含有包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒的組合物、其製備和使用方法

2023-06-14 15:13:31 2

專利名稱：含有包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒的組合物、其製備和使用方法
技術領域：
本發明涉及包含萜和中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒的組合物及這些組合物的製備方法。所述組合物提高萜穩定性和活性，並為所述萜提供合適的載體。本發明還涉及在醫學、獸醫學和農業領域中使用這些組合物的方法。
萜是在自然界中廣泛分布的化學化合物，主要在植物中作為精油的成分。它們的結構單元是烴異戊二烯(C5H8)n。萜的實例包括檸檬醛、蒎烯、橙花醇、b-紫羅酮、香葉醇、香芹酚、丁子香酚、香芹酮、terpeniol、茴香腦、樟腦、薄荷醇、薴烯、橙花叔醇、法呢醇、植醇、胡蘿蔔素(維生素A1)、角鯊烯、百裡酚、生育三烯酚、紫蘇子醇、冰片、月桂烯、simene、蒈烯、terpenene和裡哪醇。
萜被歸類為Generally Recognized as Safe(GRAS)，並且在調味料和香料工業中已經使用多年。檸檬醛在大鼠中的LD50為約5g/kg，這進一步表明這些化合物的相對安全性。此外，一旦暴露於氧(例如空氣)，萜具有約28天的相對短暫的壽命。萜會分解為CO2和水。萜的這種分解或裂解表明本發明的組合物和方法的安全性和環境友好性。
已經發現萜抑制癌細胞生長、減小腫瘤尺寸、降低膽固醇水平並且對體外微生物具有殺滅作用。Owawunmi(Letters in Applied Microbiology，1993，9(3)105-108)顯示，含多於0.01％檸檬醛的生長培養基降低大腸桿菌(E.coli)的濃度，並且在0.08％時具有殺菌作用。美國專利5,673,468描述了一種基於松油的萜製劑，其用作消毒劑或防腐清潔劑。美國專利5,849,956教導了在米中發現的萜具有抗真菌活性。美國專利5,939,050描述了一種口腔衛生抗微生物產品，其含顯示協同作用的2種或3種萜的組合。幾項美國專利(美國專利5,547,677、5,549,901、5,618,840、5,629,021、5,662,957、5,700,679、5,730,989)教導了某些類型的水包油型乳液具有抗微生物、佐劑和遞送性質。已經發現萜是有效且無毒的膳食抗腫瘤劑，它們通過多種作用機理髮揮作用(Crowell等人，Crit.Rev.Oncog.，1994，5(1)1-22；Crowell等人，Adv.Exp.Med.Biol.，1996，401131-136)。萜香葉醇、生育三烯酚、紫蘇子醇、b-紫羅酮和d-薴烯抑制肝HMG-CoA還原酶活性，其是膽固醇合成中的限速步驟，並且適當降低動物中的膽固醇水平(Elson等人，J.Nutr.，1994，124607-614)。D-薴烯和香葉醇減小乳腺腫瘤(Elegbede等人，Carcinogenesis，1984，5(5)661-664；Elegbede等人，J.Natl.CancerInst.，1986，76(2)323-325；Karlson等人，Anticancer Drugs，1996，7(4)422-429)，並且抑制移植腫瘤的生長(Yu等人，J.Agri.Food Chem.，1995，432144-2147)。
還發現萜抑制細菌和真菌的體外生長(Chaumont等人，Ann.Pharm.Fr，1992，50(3)156-166；Moleyar等人，Int.J.Food Microbiol，1992，16(4)337-342；和Pattnaik等人，Microbios，1997，89(358)39-46)和一些體內和體外寄生蟲(Hooser等人，J.Am.Vet.Med.Assoc.，1986，189(8)905-908)。發現香葉醇通過提高鉀滲漏速率並破壞膜流動性而抑制白色念珠菌(Candida albicans)和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株的生長(Bard等人，Lipids，1998，23(6)534-538)。通過抑制孢子萌發和在瓊脂中的生長抑制確定b-紫羅酮具有抗真菌活性(Mikhlin等人，A.Prikl.Biokhim.Mikrobiol，1983，19795-803；Salt等人，Adam.Physiol.Molec.Plant Path，1986，28287-297)。替普瑞酮(戊四烯酮)對幽門螺桿菌(H.pylori)具有抗菌作用(Ishii，Int.J.Med.Microbiol.Virol.Parasitol.Infect.Dis.，1993，280(1-2)239-243)。已表明Rosanol，一種含1％玫瑰油的市售產品，抑制幾種細菌的生長(假單胞菌(Pseudomonas)、葡萄球菌(Staphylococus)、大腸桿菌和幽門螺桿菌)。香葉醇是玫瑰油的活性成分(75％)。玫瑰油和濃度為2mg/L的香葉醇抑制幽門螺桿菌的體外生長。已表明來自草藥的一些提取物對幽門螺桿菌具有抑制作用，最有效的是前胡醇當歸酸酯、前胡素、木蘭醇、小檗鹼、肉桂酸、前胡醇和沒食子酸(Bae等人，Biol.Pharm.Bull.，1998，21(9)990-992)。已表明來自腰果的提取物、漆樹酸和(E)-2-己烯醛對幽門螺桿菌具有殺菌作用。
已表明二萜，即trichorabdal A(來自R.Trichocarpa)對幽門螺桿菌具有極強的抗菌作用(Kadota等人，Zentralbl.Bakteriol，1997，287(1)63-67)。
在體外測試中，11種不同萜的溶液有效抑制致病菌的生長；在100ppm至1000ppm之間的水平是有效的。用含1％聚山梨醇酯20的水稀釋所述萜(Kim等人，J.Agric.Food Chem.，1995，432839-2845)。
可能存在萜對抗微生物的不同作用模式；它們可以(1)幹擾細胞膜的磷脂雙分子層，(2)削弱多種酶系統(HMG-還原酶)，和(3)破壞或滅活遺傳物質。相信由於萜的作用模式是如此基礎，例如阻斷膽固醇，以致感染劑不能建立對萜的耐藥性。
但是，使用萜有許多缺點。這些缺點包括-萜是液體，這使得它們難以處理並且不適於某些目的。
-萜與水不是非常可混溶，並且其通常需要使用洗滌劑、表面活性劑或其它乳化劑來製備水乳液。但是，通過在高剪切下混合所述萜可以獲得穩定溶液。
-乾粉萜製劑通常僅含有低重量百分比的萜。
-萜在水乳液系統中趨於氧化，這使長期貯存成問題。
存在對噴霧包衣、擠出、凝聚、分子包封和噴霧乾燥/冷卻以提供成分遞送系統的當前技術的限制。
發麵酵母細胞壁來自發麵酵母細胞，並且由不溶性生物聚合物β-1，3-葡聚糖、β-1，6-葡聚糖、甘露聚糖和殼多糖組成。它們通常為2-4微米直徑的微球，具有厚度僅為0.2-0.3微米的殼壁，殼壁環繞著開放的空穴。這種材料具有可觀的液體保持容量，通常吸收5-25倍於其重量的液體。殼是充分多孔的，使尺寸高至150000道爾頓的有效負荷可以通過外殼，並被吸收入球形顆粒的空穴中。發麵酵母細胞壁具有幾種獨特的性質，包括熱穩定性(例如高至121℃)、剪切穩定性、pH穩定性(例如pH2-12)以及在高濃度下它們不形成顯著的粘度。除了其物理性質外，這種組合物還含有天然和健康的膳食纖維，它們具有心血管和免疫增強的健康益處。
通過從酵母細胞的可溶性成分提取和純化不溶性微粒部分而從酵母細胞製備酵母細胞壁。可以從酵母抽提物生產的不溶性副產物製備真菌細胞壁。此外，可以用氫氧化物水溶液處理酵母細胞，不破壞酵母細胞壁，氫氧化物水溶液消化細胞的蛋白質和胞內部分，使酵母細胞壁成分避免嚴重的蛋白質汙染，並且具有基本上未改變的β(1-6)和β(1-3)連接的葡聚糖的細胞壁結構。Jamas等人在美國專利4,810,646和共同在審專利申請U.S.Ser.No.166,929、U.S.Ser.No.297,752和U.S.Ser.No.297,982中更詳細地描述了完整葡聚糖顆粒及其製備方法。轉讓給Novogen Research Pty Ltd.的美國專利6,242,594描述了一種通過鹼提取、酸提取然後用有機溶劑提取和最後乾燥來製備酵母葡聚糖顆粒的方法。轉讓給AS Biotech-Mackzymal的美國專利5,401,727公開了獲得酵母葡聚糖顆粒的方法和使用它們增強水生動物抵抗力和作為疫苗佐劑的方法。轉讓給Alpha-BetaTechnology Inc.的美國專利5,607,677公開了中空完整葡聚糖顆粒作為遞送包裝和輔劑用於遞送多種藥劑的用途。上述專利和申請的教導引入本文作為參考。
其它類型的酵母和真菌細胞的細胞壁不含葡聚糖。可以通過與上述技術相似的技術分離這些酵母和真菌的細胞壁以獲得細胞壁顆粒。
此外，許多植物、藻類、細菌和其它微生物的細胞也包括細胞壁。不同微生物的細胞壁的結構和組成不同，但其通常是堅固和相對惰性的結構。通過常規技術如以上關於酵母所提及的技術，可能從這些細胞獲得細胞壁顆粒。
我們現已發現，可以將萜吸收並穩定地包封在中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒中。可以通過將顆粒與萜一起溫育而將所述萜包封入這些顆粒中。
根據本發明，提供了一種組合物，其包含包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒。
本文所用的術語「中空葡聚糖顆粒」包括任何包含葡聚糖作為結構部分的中空顆粒。因此，該術語具體包括(經純化或粗品形式的)酵母細胞壁或中空完整葡聚糖顆粒。術語「細胞壁顆粒」指(經純化或粗品形式的)包括細胞的壁的顆粒，其中葡聚糖不是結構部分。合適的顆粒包括植物、藻類、真菌或細菌細胞的細胞壁。細胞壁顆粒通常保留它們所來源於的細胞的形狀，因此，像中空葡聚糖顆粒一樣，提供適於包封萜成分的中央空穴。
對於本發明，所述中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒能夠穩定地包封所述萜成分是必要的。通常，這意味著在與所述萜成分一起溫育的過程中(通常所述萜成分處於相對高的濃度)，所述中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒必須能夠保持其結構，並且所述萜成分必須能夠遷移入所述顆粒中。所述中空葡聚糖顆粒和細胞壁顆粒通常從相對惰性的材料形成並且是多孔的，所以可以認為通常中空葡聚糖顆粒和細胞壁顆粒將能夠包封萜成分。
本發明的組合物有效對抗各種感染劑，包括細菌、病毒、支原體、真菌和/或線蟲。
本發明的組合物可以提供以下優點-使萜有效負荷最大化；-使未包封的有效負荷最小化；-控制有效負荷穩定性；-控制有效負荷釋放動力學；-產生液體萜的固體形式，以增加質量(mass)和均勻性；-簡化萜的處理和應用；和-掩蓋所述萜的氣味和味道。
特別合適的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒是真菌細胞壁，優選酵母細胞壁。酵母細胞壁是酵母細胞的製劑，其保留它們所來源於的酵母細胞的三維結構。因此它們具有中空結構，其允許將所述萜成分包封在所述酵母細胞壁內。酵母壁可以適當地來源於發麵酵母細胞(可得自Sigma ChemicalCorp.，St.Louis，MO)。也可以以商品名Nutricell MOS 55從Biorigin(SaoPaolo，Brazil)獲得具有合意性質的酵母細胞壁顆粒。這些顆粒是噴霧乾燥的釀酒酵母抽提物。
可選擇的顆粒是商品名為SAF-Mannan(SAF Agri，Minneapolis，MN)和Nutrex(Sensient Technologies，Milwaukee，WI)的顆粒。這些顆粒是中空葡聚糖顆粒，其是來自酵母抽提物生產過程的不溶性廢物流。在生產酵母抽提物的過程中，部分自溶酵母細胞的可溶性成分被除去，而不溶性殘渣是用於萜裝載的合適材料。這些中空葡聚糖顆粒包含約25-35重量％β-1，3-葡聚糖。這些材料的關鍵屬性是它們含有多於10重量％脂質，並且非常有效地吸收萜。此外，作為廢物流產物，它們是相對廉價的中空葡聚糖顆粒來源。
具有更高純度的可選擇的中空葡聚糖顆粒是由Nutricepts(NutriceptsInc.，Burnsville，MN)和ASA Biotech生產的顆粒。這些顆粒已經過鹼提取，其除去額外的細胞內成分並除去細胞壁的外部甘露糖蛋白層，獲得50-65重量％葡聚糖的顆粒。
