:4的比率(二級抗體比一級單鏈三聚體的人4-1bbl抗原結合分子多4倍)加入50μl/孔的含有二級抗體抗人iggfcγ片段特異性山羊iggf(ab`)2片段(jacksonimmunoresearch，目錄號109-006-098)的培養基。將板在37℃和5％co2下溫育6小時。如在實施例11.1.1中所述測定螢光素酶活性。測定原理展示在圖15中。如圖16中所示，通過fap靶向的單鏈三聚體的人4-1bbl(實心圓)或含有dp47的單鏈三聚體的人4-1bbl(空心圓，虛線)的二級多克隆抗huigg1fcγ特異性山羊iggf(ab)2片段的交聯導致nfκb啟動子的相似活化，如通過報告細胞系中螢光素酶表達的水平所評估的。因此，在它們的人工誘導的非特異性寡聚化之後，含有dp47的和fap靶向的單鏈三聚體的人4-1bbl分子顯示出相當的在細胞表面激動性地接合4-1bb的能力。11.1.3通過表達fap的腫瘤細胞在表達人4-1bb的hela細胞中的nfκb活化收穫nf-κb-螢光素酶人4-1bbhela細胞並重懸於補充有10％fbs和1％glutamaxi的dmem培養基中，濃度為0.2x106個細胞/ml。將100μl(2x104個細胞)的該細胞懸液轉移到具有蓋子的無菌白色96孔平底組織培養板(greinerbioone，目錄號655083)的每個孔中，並將平板在37℃和5％co2下溫育過夜。次日，加入50μl含有逐步滴加的fap或dp47靶向的單鏈三聚體的人4-1bbl抗原結合分子的培養基。將下列表達人fap的腫瘤細胞重懸於補充有10％fbs和1％glutamax-i的dmem中，濃度為2x106個細胞/ml：人黑色素瘤細胞系mv3(首次公開於vanmuijengn等人1991)、人類女性黑色素瘤wm-266-4細胞系(atccno.crl-1676)、和用表達載體petr4921轉染以表達人fap和嘌呤黴素抗性的小鼠胚胎成纖維細胞nih/3t3(atccno.crl-1658)：如實施例10.2中所述的nih/3t3-hufap克隆39。向每個孔中加入50μl表達fap的腫瘤細胞懸液。在加入交聯的表達fap的腫瘤細胞或培養基(無交聯)之後，將板在37℃和5％co2下溫育6小時。如在實施例11.1.1中所述測定螢光素酶活性。逐步增加nfκb-螢光素酶人cd137hela細胞和3t3-人fap克隆39細胞之間的溫育時間和比率，並將時間和比率設定為達到螢光素酶激活平臺的值。測定原理顯示在圖17中。如圖18a至18d中所示，fap靶向的含有單鏈4-1bbl三聚體的fc(kih)融合抗原結合分子(化合物s1)(實心圓)可以經由表達fap的腫瘤細胞而交聯，導致報告細胞系中濃度依賴性方式的nfκb介導的螢光素酶活化。相比之下，在相同的實驗條件下，含有dp47的單鏈三聚體的人4-1bbl(對照1)不能使該報告細胞系活化。在缺乏交聯的情況下(不添加表達fap的腫瘤細胞)，兩種分子都不能誘導報告細胞系中的nfκb介導的螢光素酶活化。如圖19a至19c中所示，單價或二價的fap(4b9或28h1)靶向的單鏈三聚體的4-1bblfc(kih)融合抗原結合分子可以通過表達fap的腫瘤細胞而交聯，因此可以濃度依賴性方式誘導報告細胞系hela-hu4-1bb-nf-κb-luc中的nfκb介導的螢光素酶活化。相比之下，單價或二價的dp47非靶向的單鏈三聚體的4-1bblfc(kih)融合分子(對照1和2)在沒有交聯的情況下不能激活報告細胞系。在缺乏交聯的情況下(不添加表達fap的腫瘤細胞)，所有分子均不能誘導報告細胞系中的nfκb介導的螢光素酶活化。單價的fap靶向的單鏈三聚體的4-1bblfc(kih)融合抗原結合分子比二價的fap(4b9)靶向的單鏈三聚體的4-1bb配體(kih)融合分子誘導更強的活化，這也反映出與表達fap的腫瘤細胞的結合。然而，在4b9和28h1fap結合性克隆之間的差異不如在針對表達fap的腫瘤細胞的結合測定中那麼強。單價的fap(4b9)靶向的單鏈三聚體的4-1bb配體(kih)融合分子仍然顯示略低的ec50值，這可以通過對fap的較高親和力來解釋。11.1.4通過表達cea的腫瘤細胞在表達人4-1bb的hela細胞中的nfκb活化使用hela人4-1bb-nf-κb-luc報告細胞連同表達cea的腫瘤細胞系以與11.1.3中所述相同的方式進行了nfκb活化測定，不過將表達fap的腫瘤細胞替換為已經在本申請的實施例10.3中描述的表達cea的mkn45腫瘤細胞系。如圖20a和20b中所示，單價和二價的cea(sm9b)靶向的單鏈三聚體的4-1bblfc(kih)融合抗原結合分子可以通過表達cea的腫瘤細胞而交聯，因此可以濃度依賴性方式誘導報告細胞系hela-hu4-1bb-nf-κb-luc中的nfκb介導的螢光素酶活化。