具有細胞滲透性的BCL‑XL抑制劑的抗體藥物綴合物的製作方法

2023-06-04 06:45:31

1.發明領域

本公開涉及抑制bcl-xl抗凋亡蛋白的活性的化合物、含有這些抑制劑的抗體藥物綴合物、用於合成這些抑制劑和抗體藥物綴合物的方法、含有這些抑制劑和抗體藥物綴合物的組合物以及治療其中抗凋亡bcl-xl蛋白被表達的疾病的方法。

2.背景

細胞程序死亡被認為是所有活物種的組織動態平衡的主要生化過程。尤其是在哺乳動物中，已經表明它可調節早期胚胎發育。在生命的後期，細胞死亡是除去潛在危險細胞(例如，攜帶癌性缺陷的細胞)的默認機構。已經發現了一些凋亡途徑，一個最重要的途徑與蛋白的bcl-2家族有關，其是細胞程序死亡的線粒體(還稱為「固有的」)途徑的關鍵調節劑。參見danial&korsmeyer,2004,cell116:205-219。

凋亡途徑失調涉及許多重要疾病的病變，例如，神經變性病症(細胞程序死亡上調)，例如，阿爾茨海默氏病；和增殖疾病(細胞程序死亡下調)，例如，癌症、自身免疫疾病和促血栓形成的病症。

在一方面，下調的細胞程序死亡(且更尤其是蛋白的bcl-2家族)與癌性惡性腫瘤的發病有關的密切關係已經表明了靶向這種疑難病的新方法。研究已經表明，例如，抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-xl在許多癌細胞類型中過度表達。參見，zhang,2002,naturereviews/drugdiscovery1:101；kirkin等人，2004,biochimicabiophysicaacta1644:229-249；以及amundson等人，2000,cancerresearch60:6101-6110。這種失調的結果是被改變的細胞的存活，這在正常情況下將會另外進行細胞程序死亡。與未調節的增殖有關的這些缺陷的重複，被認為是癌性演變的起點。

這些發現以及許多其它發現，使得在靶向癌症的藥物研發中，可能出現新的策略。如果小分子能夠進入細胞，並且克服抗凋亡蛋白的過度表達，則它可能重新設定凋亡過程。這種策略的好處是，它可以減輕耐藥性的問題，這種問題通常是凋亡失調(異常存活)的結果。

研究人員還已經證明，為了通過固有的凋亡途徑來執行編程性細胞死亡，血小板也含有必要的凋亡機構(例如，bax、bak、bcl-xl、bcl-2、細胞色素c、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-3和apaf-1)。雖然循環血小板產生是正常生理過程，但過量的血小板或血小板的非所要求的活化導致或加重許多疾病。以上說明，能夠在哺乳動物中抑制血小板中的抗凋亡蛋白和減少血小板數量的治療劑，可以用於治療促血栓形成病症和以過量的血小板或血小板的非所要求的活化為特徵的疾病。

已經研發了許多bcl-xl抑制劑，用於治療與凋亡途徑失調有關的疾病(例如，癌症)。然而，bcl-xl抑制劑可以作用於除了靶細胞(例如，癌細胞)以外的細胞。例如，臨床前研究表明，bcl-xl的藥理學失活降低血小板半衰期，並且引起血小板減少(參見mason等人，2007,cell128:1173-1186)。

由於bcl-xl在調節細胞程序死亡中的重要性，所以，本領域還需要選擇性地或非選擇性地抑制bcl-xl活性的藥劑，作為治療其中細胞程序死亡的失調通過抗凋亡bcl-2家族蛋白(例如，bcl-xl)表達或過度表達的疾病的途徑。相應地，需要劑量限制性毒性降低的新的bcl-xl抑制劑。

另外，還需要遞送限制毒性的bcl-xl抑制劑的新方法。將藥物遞送到細胞中的一個可能的方法是通過使用抗體藥物綴合物(adc)來遞送藥物，這對於bcl-xl抑制劑來說，還沒有進行探索。通過連接子，將細胞毒類藥物與單克隆抗體進行化學連接，形成adc。adc的單克隆抗體選擇性地與細胞(例如，癌細胞)的靶點抗原結合，並將藥物釋放到細胞中。adc具有治療潛力，這是由於它們將抗體的特異性和藥物的細胞毒素潛力結合在一起。儘管如此，到目前為止，由於各種因素，例如，不利的毒性特性、低的效果和差的藥理學參數，因此研發adc作為治療劑的成果很有限。相應地，研發能夠克服這些問題並且可以選擇性地將bcl-xl遞送到靶向癌細胞中的新的adc，將成為有重大意義的發現。

3.概述

現在已經發現，當給藥形式是與細胞表面上表達的抗原結合的抗體藥物綴合物(adc；也稱為免疫綴合物)形式時，bcl-xl的小分子抑制劑是有效的，其中抑制bcl-xl和後續的誘導細胞程序死亡是有益的。這個發現首次提供了對於感興趣的具體細胞和/或組織的靶向bcl-xl抑制治療、潛在地降低了達到目標治療益處所必需的血清水平和/或避免和/或改善了與全身性給予小分子bcl-xl抑制劑本身有關的潛在副作用。

相應地，在一方面，本公開提供了包含bcl-xl抑制劑的adc，尤其可用於抑制抗凋亡的bcl-xl蛋白，作為治療與細胞程序死亡途徑失調有關的疾病(例如，癌症)的治療途徑。adc通常包含bcl-xl的小分子抑制劑(本文稱為bcl-xl抑制劑)，它通過連接子與抗體連接，所述抗體特異性地結合感興趣的靶細胞上表達的抗原。

adc的抗體可以是通常(但不一定是特異性)與感興趣的靶細胞的表面上表達的抗原結合的任何抗體。感興趣的靶細胞通常包括：需要通過抑制抗凋亡bcl-xl蛋白來誘導細胞程序死亡的細胞，包括，例如(沒有限制性)，表達或過度表達bcl-xl的腫瘤細胞。靶點抗原可以是感興趣的靶細胞上表達的任何蛋白，但通常是在靶細胞上獨特表達並且在正常或健康細胞上沒有表達的蛋白；或與正常或健康細胞相比較，在靶細胞上過度表達的蛋白，以便adc選擇性地靶向感興趣的具體細胞，例如，腫瘤細胞。正如本領域所公認的那樣，與內化所結合的adc的某些細胞表面抗原結合的adc具有某些優越性。相應地，在一些實施方案中，抗體靶向的抗原是能夠使其結合的adc內化的抗原。然而，adc靶向的抗原無需是使結合的adc內化的抗原。在靶細胞或組織外部釋放的bcl-xl抑制劑可以通過被動擴散或其它機制進入細胞，抑制bcl-xl。

本領域技術人員會理解，具體抗原以及由此選擇的抗體取決於感興趣的目標靶細胞的特徵。在某些具體治療實施方案中，adc的抗體的靶點抗原是在已知的正常或健康細胞類型上沒有表達的抗原，或被懷疑至少部分地依賴於bcl-xl存活的抗原。在其它某些具體治療實施方案中，adc的抗體是適合於給予人類的抗體。

用作治療靶點的種類繁多的細胞特異性抗原，以及結合這些抗原的抗體是本領域已知的，獲得適合於靶向已知的細胞特異性抗原的其它抗體的技術或後來發現的細胞特異性抗原也是本領域已知的。這些不同抗體中的任何抗體可以包括在本文描述的adc中。

在性質上，連接adc的bcl-xl抑制劑與抗體的連接子可以是長的、短的、柔性、剛性、疏水性或親水性的連接子，或可以包含不同特徵的片段，例如，柔性片段、剛性片段等等。連接子可以是對於胞外環境化學上穩定的連接子，例如，在血流中化學穩定，或可以包括在胞外環境中不穩定並且釋放bcl-xl抑制劑的連接基。在一些實施方案中，連接子包括被設計為adc在細胞中內化之時釋放bcl-xl抑制劑的連接基。在一些具體實施方案中，連接子包括被設計為在細胞內部特異性或非特異性斷裂和/或裂解或分解的連接基。在adc背景下用於連接藥物與抗體的多種連接子在本領域是已知的。這些連接子中的任何連接子以及其它連接子，可以用於連接本文描述的adc中的bcl-xl抑制劑與抗體。

與adc的抗體連接的bcl-xl抑制劑的數量可以變化(稱為「藥物對抗體比例」或「dar」)，並且僅僅受到抗體上的可供的連接位點的數量以及與單一連接子連接的抑制劑的數量的限制。通常，連接子連接單一bcl-xl抑制劑與adc的抗體。在使用和/或儲存條件下，只要adc沒有顯示出不能接受的聚集水平，考慮包括dar為20或dar更高的adc。在一些實施方案中，本文描述的adc可以具有大約1-10、1-8、1-6或1-4範圍內的dar。在某些具體實施方案中，adc可以具有2、3或4的dar。在一些實施方案中，選擇bcl-xl抑制劑、連接子和dar的組合，使得所得到的adc在使用和/或儲存條件下不會過度聚集。