更高純度的中空葡聚糖顆粒是來自Biopolymer Engineering的WGP顆粒。這些顆粒經酸提取除去額外的酵母成分，獲得75-85重量％葡聚糖的產物。
極高純度的中空葡聚糖顆粒是來自Alpha-beta Technology，Inc.(Worcester，MA)的AdjuvaxTM和來自Novogen(Stamford，CT)的微粒葡聚糖。這些顆粒經有機溶劑提取，其除去殘餘的脂質，從而使所述顆粒包含多於90重量％葡聚糖。
在一些實施方案中，可能需要高純度的葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒，例如當需要嚴格控制可能的汙染物時。在這些情況下，更高純度的顆粒將比其它較低純度的產品更優選。對於其它實施方案，由於經濟原因，較低純度的顆粒將是優選的；還發現那些顆粒更有效地吸收萜。
優選地，所述中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒含有少量脂質，如1或2重量％脂質。少量脂質可以增加所述顆粒包封所述萜成分的能力。優選地，所述中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒的脂質含量為5重量％或更高，更優選10重量％或更高。
任選地，本發明的萜成分可以與表面活性劑締合。所述表面活性劑可以是非離子型、陽離子型或陰離子型的。合適的表面活性劑的實例包括十二烷基硫酸鈉、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚甘油酯、聚甘油一油酸酯、十甘油一辛酸酯(decaglycerylmonocaprylate)、丙二醇二辛酸酯、三甘油一硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯、Tween_、Span_20、Span_40、Span_60、Span_80、Brig 30或其混合物。所述表面活性劑將所述萜成分保持在乳液中，還幫助將所述萜成分包封入所述中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒中。
本發明的萜成分可以包含單一的萜或多種萜的混合物。多種萜的混合物可以導致協同作用。
本文所用的術語「萜」不僅指式(C5H8)n的萜，而且包括萜衍生物，如萜醛或萜聚合物。包括天然和合成萜，例如單萜、倍半萜、二萜、三萜和四萜。此外，提及單個化合物名稱將包括該化合物的各種異構體。例如，術語檸檬醛包括順式異構體檸檬醛-a(或香葉醛)和反式異構體檸檬醛-b(或橙花醛)。
應該注意，也用含有萜的提取物或精油的名稱來稱呼萜，例如檸檬草油(含有檸檬醛)。
被美國規則豁免且列在EPA規則40 C.F.R.Part 152(被全文引入本文作為參考)的萜適用於本發明。
特別適用於本發明的萜包括選自以下的萜檸檬醛、蒎烯、橙花醇、b-紫羅酮、香葉醇、香芹酚、丁子香酚、香芹酮(例如L-香芹酮)、terpeniol、茴香腦、樟腦、薄荷醇、百裡酚、薴烯、橙花叔醇、法呢醇、植醇、胡蘿蔔素(維生素A1)、角鯊烯、百裡酚、生育三烯酚、紫蘇子醇、冰片、月桂烯、simene、蒈烯、terpenene、裡哪醇及其混合物。
優選地，用於本發明的萜具有通式結構C10H16，因為這一亞組通常更有效地對抗感染劑。
更優選地，所述萜成分包含選自香葉醇、百裡酚、檸檬醛、香芹酮(例如L-香芹酮)、丁子香酚和b-紫羅酮的萜。
所述萜成分可以合適地包含百裡酚，因為已表明這種萜特別有效地治療或預防真菌植物感染。
另一種特別合適的萜是檸檬醛，其表現對抗多種微生物的特別功效。
香葉醇、百裡酚和丁子香酚的組合在對抗植物感染方面表現特別的功效，因此是特別合適的萜成分。
在治療植物感染方面顯示高功效的其它萜製劑包括(重量百分比)-100％百裡酚；-50％香葉醇和50％百裡酚；-50％丁子香酚和50％百裡酚；
-33％香葉醇、33％丁子香酚和33％百裡酚；-33％丁子香酚、33％百裡酚和33％檸檬醛；-25％香葉醇、25％丁子香酚、25％百裡酚和25％檸檬醛；-20％香葉醇、20％丁子香酚、20％檸檬醛、20％百裡酚和20％L-香芹酮。
因此，包含任何以上製劑的萜成分都特別適用於本發明。
在一個實施方案中，所述萜成分包含一種或多種含氧的萜。檸檬醛，例如檸檬醛95，是一種氧化的C10H16萜，C10H16CAS No.5392-40-5(3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醛)。可以形成高至約2500ppm的檸檬醛的穩定懸浮液。可以將檸檬醛製成高至約500ppm的溶液。可以製備摻入25ppt檸檬醛的中空葡聚糖顆粒的穩定懸浮液。
本發明的組合物可以包含1至99體積％萜、0至99體積％表面活性劑和1至99％中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒。更具體地，所述組合物可以包含約10％至約67重量％萜、約0.1-10％表面活性劑和約40-90％中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒。
合適地，本發明的組合物包含約500至約10000ppm中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒，其中所述顆粒含有約1至約67％萜成分。優選地，所述組合物包含約1000至約2000ppm中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒，其中所述顆粒含有約10至約50％萜成分。
例如，對於細菌和真菌，具體的組合物可以包含包封萜的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒，其在水或標準0.9％鹽水中，具有高至67％的L-香芹酮、高至67％的丁子香酚、高至67％的檸檬醛、高至67％的百裡酚和L-香芹酮、高至67％的香葉醇或高至67％的檸檬醛和L-香芹酮和丁子香酚以及1％的Tween_80；對於黴菌，具體的組合物可以包含包封萜的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒，其在水或標準0.9％鹽水中，具有高至67％的檸檬醛和1％的Tween_80；或者對於支原體，具體的組合物可以包含包封萜的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒，其在水或標準0.9％鹽水中，具有高至67％的檸檬醛、高至67％的L-香芹酮和丁子香酚、高至67％的丁子香酚、高至67％的香葉醇或高至67％的香葉醇、百裡酚以及1％的Tween_80。
在本發明的組合物和方法中可以用作有效濃度的包封萜的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒濃度為1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、125、130、140、150、160、175、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1250、1375、1425、1500、1600、1750或2000ppm。甚至更高的濃度(高至25ppt，即千分之...)可以得到製備並可以用於本發明。
本發明的組合物可以包含約1ppm至約25ppt(25000ppm)所述萜成分，優選100至2000ppm所述萜成分，例如250、500、1000、2000ppm。
可以容易地購得或使用合成化學家公知的技術合成本發明的萜、表面活性劑和其它成分。
出於安全性和規章原因，高度優選本發明中所用的萜至少是食品級萜(如美國FDA或美國以外的同等管理機構定義)。
任選地，除了所述萜成分外，所述組合物還可以包含其它食品級活性化合物，例如其它抗微生物劑、酶等。
任選地，除了所述萜成分外，所述組合物還可以包含其它活性劑，例如抗微生物劑、抗真菌劑、殺蟲劑、抗炎藥、麻醉劑等。合適的活性劑包括-抗真菌劑細胞壁水解酶(假設它們不降解所述中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒)、細胞壁合成抑制劑、標準抗真菌劑。
-抗菌劑防腐劑、細胞壁水解酶、合成抑制劑、抗生素。
-殺蟲劑天然殺蟲劑、幾丁質酶。
所述組合物可以包含抗氧化劑以減少所述萜的氧化。這種抗氧化劑的實例可以是迷迭香油、維生素C或維生素E。
本發明的組合物可以是乾粉形式。可以與液體、固體或凝膠樣形式的農學、食品或藥學可接受的載體或賦形劑組合提供所述組合物。
對於固體組合物，合適的載體包括藥用級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。合適地，製劑為片劑或小球形式。合適的載體也可以是人或動物食品材料。此外，也可以使用常規農學載體。
所述組合物的小球、片劑或其它固體形式還可以優選地含有分散劑，當將所述組合物放入液體如水中時，所述分散劑促進所述組合物的分散。合適的分散劑包括黃原膠、麥芽糖糊精、藻酸鹽等。
例如，通過將所述組合物分散在水、鹽水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇等中以形成溶液或懸浮液，可以製備液體組合物。如果合意，這些組合物可以含有少量無毒輔助物質，如潤溼劑或乳化劑、pH緩衝劑(例如乙酸鈉、失水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺乙酸鈉或油酸三乙醇胺)。對於本領域技術人員，製備這些液體組合物的方法是已知的或著會是明顯的；例如參見RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy；Lippincott，Williams Wilkins；(December 15，2000)，該文獻引入本文作為參考。此外，通過將所述組合物分散在人或動物液體食品或飲料中，可以製備液體組合物。還可以使用合適的農學液體賦形劑。
對於口服給予，通常優選片劑和膠囊劑。片劑可以含有粘合劑和潤滑劑。細粉或顆粒可以含有稀釋劑、分散劑和/或表面活性劑，並且可以存在於水或糖漿中。膠囊劑或小藥袋(sachet)可以方便地含有乾燥狀態的所述組合物。所述組合物的非水溶液或懸浮液也是合適的，並且可以含有助懸劑。當合意或必需時，可以包含調味劑、防腐劑、助懸劑、增稠劑或乳化劑。當然，使用食品或飲料作為口服遞送方法也是適合的。
胃腸外給予通常的特徵是注射。對於可注射物，可以理解，通常所述組合物中使用的所有材料和所用的任何賦形劑都必須是藥用級的。可以將可注射物製備成常規形式，作為液體溶液、乳液或懸浮液、適於在注射前溶解、懸浮在液體中的固體形式或者作為乳液。用於胃腸外給予的可選擇的方法包括使用緩釋或延遲釋放系統，從而保持穩定的劑量水平。參見例如美國專利3,710,795，該文獻引入本文作為參考。胃腸外製劑還可以含有緩衝劑、稀釋劑和其它合適的添加劑。非水溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油)和可注射的有機酯(如油酸乙酯)。含水載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。其它胃腸外載體包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸鈉林格氏液(lactatedRinger’s)或固定油。靜脈內使用的載體包括液體和營養補充劑、電解質補充劑(如基於林格氏右旋糖的電解質補充劑)等。也可以存在防腐劑和其它添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。
對於局部給予，可以使用液體、混懸劑、洗劑、乳膏、凝膠劑、軟膏劑、滴劑、栓劑、噴霧劑和散劑。如果必需或合意，可以使用常規藥用載體、含水基質、粉末基質或含油基質、增稠劑等。
