一種具有抗氧化活性的茶樹菇子實體多糖的製備方法

2023-06-08 11:49:46 1

專利名稱：一種具有抗氧化活性的茶樹菇子實體多糖的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種具有抗氧化活性的茶樹菇子實體多糖的製備方法。屬生物工程技術應用領域。
背景技術：
茶樹菇屬擔子菌綱，糞鏽傘科，田菇屬，又名茶菇、油茶菇、神菇。是近年來發展起來的一種食用菌新品種。茶樹菇營養豐富，蛋白質含量高，含有人體必需的胺基酸，並且有豐富的B族維生素和鉀、鈉、鈣、鎂、鐵、鋅等礦質元素。中醫認為該菇性平、甘溫、無毒，具有較高的藥用價值，有清熱、平肝、明目、健脾的功效。是一種集營養、保健、理療於一身的綠色食品。通過熱水浸提獲得的多糖，具有一定的抗氧化活性，可應用於保健品行業。發明內容
本發明的目的是提供一種具有抗氧化活性的茶樹菇子實體多糖的製備方法
技術領域：
本發明的技術方案為將樹菇子實體通過粉碎，脫脂，熱水浸提，乙醇沉澱，脫蛋白，脫色、葡聚糖凝膠柱G-2 00層析、透析後冷凍乾燥得到茶樹菇子實體多糖，最後進行體外抗氧化實驗。
本發明發明的一種具有抗氧化活性的茶樹菇子實體多糖製備方法，提取得率為3.63g/100g子實體乾重，測得多糖含量為97. 8%。經初步的研究確認，基本無毒，具有一定的抗氧化活性。可以作為原料應用於保健食品等領域。
具體來說，首先，我們用粉碎機將市售乾燥的茶樹菇子實體粉碎，然後用有機溶劑乙醚進行脫脂，80°C _95°C熱水浸提，加水量為30倍體積脫脂後產物，總提取時間為12h，提取3次，提取液濃縮後加入4倍體積無水乙醇在4°C醇析，離心收集沉澱，乙醇，乙醚洗滌後用蒸餾水復溶，用木瓜蛋白酶和Sevage法聯合去除游離蛋白，H2O2脫色、葡聚糖凝膠G-200 層析柱純化，蒸餾水透析，冷凍乾燥後得到茶樹菇子實體多糖。抗氧化試驗將總還原能力， 清除羥基自由基、超氧陰離子、DPPH的能力作為指標。
具體實施方式
下面的實例將具體說明本發明的操作方法，但不能作為對本發明的限定。
實例一
IOOg粉碎後的茶樹菇子實體加入Soxhelt提取器，以乙醚作為溶劑，進行回流脫脂8h，收集固形物用熱水浸提，提取溫度80°C _95°C，加水量為30倍體積固形物，總提取時間為12h，提取3次，提取液濃縮後加入3倍體積95%乙醇在4°C醇析過夜，8000rpm離心得沉澱物，沉澱物用蒸餾水復溶後用木瓜蛋白酶和Sevage法聯合去除游離蛋白，先在5%的糖溶液中加入1% (w/v)的木瓜蛋白酶於58±2°C，pH6.5條件下反應4h，然後按發酵液1/5 的體積加入氯仿，然後加入氯仿體積1/5的正丁醇，混合後振蕩20min。蛋白質與氯仿-正丁醇生成凝膠，4000rpm離心20min，收集上清液，反覆操作8次至氯仿-正丁醇層不渾濁為止。然後在上清液中加入95%乙醇置4°C冰箱過夜，次日離心收集沉澱。沉澱物用蒸餾水復溶後將5%的多糖溶液用NaOH調pH至9. 0，然後滴加20%的H2O2 (用量為多糖溶液體積的15% )，保持PH8. 0-9. OAh後終止反應，加入95%乙醇置4°C冰箱過夜，次日離心收集沉澱，用95%乙醇、無水乙醇、丙酮洗滌數次。待有機溶劑揮發完畢，將沉澱物用蒸餾水完全溶解,用Sephadex G-200凝膠層析對多糖進行純化,流動相為O. IM NaCl,流速O. 5mL/min,每管3mL。以苯酚-硫酸法在490nm處檢測每管的糖濃度，測定該多糖的純度。多糖復溶後裝入透析袋中，紮緊袋口，懸浮於蒸餾水中，透析72h，中間每隔12小時換水一次。冷凍乾燥後得到茶樹菇子實體多糖3. 63g，用苯酚-硫酸法測得總糖含量為97. 8%。
實例二
將製備得到的茶樹菇子實體多糖進行抗氧化活性實驗，以蒸餾水為空白對照，以抗壞血酸為陽性對照，數據經SPSS13. O軟體分析。
I.實驗方法
(I)還原力測定
在具塞試管中加入適量不同濃度的茶樹菇子實體多糖樣品(O. 10-1. Omg/mL)、 O. 2mL PBS (2. OM, pH 6. 6)和O. 5mL I %鐵氰化鉀溶液。置50°C恆溫水浴中反應20min，迅速冷卻，再加入適量的10% (w/v)三氯乙酸溶液,3000*g離心IOmin,取上清液I. 5mL,加入 O. 2mLl%三氯化鐵溶液和3. OmL去離子水，振蕩均勻，靜置5min，在λ 700處以蒸餾水為空白測定其吸光值。鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]可被還原試劑還原成亞鐵氰化鉀[K4Fe (CN)6]，亞鐵氰化鉀再和鐵離子作用生成普魯士藍，在OD7tltol處有最大吸收值，以檢測其還原力。吸光值越大，說明其還原力越高。
(2)對羥自由基的清除