含有本文所描述的adc的bcl-xl抑制劑通常是按照下面結構式(iia)的化合物，和/或其可藥用鹽，其中各個取代基ar、z1、z2、r1、r2、r4、r10a、r10b、r10c、r11a、r11b和n如詳細說明部分所定義∶

在式(iia)中，#代表與連接子的連接點。在不是adc部分的抑制劑中，#代表氫原子。

在一些實施方案中，本文所描述的adc通常是按照結構式(i)的化合物∶

其中，ab代表抗體，d代表藥物(本文中，代表bcl-xl抑制劑)，l代表連接藥物d與抗體ab的連接子，lk代表在連接子l上的官能團和抗體ab上的互補官能團之間形成的連接基，和m代表連接到抗體上的連接子-藥物單元的數目。

在某些具體實施方案中，adc是按照下面結構式(ia)的化合物，其中各個取代基ar、z1、z2、r1、r2、r4、r10a、r10b、r10c、r11a、r11b和n分別如先前式(iia)所定義，ab和l如結構式(i)所定義，m是1至20的整數，和在一些實施方案中，m是2至8的整數，和在一些實施方案中，m是1至8的整數，和在一些實施方案中，m是2、3或4∶

。

在另一個方面，本公開提供了用於合成本文所描述的adc的中間體合成子，以及合成adc的方法。所述中間體合成子通常包含與連接子部分連接的bcl-xl抑制劑，所述連接子部分包括能夠連接合成子與抗體的官能團。合成子通常是按照下面結構式(iii)的化合物，或其鹽，其中d是本文先前所描述的bcl-xl抑制劑，l是先前所描述的連接子，rx含有能夠使合成子與抗體上的互補官能團綴合的官能團∶。

在某些具體實施方案中，中間體合成子是按照下面結構式(iiia)的化合物，或其鹽，其中，各個取代基ar、z1、z2、r1、r2、r4、r10a、r10b、r10c、r11a、r11b和n如先前結構式(iia)所定義，rx含有上述官能團∶

。

為了合成adc，在官能團rx與抗體上的互補官能團反應形成共價鍵的條件下，使按照結構式(iii)或(iiia)-(iiid)的中間體合成子或其鹽與感興趣的抗體接觸。基團rx的特徵取決於目標偶合化學，以及合成子連接的抗體上的互補基團。適合於將分子與抗體結合的許多基團在本領域是已知的。這些基團中的任何基團可以適合於rx。非限制性的示例性官能團(rx)包括nhs-酯、馬來醯亞胺、滷代乙醯基、異硫氰酸酯、乙烯基碸和乙烯基磺醯胺。

在另一個方面，本公開提供了包括本文所描述的adc的組合物。所述組合物通常包含一或多種本文所描述的adc和/或其鹽，以及一或多種賦形劑、載體或稀釋劑。可以將所述組合物配製為用於藥物用途，或其它用途。在一個具體實施方案中，將所述組合物配製為用於藥物用途，並且含有按照結構式(ia)的adc或其可藥用鹽，以及一或多種可藥用賦形劑、載體或稀釋劑。

配製為用於藥物用途組合物可以是適合於多次給藥的散裝形式，或可以是適合於單一給藥的單位劑量包裝形式。無論是散裝或單位劑量形式，所述組合物可以是乾燥組合物，例如冷凍乾燥物，或液體組合物。可以將單位劑量液體組合物方便地包裝為預先充滿適合於單次給藥數量的adc的注射器形式。

在另一個方面，本公開提供了抑制抗凋亡bcl-xl蛋白的方法。所述方法通常包括：在抗體結合靶細胞上的抗原的條件下，使本文所描述的adc，例如，按照結構式(ia)的adc，與表達或超表達bcl-xl的靶細胞以及adc的抗體的抗原接觸。取決於抗原，adc可以被內化於靶細胞中。可以在抑制bcl-xl活性的細胞試驗中體外進行所述方法，或作為治療其中需要抑制bcl-xl活性的疾病的治療途徑來體內進行。

在另一個方面，本公開提供了在細胞中誘導細胞程序死亡的方法。所述方法通常包括：在抗體結合靶細胞上的抗原的條件下，使本文所描述的adc，例如，按照結構式(ia)的adc，或其鹽，與表達或超表達bcl-xl的靶細胞以及adc的抗體的抗原接觸。取決於抗原，adc可以被內化於靶細胞中。可以在誘導細胞程序死亡的細胞試驗中體外進行所述方法，或作為治療疾病的治療途徑來體內進行，其中，在具體細胞中誘導細胞程序死亡有益於治療所述疾病。在一個實施方案中，本文所描述的adc的抗體結合腫瘤細胞上表達的細胞表面受體或腫瘤相關抗原。在另一個實施方案中，本文所描述的adc的抗體結合選自egfr、epcam和ncam1的細胞表面受體或腫瘤相關抗原中的一種。在另一個實施方案中，本文所描述的adc的抗體結合egfr、epcam或ncam1。在另一個實施方案中，本文所描述的adc的抗體結合epcam或ncam1。在另一個實施方案中，本文所描述的adc的抗體結合epcam。在另一個實施方案中，本文所描述的adc的抗體結合ncam1。在另一個實施方案中，本文所描述的adc的抗體結合egfr。

在又一個方面，本公開提供了治療疾病的方法，在所述疾病中，需要抑制bcl-xl和/或誘導細胞程序死亡。正如在詳細說明部分中更充分討論的那樣，多種疾病至少部分地由失調的細胞程序死亡所介導、至少部分地由抗凋亡bcl-xl蛋白的表達和/或超表達所介導。可以用本文所描述的adc來治療或改善這些疾病中的任何疾病。

所述方法包括：給予患有至少部分地由bcl-xl的表達或超表達所介導的疾病的患者能夠有效提供治療益處數量的adc。所給予的adc的抗體的特徵取決於所治療的疾病。本文所描述的adc獲得的治療益處也取決於所治療的疾病。在某些情況下，當以單一療法給予時，adc可以治療或改善具體疾病。在其它情況下，adc可以是整個治療方案的一部分，所述治療方案包括其它藥劑，以及adc，用於治療或改善疾病。

例如，bcl-xl的表達水平升高，與癌症中的化學療法和放射療法的耐受性有關(datta等人，1995,cellgrowthdiffer6:363-370；amundson等人，2000,cancerres60:6101-6110；haura等人，2004,clinlungcancer6:113-122)。在治療癌症的背景下，本文公開的數據證明，adc可以有效作為單一療法，或當輔助其它靶向或非靶向的化學治療劑和/或放射治療給予或與它們一起給予時，adc也是有效的。儘管不受任何工作原理束縛，但人們相信，在對於靶向或非靶向化學和/或放射治療具有耐受性的腫瘤中，用本文所描述的adc抑制bcl-xl活性，可以使腫瘤「敏感」，這樣就可以使腫瘤再次對化學治療劑和/或放射療法敏感。

相應地，在治療癌症的背景下，「治療益處」包括給予還沒有開始化學和/或放射療法治療方案或對於化學和/或放射療法治療方案顯示出耐受性(或懷疑或變得耐受性)的患者本文所描述的adc作為靶向或非靶向化學治療劑和/或放射治療的輔助治療，或與它們一起給予所述患者，作為使腫瘤對於化學和/或放射治療敏感的方法。一個實施方案涉及使腫瘤對於標準細胞毒素藥劑和/或放射療法敏感的方法，所述方法包括：使腫瘤與有效使腫瘤細胞對於標準細胞毒素藥劑和/或放射療法敏感數量的、能夠結合腫瘤的本文所描述的adc接觸。另一個實施方案涉及使腫瘤對於標準細胞毒素藥劑和/或放射療法敏感的方法，所述方法包括：使腫瘤與有效使腫瘤細胞對於標準細胞毒素藥劑和/或放射療法敏感數量的、能夠結合腫瘤的本文所描述的adc接觸，其中，腫瘤對於標準細胞毒素藥劑和/或放射療法變得耐受。另一個實施方案涉及使腫瘤對於標準細胞毒素藥劑和/或放射療法敏感的方法，所述方法包括：使腫瘤與有效使腫瘤細胞對於標準細胞毒素藥劑和/或放射療法敏感數量的、能夠結合腫瘤的本文所描述的adc接觸，其中，腫瘤以前沒有接觸過標準細胞毒素藥劑和/或放射治療。

4.附圖的簡要說明

圖1描述了用靶向egfr的bcl-xl抑制性adc(bcl-xliadc)或與多西他賽(dtx)聯用藥治療之後的h1650異種移植腫瘤生長的抑制。

圖2描述了用各種劑量的靶向egfr的bcl-xliadc治療之後的h1650異種移植腫瘤生長的抑制。

圖3描述了作為單一藥劑或與多西他賽(dtx)聯合的靶向egfr的bcl-xliadc治療之後的ebc-1異種移植腫瘤生長的抑制。

圖4描述了用靶向α-ncam1的、以單一藥劑形式給予的或與選擇性的bcl-2抑制劑abt-199聯合給予的bcl-xliadc治療後的h146異種移植腫瘤生長的抑制。

圖5描述了用靶向α-ncam1的、以單一藥劑形式給予的或與選擇性的bcl-2抑制劑abt-199聯合給予的bcl-xliadc治療後的h1963.fp5異種移植腫瘤生長的抑制。