本發明還提供包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒的製備方法，所述方法包括以下步驟a)提供萜成分；b)提供中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒；c)在適合萜包封的條件下，將所述萜成分和所述葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒一起溫育；和d)回收包封所述萜成分的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒。
任選地，以上方法還可以包括乾燥包封所述萜成分的所述顆粒的步驟。可以用多種方式實現乾燥，並且可以提及冷凍乾燥、流化床乾燥、轉鼓式乾燥或噴霧乾燥，所有這些都是公知的方法。
在以上方法的步驟a)中，所述萜成分任選地在表面活性劑存在下，以在含水溶劑中的懸浮液的形式提供。合適的所述溶劑為水。合適的表面活性劑為Tween-80(聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)，並且優選所述表面活性劑存在的濃度為總反應混合物的約0.1至10體積％，更優選約1％。或者，可以將所述萜成分以在溶劑如水中的真溶液的形式提供。通過在高剪切下混合萜和水直到獲得真溶液，可以獲得所述萜在水中的真溶液。公開WO03/020024提供了形成萜在水中的真溶液的更多細節。
在以上方法的步驟b)中，適合地以在水或其它合適液體中的懸浮液的形式提供所述中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒。合適地，所述懸浮液每毫升包含約1至1000mg顆粒，優選200至400mg/ml。或者，可以以乾粉的形式提供所述顆粒，並添加到所述萜-表面活性劑懸浮液中。
或者，可以在最低程度地水化所述顆粒但不顯著過量的充足液體中提供所述顆粒。術語「流體力學體積(HV)」用於描述最低程度地水化所述顆粒所需的液體體積。因此，合適地，為所述顆粒提供HV至1.5倍HV(1.5HV)的體積。這使得隨後的乾燥步驟更有效。而且，當使用小體積液體(即約HV至1.5HV)時，還可能將成品擠出成小球或麵條形式，這對於流化床乾燥是方便的。
已經發現所述萜成分可以在室溫下被所述中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒包封。雖然包封速率在37℃下會提高，但應該將溫度保持在所述組合物的任何成分的沸點或變性溫度以下。因此，對於以上方法的步驟c)，合適的條件是大氣壓和20℃至37℃的溫度。對特定包封反應進行條件優化將是常規實驗的內容。
本發明還提供殺死微生物的方法，所述方法包括以下步驟a)使所述微生物與包含包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒的組合物接觸。
合適的組合物是以上更詳細定義的組合物。
本發明還提供預防或治療患者的感染的方法，所述方法包括以下步驟a)給予所述患者治療有效劑量的包含包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒的組合物。
合適的組合物是以上更詳細定義的組合物。
所述患者的感染可能由任何感染劑引起。這些感染劑的實例包括但不限於金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、煙麴黴(Aspergilliusfumigatus)、衣阿華支原體(Mycoplasma iowae)、青黴(Penicillium sp.)和肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)。
對於體內給予，可以口服、陰道、直腸、吸入或者通過胃腸外途徑給予所述組合物，例如通過皮內、皮下、肌內、腹膜內、直腸內、動脈內、淋巴內、靜脈內、鞘內和氣管內途徑給予。以上討論了用於這些途徑的所述組合物的合適製劑。
對於體外治療，可以局部施用所述組合物，例如作為乳劑或軟膏或者作為乾粉施用，用於治療傷口。
在以上方法中給予的萜的量顯然應該足以獲得合意的結果，即預防和/或治療感染，但其水平不應為在患者中引起嚴重毒性作用的水平。
當然，所給予的組合物的量將取決於給予方式、被治療的患者(即他們的體重、它們的年齡、狀態、性別)和個體中疾病的程度，並取決於處方醫師的判斷。劑量、給藥方案和給予途徑是可以變化的。基於本領域的常識和以下給出的實施例中的程序，本領域技術人員將能夠容易地確定給定應用的抗感染量。應該注意，本文所用的術語「患者」指向其施用所述治療的任何個體，人或動物。因此，所述患者可以是馴養動物(例如貓、狗等)、家畜(例如牛、馬、豬、羊、山羊等)、實驗室動物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)、鳥和魚。合適地，所述個體為哺乳動物，尤其是靈長類動物，例如人。
在其它實施方案中，本發明提供治療或防止植物感染的方法，所述方法包括以下步驟a)將治療有效劑量的包含包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒的組合物給予所述植物或所述植物附近的土壤。
合適的組合物是以上更詳細定義的組合物。
已表明萜消除多種植物病原體(參見WO03/020024)，並且如共同在審申請US60/538,627中所述，萜還有效殺死線蟲，其是重要的植物寄生蟲。但是，萜單獨在懸浮液或溶液中有些不穩定，並且在土壤環境中迅速降解，從而失去功效。
將萜成分摻入中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒中可以降低萜釋放和降解的速率，從而增加所述萜在土壤中的作用時間。
合適地，要在以上方法中治療或預防的植物感染為線蟲感染。
可以治療或預防的其它植物感染包括真菌植物感染，尤其是影響植物表面的感染。這些感染包括霜黴病、白粉病或灰黴病(botrytis bunch rot)；這些感染特別地影響葡萄樹。
在一個實施方案中，所述植物感染可以由以下一種或多種引起煙麴黴、Sclerotinta homeocarpa、茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)、禾生毛盤孢(Colletotrichum graminicola)或青黴。
基於萜處理植物的優點是可以在快要收穫時施用之。
許多常規處理要求在再次進入處理區域之前有較長的時間(通常為3周)。這意味著不能用常規處理來處理在快要收穫時的植物病害發作，因為這樣就不可能在合意的時間收穫作物。本發明的組合物可以合適地在直至收穫的任何時間施用，例如收穫前21天、收穫前14天、收穫前7天或甚至收穫前3天或更短。
包封萜顯示在處理葡萄的霜黴病、白粉病和灰黴病方面特別的功效，因此本發明提供治療或預防這些病害的方法。
通過有規律地用包封萜作為預防措施處理植物可以實現植物感染的預防。
合適地，本發明的組合物通過噴霧施用。這對於處理影響植物表面的植物病害是特別合適的。為了噴霧，可以使用在水中包含2g/l組合物的製劑。2至4g/l的濃度是特別有效的，並且可以根據需要使用高於4g/l的濃度。明顯地，重要的是所用組合物的濃度足以殺死或抑制致病劑，但不高到傷害被處理的植物。
當噴霧植物時，500L/Ha或更高的比率適於覆蓋所述植物。優選使用900L/Ha或更高，更優選1200L/Ha或更高的比率以保證良好覆蓋。當處理葡萄樹時，證明1200L/Ha的比率是合適有效的。
或者，可以通過灌溉施用本發明的組合物。這特別合於處理線蟲或其它土傳病原體或寄生蟲。
在其它實施方案中，本發明還提供包含包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒的組合物，其用於預防或治療患者或植物的感染。合適的組合物是以上更詳細定義的組合物。
在其它實施方案中，本發明提供包含包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒的組合物在製備用於治療由微生物引起的感染的藥物中的用途。合適的組合物是以上更詳細定義的組合物。
現在將參考以下非限制性實施例和附圖進一步描述本發明，在附圖中


圖1表示空酵母細胞壁的光學顯微照片。
圖2表示包封L-香芹酮的酵母細胞壁的光學顯微照片。
圖3表示包封檸檬醛的酵母細胞壁的光學顯微照片。
圖4表示萜乳液的光學顯微照片。
圖5表示在流體力學體積(HV)的水中的酵母細胞壁的光學顯微照片。
圖6表示在5倍流體力學體積(HV)的水中的包封萜的酵母細胞壁的光學顯微照片。
圖7表示在HV的水中的包封萜的酵母細胞壁的光學顯微照片。
圖8表示在HV+5％的水中的包封萜的酵母細胞壁的光學顯微照片。
圖9表示在HV+10％的水中的包封萜的酵母細胞壁的光學顯微照片。
圖10表示在HV+20％的水中的包封萜的酵母細胞壁的光學顯微照片。
圖11表示在HV+30％的水中的包封萜的酵母細胞壁的光學顯微照片。
圖12表示在HV+40％的水中的包封萜的酵母細胞壁的光學顯微照片。
圖13表示顯示包封萜成分且不含黃原膠的乾燥的中空葡聚糖顆粒的分散的光學顯微照片。
圖14表示在包含0.07g1％黃原膠時如
圖13中的光學顯微照片。
圖15表示在包含0.14g1％黃原膠時如
圖13中的光學顯微照片。
圖16表示在包含0.28g1％黃原膠時如
圖13中的光學顯微照片。
圖17表示在包含0.55g1％黃原膠時如
圖13中的光學顯微照片。
圖18表示在包含1.1g1％黃原膠時如
圖13中的光學顯微照片。
圖19表示在包含2.2g1％黃原膠時如
圖13中的光學顯微照片。
圖20表示在包含4.4g1％黃原膠時如
圖13中的光學顯微照片。
圖21顯示在位置18和20上的處理區域的圖示。
圖22顯示在位置18和20上的處理區域的圖示。
圖23顯示在位置7上的處理區域的圖示。
圖24顯示對比經包封與未包封萜製劑的圖。
提供以下實施例以進一步使本領域普通技術人員能夠製備或實施本發明。它們完全是示例性的，並非用於限制本發明的範圍。除非另有說明，份數為所述的體積份或重量份，溫度為攝氏度(℃)或處於環境溫度，而壓力為處於或接近大氣壓。組合物及其製備或使用條件存在許多變化和組合，例如成分濃度、合意的溶劑、溶劑混合物、溫度、壓力和可以用於優化從所述組合物和方法獲得的結果的其它範圍和條件。優化它們僅需要合理和常規的實驗。
實施例1-證明萜裝載到發麵酵母顆粒和純化的酵母葡聚糖顆粒中實施以下方案以證明萜會裝載到酵母細胞壁和其它中空葡聚糖顆粒中。
通過混合150μl所述萜和100μl 10％Tween 80的水溶液和250μl水來製備檸檬醛和L-香芹酮的乳液。
將可得自Savory Systems International，Inc.，Branchburg，NJ的發麵酵母顆粒(YP)或LevacanTM酵母葡聚糖顆粒(YGP)與水混合，形成250mg/ml懸浮液。
將500μl所述YP或YGP懸浮液和250μl所述萜乳液一起混合，並在持續攪拌下溫育過夜。用500μl YP或YGP懸浮液和500μl水作為對照。然後用水洗滌所述顆粒，直到沒有外部乳液。然後將顆粒製劑冷凍並冷凍乾燥直到乾燥。
然後將所述顆粒再水化，並在光學顯微鏡下檢查。結果示於
圖1至4中。
圖1顯示於其中心有黑暗區域的球形結構，這些是空的中空葡聚糖顆粒。圖2和3顯示具有腫脹外觀和淺色內部的球形結構，這些是萜被包封在中央空穴中的顆粒，在圖2中萜為檸檬醛，而在圖3中萜為L-香芹酮。在圖2和3中還可以看到游離萜的小斑點，例如在圖2的頂部，就在中央的左側。圖4顯示萜乳液，其為懸浮在水中的萜小泡。
實施例2-確定發麵酵母細胞壁顆粒(YP)中的最高檸檬醛和L-香芹酮裝載水平實施以下方案以確定裝載到YP中的萜的最大量。
-通過將4.5g所述萜與0.3ml水一起超聲來製備L-香芹酮和檸檬醛乳液。
-通過將4.5g Tween-80在40.5ml水中超聲來製備10％Tween-80溶液。
-通過將YP與水混合以形成20mg/ml懸浮液來製備YP懸浮液。
-如表1所述進行包封反應。
在室溫下將檸檬醛或L-香芹酮-水乳液與YP和Tween 80表面活性劑混合過夜。將樣品在14000xg下離心10分鐘，並評價漂浮在水層上的游離萜的外觀。結果示於表1標為游離萜的右手欄中。
表述「游離萜」指在經離心的反應混合物中存在可見的萜。不存在游離萜表明所述萜完全被所述顆粒吸收。將由不存在游離萜證明被所述顆粒吸收的萜的最大體積記錄為被吸收的萜乳液的最大體積。
表1
從該結果可以看出，每10mg YP能夠吸收和包封至少16.5μl L-香芹酮萜乳液或至少5μl檸檬醛乳液。