相比之下，單價或二價的dp47非靶向的單鏈三聚體的4-1bblfc(kih)融合分子(對照1和2)在沒有交聯的情況下不能激活報告細胞系。在缺乏交聯的情況下(不添加表達cea的腫瘤細胞mkn45)，所有分子均不能誘導報告細胞系中的nfκb介導的螢光素酶活化。單價的cea(sm9b)靶向的單鏈三聚體的4-1bb配體(kih)融合分子(化合物s5)比二價的cea(sm9b)靶向的單鏈三聚體的4-1bb配體(kih)融合分子(化合物s4)誘導更強的活化，這也反映出圖13e中所示的與表達cea的人mkn45腫瘤細胞系的結合的mfi。11.1.5表達人ox40的hela細胞和報告基因nfκb-螢光素酶ox40與其配體的激動性結合通過nfκb活化誘導下遊信號轉導(weinberg等人，2004)。生成了重組報告細胞系hela_hox40_nfκb_luc1，以便在其表面上表達人ox40。另外，它包含報告基因質粒，所述報告基因質粒含有在nfκb敏感性增強子區控制下的螢光素酶基因。ox40觸發誘導在細胞核中易位的nfκb的劑量依賴性活化，後者在報告基因質粒的nfκb敏感增強子上結合以增加螢光素酶蛋白的表達。螢光素酶催化螢光素氧化，生成發光的氧化螢光素。這可以通過發光計進行定量。一項實驗的範圍是測試單鏈三聚體的人ox40l抗原結合分子在hela_hox40_nfκb_luc1細胞中誘導nfκb活化的能力。morris等人表明，通過常規抗ox40抗體的激動性共刺激依賴於表面固定(morris等人，2007)。因此，為了實現ox40的更高程度的超交聯，使fap靶向的單鏈三聚體的人ox40l抗原結合分子與天然表達fap的wm-266-4腫瘤細胞超交聯。11.1.6通過表達fap的腫瘤細胞在表達人ox40的hela細胞中的nfκb活化所有離心在4℃下以350xg進行5分鐘。為了洗滌細胞，用指示的緩衝液充滿管或孔。離心後，吸出上清液，將細胞沉澱重懸於指示的緩衝液中。使用細胞解離緩衝液(invitrogen，目錄號13151-014)在37℃收穫粘附的hela_hox40_nfκb_luc1細胞和wm-266-4細胞10分鐘。用dpbs將細胞洗滌一次。在含有mem(invitrogen，目錄號22561-021)、10％(v/v)熱滅活的fbs、1mm丙酮酸鈉和1％(v/v)非必需胺基酸的測定培養基中將hela_hox40_nfκb_luc1細胞調整至2x105個細胞/ml的細胞密度。將細胞以0.3x105個細胞/孔的密度接種在具有蓋子的無菌白色96孔平底組織培養板(greinerbioone，目錄號655083)中，並在培養箱(heracell150)中在37℃和5％co2下保持過夜。次日，加入含有逐步滴加的fap靶向的或含有dp47的單鏈三聚體的人ox40l抗原結合分子的測定培養基將hela_hox40_nfκb_luc1刺激6小時。對於超交聯，將表達人fap的wm266-4腫瘤細胞在測定培養基中調整至3x106個細胞/ml的細胞密度，並加入細胞至最終密度為0.75x105個細胞/孔。在培養箱中在37℃和5％co2下溫育6小時後，吸出上清液，用dpbs洗板兩次。根據製造商的說明，使用螢光素酶100測定系統和報告基因裂解緩衝液(均來自promega，目錄號e4550和目錄號e3971)進行光發射的定量。通過hela_hox40_nfκb_luc1細胞的基礎發光校正發射的相對光單位(url)，並使用prism4(graphpadsoftware,usa)針對一級抗體的對數濃度進行印跡。使用內置的s形劑量反應來擬合曲線。如圖21中所示，fap靶向和含有dp47的單鏈三聚體的人ox40lfc(kih)融合分子(實心圓和空心圓)都誘導了可檢測的nfκb活化。這與使用沒有通過二級抗體進行超交聯的顯示出沒有nfκb誘導活性的單鏈三聚體的人4-1bbl分子所觀察到的相反。通過fap靶向的單鏈三聚體的人ox40lfc(kih)融合抗原結合分子(化合物s10，實心圓)，經由表達fap的腫瘤細胞wm-266-4的超交聯以濃度依賴性方式強烈增加了nfκb介導的螢光素酶表達的誘導。當使用含有dp47的單鏈三聚體的人ox40lfc(kih)融合分子時，沒有觀察到這樣的效應。11.2基於抗原特異性cd8+t細胞的測定11.2.1抗原特異性cd8t細胞的分離和培養從hla-a2+的cmv感染志願者獲得新鮮血。通過ficoll密度離心如實施例10.1中所述分離pbmc。根據製造商的建議，使用陰性選擇人cd8t細胞分離試劑盒(miltenyibiotec，目錄號130-094-156)從pbmc中純化cd8t細胞。