圖6描述了含有細胞滲透性bcl-xl抑制劑的bcl-xliadc對於循環血小板數量的影響。

5.詳細說明

本公開涉及adc、用於合成所述adc的合成子、含有所述adc的組合物和使用所述adc的各種方法。

正如技術人員所理解的那樣，本文公開的adc性質上是「模塊化的」。在整個本發明公開中，描述了包含adc的各個「模塊」以及用於合成adc的合成子的各個具體實施方案。作為具體非限制性實施例，描述了抗體、連接子以及可以包含adc和合成子的bcl-xl抑制劑的具體實施方案。所描述的所有具體實施方案可以彼此組合，就好像單獨明確地描述每個具體組合一樣。

技術人員也可以理解，本文描述的各種bcl-xl抑制劑、adc和/或adc合成子可以是鹽形式，在某些實施方案中，尤其是可藥用鹽。具有充分酸性官能團、充分鹼性官能團或兩種官能團的本公開的化合物，可以與許多無機鹼、無機酸和有機酸反應，形成鹽。或者，固有帶電荷的化合物，例如具有季氮的那些化合物，可以與合適的反離子（例如，滷素，例如，溴、氯或氟）形成鹽。

形成酸加成鹽通常所使用的酸是無機酸，例如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸，等等；以及有機酸，例如對甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、對溴苯基-磺酸、碳酸、琥珀酸、檸檬酸，等等。鹼加成鹽包括衍生自無機鹼的那些鹽，例如銨和鹼金屬或鹼土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽，等等。

在下面的公開內容中，如果包括結構圖和命名兩者，並且如果命名與結構圖不一致，則以結構圖為準。

5.1.定義

除非本文另外定義，否則，與本公開結合使用的科學和技術術語具有本領域普通技術人員所通常理解的含義。

下面定義了各種化學取代基。在有些情況下，取代基(例如，烴基、烷基、烯基、炔基、環烴基、雜環基、雜芳基和芳基)中的碳原子數目是通過前綴「cx-cy」表示的，其中，x是取代基中的碳原子的最小數目，y是取代基中的碳原子的最大數目。由此，例如，「c1-c6烴基」是指含有1至6個碳原子的烴基。進一步舉例說明，「c3-c8環烷基」是指含有3至8個碳環原子的飽和烴基環。如果取代基被描述為「取代的」，則碳或氮上的氫原子被非氫基團代替。例如，取代的烴基取代基是烴基上的至少一個氫原子被非氫基團代替。舉例說明，單氟烴基是被氟基團取代的烴基，二氟烴基是被兩個氟基團取代的烴基。應該認識到，如果在取代基上有一個以上的取代，則每個取代可以相同或不同(除非另有說明)。如果取代基被描述為「任選取代的」，則該取代基可以：(1)沒有被取代，或(2)被取代。可能的取代基包括但不局限於：：c1-c6烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、芳基、環烴基、雜環基、雜芳基、滷素、c1-c6滷代烴基、氧代、cn、no2、orxa、oc(o)rz、oc(o)n(rxa)2、srxa、s(o)2rxa、s(o)2n(rxa)2、c(o)rxa、c(o)orxa、c(o)n(rxa)2、c(o)n(rxa)s(o)2rz、n(rxa)2、n(rxa)c(o)rz、n(rxa)s(o)2rz、n(rxa)c(o)o(rz)、n(rxa)c(o)n(rxa)2、n(rxa)s(o)2n(rxa)2、(c1-c6亞烴基)cn、(c1-c6亞烴基)orxa、(c1-c6亞烴基)oc(o)rz、(c1-c6亞烴基)oc(o)n(rxa)2、(c1-c6亞烴基)srxa、(c1-c6亞烴基)s(o)2rxa、(c1-c6亞烴基)s(o)2n(rxa)2、(c1-c6亞烴基)c(o)rxa、(c1-c6亞烴基)c(o)orxa、(c1-c6亞烴基)c(o)n(rxa)2、(c1-c6亞烴基)c(o)n(rxa)s(o)2rz、(c1-c6亞烴基)n(rxa)2、(c1-c6亞烴基)n(rxa)c(o)rz、(c1-c6亞烴基)n(rxa)s(o)2rz、(c1-c6亞烴基)n(rxa)c(o)o(rz)、(c1-c6亞烴基)n(rxa)c(o)n(rxa)2或(c1-c6亞烴基)n(rxa)s(o)2n(rxa)2；其中，rxa在每次出現時獨立地是氫、芳基、環烴基、雜環基、雜芳基、c1-c6烴基或c1-c6滷代烴基；rz在每次出現時獨立地是芳基、環烴基、雜環基、雜芳基、c1-c6烴基或c1-c6滷代烴基。

在本文一些實施方案中，參考包括取代基的結構式，例如，取代基ar、z1、z2、r1、r2、r4、r10a、r10b、r10c、r11a、r11b、l、rx、fx、lk、ab、n和/或m，描述了各種adc、合成子和含有adc和/或合成子的bcl-xl抑制劑。可以理解，含有取代基的各個基團可以根據化合價和穩定性來進行組合。本公開所設想的取代基和變量的組合，只是能夠形成穩定化合物的那些組合。本文使用的術語「穩定」是指具有足夠製備穩定性，並且在足夠的時間內保持化合物的完整性，可有效用於本文說明的目的的化合物。

本文使用的下列術語具有下列含義∶

術語「烷氧基」是指式-ora的基團，其中，ra是烴基。代表性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基，等等。

術語「烷氧基烴基」是指被烷氧基取代的烴基，並且可以由通式-rbora代表，其中，rb是亞烴基，ra是烴基。

單獨或作為另一個取代基的一部分的術語「烴基」，是指飽和或不飽和的支鏈、直鏈或環狀一價烴基，它是從母體烷、烯或炔烴的單個碳原子上除去一個氫原子所產生的。典型的烴基包括但不局限於：甲基；乙基（ethyls），例如，乙烷基(ethanyl)、乙烯基、乙炔基；丙基（propyls），例如，丙-1-基、丙-2-基、環丙-1-基、丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基、環丙-1-烯-1-基；環丙-2-烯-1-基、丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基、等等；丁基（butanyls），例如丁-1-基、丁-2-基（仲丁基）、2-甲基-丙-1-基（異丁基）、2-甲基-丙-2-基（叔丁基）、環丁烷-1-基、丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基、環丁-1-烯-1-基、環丁-1-烯-3-基、環丁-1,3-二烯-1-基、丁-1-炔-1-基、丁-1-炔-3-基、丁-3-炔-1-基，等；等等。如果指定具體的飽和水平，則使用下面定義的「烷基」、「烯基」和/或「炔基」。術語「低級烴基」是指具有1至6個碳的烴基。

單獨或作為另一個取代基的一部分的術語「烷基」，是指飽和的支鏈、直鏈或環狀烴基，它是從母體烷烴的單個碳原子上除去一個氫原子所產生的。典型的烷基包括但不局限於：甲基；乙烷基(ethanyl)；丙烷基(propanyls)，例如，丙-1-基、丙-2-基(異丙基)、環丙-1-基，等等；丁基，例如，丁-1-基、丁-2-基(仲丁基)、2-甲基-丙-1-基(異丁基)、2-甲基-丙-2-基(叔丁基)、環丁-1-基，等；等等。

單獨或作為另一個取代基的一部分的術語「烯基」，是指具有至少一個碳-碳雙鍵的不飽和的支鏈、直鏈或環狀烴基，它是從母體烯烴的單個碳原子上除去一個氫原子所產生的。典型的烯基包括但不局限於：乙烯基；丙烯基，例如，丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基、丙-2-烯-2-基、環丙-1-烯-1-基；環丙-2-烯-1-基；丁烯基例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1,3-二烯-1-基、丁-1,3-二烯-2-基、環丁-1-烯-1-基、環丁-1-烯-3-基、環丁-1,3-二烯-1-基，等；等等。

單獨或作為另一個取代基的一部分的術語「炔基」，是指具有至少一個碳-碳三鍵的不飽和的支鏈、直鏈或環狀烴基，它是從母體炔烴的單個碳原子上除去一個氫原子所產生的。典型的炔基包括但不局限於：乙炔基；丙炔基，例如，丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基、等等；丁炔基，例如，丁-1-炔-1-基、丁-1-炔-3-基、丁-3-炔-1-基，等；等等。

術語「烴基胺」是指式-nhra的基團，「二烴基胺」是指式-nrara的基團，其中，每個ra彼此獨立地是烴基。

術語「亞烴基」是指具有兩個端部單價基團核心的烷烴、烯烴或炔烴基團，其是從兩個端部碳原子的每個碳原子上除去一個氫原子所產生的。典型的亞烴基包括但不局限於：亞甲基；以及飽和或不飽和的亞乙基；亞丙基；亞丁基；等等。術語「低級亞烴基」是指具有1至6個碳的亞烴基。

術語「芳基」是指含有6至14個碳環原子的芳香碳環基。芳基可以是單環或多環的(即，可以含有一個以上的環)。在多環芳環的情況下，只要求多環系統中的一個環是芳香環，而其餘的環可以是飽和、部分飽和或不飽和環。芳基的例子包括苯基、萘基、茚基、茚滿基和四氫萘基。