實施例3-證明用表面活性劑改善萜裝載以及確定最佳Tween-80萜比率實施以下方案以證明表面活性劑的存在改善萜裝載，並確定YP萜裝載反應所需的Tween-80表面活性劑的最低水平。
-通過將4.5g所述萜和0.3ml水一起超聲來製備L-香芹酮和檸檬醛乳液。
-通過將4.5g Tween-80在40.5ml水中超聲來製備10％Tween-80溶液。
-通過將YP與水混合以形成250mg/ml懸浮液來製備發麵YP懸浮液。
如下表2所示進行裝載反應。
在室溫下將檸檬醛或L-香芹酮-水乳液與含0-10％v/v Tween 80表面活性劑的YP混合過夜。將樣品在14000xg下離心10分鐘，並評價漂浮在水層上的游離萜的外觀。結果示於表2標為游離萜的右手欄中。
表述「游離萜」指在經離心的反應混合物中存在可見的萜。不存在游離萜表明所述萜完全被所述YP吸收。將由不存在游離萜證明被所述YP吸收的萜的最大體積記錄為被吸收的萜乳液的最大體積。
表2
Sl＝輕微從該結果可以看出，Tween-80濃度為1％(即1000μl反應混合物中含100μl 10％Tween-80)足以允許在上述反應中萜的完全吸收。2％Tween-80不引起結果的改善，而用0.33％的濃度觀察到游離萜。這表明a)當不存在表面活性劑時，萜被吸收到YP顆粒中，但存在表面活性劑顯著增加萜吸收。
b)約1％的Tween-80濃度對於YP裝載是最佳的，因為其保證適當的裝載，同時使YP顆粒的萜有效負荷最大化。
實施例4-確定在高發麵酵母細胞壁顆粒(YP)水平下的最大萜裝載和包封實施以下方案以確定在高YP水平下裝載到YP中的萜的最大量。
-通過將4.5g所述萜和3ml 1％Tween一起超聲來製備L-香芹酮和檸檬醛乳液。
-通過將0.5g Tween-80在9.5ml水中超聲來製備5％Tween-80溶液。
-通過將YP與水混合以形成250mg/ml懸浮液來製備YP懸浮液。
-如下表3所示進行包封反應。
在室溫下將檸檬醛或L-香芹酮-水乳液與YP和Tween 80表面活性劑混合過夜。將樣品在14000xg下離心10分鐘，並評價漂浮在水層上的游離萜的外觀。結果示於表3標為游離萜的右手欄中。
表述「游離萜」指在經離心的反應混合物中存在可見的萜。不存在游離萜表明所述萜完全被所述YP吸收。將由不存在游離萜證明被所述YP吸收的萜的最大體積記錄為被吸收的萜乳液的最大體積。
表3
從表3中的結果可以看出，在高YP濃度下，YP能夠吸收和包封萜。每125 mg YP吸收和包封至少112.5μl L-香芹酮萜乳液或至少75μl檸檬醛乳液。這證明在所測試的範圍內萜包封反應不依賴於YP濃度。實施例5-篩選用於萜吸收的市售顆粒實施以下方案以分析不同類型的顆粒的裝載性質。所研究的顆粒是發麵酵母細胞壁顆粒(Sigma Chemical Corp.，St.Louis，MO)、NutrexTMWalls(Sensient Technologies，Milwaukee，WI)、SAF-MannanTM(SAF Agri，Minneapolis，MN)、Nutricept WallsTM(Nutricepts Inc.，Burnsville，MN)、LevacanTM(Savory Systems International，Inc.，Branchburg，NJ)和WGPTM(Alpha-beta Technology，Inc.Worcester，MA)。
通過將7g萜+3ml 3.3％Tween-80超聲來製備L-香芹酮和檸檬醛乳液。
下面的表4比較了純度與酵母顆粒數/mg和填充的(packed)固體重量/體積比。
表4
從表4可以得出結論，顆粒數/mg與純度成反比。因此，每mg WGP的顆粒數幾乎比發麵YP高10倍。
如下製備所述YP懸浮液-通過混合250mg YP/ml 1％Tween 80來製備發麵酵母細胞壁顆粒懸浮液(YP)。
-通過混合163mg Nutrex YGP/ml 1％Tween 80來製備Nutrex懸浮液。
-通過混合234mg Biospringer YGP/ml 1％Tween 80來製備SAFMannan懸浮液。
-通過混合99mg Nutricepts YGP/ml 1％Tween 80來製備Nutricepts懸浮液。
-通過混合217mg Lev YGP/ml 1％Tween 80來製備Levacan懸浮液。
-通過混合121mg WGP YGP/ml 1％Tween 80來製備WGP懸浮液。
以上顆粒的填充體積(packed volume)一樣，這意味著測定了相同數目的顆粒。
如表5所示進行裝載反應，並溫育過夜。將樣品在14000xg下離心10分鐘，並評價漂浮在水層上的游離萜的外觀和小球中包封萜的顏色。結果示於表5的兩個右手欄中。將由不存在游離萜證明被顆粒吸收的萜的最大體積記錄為被吸收的萜乳液的體積。
表5
W＝白色；Y＝黃色；sl＝輕微；int＝中等從該結果可以得到以下結論-具有低脂質含量的純化的顆粒在吸收萜方面效率較低。
-純度較低的顆粒在吸收萜方面更有效。
-當包封在SAF-MannanTM中時，沒有形成檸檬醛的黃色降解產物。
-根據所測試的單一萜水平的定性裝載，SAF MannanTM似乎最佳，NutreTM第二，而Baker′s第三。
實施例6-萜裝載到不同類型的顆粒中的動力學和不同溫育溫度採用以下方案比較不同類型的酵母顆粒的裝載動力學。
-通過將7g萜和3ml 3.3％Tween-80一起超聲來製備L-香芹酮和檸檬醛乳液。
-通過將1ml 10％Tween-80在10ml水中超聲來製備1％Tween-80溶液。
-通過將5g發麵YP與20ml 1％Tween-80混合來製備發麵YP。
-通過混合2g NutrexTMYGP和20ml 1％Tween-80來製備NutrexTMYGP懸浮液。
-通過混合2g SAF MannanTM和20ml 1％Tween-80來製備SAFMannanTM懸浮液。
如表6中所示進行裝載反應。
在室溫或37℃下將反應物溫育1、3、6、9和24小時。在溫育後，將樣品在14000xg下離心10分鐘，並評價漂浮在水層上的游離萜的外觀。結果示於表6的兩個右手欄中。將由不存在游離萜證明被所述顆粒吸收的萜的最大體積記錄為被吸收的萜乳液的體積。在24小時時評價包封小球的顏色。
表6
白色，W；黃色，Y；極黃，VY；室溫，Rt
從表6中所示的結果和其它觀察可以得到以下結論·萜裝載反應花費1至3小時。
·萜裝載在37℃下比在室溫下更迅速地發生。
·由於兩個原因，SAF MannanTM似乎是更優選的顆粒-更快和更完全地吸收兩種萜。
-在37℃下24小時後，由不存在檸檬醛降解特徵性的黃色證明檸檬醛在裝載時保持穩定。
實施例7-篩選多種單一萜和萜組合的顆粒裝載採用以下方案比較發麵YP與SAF MannanTM的裝載效率。
如下製備萜乳液-L-香芹酮-4.5g L-香芹酮於1.5ml 3.3％Tween-80中。
-檸檬醛-4.5g檸檬醛於1.5ml 3.3％Tween-80中。
-百裡酚/L-香芹酮混合物(T/L)-2.25g百裡酚和2.25g L-香芹酮於1.5ml 3.3％Tween-80中。
-丁子香酚-4.5g丁子香酚於1.5ml 3.3％Tween-80中。
-香葉醇-4.5g香葉醇於1.5ml 3.3％Tween-80中。
-檸檬醛/L-香芹酮/丁子香酚混合物(C/L/E)-1.5g檸檬醛、1.5g L-香芹酮、1.5g丁子香酚於1.5ml 3.3％Tween-80中。
將萜∶水∶表面活性劑比率為0.75∶0.3∶0.05的乳液用於這些實驗中。
如表7和8所示，在室溫下將增加體積的萜乳液與250mg/ml發麵YP或250mg/ml SAF MannanTM混合過夜。將樣品在14000xg下離心10分鐘，並評價漂浮在水層上的游離萜的外觀。將由不存在游離萜證明被發麵YP或SAF MannanTM吸收的萜乳液的最大體積記錄為被吸收的萜乳液的體積。記錄小球中包封萜的顏色。表7和8中的結果顯示，所有單一萜和萜組合都有效地裝載到發麵YP或SAF Mannan顆粒中。
表7-不同萜和萜混合物的發麵YP裝載評價
表8-不同萜和萜混合物的SAF Mannan裝載評價
反轉的＝相反轉-固體漂浮在頂部-不含游離油；W＝白色；Y＝黃色從該結果得到以下觀察-所有萜看來都裝載入發麵YP和SAF Mannan中。
-SAF Mannan的萜裝載容量高於發麵YP的。
-萜的兩和三向混合物看來也被有效地裝載。
-萜丁子香酚的密度看來高於顆粒和水的，因為發現它與小球締合。
-對於SAF Mannan，更高的裝載水平和更輕的顆粒導致在檸檬醛和香葉醇的情況下裝載顆粒漂浮在水層的表面上。
-SAF Mannan保護檸檬醛不被氧化，但發麵YP沒有這種保護。
確定每種顆粒類型的近似最大裝載，並示於下面的表9和10中。裝載百分比表示裝載的萜量與存在的顆粒量的比率(重量比)。
表9-在發麵YP中的最大萜裝載
表10-在SAF Mannan中的最大萜裝載
實施例8-評價在水乳液和包封萜製劑中的萜穩定性通過觀察檸檬醛製劑的黃色氧化產物形成來評價萜穩定性。如表5-8的右手欄中所示，檸檬醛乳液和檸檬醛包封發麵YP隨時間而黃色不斷增加。但是，在SAF MannanTM中包封檸檬醛增加檸檬醛穩定性，這由黃色隨時間減少或不存在黃色證明。
實施例9-在最少量的水中裝載萜進行以下方案評價如下可能性，即可以在極高酵母顆粒(YP)固體水平下將萜裝載和包封到YP中，以允許將裝載製劑直接擠出到流化床乾燥器中。確定完全水化SAF MannanTM顆粒的最小水量為3.53g水/g固體。這定義了所述顆粒的流體力學體積(HV)或水吸收容量。在這樣的水量下，水化顆粒具有硬麵團的稠度，其是觸變性的，即像蛋黃醬一樣剪切稀化。添加水至超過HV 40％導致可流動的稠糊。以3 X HV的水進行以上實施例中所用的標準反應。
進行一系列萜(L-香芹酮)裝載反應，保持顆粒∶萜∶Tween(1∶0.44∶0.04)的比率不變，並將系統中的水量從HV(3.53g)變為HV+40％水(4.92g)。對照是標準裝載系統，其使用3 X HV的水、僅顆粒和僅萜的反應。在溫育過夜後，用顯微鏡評價混合物樣品的游離萜和吸收到所述顆粒中的萜的證據，並通過評價15分鐘內在反轉試管中的流動來評價材料流動性。此外，通過用5 X HV水化反應混合物，渦旋以使顆粒完全分散並離心以沉積顆粒包封的萜，來評價游離油的存在。結果示於表11和圖7至12中。圖7至12顯示以下試管的裝載結果-圖7-試管3-圖8-試管5-圖9-試管6-
圖10-試管8-
圖11-試管10-
圖12-試管11表11
表11和圖7至12中所示的結果證明，在所評價的所有水比率下都發生萜裝載和包封到所述顆粒中。令人驚訝地，即使在使用最小量的水水化所述顆粒的具有硬麵團的稠度的反應物中進行裝載反應，也發生等價的裝載。用顯微鏡觀察到不存在游離萜(圖7至12)，並且萜在上清液中的水平較低，這由所述上清液相對於僅萜對照的顯著稠度降低證明。
這些結果擴展了我們對將萜裝載到中空葡聚糖顆粒中的條件的理解。在裝載過程中可以使用最小體積的水來水化所述顆粒，這種適應性將允許在反應混合物是可延展麵團樣稠度的條件下，使用標準食品級掃描曲面揉面機(swept surface dough mixer)裝載所述萜。裝載著高固體萜的最終混合物的稠度適於直接擠出以形成用於流化床乾燥的麵條和小球。
放大以此方式的生產的合適的設備需要-Gaulin均質器或等價物以產生穩定的萜乳液。
-掃描曲面揉面槽。
-擠出機。
-流化床乾燥器。
實施例10-評價間充水膠體(interstitial hydrocolloid)試劑幫助包封萜成分的乾燥中空葡聚糖顆粒再水化時分散採用以下方案評價間充水膠體增加乾燥中空葡聚糖顆粒包封萜製劑再水化時分散的效果。
-SAF MannanTM顆粒-0.1％Tween 80-L-香芹酮-黃原膠-1％w/v於0.1％Tween 80中。
如表12所示，通過溫育1.1g L-香芹酮乳液(L-香芹酮∶水∶表面活性劑比率為0.75∶0.3∶0.05)與1g SAF Mannan和含有0-1％黃原膠的4.4g 0.1％Tween 80，將L-香芹酮裝載到SAF Mannan中，評價提高黃原膠水平對乾燥中空葡聚糖顆粒包封的L-香芹酮在水中分散的影響。
表12
表12和
圖13至20中的結果證明，在乾燥顆粒包封的萜的過程中包含高分子量水膠體有助於微粒水化和分散成均勻懸浮液。這些水膠體試劑的其它實例是麥芽糖糊精、藻酸鹽等。
還可能值得做的是包括小球包衣以增加裝載的萜的穩定性，並提供萜的持續釋放。