將1000萬個分離的cd8t細胞重懸於補充有1％(v/v)fbs的1ml無菌dpbs中，其中dpbs還補充有50μl的含有cmv衍生的nlvpmvatv肽(proimmune，目錄號f008-2b，seqidno:183)的pe標記的hla-a2-五聚體，並在室溫下溫育10分鐘。用補充有1％(v/v)fbs的3ml無菌dpbs將細胞洗滌兩次。將細胞重懸於含有1μg/ml抗人cd8-fitc(克隆lt8，abcam，目錄號ab28010)的補充有1％(v/v)fbs的1mldpbs中，並在4℃下溫育30分鐘。然後，將細胞洗滌兩次，以5x106個細胞/ml的濃度重懸於補充有1％(v/v)fbs的dpbs中，並通過30μm預分離尼龍網細胞過濾器(miltenyibiotec，目錄號130-041-407)過濾。通過使用aria細胞分選儀(bdbioscience，diva軟體)通過facs分選分離nlv肽特異性cd8+t細胞，所述細胞分選儀具有以下設置：100μm噴嘴和純度分選掩模。將分選的細胞收集在含有補充10％(v/v)fbs、1％(v/v)glutamax-i和400u/ml普留淨的5mlrpmi1640培養基的15ml聚丙烯離心管(tpp，目錄號91015)中。將分選的細胞在室溫下以350xg離心7分鐘，重懸於相同培養基中，濃度為0.53x106個細胞/ml。將該細胞懸液以100μl/孔加入預先準備的具有pha-l激活的照射的異基因飼養細胞的板的每個孔中。如前所述(levitsky等人，1998)從pbmc製備飼養細胞，並且使用每孔2x105個飼養細胞分配至96孔培養板。培養1天後，從每個孔中移出100μl培養基，更換為補充有10％(v/v)fbs和1％(v/v)glutamax-i和400u/ml普留淨的新的rpmi1640培養基。在培養期間定期重複此操作(每2-4天一次)。一旦nlv特異性cd8+t細胞開始增殖，就將其轉移到24孔平底組織培養板(tpp,92024)上。使細胞擴增/分裂，定期地用新的飼養細胞製劑再活化。11.2.2抗原特異性cd8+t細胞的活化測定收穫表達人fap的黑色素瘤細胞系mv3細胞系(描述於實施例11.1.3中)的細胞並用dpbs洗滌，並將2x107個細胞重懸於250μl的pkh-26redfluorescencecelllinkerkit(sigma，目錄號pkh26gl)的c稀釋劑中。將1μlpkh26-red染色溶液用250μlc稀釋劑稀釋，並加入到mv3細胞懸液中，然後在黑暗中在室溫下溫育5分鐘。加入0.5mlfbs，將細胞溫育1分鐘，並用由rpmi1640培養基組成的t細胞培養基洗滌一次，所述rpmi1640培養基補充有10％(v/v)fbs、1％(v/v)glutamax-i、1mm丙酮酸鈉、1％(v/v)mem非必需胺基酸和50μmβ-巰基乙醇。將1x106個mv3細胞/ml重懸於t細胞培養基中並分到三個管中。加入合成的nlvpmvatv肽(從thinkpeptides獲得，seqidno:181)至終濃度為1x10-9m或1x10-8m，在37℃和5％co2下將細胞在旋轉下溫育90分鐘。將mv3細胞用t細胞培養基洗滌一次，並以0.5x106個細胞/ml的密度重懸，分配(100μl/孔)到96孔圓底細胞懸浮板(greinerbio-one，cellstar，目錄號650185)中，在37℃和5％co2下溫育過夜。次日，加入fap靶向的和含有dp47的單鏈三聚體的人4-1bbl分子與50μl的t細胞培養基以達到指示的終濃度。收穫nlv特異性cd8t細胞，洗滌並在每孔中加入50μl培養基(最終腫瘤:cd8t細胞比率為0.125)。將細胞溫育24小時，並向每孔加入50μl/孔的含有2.64μl/ml的golgi終止液(含莫能菌素的蛋白轉運抑制劑，bdbioscience，目錄號554724)的t細胞培養基。將細胞另外溫育4小時，用200μl/孔的dpbs洗滌，用含有1:5000稀釋的可固定活力染料ef450(ebioscience，目錄號65-0864)的100μldpbs在4℃染色30分鐘。用dpbs洗滌細胞並在含有以下螢光染料綴合的抗體的40μl/孔facs緩衝液中染色：抗人cd137-percp/cy5.5(克隆4b4-1，小鼠igg1κ，biolegend，目錄號309814)，抗人cd8-bv605(克隆rpat8，小鼠igg1κ，biolegend，目錄號301012)和抗人cd25pe/cy7(克隆bc96，小鼠igg1κ，biolegend，目錄號302612)。在4℃下溫育30分鐘後，用200μl/孔的facs緩衝液洗滌細胞兩次，重懸於50μl/孔新鮮製備的foxp3fix/perm緩衝液(ebioscience目錄號00-5123和00-5223)中，在4℃下溫育30分鐘。