前綴「滷代」表示：包括該前綴的取代基被一個或多個獨立選擇的滷素基團取代。例如，滷代烴基是指至少一個氫被滷素基團代替的烴基取代基。典型的滷素基團包括氯、氟、溴和碘。滷代烴基的例子包括氯甲基、1-溴乙基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基和1,1,1-三氟乙基。應該認識到，如果取代基被一個以上的滷素基團取代，則那些滷素基團可以相同或不同(除非另有說明)。

術語「滷代烷氧基」是指式-orc的基團，其中，rc是滷代烴基。

術語「雜烴基」（heteroalkyl）、「雜烷基」、「雜烯基」、「雜炔基」和「雜亞烴基」（heteroalkylene）分別指的是烴基、烷基、烯基、炔基和亞烴基基團，其中的一個或多個碳原子，例如，1、2或3個碳原子，各自獨立地被相同或不同的雜原子或雜原子的基團代替。可以替代碳原子的典型的雜原子和/或雜原子基團包括但不局限於：-o-、-s-、-s-o-、-nrc-、-ph-、-s(o)-、-s(o)2-、-s(o)nrc-、-s(o)2nrc-，等等，包括其組合，其中每個rc獨立地是氫或c1-c6烴基。

術語「環烴基」和「雜環基」分別指的是「烴基」和「雜烴基」的環狀形式。對於雜環基，雜原子可以佔據與分子的其餘部分連接的位置。環烴基或雜環基環可以是單個環(單環)或具有兩個或多個環(雙環或多環)。

單環環烴基和雜環基通常含有3至7個環原子，更通常含有3至6個環原子，且更通常含有5至6個環原子。環烴基的實例包括但不局限於：環丙基；環丁基（cyclobutyls），例如環丁烷基和環丁烯基；環戊基（cyclopentyls），例如環戊烷基和環戊烯基；環己基（cyclohexyls），例如環己烷基和環己烯基；等等。單環雜環基的例子包括但不局限於：氧雜環丁烷、呋喃基、二氫呋喃基、四氫呋喃基、四氫吡喃基、噻吩基(硫呋喃基)、二氫噻吩基、四氫噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、三唑基、四唑基、噁唑基、噁唑烷基、異噁唑啉基、異噁唑基、噻唑基、異噻唑基、噻唑啉基、異噻唑啉基、噻唑烷基、異噻唑烷基、噻二唑基、噁二唑基(包括1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基(呋咱基)或1,3,4-噁二唑基)、噁三唑基(包括1,2,3,4-噁三唑基或1,2,3,5-噁三唑基)、二噁唑基(包括1,2,3-二噁唑基、1,2,4-二噁唑基、1,3,2-二噁唑基或1,3,4-二噁唑基)、1,4-二噁烷基、二氧代硫嗎啉基、噁噻唑基、氧硫雜環戊烯基、氧雜硫雜環戊烷基、吡喃基、二氫吡喃基、硫吡喃基、四氫硫吡喃基、吡啶基(吖嗪基)、哌啶基、二吖嗪基(包括噠嗪基(1,2-二吖嗪基))、嘧啶基(1,3-二吖嗪基)或吡嗪基(1,4-二吖嗪基))、哌嗪基、三嗪基(包括1,3,5-三嗪基、1,2,4-三嗪基和1,2,3-三嗪基))、噁嗪基(包括1,2-噁嗪基、1,3-噁嗪基或1,4-噁嗪基))、噁噻嗪基(包括1,2,3-噁噻嗪基、1,2,4-噁噻嗪基、1,2,5-噁噻嗪基或1,2,6-噁噻嗪基))、噁二嗪基(包括1,2,3-噁二嗪基、1,2,4-噁二嗪基、1,4,2-噁二嗪基或1,3,5-噁二嗪基))、嗎啉基、氮雜卓基、氧雜環庚烯基、硫雜環庚烯基、二氮雜卓基、吡啶酮基(包括吡啶-2(1h)-酮基和吡啶-4(1h)-酮基)、呋喃-2(5h)-酮基、嘧啶酮基(包括嘧啶-2(1h)-酮基和嘧啶-4(3h)-酮基)、噁唑-2(3h)-酮基、1h-咪唑-2(3h)-酮基、噠嗪-3(2h)-酮基和吡嗪-2(1h)-酮基。

多環環烴基和雜環基含有一個以上的環，雙環環烴基和雜環基含有兩個環。環可以是橋接的、稠合的或螺取向的。多環環烴基和雜環基可以包括橋環、稠合環和/或螺環的組合形式。在螺環環烴基或雜環基中，兩個不同的環共用一個原子。螺環烴基的實例是螺[4.5]癸烷，螺雜環基的實例是螺二氫吡唑。

在橋接的環烴基或雜環基中，環共享至少兩個常規非相鄰的原子。橋接的環烴基的實例包括但不局限於：金剛烷基和降冰片基環。橋接的雜環基的實例包括但不局限於：2-氧雜三環[3.3.1.13,7]癸基。

在稠合的環烴基或雜環基中，兩個或多個環稠合在一起，使得兩個環共享一個普通鍵。稠合環環烴基的實例包括十氫化萘、亞萘基、四氫萘和蒽。含有兩個或三個環的稠合環雜環基的例子包括：咪唑並吡嗪基(包括咪唑並[1,2-a]吡嗪基)、咪唑並吡啶基(包括咪唑並[1,2-a]吡啶基)、咪唑並噠嗪基(包括咪唑並[1,2-b]噠嗪基)、噻唑並吡啶基(包括噻唑並[5,4-c]吡啶基、噻唑並[5,4-b]吡啶基、噻唑並[4,5-b]吡啶基和噻唑並[4,5-c]吡啶基)、茚嗪基、吡喃並吡咯基、4h-喹嗪基、嘌呤基、萘啶基、吡啶並吡啶基(包括吡啶並[3,4-b]-吡啶基、吡啶並[3,2-b]-吡啶基或吡啶並[4,3-b]-吡啶基)和喋啶基。稠合環雜環基的其它實例包括：苯並稠合的雜環基，例如，二氫色烯基、四氫異喹啉基、吲哚基、異吲哚基(異苯並吖唑基、假異氮茚基)、假吲哚基(異氮雜茚基)、異吲唑基(苯基吡唑基)、苯並吖嗪基(包括喹啉基(1-苯並吖嗪基)或異喹啉基(2-苯並吖嗪基))、酞嗪基、喹喔啉基、喹唑啉基、苯並二吖嗪基(包括噌琳基(1,2-苯並二吖嗪基)或喹唑啉基(1,3-苯並二吖嗪基))、苯並吡喃基(包括苯並二氫吡喃基或異苯並二氫吡喃基)、苯並噁嗪基(包括1,3,2-苯並噁嗪基、1,4,2-苯並噁嗪基、2,3,1-苯並噁嗪基或3,1,4-苯並噁嗪基)、苯並[d]噻唑基和苯並異噁嗪基(包括1,2-苯並異噁嗪基或1,4-苯並異噁嗪基)。

術語「雜芳基」是指含有5至14個環原子的芳香雜環基。雜芳基可以是單環或2或3個稠環。雜芳基的實例包括6元環，例如，吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噠嗪基和1,3,5-、1,2,4-或1,2,3-三嗪基；5元環取代基，例如，三唑基、吡咯基、咪唑基、呋喃基、噻吩基、吡唑基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、1,2,3-、1,2,4-、1,2,5-或1,3,4-噁二唑基和異噻唑基；6/5元稠環取代基，例如，咪唑並吡嗪基(包括咪唑並[1,2-a]吡嗪基)咪唑並吡啶基(包括咪唑並[1,2-a]吡啶基)、咪唑並噠嗪基(包括咪唑並[1,2-b]噠嗪基)、噻唑並吡啶基(包括噻唑並[5,4-c]吡啶基、噻唑並[5,4-b]吡啶基、噻唑並[4,5-b]吡啶基和噻唑並[4,5-c]吡啶基)、苯並[d]噻唑基、苯並硫呋喃基、苯並異噁唑基、苯並噁唑基、嘌呤基和苯鄰甲內醯胺基；以及6/6元稠環，例如，苯並吡喃基、喹啉基、異喹啉基、噌琳基、喹唑啉基和苯並噁嗪基。雜芳基也可以是具有芳香(4n+2π電子)共振部分的雜環，例如，吡啶酮基(包括吡啶-2(1h)-酮基和吡啶-4(1h)-酮基)、嘧啶酮基(包括嘧啶-2(1h)-酮基和嘧啶-4(3h)-酮基)、噠嗪-3(2h)-酮基和吡嗪-2(1h)-酮基。

本文使用的術語「磺酸鹽或酯（sulfonate）」是指磺酸的鹽或酯。

本文使用的術語「磺酸甲酯」是指磺酸的甲基酯。

本文使用的術語「羧酸鹽或酯（carboxylate）」是指羧酸的鹽或酯。

在連接子的背景下，本文使用的術語「糖」是指單糖類的o-糖苷或n-糖苷碳水化合物衍生物，並且可以來源於天然存在的來源，或可以起源於合成。例如，「糖」包括衍生物，例如但不局限於：衍生自β-葡糖醛酸和β-半乳糖的那些糖。合適的糖取代基包括但不局限於：羥基、胺、羧酸、酯和醚。