實施例11-評價萜乳液、新鮮發麵YP和SAF Mannan包封的萜和冷凍乾燥的發麵YP和SAF Mannan包封的萜對金黃色葡萄球菌(S.aureus)的最小抑制濃度(MIC)下面的表13顯示為比較新鮮的和冷凍乾燥的中空葡聚糖顆粒包封的萜製劑而實施的方案的結果。還測試了簡單的萜乳液，並顯示結果用於比較。
表13MICμg/ml萜
從以上結果得出的結論是-將萜裝載到中空葡聚糖顆粒中看來提高萜MIC。一般而言，新鮮萜乳液的功效比包封製劑低約4-375倍。
-裝載到SAF MannanTM中的萜表現稍好於裝載到發麵YP中的。
-新鮮裝載的萜組合物表現稍好於冷凍乾燥的組合物(在冷凍乾燥過程中可能會從乾燥組合物中揮發掉一些萜)。
-水乳液中的萜穩定至少3周。
實施例12-中試規模的包封萜對抗金黃色葡萄球菌的功效用中試規模生產的包封萜和混合物對金黃色葡萄球菌進行抗微生物測定。含有新鮮和冷凍乾燥的包封萜樣品的材料都顯示強抗微生物活性。結果總結於下表14中。
以2.5kg規模將萜包封到SAF-MannanTM中。用100g Tween-80和8L水溶解和勻化三種萜(香葉醇275g；丁子香酚385g；和百裡酚，440g)的混合物。添加SAF-MannanTM(2.5Kg)以形成均勻的懸浮液。使所述懸浮液通過Gaulin均質器以減小顆粒尺寸，並將均勻混合物在室溫下溫育過夜。取出包封萜的樣品，並貯存在室溫下。然後在盤中將剩餘的包封萜冷凍並冷凍乾燥。將冷凍乾燥的包封萜粉末研磨並貯存在室溫下。
表14
在中試規模下，以萜重量計，新鮮和冷凍乾燥的樣品具有相等的功效。
基於大規模製備的結果，冷凍乾燥製劑對金黃色葡萄球菌的預期有效劑量為200ppm(所述製劑含有約50重量％的萜)或0.2g/L水。
實施例13-包封萜對抗分枝桿菌的功效如下製備萜乳液-檸檬醛-4.5g檸檬醛於1.5ml 3.3％Tween-80中。
-L-香芹酮/丁子香酚-2.25g L-香芹酮和2.25g丁子香酚於1.5ml3.3％Tween-80中。
-丁子香酚-4.5g丁子香酚於1.5ml 3.3％Tween-80中。
-香葉醇-4.5g香葉醇於1.5ml 3.3％Tween-80中。
-香葉醇/百裡酚混合物-2.25g香葉醇和2.25g百裡酚於1.5ml 3.3％Tween-80中。
-對照乳液-6ml 1％Tween-80。
將SAF-MannanTM(2.5g)與3ml每種乳液和7ml 1％Tween 80混合，並溫育過夜，以包封所述萜和萜混合物。將包封萜製劑冷凍並冷凍乾燥，並將粉末研磨成細粉。測定包封萜的懸浮液(25mg/ml)和未包封萜乳液對抗分支桿菌的抗菌活性。結果列於表15中。
表15
FD＝(冷凍乾燥)實施例14-包封萜的殺線蟲活性根據上述程序製備酵母細胞壁包封的檸檬醛製劑。中空葡聚糖顆粒含有17.5％檸檬醛，並且所述顆粒在測試製劑中的濃度為1000ppm。這意味著萜的有效濃度為175ppm。
將1.0ml測試製劑添加到0.1至0.15ml含有根結線蟲的水中。向所述線蟲中添加1.0水作為對照。
如前所述進行觀察，並且在24和48小時後評價殺傷率(即死亡百分比)。下表16中所示的結果是2批結果的平均值。
表16-包封萜溶液(17.5％檸檬醛，1000ppm)的殺線蟲活性
結果證明，當顆粒濃度為1000ppm(相當於檸檬醛濃度僅為175ppm)時，包封萜的中空葡聚糖顆粒有效地殺死根結線蟲。
因此，包封萜的中空葡聚糖顆粒作為殺線蟲劑看來與溶液中的萜或與表面活性劑一同的萜同樣有效。儘管萜被包封在所述顆粒中，但仍然保留了殺線蟲活性。可以預期，萜在所述中空葡聚糖顆粒中的更高濃度或者所述顆粒的更高濃度會導致甚至更高的殺傷率，就像在溶液中的萜或與表面活性劑一同的萜的情況一樣。
實施例15-包封和未包封萜的殺真菌性質進行以下方案評價各種萜組合的殺真菌性質，並比較包封和未包封組合物的功效。
評價不同萜製劑的殺真菌性質使用微量滴定板測定評價多種萜化合物對抗不同致病微生物的最小抑制濃度(MIC)。下文更詳細地描述用於每種微生物的測定，但重要的一般特徵如下。
測定使用兩個溫育期以區別抑制(static)活性(生長抑制)和殺滅(殺死)活性。第一個溫育期允許評價生長抑制，但不能區別僅僅阻止細胞生長和殺死細胞。第二個溫育期的目的是允許存活於萜暴露的任何休眠或受抑制的細胞有足夠的時間和養分以增殖。被真菌抑制作用抑制的任何細胞都應在第二個溫育期內反應並生長，而被萜暴露殺死的細胞則不會在新鮮培養基中生長。
用總共31種不同的萜製劑進行初始篩選試驗(表17)。用具有強活性的萜製劑子集重複這些試驗(表18)。
還測試了包封在葡聚糖顆粒中的比率為2∶1∶2的香葉醇、丁子香酚和百裡酚萜組合；該樣品稱為YP-GET。還測試了相同比率的未包封香葉醇、丁子香酚和百裡酚組合，用於與包封形式比較。
使用釀酒酵母的MIC測定向96孔微量滴定板的每個孔中添加100μL釀酒酵母等分試樣(5×105個細胞/mL，在YPD生長培養基中)。將每板的至少一欄指定為僅細胞對照，不向這些孔中添加萜。向其餘欄的第一行添加不同萜製劑的等分試樣(100μL)，並通過從一行向下一行轉移100μL來進行系列2倍稀釋，總共7次。最後，為了保證所有孔中含有相同的體積，從最後一行棄去100μL。在30℃下將微量滴定板靜止溫育過夜。
在溫育後，評價板的生長抑制(由缺少濁度證明)。通過顯微鏡視覺證明生長抑制(≥75％)。
一旦確定每種製劑的MIC，就將微量滴定板離心，並且從不混濁的孔中除去用過的培養基。將細胞再懸浮於新鮮培養基(100μL)中，並在30℃下將所述板再溫育過夜。如前進行生長抑制的評價。
使用混合接種物的MIC測定如關於釀酒酵母所述，在96孔微量滴定板中系列稀釋不同的萜製劑。然後將熔化的YPD瓊脂和5μL混合接種物(從發黴的葡萄葉製成濃度為5×104個細胞/mL)一起添加到孔中。將所述板在室溫下靜止溫育24小時，並通過顯微鏡視覺評價孢子生長。
由於使用固體培養基，所以不能進行在新鮮培養基中的第二個溫育期。
使用禾生毛盤孢的MIC測定如關於釀酒酵母所述，在96孔微量滴定板中系列稀釋不同的萜製劑。將禾生毛盤孢(300個孢子/孔)添加到經稀釋的萜中，並將所述板在室溫下靜止溫育48小時。通過顯微鏡視覺評價孢子萌發和生長。
一旦確定每種製劑的MIC，就將微量滴定板離心，並從生長受抑制的孔中除去用過的培養基。將孢子再懸浮於新鮮培養基(100μL)中，並將所述板在室溫下再溫育過夜。如前進行生長抑制的評價。
表17-從31種萜製劑的初始篩選中獲得的MIC和殺真菌MIC值
NT，未測試；YP-GET，酵母包封的GET製劑a除非另有說明，萜組合以1∶1(w/w)的比率混合b按萜含量計算的MIC
表18-重複測定以確定MIC和殺真菌MIC值
NT，未測試；YP-GET，酵母包封的GET製劑說明樣品平行測定兩次。如果兩份樣品獲得不同的值，則報告較高的值。
沒有兩份樣品差別大於一個2倍稀釋a除非另有說明，萜組合以1∶1(w/w)的比率混合b1×104個細胞/mL貯備懸浮液c按萜含量計算的MIC混合接種物使用混合接種物存在許多問題。製劑的孢子含量變化導致測定間的重複性較差，並且汙染微生物的生長妨礙孢子萌發的評價。單細胞酵母種類在掩蓋孢子生長方面特別成問題。雖然不能從該測定獲得精確的數據，但也觀察到了萜的抑制作用。
與初始篩選測定相比，在評價重複測定時鑑別孢子更容易，因為使用了更大量的孢子(約50個孢子/孔相對約10個孢子/孔)。因此，在重複測定過程中獲得的數據可能提供更可靠的MIC評價。
禾生毛盤孢與初始篩選測定相比，從重複測定獲得了通常更高的MIC值，這可能是因為·使用放置1周的萜溶液·使用新鮮製備的孢子，與初始篩選測定中使用的孢子相比，它們具有更高的存活力，因此可能更難殺死。
比較作為游離乳液的萜製劑和包封在中空葡聚糖顆粒中的相同萜製劑釀酒酵母MIC測定向96孔微量滴定板的每個孔中添加YPD生長培養基(100μL)，並向第一行添加不同萜製劑的等分試樣，使該行中的總體積達到200μL。將一欄指定為僅細胞對照，並且不向這些孔中添加萜。通過從一行向下一行轉移100μL來進行系列2倍稀釋，總共7次。最後，為了保證所有的孔中含有相同的體積，從最後一行棄去100μL。然後向每個孔中添加100μL釀酒酵母等分試樣(5×105個細胞/mL，在YPD生長培養基中)，並用微量滴定板計數器測量每個孔在620nm的吸光度(A620)。在30℃下將微量滴定板靜止溫育過夜。
在溫育後，再次測量A620，並評價板的生長抑制(≥75％)。通過顯微鏡視覺證明生長抑制。
對於游離萜乳液，一旦確定了每種製劑的MIC，就將微量滴定板離心，並從生長受抑制的孔中除去用過的培養基。將細胞再懸浮於新鮮培養基(100μL)中，並將所述板在30℃下再溫育過夜。如前進行生長抑制的評價。
MIC和殺真菌MIC結果總結於表19中。
結果表19-從篩選31種萜製劑獲得的對釀酒酵母的MIC和殺真菌MIC值
NT，未測試；YP-GET，酵母包封的GET製劑；YP-ETC，酵母包封的ETC製劑
a除非另有說明，萜組合以1∶1(w/w)的比率混合b除非另有說明，為酵母包封的製劑c按萜含量計算的MICd未包封的乳液製劑對於萜乳液和酵母包封的萜，MIC典型地≤125ppm，其中活性最強的製劑在約60ppm下抑制生長。從萜乳液獲得的MIC值與從它們各自的酵母包封製劑獲得的MIC值相似。當獲得不同的值時，它們僅相差約一個2倍稀釋。
在生長抑制MIC下，許多游離萜乳液都是殺真菌的，其中大多數在高2倍的濃度下顯示殺真菌活性。
這些結果證明，包封在葡聚糖顆粒中的萜至少與未包封形式一樣有效地殺死真菌。此外，所用的包封組合物可能具有降低的功效，因為它們已經在4℃下貯存了45天，並且具有約4重量％的次佳(sub-optimal)萜含量。
確定殺真菌活性的測定包括離心步驟，其通過在孔底部產生細胞小球而試圖分離微生物細胞和生長培養基中的任何殘餘萜。然後將該小球再懸浮於新鮮培養基中，並在無萜存在下溫育第二次。但是，離心步驟不能區分微生物細胞和酵母顆粒，因此當使用酵母包封的萜時，細胞小球還會含有裝載萜的酵母顆粒。結果是，然後酵母顆粒和細菌細胞均被再懸浮於新鮮培養基中。
出於以下原因，認為這種方法學不影響在上述實驗中獲得的結果。
·在前面的實驗中，使用萜乳液而不是裝載萜的酵母顆粒，並且已清楚地顯示了殺真菌活性。
·包封萜通過擴散被釋放，並且在周圍培養基中迅速達到包封萜濃度和釋放萜濃度之間的平衡。因此，在離心和再懸浮於新鮮培養基中後，生長培養基中釋放萜的濃度可能大大低於生長抑制活性所需要的濃度。
·當將殺真菌MIC孔的內容物鋪到固體瓊脂生長培養基上時，沒有生長。當鋪到固體生長培養基上時，任何殘餘的萜擴散通過大體積的瓊脂板導致局部萜濃度太低以至於不引起生長抑制。因此，殺真菌MIC孔的內容物缺少生長必然是因為初始殺真菌活性。相反，當獲得低於殺真菌MIC的MIC並且將MIC孔的內容物鋪到固體瓊脂生長培養基上時，觀察到了生長，表明真菌抑制作用。
實施例16-製備用于田間試驗的包封萜組合物以下方案的目的是將萜組合物包封到中空葡聚糖顆粒中，用於隨後的田間試驗。
材料百裡酚(由Alpha-Gamma Corporation供應)丁子香酚(由Alpha-Gamma Corporation供應)香葉醇(由Alpha-Gamma Corporation供應)1％Tween-80(由Alpha-Gamma Corporation供應)酵母細胞壁顆粒黃原膠酵母細胞壁顆粒以商品名Nutricell MOS 55得自Biorigin(Sao Paolo，Brazil)，並由Acucareira QuatáS.A，Usina Quatá，Quatá-Sao Paolo-Brazil-郵政編碼19780 000生產。所述顆粒是噴霧乾燥的釀酒酵母細胞壁提取物，是淺米色至茶色的自由流動粉末。
方案以下方案適於1Kg顆粒，但可以簡單地放大到更大的生產。
1.製備萜混合物一在玻璃燒瓶中混合375克香葉醇+525克丁子香酚+600克百裡酚並攪拌。
2.通過在2加侖白色桶中混合62克Tween 80和6.2L水來製備6.2L1％Tween 80。混合以形成溶液。
3.將6.2克黃原膠添加到Tween溶液中並攪拌使溶解。
4.通過在白色桶中用polytron混合器混合1.5Kg萜混合物+6.2L 1％Tween 80/0.1％黃原膠來製備萜乳液。
5.添加1000克酵母細胞壁顆粒一用塗料混合器混合以形成均勻的懸浮液。
6.將步驟4的萜乳液添加到所述酵母細胞壁顆粒中，同時混合以形成稀蛋黃醬樣稠度。
7.將萜混合物傾入罐中並溫育過夜。