用200μl/孔的perm-buffer(補充有2％(v/v)fbs、1％(w/v)皂苷(sigmalifescience，s7900)和1％(w/v)疊氮化鈉(sigma-aldrich，s2002)的dpbs)洗板兩次，並用50μl/孔的perm-buffer(ebioscience，目錄號00-8333-56)染色，所述perm-buffer含有0.25μg/ml的抗人ifnγ-apc(克隆b27，小鼠igg1κ，biolegend，目錄號506510)。將板在4℃下溫育1小時，用200μl/孔的perm-buffer洗滌兩次。為了固定，加入含有1％甲醛的50μl/孔的dpbs，細胞在4℃下儲存過夜。次日，將細胞重懸於100μl/孔的facs緩衝液中，並使用5雷射fortessa流式細胞儀(bdbioscience，diva軟體)收穫細胞。測定原理顯示在圖22中。如圖23a至23f中所示，抗原特異性的經刺激的cd8+t細胞(而不是未刺激的對照)在fap靶向的單鏈三聚體的人4-1bblfc(kih)融合抗原結合分子(化合物s1，實心圓)存在下表現出表面4-1bb表達水平的增加。三聚體的人4-1bbl的這種作用是劑量依賴性的並且需要fap靶向，因為添加非靶向的對照分子(對照1)不影響4-1bb表達水平。此外，在較高肽濃度(1x10-8m)下活化的t細胞在fap靶向單鏈三聚體的人4-1bbl存在下顯示出持續的infγ分泌(圖24a至24f)。值得注意的是，這種作用與fap靶向的單鏈三聚體的人4-1bbl對4-1bb上調的作用相比需要更強的初級tcr觸發，因為在低的肽濃度時也清楚地觀察到後者。總的來說，這些數據表明，fap靶向的單鏈三聚體的人4-1bblfc(kih)融合抗原結合分子以靶向依賴的方式調節抗原特異性t細胞的表面表型和反應性。如圖25和26中所示，用nlv肽(活化信號1)和交聯的單價或二價的fap(28h1或4b9)靶向的單鏈三聚體的4-1bblfc(kih)融合抗原結合分子(活化信號2)共同刺激的抗原特異性cd8+t細胞(而不是未刺激的對照)表現出表面4-1bb表達和ifnγ分泌水平的增加。這種作用對於nlv肽濃度以及fap靶向的單鏈三聚體的4-1bblfc(kih)融合抗原結合分子的濃度而言是劑量依賴性的。總的來說，這些數據表明，fap靶向的單鏈三聚體的4-1bblfc(kih)融合抗原結合分子以靶向依賴的方式調節抗原特異性t細胞的表面表型和反應性。在使用hela-hu4-1bb-nk-κb-luc報告細胞系的活化測定中，可以看到單價的fap(28h1)靶向的和fap(4b9)靶向的單鏈三聚體的4-1bb配體(kih)融合分子之間的相同差異，例如，單價的fap(4b9)靶向的單鏈三聚體的4-1bblfc(kih)融合抗原結合分子顯示出較低的ec50值。與hela-hu4-1bb-nk-κb-luc報告細胞系活化測定不同，在單價的和二價的fap(4b9)靶向的單鏈三聚體的4-1bb配體(kih)融合分子之間沒有看到很大差異。在高nlv肽濃度(10-8m)下，似乎可以看出，二價的fap(4b9)靶向的單鏈三聚體的4-1bblfc(kih)融合抗原結合分子產生優於單價的fap(4b9)靶向的單鏈三聚體的4-1bblfc(kih)融合抗原結合分子的活化。11.3ox40介導的次最佳tcr觸發的靜息人pbmc的共刺激人pbmc製劑含有(1)靜息ox40陰性cd4+和cd8+t細胞和(2)在其細胞表面上具有各種fcγ受體分子的抗原呈遞細胞，例如b細胞和單核細胞。人igg1同種型的抗人cd3抗體可以其fc部分與fcγ受體分子結合，並介導靜息的ox40陰性cd4+和cd8+t細胞上的tcr觸發，從而在幾小時內開始表達ox40。針對ox40的功能性激動性化合物可以通過活化的cd8+和cd4+t細胞上存在的ox40受體發信號，並支持tcr介導的刺激，從而導致活的cd4+和cd8+t細胞的更突出的表型變化(例如更高的cd25表達水平)、增殖增強和數量增加。用hela_hox40_nfκb_luc1報告細胞系進行的實驗表明三聚體單鏈ox40l分子具有一定的誘導nfκb表達的內在能力(參見實施例11.1.5)。通過藉助於表達fap的腫瘤細胞的fap靶向化合物的額外超交聯，大大增強了激動作用。因此，在nih/3t3-hufap克隆39細胞和含有dp47(非靶向)和fap靶向的三聚體的單鏈ox40l分子的存在下進行靜息人pbmc的次最佳tcr刺激，以測試在具有和沒有進一步超交聯情況下的共刺激活性。使用細胞解離緩衝液(invitrogen，目錄號13151-014)在37℃收穫小鼠胚胎成纖維細胞nih/3t3-hufap克隆39細胞(參見實施例9.2)10分鐘。