在試管中依次加入O. 2mL不同濃度的茶樹菇子實體多糖樣品(O. 10-1. Omg/mL)，2.O mL 的 EDTA-Fe (O. 15mM)，O. 8mL 水楊酸鈉(2. OmM)，2. OmLH2O2 (6. OmM)，O. 8mL 去離子水。 37°C反應60min，於λ 510處測得不同茶樹菇多糖濃度下的吸光值A1，用水替代茶樹菇多糖時的吸光值A1,用水代替多糖和H2O2時測得空白對照吸光值Atl.按下式計算羥自由基(·0Η) 的清除率· OH 清除率(% ) = [ (A1-Aj) / (A0-Aj) ] X 100
(3)對超氧陰離子的清除
ImL的不同濃度(O. 10-1. Omg/mL)的茶樹菇子實體多糖樣品以及2mL的 Tris-HCl (16mM, pH 8. O)溶解的 76 μ M 的 NBT 和 394 μ M 的 NADH，加 O. 4mL 的 56 μ M PMS, 振蕩均勻，室溫反應5min，用Tris-HCl代替樣品反應作為空白對照，測定A560nm值。
(4)對DPPH ·自由基的清除
樣品管中加入O. 5mL不同濃度的子實體多糖溶液(O. 10-1. Omg/mL)與3. OmL的O.004%溶於95%乙醇的DPPH溶液；對照管用95%乙醇代替DPPH溶液；空白管用蒸餾水代替多糖溶液。以上三組置於室溫靜置30min後，用O. 55mL蒸餾水和3. OmL 95%的乙醇調零，於517nm處測定吸光值。
結果顯示
(I)還原力測定試驗組和陰性對照組比較，P O. 05，表明試驗組不同濃度之間的還原力沒有顯著性差異；試驗組與陽性對照組相比，P< O. 05,表明多糖的還原力不及抗壞血酸。
(2)對羥基自由基的清除試驗組和陰性對照組比較，P < O. 05，顯示兩者在對羥基自由基的清除方面有顯著性差異，表明茶樹菇子實體多糖具有一定的清除羥基自由基能力；試驗組不同濃度的多糖之間進行比較時，當濃度大於O. 2mg/mL時，P < O. 05，表明多糖從O. 2mg/mL開始隨著濃度的升高，其清除羥基自由基的能力增強；試驗組與陽性對照組相比，P < O. 05，表明多糖對羥基自由基的清除能力不及抗壞血酸。
(3)對超氧陰離子的清除能力試驗組和陰性對照組比較，P < O. 05，顯示兩者對超氧陰離子的清除率有顯著性差異，前者清除超氧陰離子的能力高於後者；試驗組不同濃度的多糖之間進行比較時，P < O. 05，表明隨著多糖濃度的增大，清除能力也相應增強，達到一定濃度時，趨於穩定；試驗組與陽性對照組相比，P < O. 05，表明多糖對超氧陰離子的清除能力不及抗壞血酸。
(4)對DPPH的清除能力；試驗組和陰性對照組比較，P O. 05，表明試驗組不同濃度之間對DPPH的清除能力沒有顯著性差異；試驗組與陽性對照組相比，P < O. 05，表明多糖對DPPH的清除能力不及抗壞血酸。
權利要求
1.一種具有抗氧化活性的茶樹菇子實體多糖的製備方法，是茶樹菇子實體通過粉碎， 脫脂，熱水浸提，離心，上清液濃縮，乙醇沉澱，Sevage法脫蛋白，H2O2脫色，透析後冷凍乾燥得到的。提取得率為3. 63g/100g子實體乾重，測得多糖含量為97.8%。可應用於製備具有抗氧化，抗疲勞功能的保健品。
2.如權利要求I所述的脫脂，其特徵在於將茶樹菇子實體粉碎後加入Soxhelt提取器， 以乙醚作為溶劑，進行回流脫脂8h。
3.如權利要求I所述熱水浸提，其特徵在於提取溫度80°C_95°C，加水量為30倍體積固形物，總提取時間為12h，提取3次。
4.如權利要求I所述的脫蛋白，其特徵在於用木瓜蛋白酶和Sevage法聯合去除游離蛋白，先在5%的糖溶液中加入1% (w/v)的木瓜蛋白酶於58±2°C，pH6. 5條件下反應4h，然後按發酵液1/5的體積加入氯仿，然後加入氯仿體積1/5的正丁醇，混合後振蕩20min，蛋白質與氯仿_正丁醇生成凝膠，4000rpm離心20min,收集上清液,反覆操作8次至氯仿-正丁醇層不渾濁為止。
5.如權利要求I所述透析，其特徵在於4°C醇析過夜後的離心沉澱物用蒸餾水復溶後取IOOmL裝入透析袋中，紮緊袋口，懸浮於蒸餾水中，透析72h，中間每隔12h換水一次。
6.如權利要求I所述的凝膠層析柱純化，其特徵在於用的是葡聚糖凝膠G-200填料。
全文摘要
本發明屬生物工程技術應用領域，具體涉及一種具有抗氧化活性的茶樹菇子實體多糖的製備方法。該茶樹菇子實體多糖為白色或淡黃色粉末，是茶樹菇子實體通過粉碎，脫脂，熱水浸提，乙醇沉澱，脫蛋白，脫色、葡聚糖凝膠柱G-200層析、透析後冷凍乾燥得到的。提取得率為3.63g/100g子實體乾重，用苯酚-硫酸法測得多糖含量為97.8％，可應用於製備具有抗氧化，防衰老功能的保健品。
文檔編號C08B37/00GK102911284SQ201210464469
公開日2013年2月6日 申請日期2012年11月19日 優先權日2012年11月19日
發明者鄧超, 陳敬華, 程詠梅, 陳荊曉, 付海田 申請人:江南大學