結果獲得包封在中空葡聚糖顆粒中的香葉醇、丁子香酚和百裡酚，其為糊狀物。通過常規噴霧乾燥技術將所述糊狀物容易地轉化為乾燥粉末。在以下方案中將所述糊狀物稱為「液體」組合物，而所述「粉末」指噴霧乾燥形式。
實施例17-包封萜組合物對霜黴病的田間試驗在葡萄中，霜黴病由真菌葡萄生單軸黴(Plasmopara viticola)引起，其在世界範圍內感染葡萄園，並且在作物產量和葡萄酒質量方面可以引起葡萄種植者的毀滅性損失。該真菌攻擊葡萄樹的果實和所有綠色部分，引起葉子枯萎以及花和漿果腐爛。該病害的表現為葉的上表面上的不規則淺黃色或黃綠色斑點，伴有密集的白-灰、棉花樣真菌生長，其覆蓋葉損傷的下面。漿果也可能被霜黴生長所覆蓋，並且取決於感染時間，可能變成棕色並軟化，或者可能根本不變軟。霜黴病通過風和雨分散孢子而傳播，並且感染需要潮溼的環境。在高溼度的環境中其特別成問題。推薦預防性措施來控制該病害，即早期施用殺真菌劑，然後以恰當的間隔重複施用。已經對一些處理產生了耐藥性，雖然通過輪換使用不同的殺真菌劑可以使耐藥性的發生最小化，但其仍然是個問題。
本試驗的目的是調查作為液體或粉末(噴霧乾燥)製劑供應的實施例16的包封萜製劑(YGP-GET)用於預防葡萄霜黴病的功效。
在Kir-Yianni葡萄園中，在位置20上標出每個覆蓋0.1ha的四個相鄰地塊。
Kir-Yianni是35ha的葡萄園，海拔300m。其在北邊和西邊以混合橡木林為邊界，且南面和東面是果園和葡萄園。
在施用所述萜製劑之前，已經用多種產品處理所有四個地塊。在2004年6月26日，以0.5g/L或2g/L的劑量向所述四個地塊中的兩個噴霧萜粉末製劑(參見圖21中的示意圖)。用常規Bordeaux混料加可溼性硫處理第三個地塊，而剩餘地塊不作處理。在隨後的一周中監測每個地塊中葡萄樹的霜黴病病徵。
在Kir-Yianni葡萄園的位置18上標出每個覆蓋0.1ha的另外四個相鄰地塊。在施用所述萜製劑之前，已經用多種產品處理所有四個地塊。在2004年6月26日，以1g/L或4g/L的劑量向所述四個地塊中的兩塊噴霧萜液體製劑(圖21)(說明1g所述萜液體製劑的體積為1ml)。對於剩餘兩個地塊，一個不作處理，而另一個在2004年6月28日噴霧Mikal_，其是對霜黴病的常規處理。在隨後的一周中監測每個地塊中葡萄樹的霜黴病病徵。
對於兩個位置，都以1200L/ha的比率施用所述萜產品。
記錄葡萄的以下生長階段-發芽，2004年3月26日-開花，2004年6月1日-轉色期(veraison)，2004年8月6日在轉色期前進行研究施用。
2004年生長季節異常遲，並且一直都很潮溼。來自霜黴病的病害壓力極高，灰黴病(botrytis)水平升高，而白粉病壓力適中。粉末和液體YGP-GET製劑都貯存在室溫下。沒有使用特別的貯存條件。
比較產品的細節粉末製劑試驗Bordeaux混料，由Manica Spa，Italy生產，由MoscholiosChemicals SA在希臘包裝；可溼性硫。
液體製劑試驗Mikal_(乙磷鋁50％，滅菌丹25％)，由BayerCropScience生產，由Bayer Hellas SA在希臘分裝。如下施用所述比較產品在發芽前以15g/L的劑量施用一次，然後每年以6.5g/L的劑量再施用兩次。全部三次施用所用的噴霧比率都為1000L/ha。
粉末製劑試驗在2004年6月26日施用Bordeaux混料(2g/L)和可溼性硫(2.2g/L)。
液體製劑試驗在2004年6月28日施用Mikal(3.2g/L)。
視覺檢查葡萄樹的霜黴病症狀。該病害發作的標誌是每片葉子上平均有兩塊油性斑點。認為阻止更多斑點出現的處理提供對抗霜黴病的有效保護。
結果YGP-GET粉末製劑(噴霧乾燥)Bordeaux混合物的常規處理提供對抗霜黴病的良好保護。在對照葡萄樹中觀察到霜黴病的輕微症狀。0.5g/L萜產品濃度沒有提供保護，而2g/L萜產品濃度僅提供稍好於對照的保護。說明因為近期的殺蟲劑處理，在該位置的病害壓力非常低。
在溶解粉末製劑時遇到了困難，因為其非常細，導致在空氣中分散。這可能不利地影響產品的功效。
YGP-GET液體製劑當以4g/L的劑量施用時，該萜產品提供對抗暴露樹冠上的霜黴病的極好保護。1g/L劑量沒有提供保護。在對照地塊中觀察到嚴重的霜黴病症狀。
該液體製劑易於使用，並且具有舒適的氣味。
討論因為霜黴病對作物產量和葡萄酒質量的影響，其可以引起葡萄種植者的毀滅性損失。對該病害的控制集中在預防上，因為一旦發生病害，感染就可以迅速傳播。在噴霧粉末製劑的位置，YGP-GET在較低劑量(0.5g/L)下未表現出功效，而2g/L的劑量不如常規處理有效。在該位置，近期的殺蟲劑施用導致病害壓力低，這可能限制了該萜處理的表觀功效。但是，認為萜產物的劑量低於2g/L是不夠的。
在噴霧液體製劑的位置，4g/L的較高劑量水平提供對暴露樹冠的極好保護。在該位置的過度植物生長導致對外部較新分枝的處理比對生長在樹冠內部的較老分枝更有效。用該萜產品完全覆蓋葉是有用的，因為該處理不是系統的。估計使用該萜處理，比用於常規系統處理的體積增加約30％會獲得良好覆蓋。
結論向葉施用濃度為4g/L的YGP-GET液體製劑高度有效地控制霜黴病。0.5g/L粉末和1g/L液體的較低濃度無效。
實施例18-包封萜組合物對白粉病的田間試驗葡萄的白粉病由真菌葡萄白粉病鉤絲殼黴(Uncinula necator)引起，並且導致葡萄樹生長減慢、果實質量降低和葡萄樹的越冬性降低。在釀酒葡萄中，僅3％的漿果感染水平就可以影響葡萄酒質量。該病害的特徵是葉子上真菌生長的白-灰小斑點，其擴大成白色粉狀被覆。該真菌生長還可以發生在漿果上，漿果可能破裂。與需要溫暖潮溼條件的霜黴病相反，白粉病是較乾燥生長季節中的問題，因為它喜歡潮溼的蔭涼區域但不是多雨的氣候條件。推薦預防性措施以控制白粉病，其中早期施用殺真菌劑，然後以適當的間隔重複使用。
本研究的目的是調查施用YGP-GET組合物預防葡萄中的白粉病的功效。
在Kir-Yianni葡萄園中，在位置18上標出每個覆蓋0.1ha的三個相鄰地塊。在2004年7月19日，以2ml/L的劑量向所述三個地塊中的一個噴霧YGP-GET液體製劑，而一塊不作處理。用Equesion(2.5g/L)、Alliete(0.9g/L)和Punch(0.075mL/L)的常規處理噴霧剩餘地塊(參見圖22)。在隨後的一周中監測每個地塊中葡萄樹的白粉病病徵。
在Kir-Yianni葡萄園的位置20上標出每個覆蓋0.1ha的另外三個相鄰地塊。在2004年7月20日，以2ml/L的劑量向所述三個地塊中的一個噴霧YGP-GET液體製劑，而剩餘兩個地塊不作處理(參見圖22)。在隨後的一周中監測每個地塊中葡萄樹的白粉病病徵。
在兩個位置上，所述地塊以前都已用多種產品處理過，包括預先施用萜產品。
以1200L/ha的比率施用所有的萜處理以保證完全覆蓋。
記錄葡萄的以下生長階段-發芽，2004年3月26日
-開花，2004年6月1日-轉色期，2004年8月6日在轉色期前進行研究施用。
2004年生長季節異常遲，並且一直都很潮溼。來自霜黴病的病害壓力極高，灰黴病水平升高，而白粉病壓力適中。
比較產品的細節在位置20不使用比較產品。下面詳述描述在位置18使用的比較處理。
Punch_(氟矽唑40％)，DuPont。
在2004年7月19日，根據生產商的使用說明，以0.075ml/L的劑量施用Punch，作為白粉病的預防性處理。
附加產品的細節在位置20不使用附加產品。下面詳述描述在位置18使用的附加產品。
Equesion系統(噁唑酮菌22.5％加霜脲氰30％)Alliete(乙磷鋁80％)在2004年7月19日，施用Equesion(2.5g/L)和Alliete(0.9g/L)，作為白粉病的預防性處理。根據生產商的使用說明確定劑量。
該比較產品和附加產品表示綜合病害控制方案中的常規處理。
視覺檢查葡萄樹的白粉病症狀。
結果位置18在對照地塊中約20％的梗和莖為黑色，表明中度感染白粉病。在常規處理地塊和萜處理地塊，所有的莖和梗都是綠色的，表明已經提供了足夠的保護。
位置20在任何地塊中都沒有觀察到白粉病感染的跡象。
附加觀察在生長季節結束時，位置18和20的地塊總的來說顯示比該葡萄園的其餘部分更少的病害壓力。
由於葡萄樹生長減慢、果實質量降低和葡萄樹越冬性降低，白粉病感染引起種植者的重大損失。此外，低至3％的漿果感染水平就可以影響葡萄酒質量。對該病害的控制集中在預防上，因為一旦發生病害，感染就可以迅速傳播。在本研究中，在位置18施用萜產品YGP-GET有效地防止白粉病感染，並且該萜產品表現出的控制水平與所述常規處理提供的控制水平相當。但是，因為不存在白粉病感染，所以來自位置20的結果是不確定的。這種沒有感染可能是因為在該研究之前廣泛施用了殺蟲劑，其導致病害壓力低。
在位置18和20的病害壓力水平較低提示在這些位置較早施用萜處理可能在長期感染控制方面是有益的。
結論YGP-GET有效預防白粉病感染，其控制水平與常規處理提供的控制水平相當。
實施例18-包封萜組合物對白粉病的其它田間試驗該研究旨在進一步研究YGP-GET處理Grimson無核鮮食葡萄中白粉病的功效。
在2004年7月1日施用Cisteine時，由於疏忽而未對Tsigaras葡萄園(在Kir-Yianni葡萄園以南約80km)上的0.1ha小區進行處理。後來這小區中的葡萄樹在葉、莖和葡萄上顯示嚴重的白粉病症狀。在2004年7月12日，以1200 l/ha的比率向該未處理小區噴霧3ml/L YGP-GET液體製劑，並向該葡萄園的其餘部分噴霧比較產品Rogana。在24小時後評價葡萄樹的白粉病症狀。
在高lyre棚架系統中排列葡萄樹。
比較產品的細節Rogana(腈苯唑5％，binocap 16％)，由BASF(BASF Agro Hellas S.A.，Athens，Greece)生產。在2004年7月12日，將Rogana施用到Tsigaras葡萄園，作為白粉病的處理。根據生產商的使用說明確定劑量。
視覺檢查葡萄樹的白粉病症狀。
結果在施用YGP-GET之前，嚴重白粉病的症狀明顯。在施用YGP-GET後僅24小時，白粉病的白花就變成了黑色，表明有效的殺真菌活性。因為此時有效地停止了病害，所以沒有施用進一步的處理。YGP-GET顯示與常規處理相當的功效。
討論在本研究中，使用YGP-GET快速並有效地處理已發生的白粉病感染。在施用後僅24小時，通過施用該萜產品就停止了以前嚴重的白粉病感染，其功效與常規處理相當。
從本研究獲得的初步數據提示，除了顯示預防能力外，YGP-GET還能有效處理已發生的真菌感染。
實施例19-包封萜組合物對白粉病的其它田間試驗背景和基本原理在本試驗中，作為使用有機產品控制白粉病的Tasmanian葡萄園(Frogmore Creek Vineyard，Hathaway Trading Pty Ltd，Box 187，RichmondTAS 7025，Australia)實驗程序的一部分，研究YGP-GET的使用。本研究的目的是調查在有機控制Chardonnay葡萄園的白粉病中，施用YGP-GET的短期功效。
在該試驗中，在2005年2月7日用萜產品YGP-GET處理葡萄樹(Chardonnay品種)或不作處理(對照)。雖然受到以前有機處理的抑制，但試驗前白粉病的嚴重性仍然處於商業上明顯無法接受的水平，並且在6個活性處理小區和6個對照小區中同樣嚴重。作物階段為約E-L 33-34(轉色期前)。
向6個Chardonnay小區噴霧YGP-GET(4mL/L)(液體製劑)，這些小區以前曾用牛奶處理過。用六個Chardonnay小區作為未處理的對照，但它們以前曾用油/乳清處理過。每個小區中葡萄樹的數目典型地為7。
在本方案中所用的YGP-GET組合物的細節在表20中給出。
表20-在本研究中所用的製劑批次
在萜處理前3天和處理後3天評價白粉病的嚴重性。在每個小區中，任意選擇20串葡萄(每個側面(panel side)10串)，並將病害嚴重性評價為被活性黴菌菌落覆蓋的串的面積百分比。不可能做進一步的評價，因為隨後種植者又向整個試驗區域噴霧了硫和基於植物油的噴霧助劑(SynertrolHorti Oil)。
待處理植物的數量/面積測試產品向6個Chardonnay小區(總計約42棵葡萄樹)施用YGP-GET(4mL/L)，這些小區以前用牛奶處理過。
對照不向作為對照的6個Chardonnay小區(總計約42棵葡萄樹)使用處理，但它們以前用油/乳清處理過。
種植方法地塊B2的vitis vinifera(Chardonnay)葡萄樹用弓形藤條垂直投射定位。
種植排列間距行間距2.5m，葡萄樹間距1.25m(行內)，每公頃3200棵葡萄樹。行方向為從北向南。