術語「nhs酯」是指羧酸的n-羥基琥珀醯亞胺酯衍生物。

當在「或其鹽」的背景下使用時，術語「鹽」包括通常用於形成鹼金屬鹽的鹽、形成游離酸或游離鹼的加成鹽的鹽。通常，這些鹽典型地可以利用常規方法製備，例如，通過合適的酸或鹼與本發明化合物的反應來製備。

如果預定給予患者鹽(例如，與上下文的體外使用相對)，優選，鹽是可藥用和/或生理學相容的鹽。在本專利申請中，作形容詞用的術語「可藥用」是指其所修飾的名詞適於用作藥物產品或作為藥物產品的一部分。術語「可藥用鹽」包括通常用於形成鹼金屬鹽和形成游離酸或游離鹼的加成鹽的鹽。通常，這些鹽典型地可以利用常規方法製備，例如，通過合適的酸或鹼與本發明化合物的反應來製備。

5.2示範性的實施方案

正如概述所提到的那樣，本公開的一個方面涉及含有bcl-xl抑制劑的adc，其中bcl-xl抑制劑通過連接子與抗體連接。在具體實施方案中，adc是按照下面結構式(i)的化合物，或其鹽，其中ab代表抗體，d代表bcl-xl抑制劑(藥物)，l代表連接子，lk代表在連接子l上的反應性官能團和抗體ab上的互補官能團之間形成的連接基，m代表與抗體連接的d-l-lk單元的數目∶

下面更詳細地描述可以包含於本文所描述的adc的各種bcl-xl抑制劑(d)、連接子(l)和抗體(ab)以及與adc連接的bcl-xl抑制劑的數量的具體實施方案。

5.2.1bcl-xl抑制劑

adc包含一或多種bcl-xl抑制劑，它們可以相同或不同，但通常是相同的。在一些實施方案中，包含於adc的bcl-xl抑制劑，和在某些具體實施方案中，上面結構式(i)的d，是按照結構式(iia)的化合物∶

或其鹽，其中∶

ar選自，其任選被一個或多個獨立地選自滷素、氰基、甲基和滷代甲基的取代基取代；

z1選自n、ch和c-cn；

z2選自nh、ch2、o、s、s(o)和s(o2)；

r1選自甲基、氯和氰基；

r2選自氫、甲基、氯和氰基；

r4是氫、c1-4烷基、c2-4烯基、c2-4炔基、c1-4滷代烴基或c1-4羥烴基，其中r4的c1-4烷基、c2-4烯基、c2-4炔基、c1-4滷代烴基和c1-4羥烴基任選被一個或多個獨立地選自och3、och2ch2och3和och2ch2nhch3的取代基取代；

r10a、r10b和r10c各自彼此獨立地選自氫、滷素、c1-6烷基、c2-6烯基、c2-6炔基和c1-6滷代烴基；

r11a和r11b各自彼此獨立地選自氫、甲基、乙基、滷代甲基、羥基、甲氧基、滷素、cn和sch3；

n是0、1、2或3；和

#代表與連接子l的連接點。

在某些實施方案中，式(iia)的ar選自，並且任選被一個或多個獨立地選自滷素、氰基、甲基和滷代甲基的取代基取代。在具體實施方案中，ar是∶。

在某些實施方案中，式(iia)的z1是n。

在某些實施方案中，式(iia)的z1是ch。

在某些實施方案中，式(iia)的z2是o。

在某些實施方案中，式(iia)的r1選自甲基和氯。

在某些實施方案中，式(iia)的r2選自氫和甲基。在具體實施方案中，r2是氫。

在某些實施方案中，式(iia)中的r1是甲基，r2是氫和z1是n。

在某些實施方案中，式(iia)中的r10a是滷素，r10b和r10c各自是氫。在具體實施方案中，r10a是氟。

在某些實施方案中，式(iia)中的r10b是滷素，r10a和r10c各自是氫。在具體實施方案中，r10b是氟。

在某些實施方案中，式(iia)中的r10c是滷素，r10a和r10b各自是氫。在具體實施方案中，r10c是氟。

在某些實施方案中，式(iia)中的r10a、r10b和r10c各自是氫。

在某些實施方案中，式(iia)中的r11a和r11b相同。在具體實施方案中，r11a和r11b各自是甲基。

在某些實施方案中，式(iia)中的n是0或1。

可以包括在本文所描述的adc中的示範性的bcl-xl抑制劑和/或其鹽，包括實施例1.1-1.8分別所描述的化合物w1.01-w1.08。

含有adc的bcl-xl抑制劑，當未包括在adc內時，與抗凋亡bcl-xl蛋白結合，並抑制它，誘導細胞程序死亡。按照結構式(iia)的具體bcl-xl抑制劑，當未包括在adc內時(即，按照結構式(iia)的化合物或鹽，其中，#代表氫原子)，其結合和抑制bcl-xl活性的能力可以在標準結合和活性試驗中得到證明，包括，例如，tao等人(2014，acsmed.chem.lett.，5:1088-1093)所描述的tr-fretbcl-xl結合試驗。可用於證明bcl-xl結合的具體tr-fretbcl-xl結合試驗提供於下面實施例4中。通常，在實施例4的結合試驗中，可以在本文描述的adc中使用的bcl-xl抑制劑的ki小於大約10nm，但可以顯示出顯著更低的ki，例如，小於大約1、0.1nm、或甚至0.01nm的ki。

在標準基於細胞的細胞毒性試驗中，例如，tao等人(2014，acsmed.chem.lett.，5:1088-1093)所描述的fl5.12細胞和molt-4細胞毒性試驗，也可以證明bcl-xl抑制活性。可以用於證明具體bcl-xl抑制劑的bcl-xl抑制活性的具體molt-4細胞毒性試驗提供於下面實施例5中。通常，在實施例5的molt-4細胞毒性試驗中，本文描述的adc中所使用的bcl-xl抑制劑表現出小於大約500nm的ec50值，但可以表現出顯著更低的ec50值，例如小於大約250、100、50、20、10或甚至5nm的ec50值。

雖然結構式(iia)定義的bcl-xl抑制劑預計是細胞滲透性的抑制劑，並且當未包括在adc內時，可以滲入細胞，但在用滲透細胞的細胞試驗中，可以證明不能自由穿過細胞膜的化合物的bcl-xl抑制活性。正如背景部分討論的那樣，線粒體外膜透化(momp)的過程是由bcl-2家族蛋白控制的。具體地說，促凋亡bcl-2家族蛋白bax和bak促進momp，並且它們一旦活化，在線粒體膜外上進行低聚反應，形成孔隙，導致細胞色素c(cytc)的釋放。cytc的釋放引起凋亡體(apoptosome)的形成，這轉而會導致半胱天冬酶活化以及使細胞經受編程性細胞死亡的其它情況(參見，goldstein等人，2005,celldeathanddifferentiation12:453-462)。抗凋亡bcl-2家族成員，包括bcl-2和bcl-xl，拮抗bax和bak的寡聚作用。bcl-xl抑制劑，在存活取決於bcl-xl的細胞中，可以導致bax和/或bak的活化、momp、cytc的釋放和導致細胞程序死亡的下遊活動。可以通過細胞中的細胞色素c的線粒體和細胞溶質部分的western印跡，確定cytc釋放的過程，並且用作細胞中的細胞程序死亡的代表性量度標準。

作為檢測低細胞滲透性的分子的bcl-xl抑制活性以及後續的cytc釋放的方法，可以用在血漿(但不是線粒體、膜)中形成選擇性孔隙的藥劑處理細胞。具體地說，與線粒體膜相比，在質膜中，膽固醇/磷脂比例更高。因此，用低濃度的膽固醇引導的淨化劑毛地黃皂苷進行短期培養，可選擇性地滲透質膜，不會顯著地影響線粒體膜。所述藥劑與膽固醇形成不溶解的複合物，導致膽固醇從它的正常磷脂結合位點分離出來。隨後，這種作用在脂質雙層中形成大約40-50å寬的孔。在凋亡細胞中，一旦質膜被透化，可以衝洗掉能夠通過毛地黃皂苷形成的孔隙的細胞溶質組分，包括從線粒體釋放到細胞溶質中的細胞色素c(campos,2006,cytometrya69(6):515-523)。

通常，在實施例5的molt-4細胞透化cytc試驗中，bcl-xl抑制劑的ec50值小於大約10nm，儘管所述化合物還可以表現出顯著更低的ec50值，例如，小於大約5、1或甚至0.5nm。

雖然許多結構式(iia)的bcl-xl抑制劑相比於其它抗凋亡bcl-2家族蛋白可選擇性或特異性地抑制bcl-xl，但不需要選擇性和/或特異性地抑制bcl-xl。除了抑制bcl-xl之外，含有adc的bcl-xl抑制劑還可以抑制一或多種其它抗凋亡bcl-2家族蛋白，例如，比如，bcl-2。在一些實施方案中，含有adc的bcl-xl抑制劑對於bcl-xl具有選擇性和/或特異性。特異性或選擇性是指，在相同試驗條件下，相比於結合或抑制bcl-2，具體bcl-xl抑制劑結合或抑制bcl-xl的程度更大。在具體實施方案中，在bcl-xl結合試驗中，相比於bcl-2，含有adc的bcl-xl抑制劑對於bcl-xl顯示出10倍、100倍或甚至更大的特異性。