細胞用dpbs洗滌一次。將nih/3t3-hufap克隆39細胞在t細胞培養基中調節至1.6x105的細胞密度，並以每孔0.2x105個細胞的密度接種在無菌96孔圓底粘附組織培養板(tpp，目錄號92097)中。將板在培養箱(heracell150)中在37℃和5％co2下保存過夜，然後在第二天使用4500rad劑量在xray輻照儀中照射，以防止人pbmc隨後由於該細胞系而生長過度。如9.1所述通過ficoll密度離心分離人pbmc並用cfse標記。然後將細胞以1x106個細胞/ml的細胞密度用[50nm]終濃度的cfda-se(sigma-aldrich，目錄號2188)在37℃下染色10分鐘。此後，將細胞用含有fbs(10％v/v)的過量dpbs洗滌兩次。將標記的細胞在t細胞培養基中在37℃下靜置30分鐘。此後，用dpbs通過兩個另外的洗滌步驟除去未轉化的cfda-se。將cfse標記的靜息人pbmc在t細胞培養基中調整至3x106個細胞/ml的細胞密度，並以每孔0.75x105個細胞的密度加入每個孔中。以指定濃度加入fap靶向的和含有dp47的單鏈三聚體的ox40l抗原結合分子，並以10nm的終濃度加入抗人cd3抗體(克隆v9，人igg1)。將板在37℃和5％co2下保持四天。48小時後進行一半培養基更換。4天後，用dpbs洗滌細胞，然後在含有以下螢光染料綴合的抗體的25μl/孔的facs緩衝液中染色：0.250μg/ml抗人cd4-bv421(克隆rpa-t4，小鼠igg1κ，biolegend，目錄號300532)、0.250μg/mlcd8-bv711(克隆rpa-t8，小鼠igg1κ，biolegend，目錄號3010441)、0.250μg/ml抗人cd25-percpcy5.5(克隆m-a251，小鼠igg1κ，biolegend，目錄號356112)。在4℃下溫育30分鐘後，用200μl/孔的facs緩衝液洗滌細胞兩次，重懸於50μl/孔新鮮製備的foxp3fix/perm緩衝液(ebioscience目錄號00-5123和00-5223)中，在黑暗中在室溫下溫育45分鐘。將板用200μl/孔的perm-wash-(ebioscience，目錄號00-8333-56)洗滌三次，然後用5μl/孔的perm-buffer(ebioscience，目錄號00-8333-56)染色，所述perm-buffer含有0.25μg/ml抗人顆粒酶b-pe(克隆gb-11，小鼠igg1κ，bdbioscience，目錄號561142)和0.60μg/ml抗人eomes-efluor670(克隆wd2918，小鼠igg1κ，ebioscience，目錄號50-4877-42)。將板在黑暗中在室溫下溫育1小時，用200μl/孔的perm-buffer洗滌兩次。將細胞重懸於85μl/孔的facs緩衝液中，並使用5雷射fortessa流式細胞儀(bdbioscience，diva軟體)收穫細胞。如圖27中所示，在用抗人cd3抗體次最佳刺激的人cd4+(左側)和cd8+t細胞(右側)中，用含有dp47的三聚體的單鏈ox40l抗原結合分子共刺激僅略微促進增殖和增強活化細胞表型(cd25表達)。通過nih/3t3-hufap克隆39細胞，fap靶向的三聚體單鏈ox40l的超交聯強烈地增加了這種效應。這與hela_hox40_nfκb_luc1細胞中的發現(圖21)相反，其中三聚體的單鏈ox40l分子本身已經具有強激動性。這可能是由於ox40在報告細胞系中的非生理學高表達的緣故，其最有可能導致低信號轉導ox40r寡聚物單元的預裝配，從而相比於ox40+t細胞降低了報告細胞系中激動性信號傳導的閾值。另外，細胞背景很可能決定ox40觸發的結果，因為在t細胞中需要通過tcr的伴隨信號傳導(但在報告細胞系中不需要)，以便觀察ox40接合的效應。引用：aggarwalb.b.(2003),signallingpathwaysofthetnfsuperfamily:adouble-edgedsword.nat.rev.immunol.3(9),745-56.bannerd.etal(1993),crystalstructureofthesolublehuman55kdtnfreceptor-humantnfbetacomplex:implicationsfortnfreceptoractivation.cell73,431-445.baumannr.,shiday.,simond.,russmanns.,muellerc.andsimonh.-u.(2004),functionalexpressionofcd134byneutrophils.eur.j.immunol.,34,2268-2275.bodmerj.,schneiderp.andtschopp,j.