樹冠密度使用點樣方(point-quadrat)法表徵試驗前Chardonnay葡萄樹的樹冠密度(表21)。在2005年1月13日，在以前用硫處理或未處理的Chardonnay小區內，選擇代表性的樹冠部分進行測量。在每個處理前對6個小區各自進行十次測量(即經硫處理小區總計60次測量，未處理的對照小區總計60次測量)。此外，測量3個直立芽(每個小區)的節點長度和數目。
表21-試驗前Chardonnay葡萄樹的樹冠密度
NA，不適用一般條件與未處理的對照相比，以前用實驗材料處理這些小區抑制白粉病。但是，認為白粉病的水平在商業上是無法接受的，雖然其水平在經牛奶處理和經油/乳清處理小區中是相等的。
施用方法、劑量和方案在2005年2月7日，用連接軟管卷盤和泵的手工噴槍施用YGP-GET處理(4mL/L)，所述泵安在多用途車的平臺上。以1500-1600kPa(200-230psi)的泵壓力推進噴霧，遞送約63mL/秒。使用常規處理的標準噴霧體積(約900L/ha)。
按被活性黴菌菌落覆蓋的葡萄串的面積(％)估計，評價在每個小區中任意選擇的20串(每個側面10串)的白粉病的嚴重性。在2005年2月4日，即施用YGP-GET處理前3天評價病害嚴重性，並且在2005年2月10日，即施用萜後3天再次評價。
用反正弦轉換轉換數據以獲得平均分離。
結果在處理前，在6個要用萜處理的小區中，Chardonnay葡萄串的白粉病平均嚴重性(20.4％)與6個對照小區中的白粉病平均嚴重性(23.2％；表22)相似。基於這些數據的反正弦轉換的統計分析發現，處理前病害的嚴重性沒有顯著性差異(表23)。
但是，在處理後三天，在YGP-GET處理的串上白粉病的平均嚴重性為23.8％，而對照上為37.8％(表22)。這些數據的反正弦轉換顯示萜處理的葡萄串有利地具有統計學顯著性差異，其活性黴菌菌落覆蓋的面積更小(p＝0.058；表23)。
表22.用YGP-GET處理前和處理後Chardonnay串的平均白粉病嚴重性(％)
表23.數據的反正弦轉換後處理的統計分離
討論葡萄樹感染白粉病可能由於對葡萄樹的生長和耐久力以及果實和葡萄酒質量的有害影響而引起種植者的顯著損失。在有機控制的葡萄園中，種植者正在尋找諸如元素硫的處理的替代。
本研究在Tasmania，Australia的有機葡萄園中調查了作為液體製劑的包封萜製劑(4mL/L)在控制白粉病方面的功效。雖然在施用萜前僅3周時已經使用了其它實驗處理，但認為白粉病感染水平在商業上仍然是無法接受的。在用YGP-GET處理Chardonnay葡萄樹後三天，被處理的葡萄上的白粉病的嚴重性就顯著低於未處理對照上的。儘管未處理對照的感染嚴重性在處理前和處理後評價的6天內惡化，但是在經處理的葡萄樹中其保持不變。因此，YGP-GET看來減緩了在處理前已經充分存在孢子化白粉病菌落的葡萄串上病害增加的速率。推測起來，菌落擴張受到抑制，雖然已有菌落在一定程度上仍在繼續形成孢子。不可能進行更長期的功效評價，因為隨後種植者向全部試驗地塊噴霧了硫。
這些鼓舞人心的結果證明了YGP-GET在控制葡萄樹的白粉病方面的功效。
實施例20-包封萜組合物對灰黴病的田間試驗葡萄的灰黴病由灰色葡萄孢(Botrytis cinerea)，一種引起果實產量嚴重損失的常見真菌引起。漿果是主要的感染位置，但該病害也可以感染花和葉。起初，受感染漿果出現軟化和水化，並且在高溼度和溼氣條件下可能被灰色真菌生長所覆蓋。受感染漿果隨時間枯萎和脫落。灰黴病喜歡空氣循環差的潮溼條件，且裂口或受損的漿果對感染的傳播尤其敏感。對灰黴病的控制策略包括在生長季節中促進良好的空氣循環、防止損傷和在合適的時間施用殺真菌劑。
本研究的目的是調查YGP-GET在處理葡萄灰黴病感染方面的功效。
不能用常規農藥處理(在施用Teldor_後3周)於2004年10月中旬Kir-Yianni葡萄園中出現的灰黴病，因為相關的再進入時間限制會阻止計劃的收穫。因此，在該葡萄園的位置7上標出兩個相鄰的0.1ha的小區，並在2004年10月12日，用4mL/L YGP-GET液體製劑處理這些小區中的一個，而另一個不作處理(參見圖23)。在3天後收穫作物，並確定每個小區的受感染漿果的比率(佔總產量的重量百分比)。然後在發酵罐中混合來自經處理和未處理小區的未感染漿果。
在施用所述萜製劑前已經用多種產品處理過位置7，但仍然出現了灰黴病感染。
以1200l/ha的比率向葡萄樹一次施用4ml/L YGP-GET液體製劑。
記錄葡萄的以下生長階段-發芽，2004年3月26日，
-開花，2004年6月1日-轉色期，2004年8月6日-收穫，2004年10月15日本研究施用在收穫前3天進行。
2004年生長季節異常遲，且一直很潮溼。來自霜黴病的病害壓力極高，白粉病壓力適中，而灰黴病水平升高。
此時施用YGP-GET以評價它對抗灰黴病感染的潛在功效，由於收穫前的殺蟲劑時間限制，不能用其它方式處理灰黴病感染。
在施用萜產品前，對位置的視覺評價顯示灰黴病感染的跡象。在收穫後，將漿果陳列在傳送帶上，並且在壓碎前手工分離受感染漿果和未受感染漿果。計算每個小區的受感染漿果的比例，以佔總產量的百分比(重量)表示。
結果在施用YGP-GET前，對該位置的視覺評價顯示灰黴病感染的跡象。在收穫後(施用YGP-GET後3天)，經處理和未處理小區的受感染漿果的比例分別為13％和23％。測試面積不足以評價統計學顯著性；但是，YGP-GET處理明顯減慢了病害的進程。
將來自未處理和經萜處理小區的未受感染漿果混合不影響發酵。
討論對灰黴病的常規處理必須在收穫前3周停止，給作物產量和質量的嚴重損害的發生留下了時間。開發可以施用到收穫時或者與現有產品相比可以持續至接近收穫的處理會導致作物產量和葡萄酒質量的顯著改善，這對種植者將相當有益。在本研究中，在收穫前僅3天用萜產品YGP-GET處理顯著減慢已發生的灰黴病感染的進程，導致在經萜處理小區中受感染漿果的比例低於未處理小區中的。此外，雖然在接近收穫時使用YGP-GET，但將經處理和未處理的葡萄組合不影響發酵。
這些結果提示，YGP-GET有效減少已發生的灰黴病感染的影響，並且可以在接近收穫時使用，而沒有對隨後發酵的有害影響。
實施例21-評價包封萜處理已發生的霜黴病，隨後評價葡萄質量在25/08/04，以1000g/250升的比率施用組合物，進行YGP-GET試驗。
對由於霜黴病而100％感染並遭受嚴重葉損失的Cabernet Sauvignon葡萄園進行噴霧。所有剩餘葉都感染了霜黴病斑點，證據是葉上部有黃色斑點並且葉底部有絨毛生長；霜黴病的典型跡象。許多葉幾乎完全變黃，表明嚴重感染。這種葉損失和感染通常延遲葡萄的成熟，並且在許多情況下葡萄根本不完全成熟到滿足釀酒目的。
偶爾在葡萄樹中觀察到的完全未成熟(即直徑約1cm的深綠色硬漿果，卵形)串表明該葡萄樹可能在轉色期前受到感染，可能是在開花期或更早。早期沒有使用過銅(Bordeaux或鹼式硫酸銅)。該葡萄園在以前收穫時受到嚴重感染，以至於沒有從Cabernet Sauvignon產出作物。去年的葉損失為100％，儘管曾試圖用碳酸氫鉀處理以接觸殺死霜黴病，然後施用Stilbourin作為長期系統保護。
在19/09/04，摘下在本試驗中處理的葡萄並壓碎，對果汁進行以下觀察(表24)表24
這些結果表明，來自經處理葡萄樹的葡萄比來自未處理葡萄樹的葡萄更成熟。對葡萄本身的觀察表明，未處理葡萄平均起來顏色更淺，一些葡萄具有透明的桃色/紫色/綠色，表明葡萄剛剛過轉色期，而經處理的葡萄平均起來為深紫色且不透明，是完全或接近完全成熟的葡萄所典型的。
品嘗這些葡萄顯示，經處理的葡萄具有成熟Cabernet Sauvignon典型的更完全的葡萄味，而未處理的葡萄沒有該完全的葡萄味。未處理的葡萄具有青蘋果的澀味，表明蘋果酸/酒石酸比率可能較高，不適於優良的釀酒。
將這些葡萄壓碎並去莖，準備從這些葡萄製造葡萄酒，以證明這些葡萄的差異，並證明經處理的葡萄對於釀酒的適合性。葡萄種植者擔心這種處理會影響葡萄酒的風味，但按照我的建議，他在施用YGP-GET後的那天品嘗了經處理的葡萄，並且沒有發現殘存的味道或氣味。
果汁的顏色進一步證明了經處理和未處理葡萄的差異。未處理葡萄的汁是淺綠色/無色的(有些像白葡萄酒果汁)，而來自經處理葡萄的果汁是成熟Cabernet Sauvignon葡萄剛壓碎後典型的桃色。這些結果表明，通過殺死和停止霜黴病再感染，YGP-GET至少在短期內在夏季後期葡萄園處理中有效。
進一步研究YGP-GET在控制霜黴病方面的長期功效會是有用的，但所得結果顯示YGP-GET是有用的處理。
晚期發作霜黴病可以完全摧毀作物，並且目前沒有能在收穫前短期施用並保持其能力以提供保護的有效處理。YGP-GET的顯著功效是提供快速殺死，並且與其它接觸殺真菌劑相比在更長時間內保持這種功效的能力。
在該市場中有許多抗真菌劑，它們具有對抗霜黴病的確定跟蹤記錄，但是它們在施用後都需要一些時間才能收穫作物。如果溫度升至高於85_，則不能使用一些處理(像含硫產品)。含銅殺真菌劑的植物毒性還主要取決於葡萄的品種。接觸殺真菌劑沒有長期作用，所以通常需要第二次施用更長效的殺真菌劑，但其可能受有關規章(例如PHI或REI)的限制。
用於霜黴病的許多常規處理具有再進入限制(REI和/或PHI)，這意味著種植者不能施用這些處理，因為害怕他將施用一些像PHI為66天的代森錳鋅的農藥；那麼種植者就不能在最成熟的時候收穫他的葡萄。
認為霜黴病是密西西比以東產出許多差葡萄酒的主要原因。在這個迅速成長的行業中，YGP-GET可以允許受到影響的葡萄適當地成熟，並在最成熟的時候被摘下。
有利地，YGP-GET應該符合各種「有機」委員會(許多是自己指定的)批准這種產品適用於在「有機」原則下栽培的葡萄的標準。這在美國和全世界快速成長的市場份額中打開了另一個適當的位置。
實施例22-體外評價包封和未包封萜的殺真菌性質進行了進一步的測試以評價實施例15中所述的31種未包封萜製劑和葡聚糖顆粒包封的製劑16和22。
為了進行這些測定，將20000個孢子放在1/3濃度的馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)中，並添加足量的所選萜製劑以得到10至1000ppm的濃度。將這些測試材料放在含灰色葡萄孢(B.c.)孢子的分離無菌加蓋微量離心管中，溫育24小時，然後通過離心回收所述孢子，並棄去萜溶液。用無菌水漂洗孢子/生物質，再次離心，然後吸收回300μl 1/3濃度的PDB中，並轉移到96孔板中。隨時間測量長成菌絲體的存活孢子的光密度。將殺真菌活性定義為在24小時萜暴露後殺死全部20000個孢子，這由不存在菌絲體生長證明。
結果提示，在目前的測試條件下，某些製劑沒有統計學顯著水平的殺真菌性(結果未顯示)。這些製劑為1、2、4、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、19、20、21、23、24、25、27、28、29、30。關於組合物的細節，參考實施例15(表17)。
在表26中列出了最有效化合物的最小抑制濃度。
表25
*在不同的測試中，沒有生長的最低濃度為500或750ppm化合物在水中和包封在中空葡聚糖顆粒中的對比測試根據前面描述的技術製備包封在中空葡聚糖顆粒中的製劑16(香葉醇、丁子香酚和百裡酚)和22(丁子香酚、百裡酚和檸檬醛)的樣品。然後使用前面關於未包封製劑所述的方案評價包封和未包封製劑的殺真菌性質。
與懸浮在水中的萜相比，包封萜製劑的結果非常不同，如圖24所示。
最小有效濃度示於下表26中。
表26
因此，材料16和22當在水懸浮液中時和當包封在葡聚糖顆粒中時的結果非常不同。(說明如後面所述，懸浮在水中的萜的結果有些可變性，上述實驗是其實例)。MIC值是來自幾個試驗的複合。重要地，包封萜製劑的結果沒有遇到與萜水懸浮液相關的可變性的問題。對懸浮在水中的萜進行五個分離的測試，對YP進行三個分離的測試。
包封萜製劑容易地與水混合，並使萜製劑緩慢釋放到水介質中。這導致孢子更長時問地暴露於所述萜。
遇到了監測未包封萜製劑在測試介質中的懸浮的問題，這可能影響了這方面的結果。
權利要求
1.組合物，其包含包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒。
2.權利要求1的組合物，其中所述中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒是真菌細胞壁。
3.權利要求2的組合物，其中所述中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒是酵母細胞壁。