5.2.2連接子

在本文所描述的adc中，bcl-xl抑制劑通過連接子與抗體連接。連接adc的bcl-xl抑制劑與抗體的連接子可以是短的、長的、疏水性的、親水性的、撓性的或剛性的連接子，或可以由各自獨立地具有一或多種上述性能的片段組成，使得連接子可以包括具有不同性能的片段。連接子可以是多價連接子，使得它們將一個以上的bcl-xl抑制劑共價連接到抗體上單一位點，或可以是單價連接子，使得它們將單個bcl-xl抑制劑共價連接到抗體上的單一位點。

正如技術人員所理解的那樣，連接子與bcl-xl抑制劑在一個位置形成共價連接基，在另一個位置與抗體形成共價連接基，由此將bcl-xl抑制劑連接到抗體上。在連接子上的官能團和抑制劑與抗體上的官能團之間反應，形成共價連接基。本文使用的術語「連接子」意圖包括：(i)連接子的非綴合形式，其包括能夠使連接子與bcl-xl抑制劑共價連接的官能團，以及能夠使連接子與抗體共價連接的官能團；(ii)連接子的部分綴合形式，其包括能夠使連接子與抗體共價連接的官能團，並且共價連接bcl-xl抑制劑，或反之亦然；和(iii)連接子的完全綴合形式，其共價連接bcl-xl抑制劑和抗體。在本文所描述的中間體合成子和adc的一些具體實施方案中，分別用rx和lk具體說明含有連接子上的官能團的部分以及在連接子和抗體之間形成的共價連接基的部分。一個實施方案涉及在合成子共價連接抗體的條件下，通過結合腫瘤細胞上表達的細胞表面受體或腫瘤相關抗原的抗體與本文描述的合成子接觸所形成的adc。一個實施方案涉及adc的製備方法，所述adc是在合成子共價連接抗體的條件下，通過接觸本文描述的合成子所形成的。一個實施方案涉及在表達bcl-xl的細胞中抑制bcl-xl活性的方法，所述方法包括：在adc結合細胞的條件下，使細胞與能夠結合細胞的本文所描述的adc接觸。

優選，連接子對於細胞外部的條件是化學上穩定的(但不是必要的)，並且可以設計成能在細胞內部斷裂、裂解和/或另外特異性地降解。或者，可以使用沒有設計成能夠在細胞內部特異性裂解或降解的連接子。在adc背景下用於連接藥物與抗體的多種連接子在本領域是已知的。這些連接子中的任何連接子以及其它連接子，可以用於連接本文描述的adc中的bcl-xl抑制劑與抗體。

例如，美國專利8,399,512、美國公開申請2010/0152725、美國專利8,524,214、美國專利8,349,308、美國公開申請2013/189218、美國公開申請2014/017265、wo2014/093379、wo2014/093394、wo2014/093640描述了可以將許多bcl-xl抑制劑連接到抗體上的示範性的多價連接子，本文以引證的方式引入它們的全部內容。例如，mersana等人開發的fleximer®連接子技術能夠使高dar的adc具有良好的物理化學性能。如下所示，fleximer®連接子技術是基於通過酯鍵的序列，將藥物分子引入到溶解的聚縮醛骨架上。該方法提供高載荷的adc(dar達到20)，同時保持良好的物理化學性能。對於bcl-xl抑制劑，可以使用這種方法，如下面反應路線所示。

為了使用上面反應路線描述的fleximer®連接子技術，可以存在脂族醇，或將其引入到bcl-xl抑制劑中。然後，醇部分與丙氨酸部分綴合，然後以合成方式結合到fleximer®連接子上。adc的體外脂質體處理釋放含有母體醇的藥物。

枝狀類型的連接子的其它實例可見於下列文獻：us2006/116422；us2005/271615；degroot等人，(2003)angew.chem.int.ed.42:4490-4494；amir等人(2003)angew.chem.int.ed.42:4494-4499；shamis等人(2004)j.am.chem.soc.126:1726-1731；sun等人(2002)bioorganic&medicinalchemistryletters12:2213-2215；sun等人(2003)bioorganic&medicinalchemistry11:1761-1768；king等人(2002)tetrahedronletters43:1987-1990。

下列文獻描述了可以使用的示範性的單價連接子：例如，nolting,2013,antibody-drugconjugates,methodsinmolecularbiology1045:71-100；kitson等人，2013,cros/cmos-chemicaoggi-chemistrytoday31(4):30-36；ducry等人，2010,bioconjugatechem.21:5-13；zhao等人，2011,j.med.chem.54:3606-3623；美國專利us7,223,837；美國專利us8,568,728；美國專利us8,535,678；和wo2004010957，本文以引證的方式結合它們各自的全部內容。

例如(但沒有限制性)，可以包括在本文所描述的adc中的一些可斷裂的和不可斷裂的連接子如下所述。

5.2.2.1可斷裂的連接子

在某些實施方案中，所選擇的連接子是體外和體內可斷裂的連接子。可斷裂的連接子可以包括化學或酶催不穩定或可降解的連接子。可斷裂的連接子通常依賴於細胞內部釋放藥物的過程，例如，在細胞質中還原、在溶酶體中接觸酸性條件或通過細胞內的特異性蛋白酶或其它酶來斷裂。可斷裂的連接子通常包括一個或多個化學或酶催可斷裂的化學鍵，而連接子的其餘部分是不可斷裂的。

在某些實施方案中，連接子包含化學上不穩定的基團，例如，腙和/或二硫基。包含化學上不穩定基團的連接子利用血漿和一些胞質腔室之間的性能差異。對於含有腙的連接子，促進藥物釋放的胞內條件是核內體和溶酶體的酸性環境，而含有二硫化物的連接子在含有高濃度的硫醇(例如，穀胱甘肽)的細胞溶質中還原。在某些實施方案中，可以在化學上不穩定的基團附近使用取代基，引入空間位阻，使得包含化學上不穩定基團的連接子的血漿穩定性提高。

對酸不穩定的基團，例如，腙，在血液的中性ph環境(ph7.3-7.5)下的系統循環期間保持完整，並且一旦adc內化到細胞的適度酸性的核內體(ph5.0-6.5)和溶酶體(ph4.5-5.0)的腔室中，將進行水解反應並釋放藥物。。這種ph依賴性釋放機制與藥物的非特異性釋放有關。為了提高連接子的腙基團的穩定性，可以通過化學改性來改變連接子，例如，取代，使得調整為在溶酶體中更有效地釋放，同時使循環過程中的損失最小化。

含有腙的連接子可以包含其它斷裂位點，例如，其它對酸不穩定的斷裂位點和/或酶催不穩定的斷裂位點。包括含有示範性的腙的連接子的adc包括下列結構∶

其中，d和ab分別代表藥物和ab，n代表與抗體連接的藥物-連接子的數量。在某些連接子中，例如，連接子(id)，該連接子包含兩個可斷裂的基團：二硫化物和腙部分。對於這種連接子，未修飾的游離藥物的有效釋放需要酸性ph，或二硫化物還原和酸性ph。已經表明，具有單個腙斷裂位點的連接子例如(ie)和(if)是有效的連接子。

可以包括在連接子中的其它對酸不穩定的基團包括含有順式烏頭基(aconityl)的連接子。順式烏頭基(aconityl)化學使用與醯胺鍵並列的羧酸，在酸性條件下促進醯胺水解。

可斷裂的連接子還可以包括二硫基。二硫化物在生理ph下保持熱力學穩定，並且可以被設計成在細胞內部內化時能夠釋放藥物，與胞外環境相比，在細胞內部，細胞溶質提供顯著更好的還原條件。二硫鍵的斷裂通常需要存在胞質的硫醇輔助因子，例如(還原的)穀胱甘肽(gsh)，使得含有二硫化物的連接子在循環中保持合理的穩定性，在細胞溶質中選擇性地釋放藥物。胞內酶蛋白二硫鍵異構酶，或能夠斷裂二硫鍵的類似的酶，還可以有助於在細胞內部優先斷裂二硫鍵。與gsh或半胱氨酸(最豐富的低分子量硫醇)在循環中的顯著更低的濃度(大約5µm)相比，據報導gsh在細胞中的濃度在0.5-10mm範圍。無規律的血流導致含氧量低的狀態的腫瘤細胞，導致還原酶的活性提高，並因此導致甚至更高的穀胱甘肽濃度。在某些實施方案中，含有二硫化物的連接子的體內穩定性，可以通過連接子的化學改性得到提高，例如，使用與二硫鍵相鄰的空間位阻。

包括示範性的含有二硫化物的連接子的adc包括下列結構∶

其中，d和ab分別代表藥物和抗體，n代表與抗體連接的藥物-連接子的數量，r在每次出現時獨立地選自氫或烴基。在某些實施方案中，增大與二硫鍵相鄰的空間位阻能夠提高連接子的穩定性。結構(例如(ig)和(ii))表明，當一個或多個r基團選自低級烴基(例如，甲基)時，體內穩定性提高。