(2002),themoleculararchitectureofthetnfsuperfamily.trendsinbiochemicalsciences27(1),19-26.bremere.(2013),targetingofthetumornecrosisfactorreceptorsuperfamilyforcancerimmunotherapy.2013,articleid371854,25pages.doi:10.1155/2013/371854brollk.,richterg.,paulys.,hofstaedterf.andschwarz,h.(2001),cd137expressionintumorvesselwalls.highcorrelationwithmalignanttumors.amjclinpathol115,543-549.buechelec.,baesslert.,schmiedelb.j.,schumacherc.e.,grosse-hovestl.,rittigk.andsalih,h.r.(2012).4-1bbligandmodulatesdirectandrituximab-inducednk-cellreactivityinchroniclymphocyticleukemia.eurjimmunol42,737-748.carterp.(2001).bispecifichumaniggbydesign.j.immunol.methods248,7-15.choib.k.,kimy.h.,kwonp.m.,lees.c.,kangs.w.,kimm.s.,leem.j.,andkwonb.s.(2009).4-1bbfunctionsasasurvivalfactorindendriticcells.jimmunol182,4107-4115.croftm.,songt.,duanw.andsoroashp.(2009).thesignificanceofox40andox40ltot-cellbiologyandimmunedisease.immunologicalreviews229,173-191.c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cc60nnntataccnnnaaattccagggccgcgtcacgatgacc9917533dna人工序列cd19h3reverseconstant175cgtcaccggttcggggaagtagtccttgaccag3317626dna人工序列lmb3176caggaaacagctatgaccatgattac2617733dna人工序列cd19l1forwardconstant177tggtatctccagaaaccgggtcagagcccgcag3317884dna人工序列34-36:52%y,4%其它,37-39:52%p,4%其它,40-42:42%v,10%l,4%其它,43-45:52%h,4%其它,46-48:42%t,10%i,4%其它,49-51:45%l,11%g,4%其它混雜特徵(34)..(36)n是a,c,g或t混雜特徵(37)..(39)n是a,c,g或t混雜特徵(40)..(42)n是a,c,g或t混雜特徵(43)..(45)n是a,c,g或t混雜特徵(46)..(48)n是a,c,g或t混雜特徵(49)..(51)n是a,c,g或t178tttaatttccagtttagttccttgaccgaaggtnnnnnnnnnnnnnnnnnnctgcagaca60atagtagacgccaacgtcttcagc8417935dna人工序列cd19l3正向恆定179accttcggtcaaggaactaaactggaaattaaacg35180107dna人工序列位置59-61:50%l,3.8%其它,62-64:50%a,4.2%其它,65-67:50%s,4.2%其它,68-70:50%g,4.2%其它,71-73:50%y,4.2%其它,74-76:50%y,4.2%其它,77-79:50%y,4.2%其它,80-82:50%t,4.2%其它,83-85:50%g,4.2%其它.混雜特徵(54)..(58)n是a,c,g或t混雜特徵(59)..(61)n是a,c,g或t混雜特徵(62)..(64)n是a,c,g或t混雜特徵(65)..(67)n是a,c,g或t混雜特徵(68)..(70)n是a,c,g或t混雜特徵(71)..(73)n是a,c,g或t混雜特徵(74)..