4.權利要求3的組合物，其中所述酵母細胞壁來自發麵酵母細胞。
5.前述權利要求之任一項的組合物，其中所述中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒是來自酵母抽提物製備過程的不溶性廢產物。
6.前述權利要求之任一項的組合物，其中所述中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒已經過鹼提取。
7.前述權利要求之任一項的組合物，其中所述中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒已經過酸提取。
8.前述權利要求之任一項的組合物，其中所述中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒已經過有機溶劑提取。
9.前述權利要求之任一項的組合物，其中所述中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒的脂質含量為1％或更高。
10.權利要求9的組合物，其中所述中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒的脂質含量為5重量％或更高。
11.權利要求10的組合物，其中所述脂質含量為10重量％或更高。
12.前述權利要求之任一項的組合物，其中所述萜成分包含選自以下的一種或多種萜檸檬醛、蒎烯、橙花醇、b-紫羅酮、香葉醇、香芹酚、丁子香酚、香芹酮(例如L-香芹酮)、terpeniol、茴香腦、樟腦、薄荷醇、百裡酚、薴烯、橙花叔醇、法呢醇、植醇、胡蘿蔔素(維生素A1)、角鯊烯、百裡酚、生育三烯酚、紫蘇子醇、冰片、月桂烯、simene、蒈烯、terpenene、裡哪醇或其混合物。
13.前述權利要求之任一項的組合物，其中所述萜成分包含具有通式結構C10H16的萜。
14.前述權利要求之任一項的組合物，其中所述萜成分包含選自香葉醇、百裡酚、檸檬醛、香芹酮(例如L-香芹酮)、丁子香酚、b-紫羅酮或其混合物的一種或多種萜。
15.前述權利要求之任一項的組合物，其中所述萜成分包含香葉醇、百裡酚和丁子香酚的混合物。
16.權利要求14的組合物，其中所述萜成分包含100％百裡酚。
17.權利要求14的組合物，其中所述萜成分包含50重量％香葉醇和50重量％百裡酚。
18.權利要求14的組合物，其中所述萜成分包含50重量％丁子香酚0和50重量％百裡酚。
19.權利要求14的組合物，其中所述萜成分包含33重量％香葉醇、33重量％丁子香酚和33重量％百裡酚。
20.權利要求14的組合物，其中所述萜成分包含33重量％丁子香酚、33重量％百裡酚和33重量％檸檬醛。
21.權利要求14的組合物，其中所述萜成分包含25重量％香葉醇、25重量％丁子香酚、25重量％百裡酚和25重量％檸檬醛。
22.權利要求14的組合物，其中所述萜成分包含20重量％香葉醇、20重量％丁子香酚、20重量％檸檬醛、20重量％百裡酚和20重量％L-香芹酮。
23.前述權利要求之任一項的組合物，其中所述萜成分與表面活性劑組合。
24.前述權利要求之任一項的組合物，其中所述表面活性劑選自十二烷基硫酸鈉、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚甘油酯、聚甘油一油酸酯、十甘油一辛酸酯、丙二醇二辛酸酯、三甘油一硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯、Tween_、Span_20、Span_40、Span_60、Span_80、Brig30或其兩種或多種的混合物。
25.前述權利要求之任一項的組合物，其包含1至99體積％萜、0至99體積％表面活性劑和1至99體積％中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒。
26.權利要求25的組合物，其包含約10至約67重量％萜、約0.1至約10重量％表面活性劑和約40至約90重量％中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒。
27.前述權利要求之任一項的組合物，其適於殺死細菌或真菌。
28.前述權利要求之任一項的組合物，其適於殺死黴菌。
29.前述權利要求之任一項的組合物，其適於殺死支原體。
30.前述權利要求之任一項的組合物，其中所用的萜是食品級的。
31.前述權利要求之任一項的組合物，其包含額外的食品級活性化合物。
32.權利要求31的組合物，其中所述額外的食品級活性化合物為抗微生物劑或酶。
33.前述權利要求之任一項的組合物，其包含抗微生物劑、抗真菌劑、殺蟲劑、抗炎藥或麻醉劑。
34.前述權利要求之任一項的組合物，其還包含抗氧化劑。
35.權利要求34的組合物，其中所述抗氧化劑為迷迭香油、維生素C或維生素E。
36.前述權利要求之任一項的組合物，其為乾粉形式。
37.權利要求1至35之任一項的組合物，其為小球、片劑或其它固體形式。
38.前述權利要求之任一項的組合物，其包含分散劑，當將所述組合物放入液體中時，所述分散劑促進所述組合物的分散。
39.前述權利要求之任一項的組合物，其與液體、固體或凝膠樣形式的農學、食品或藥學可接受的載體或賦形劑組合。
40.權利要求1至35之任一項的組合物，其懸浮或溶解在液體中。
41.權利要求40的組合物，其中所述液體為水。
42.權利要求40或41的組合物，其包含約500至約10000ppm中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒，其中所述顆粒含有約1至約67％萜成分。
43.權利要求42的組合物，其包含約1000至約2000ppm中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒，其中所述顆粒含有約10至約50重量％萜成分。
44.權利要求40至43之任一項的組合物，其包含約1ppm至約25ppt萜成分。
45.權利要求44的組合物，其包含約100至約1000ppm萜成分。
46.權利要求1至39之任一項的組合物，其分散在水、鹽水、右旋糖水溶液、甘油或乙醇中，形成溶液或懸浮液。
47.前述權利要求之任一項的組合物，其包含潤溼劑、乳化劑或pH緩衝劑。
48.前述權利要求之任一項的組合物，其分散在人或動物液體食品或飲料中。
49.前述權利要求之任一項的組合物，其為適於口服給予的形式。
50.權利要求1至46之任一項的組合物，其為適於腸胃外給予的形式。
51.權利要求1至46之任一項的組合物，其為適於局部給予的形式。
52.包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒的製備方法，所述方法包括以下步驟a)提供萜成分；b)提供中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒；c)在適合萜包封的條件下，將所述萜成分與所述葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒一起溫育；和d)回收包封所述萜成分的所述葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒。
53.權利要求52的方法，其還包括乾燥包封所述萜成分的所述葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒的步驟。
54.權利要求53的方法，其中通過冷凍乾燥、流化床乾燥、轉鼓式乾燥或噴霧乾燥來實現乾燥。
55.權利要求52至54之任一項的方法，其中在步驟a)中提供的萜成分為在含水溶劑中的懸浮液。
56.權利要求55的方法，其中將萜成分與表面活性劑組合提供。
57.權利要求56的方法，其中所述表面活性劑為聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯，其濃度為總反應混合物的約0.1至10體積％。
58.權利要求52至54之任一項的方法，其中在步驟a)中提供的萜成分為在含水溶劑中的真溶液。
59.權利要求52至58之任一項的方法，其中在步驟b)中提供的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒為在水或其它合適液體中的懸浮液。
60.權利要求59的方法，其中每毫升所述懸浮液包含約1至1000mg葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒。
61.權利要求59的方法，其中所述顆粒分散在流體力學體積(HV)至1.5HV液體的體積中。
62.權利要求52至58之任一項的方法，其中在步驟b)中提供的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒為乾粉。
63.權利要求52至62之任一項的方法，其中在步驟c)中反應在大氣壓和約20至37℃的溫度下進行。
64.殺死微生物的方法，所述方法包括以下步驟-使所述微生物與包含包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒的組合物接觸。
65.治療或預防植物感染的方法，所述方法包括以下步驟-將治療有效劑量的包含包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒的組合物給予所述植物或所述植物附近的土壤。
66.權利要求65的方法，其中所述植物感染由線蟲引起。
67.權利要求65的方法，其中所述植物感染由真菌引起。
68.權利要求67的方法，其中所述真菌為霜黴病、白粉病或灰黴病。
69.權利要求65至68之任一項的方法，其中所述植物為葡萄樹。
70.權利要求65至69之任一項的方法，其中在從所述植物收穫作物前21天或更短的時間給予所述組合物。
71.權利要求70的方法，其中在收穫前14天或更短的時間給予所述組合物。
72.權利要求71的方法，其中在收穫前7天或更短的時間給予所述組合物。
73.權利要求72的方法，其中在收穫前3天或更短的時間給予所述組合物。
74.權利要求65至73之任一項的方法，其中通過噴霧施用所述組合物。
75.權利要求74的方法，其中以500L/Ha或更高的比率噴霧所述組合物。
76.權利要求75的方法，其中以900L/Ha或更高的比率噴霧所述組合物。
77.權利要求76的方法，其中以1200L/Ha或更高的比率噴霧所述組合物。
78.權利要求65至73之任一項的方法，其中通過灌溉給予所述組合物。
79.本發明還提供預防或治療患者的感染的方法，所述方法包括以下步驟-給予所述患者治療有效劑量的包含包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒的組合物。
80.權利要求79的方法，其中所述患者的感染由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、煙麴黴(Aspergillius fumigatus)、衣阿華支原體(Mycoplasma iowae)、青黴(Penicillium sp.)或肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae)引起。
81.權利要求80的方法，其中通過口服、陰道、直腸、吸入、局部或胃腸外途徑給予所述組合物。
82.包含包封萜成分的中空葡聚糖顆粒的組合物，其用於預防或治療患者或植物的感染。
83.包封萜成分的中空葡聚糖顆粒在製備用於治療患者的感染的藥物中的用途。
84.權利要求83的用途，其中所述感染由煙麴黴、Sclerotintahomeocarpa、茄屬絲核菌(Rhizoctonia solani)、禾生毛盤孢(Colletotrichumgraminicola)或青黴引起。
全文摘要
本發明涉及包含包封萜成分的中空葡聚糖顆粒或細胞壁顆粒的組合物、它們的製備方法和它們的用途。所述組合物適於預防和治療植物和包括人在內的動物的感染。
文檔編號A01N35/06GK1997446SQ200580024514
公開日2007年7月11日 申請日期2005年5月20日 優先權日2004年5月20日
發明者蘭妮·富蘭克林, 加裡·奧斯特羅夫 申請人:伊頓研究有限公司