可以使用的另一個類型的連接子是通過酶特異性斷裂的連接子。在一個實施方案中，連接子是溶酶體酶可斷裂的連接子。這種連接子通常是基於肽的連接子，或包括起到酶的底物作用的肽域。與化學上不穩定的連接子相比，基於肽的連接子在血漿和胞外環境(milleu)中傾向於更穩定。肽鍵通常具有良好的血清穩定性，與溶酶體相比，溶酶體的蛋白水解酶在血液中的活性極低，這是由於內源性的抑制劑和不利的血液高ph值。由於溶酶體的蛋白酶的作用，例如，組織蛋白酶和纖溶酶，藥物從抗體上特異性地釋放。在某些腫瘤組織中，這些蛋白酶的存在水平可以升高。在一個實施方案中，連接子可通過溶酶體酶斷裂，溶酶體酶是組織蛋白酶b。在某些實施方案中，可通過溶酶體酶斷裂連接子，溶酶體酶是β-葡糖苷酸酶或β-半乳糖苷酶。在某些實施方案中，可通過溶酶體酶斷裂連接子，溶酶體酶是β-葡糖苷酸酶。在某些實施方案中，可通過溶酶體酶斷裂連接子，溶酶體酶是β-半乳糖苷酶。

在示範性的實施方案中，可斷裂的肽選自四肽，例如，gly-phe-leu-gly、ala-leu-ala-leu，或二肽，例如，val-cit、val-ala和phe-lys。在某些實施方案中，由於更長的肽的疏水性，所以，二肽優於更長的多肽。

已經描述了用於連接藥物(例如，多柔比星、絲裂黴素、喜樹鹼、太利蘇黴素和阿里他汀(auristatin)/阿里他汀(auristatin)家族成員)與抗體的基於各種二肽的可斷裂的連接子(參見，dubowchik等人，1998,j.org.chem.67:1866-1872；dubowchik等人，1998,bioorg.med.chem.lett.8:3341-3346；walker等人，2002,bioorg.med.chem.lett.12:217-219；walker等人，2004,bioorg.med.chem.lett.14:4323-4327；以及francisco等人，2003,blood102:1458-1465，本文以引證的方式結合它們各自的內容)。所有這些二肽連接子，或這些二肽連接子的改進型，可以在本文描述的adc使用。可以使用的其它二肽連接子包括在adc中發現的那些二肽連接子，例如，seattlegenetics的布妥昔單抗(brentuximab)、vendotinsgn-35(adcetris™)、seattlegeneticssgn-75(抗cd-70，mc-一甲基阿里他汀(auristatin)f(mmaf)、celldextherapeuticsglembatumumab(cdx-011)(抗-nmb，val-cit-一甲基阿里他汀(auristatin)e(mmae)和cytogenpsma-adc(psma-adc-1301)(抗psma，val-cit-mmae)。

酶催可斷裂的連接子可以包括自降解的間隔基（self-immolativespacer），空間上將藥物與酶斷裂位點分開。藥物與肽連接子的直接連接，可以導致藥物的胺基酸加合物的蛋白質水解釋放，由此減弱它的活性。使用自降解間隔基，可以允許在醯胺鍵水解時完全活性的、化學上未修飾的藥物的消除。

一種自降解間隔基是雙功能的對氨基苄醇基團，它通過氨基與肽連接，形成醯胺鍵，而含有胺的藥物可以通過氨基甲酸酯官能團與連接子的苄基羥基連接(得到對醯胺基苄基氨基甲酸酯，pabc)。一旦出現蛋白酶介導的斷裂，所得到的前體藥物被活化，引起1,6-消除反應，釋放未修飾的藥物、二氧化碳和殘餘的連接子基團。下列反應路線描述了對醯胺基氨基甲酸苄酯的斷裂和藥物的釋放∶

其中，x-d代表未修飾的藥物。

還描述了這種自降解基團的雜環變體。參見美國專利us7,989,434。

在某些實施方案中，酶催斷裂的連接子是基於ß-葡糖醛酸的連接子。溶酶體酶ß-葡糖苷酸酶將ß-葡糖苷酸糖苷鍵斷裂，可以容易地釋放藥物。這種酶大量地存在於溶酶體內，並且在一些腫瘤類型中過度表達，同時，細胞外部的酶活性很低。由於ß-葡糖苷酸的親水性，所以，基於ß-葡糖醛酸的連接子可以用於防止adc聚集的傾向。在某些實施方案中，優選，基於ß-葡糖醛酸的連接子作為與疏水性藥物連接的adc的連接子。下列反應路線描述了從含有基於ß-葡糖醛酸的連接子的adc中釋放藥物∶

已經描述了用於連接藥物(例如，阿里他汀(auristatin)、喜樹鹼(camptothecin)和多柔比星類似物、cbi小溝結合劑(minor-groovebinders)和psymberin)與抗體的各種可斷裂的基於ß-葡糖醛酸的連接子(參見，jeffrey等人，2006,bioconjug.chem.17:831-840；jeffrey等人，bioorg.med.chem.lett.17:2278-2280；以及jiang等人，2005,j.am.chem.soc.127:11254-11255，本文以引證的方式結合它們各自的內容)。所有基於這些ß-葡糖醛酸的連接基可以在本文所描述adc中使用。在某些實施方案中，酶催可斷裂的連接基是基於ß-半乳糖苷的連接基。ß-半乳糖苷大量地存在於溶酶體內，同時，細胞外部的酶活性很低。另外，含有酚基團的bcl-xl抑制劑可以通過酚上的氧與連接子共價鍵合。美國公開的app.no.2009/0318668所描述的一種這樣的連接子，依賴於使用與基於常規「pabo」的自降解基團結合的二氨基-乙烷「spacelink」來遞送酚的方法。下面使用本公開的bcl-xl抑制劑，圖解描述連接子的斷裂。

可斷裂的連接子可以包括不可斷裂的部分或片段，和/或，在另外的不可斷裂的連接子中可以包括可斷裂的片段或部分，以使它可斷裂。僅用於舉例，聚乙二醇(peg)和相關的聚合物，在聚合物骨架中可以包括可斷裂的基團。例如，聚乙二醇或聚合物連接子可以包括一個或多個可斷裂的基團，例如二硫化物、腙或二肽。

可以包括在連接子中的其它可降解的連接基，包括由peg羧酸或活化的peg羧酸與生物活性劑上的醇基反應所形成的酯鍵，其中這種酯基通常在生理條件下水解，釋放出生物活性劑。水解可降解的連接基包括但不局限於：碳酸酯連接基；胺和醛反應所產生的亞胺連接基；醇與磷酸基反應所形成的磷酸酯連接基；作為醛和醇的反應產物的縮醛連接基；作為甲酸酯和醇的反應產物的原酸酯連接基；以及由亞磷醯胺基團(包括但不局限於：在聚合物的端部)和寡核苷酸的5'羥基所形成的寡核苷酸連接基。

在某些實施方案中，連接子包含酶催可斷裂的肽部分，例如，包含結構式(iva)、(ivb)或(ivc)的連接子∶

或其鹽，其中∶

肽代表可通過溶酶體酶斷裂的肽(舉例說明的n→c，其中，肽包括氨基和羧基「端」)；

t代表含有一個或多個乙二醇單元或亞烴基鏈或其組合的聚合物；

ra選自氫、烴基、磺酸酯和磺酸甲酯；

p是0至5的整數；

q是0或1；

x是0或1；

y是0或1；

代表連接子與bcl-xl抑制劑的連接點；和

*代表與連接子的其餘部分的連接點。

在某些實施方案中，連接子包含酶催可斷裂的肽部分，例如，包含結構式(iva)、(ivb)或(ivc)或其鹽的連接子。

在某些實施方案中，肽選自三肽或二肽。在具體實施方案中，二肽選自∶

或其鹽。

可以包括在本文描述的adc中的按照結構式(iva)的連接子的具體示範性實施方案包括下面舉例說明的連接子(正如所描述的，連接子包括適合於將連接子與抗體共價連接的基團)∶

可以包括在本文描述的adc中的按照結構式(ivb)的連接子的具體示範性實施方案包括下面舉例說明的連接子(正如示例所述，連接子包括適合於將連接子與抗體共價連接的基團)∶

在某些實施方案中，連接子包含酶催可斷裂的糖部分，例如，包含結構式(va)、(vb)、(vc)或(vd)或其鹽的連接子∶

其中∶

q是0或1；

r是0或1；

x1是o或nh；

代表連接子與藥物的連接點；和

*代表與連接子的其餘部分的連接點。

可以包括在本文描述的adc中的按照結構式(va)的連接子的具體示範性實施方案包括下面舉例說明的連接子(正如示例所述，連接子包括適合於將連接子與抗體共價連接的基團)∶

可以包括在本文描述的adc中的按照結構式(vb)的連接子的具體示範性實施方案包括下面舉例說明的連接子(正如示例所述，連接子包括適合於將連接子與抗體共價連接的基團)∶