(76)n是a,c,g或t混雜特徵(77)..(79)n是a,c,g或t混雜特徵(80)..(82)n是a,c,g或t180ttggtgctagcagagcttacggtcaccgtggtaccttggccccagtaatcaaannnnnnn60nnnnnnnnnnnnnnnnnnnngcgtgcacaa標籤taaacagcggtgtc1071813078dna人工序列與三聚體hu4-1bbl(71-254)融合的dp47fc節的核苷酸序列181gaggtgcaattgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60tcctgtgcagcctccggattcacctttagcagttatgccatgagctgggtccgccaggct120ccagggaaggggctggagtgggtctcagctattagtggtagtggtggtagcacatactac180gcagactccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240ctgcagatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatattactgtgcgaaaggcagc300ggatttgactactggggccaaggaaccctggtcaccgtctcgagtgctagcaccaagggc360ccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctg420ggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgcc480ctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctc540agcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtg600aatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaa660actcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagctgcagggggaccgtcagtcttcctc720ttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtg780gtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtg840gaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtg900gtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaag960gtctccaacaaagccctcggcgcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcag1020ccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccctgcagagatgagctgaccaagaaccag1080gtgtccctgtggtgcctcgtgaagggcttctacccctccgatatcgccgtggaatgggag1140agcaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggc1200tcattcttcctgtactccaagctgaccgtggacaagagccggtggcagcagggcaacgtg1260ttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagc1320ctgagccctggcggaggcggaggatctggcgggggaggatctagagagggccctgagctg1380tcccccgatgatcctgctggactgctggacctgcggcagggcatgtttgctcagctggtg1440gcccagaacgtgctgctgatcgacggccctctgagctggtacagcgatcctggactggct1500ggcgtgtcactgacaggcggcctgagctacaaagaggacaccaaagaactggtggtggcc1560aaggccggcgtgtactacgtgttctttcagctggaactgcggagagtggtggccggcgag1620ggatctggatctgtgtctctggccctgcatctgcagcccctgagatcagctgctggcgct1680gctgctctggctctgacagtggatctgcctcctgccagcagcgaggcccggaatagcgca1740tttgggtttcaaggcaggctgctgcacctgtctgccggccagaggctgggagtgcatctg1800cacacagaagccagagccaggcacgcttggcagctgacacagggcgctacagtgctgggc1860ctgttcagagtgacccccgagattccagccggcctgccttctccaagaagcgaaggcggc1920ggaggctccggaggaggcggctctagagaaggacctgaactgagcccagacgaccccgca1980gggctgctggatctgagacagggaatgttcgcccagctggtggctcagaatgtgctgctg2040attgatggacccctgtcctggtactccgacccagggctggcaggggtgtccctgactggc2100ggactgtcttacaaagaagatacaaaagaactggtggtggctaaagctggggtgtactat2160gtgttttttcagctggaactgaggcgggtggtggctggggaaggcagtggctctgtgtcc2220ctggcactgcatctgcagcctctgcgcagtgctgcaggcgcagccgcactggcactgact2280gtggacctgcccccagcttccagcgaggctagaaacagcgccttcgggtttcaaggacgc2340ctgctgcatctgagcgccggacagcgcctgggagtgcatctgcatactgaggctagggcc2400agacatgcctggcagctgacccagggggcaactgtgctgggactgtttcgcgtgacacct2460gagatccccgctggcctgccaagccctagatcagaaggcggagggggatcagggggaggc2520ggatccagagagggccctgagctgagccccgatgatcctgctggactgctggacctgcgg2580cagggcatgtttgctcagctggtggcccagaacgtgctgctgatcgatggccccctgtcc2640tggtacagcgatcctggactggctggcgtgtcactgacaggcggcctgagctacaaagag2700gacaccaaagaactggtggtggccaaggccggcgtgtactacgtgttctttcagctggaa2760ctgcggagagtggtggccggcgaaggatctggctctgtgtctctggccctgcatctgcag2820cctctgagaagcgctgctggcgctgcagctctggcactgacagtggatctgcctcctgcc2880agctccgaggcccggaatagcgcatttgggtttcaaggcaggctgctgcacctgtctgcc2940ggccagaggctgggagtgcatctgcacacagaggccagggctagacacgcctggcagctg3000acacagggcgctacagtgctgggcctgttcagagtgacccccgagattccagccggcctg3060ccttctccaagaagcgaa30781821026prt人工序列與三聚體hu4-1bbl(71-254)融合的dp47fc節182gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr202530alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045seralaileserglyserglyglyserthrtyrtyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alalysglyserglypheasptyrtrpglyglnglythrleuvalthr100105110valserseralaserthrlysglyproservalpheproleualapro115120125serserlysserthrserglyglythralaalaleuglycysleuv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