可以包括在本文描述的adc中的按照結構式(vc)的連接子的具體示範性實施方案包括下面舉例說明的連接子(正如示例所述，連接子包括適合於將連接子與抗體共價連接的基團)∶

可以包括在本文描述的adc中的按照結構式(vd)的連接子的具體示範性實施方案包括下面舉例說明的連接子(正如示例所述，連接子包括適合於將連接子與抗體共價連接的基團)∶

5.2.2.2不可斷裂的連接子

雖然可斷裂的連接子可以提供某些優勢，但含有本文所描述的adc的連接子沒有必要是可斷裂的連接子。對於不可斷裂的連接子，藥物釋放不會依賴於血漿和一些胞質腔室之間的性能差異。adc內化之後，通過抗原介導的胞吞作用，假定出現藥物的釋放，並且遞送到溶酶體的腔室中，在溶酶體的腔室中，通過胞內蛋白質降解，抗體降解至胺基酸的水平。這個過程釋放出由藥物、連接子以及連接子共價連接的胺基酸殘基所形成的藥物衍生物。與帶有可斷裂的連接子的綴合物相比，源自於帶有不可斷裂的連接子的綴合物的胺基酸藥物代謝物更具親水性，並且通常膜滲透性更小，這導致旁觀者效應更小，非特異性的毒性更小。通常，與帶有可斷裂的連接子的adc相比，帶有不可斷裂的連接子的adc在循環中的穩定性更大。不可斷裂的連接子可以是亞烴基鏈，或性質上可以是聚合物，例如，基於聚烷撐二醇的聚合物、醯胺聚合物，或可以包括亞烴基鏈、聚烷撐二醇和/或醯胺聚合物的片段。在某些實施方案中，連接子包含具有1至6個乙二醇單元的聚乙二醇片段。

已經描述了用於連接藥物與抗體的各種不可斷裂的連接子(參見，jeffrey等人，2006,bioconjug.chem.17;831-840；jeffrey等人，2007,bioorg.med.chem.lett.17:2278-2280；以及jiang等人，2005,j.am.chem.soc.127:11254-11255，本文以引證的方式結合它們的內容)。所有這些連接子可以包括在本文描述的adc中。

在某些實施方案中，連接子是體內不可斷裂的連接子，例如，舉例說明的按照結構式(via)、(vib)、(vic)或(vid)的連接子，所述連接子包括適合於將連接子與抗體共價連接的基團∶

或其鹽，其中∶

ra選自氫、烴基、磺酸酯和磺酸甲酯；

rx是包括能夠將連接子與抗體共價連接的官能團的部分；

代表連接子與bcl-xl抑制劑的連接點。

可以包括在本文描述的adc中的按照結構式(via)-(vid)的連接子的具體示範性實施方案包括下面舉例說明的連接子(正如示例所述，連接子包括適合於將連接子與抗體共價連接的基團，和「」代表連接bcl-xl抑制劑的點)∶

5.2.2.3用於連接連接子與抗體的基團

連接基團性質上可以是親電子的基團，包括∶馬來醯亞胺基團、活化的二硫化物、活性酯，例如，nhs酯和hobt酯、滷代甲酸酯，醯滷、烴基和苄基滷，例如，滷代乙醯胺。正如下面討論的那樣，還有與可以按照本公開使用的「自穩定的」馬來醯亞胺和「橋接二硫化物」相關的新興技術。

已經觀察到藥物-連接子從adc中的缺失，其是用白蛋白、半胱氨酸或穀胱甘肽的馬來醯亞胺調換過程的結果(alley等人，2008,bioconjugatechem.19:759-769)。這種情況在綴合物的高度溶劑可及的位點尤其普遍，而部分可及的且具有荷正電環境的位點促進了馬來醯亞胺環的水解(junutula等人，2008,nat.biotechnol.26:925-932)。公認的解決方案是使綴合所形成的琥珀醯亞胺水解，這可以抵抗從抗體的脫綴合，由此使得adc在血清中穩定。據以前報導，琥珀醯亞胺環在鹼性條件下會進行水解(kalia等人，2007,bioorg.med.chem.lett.17:6286-6289)。下面的示意圖描述了在抗體綴合條件下自發水解得到穩定性提高的adc的「自穩定的」馬來醯亞胺基團的一個實例。參見美國公開申請2013/0309256。

polytherics已經公開了橋接一對由天然鉸鏈二硫鍵的還原所獲得的巰基的方法。參見badescu等人，2014,bioconjugatechem.25:1124-1136。下面的示意圖描述了該反應。這種方法的優越性是，通過iggs的完全還原(得到4對巰基)，而後與4當量的烷基化劑反應，能夠合成均勻的dar4adc。包含「橋接二硫化物」的adc也使穩定性提高。

類似地，正如下面所描述的那樣，已經研發了能夠橋接一對巰基的馬來醯亞胺衍生物。參見美國公開申請2013/0224228。

5.2.2.4連接子選擇因素

正如技術人員所了解的那樣，為具體adc所選擇的連接子可以受到各種因素的影響，包括但不局限於：與抗體連接的位點(例如，lys、cys或其它胺基酸殘基)、藥物藥效團的結構限制以及藥物的親油性。對於特異性抗體/藥物組合，為adc所選擇的具體連接子應該設法平衡這些不同因素。對於受到adc中的連接子的選擇影響的因素的綜述，參見nolting,chapter5「linkertechnologyinantibody-drugconjugates,」in:antibody-drugconjugates:methodsinmolecularbiology,vol.1045,pp.71-100,laurentducry(ed.),springerscience&businessmedica,llc,2013。

例如，已經觀察到，adc實施殺傷抗原陽性腫瘤細胞附近的旁觀者抗原陰性細胞。adc的旁觀者細胞殺傷機理表明，在adc的胞內處理期間形成的代謝產物可以起到作用。adc在抗原陽性細胞中代謝產生的中性細胞毒素代謝物，似乎在旁觀者細胞殺傷過程中起一定作用，而帶電荷的代謝物則可能被阻止擴散穿過膜進入到培養基中，並由此不能影響旁觀者殺傷。在某些實施方案中，為了減弱adc的細胞代謝物所引起的旁觀者殺傷效應，對連接子進行選擇。在某些實施方案中，為了提高旁觀者殺傷效應，對連接子進行選擇。

連接子的性能也可以影響adc在使用和/或儲存條件下的聚集。通常，據文獻報導，每個抗體分子，adc包含至多3-4個藥物分子(參見，例如，chari,2008,accchemres41:98-107)。獲得更高的藥物對抗體比例(「dar」)的企圖經常失敗，尤其是在藥物和連接子都是疏水性的情況下，原因是adc出現聚集(參見，king等人，2002,jmedchem45:4336-4343；hollander等人，2008,bioconjugatechem19:358-361；burke等人，2009bioconjugatechem20:1242-1250)。在許多情況下，作為提高效能的方法，dar高於3-4是有利的。在bcl-xl抑制劑性質上是疏水性的情況下，作為降低adc聚集的方法，合乎需要的是，選擇相對親水性的連接子，特別是在需要dar大於3-4的情況下。由此，在某些實施方案中，連接子引入降低adc在儲存和/或使用期間聚集的化學部分。為了降低adc的聚集，連接子可以引入極性或親水基，例如帶電荷的基團、或在生理ph值下變成帶電荷的基團。例如，連接子可以引入帶電荷的基團，例如鹽或去質子化的基團，例如羧酸鹽，或在生理ph值下質子化，例如胺。

據報導，能夠達到高達20的dar的示範性的多價連接子，可用於將許多bcl-xl抑制劑與抗體連接，如下列文獻所述：美國專利us8,399,512；美國公開申請2010/0152725；美國專利us8,524,214；美國專利us8,349,308；美國公開申請2013/189218；美國公開申請2014/017265；wo2014/093379；wo2014/093394；wo2014/093640，本文以引證的方式結合它們的全部內容。

在具體實施方案中，利用分子排阻色譜(sec)測定，adc在儲存或使用期間的聚集小於大約40%。在具體實施方案中，利用分子排阻色譜(sec)測定，adc在儲存或使用期間的聚集小於35%，例如小於大約30%，例如小於大約25%，例如小於大約20%，例如小於大約15%，例如小於大約10%，例如小於大約5%，例如小於大約4%，或甚至更小。

一個實施方案涉及adc或合成子，其中，連接子l選自連接子iva.1-iva.7、ivb.1-ivb.15、ivc.1-ivc.2、va.1-va.12、vb.1-vb.4、vc.1-vc.9、vd.1-vd.2、via.1、v1c.1-v1c.2、v1d.1-v1d.3和其鹽。

5.3抗體

adc的抗體可以是，通常但不必然是是特異性，與感興趣的靶細胞的表面上表達的抗原結合的任何抗體。抗原不必將其中結合的adc內化到細胞中，但在一些實施方案中，其能夠將其中結合的adc內化到細胞中。感興趣的靶細胞通常包括：需要抑制抗凋亡bcl-xl蛋白來誘導細胞程序死亡的細胞，包括，例如(沒有限制性)，表達或過度表達bcl-xl的腫瘤細胞。靶點抗原可以是感興趣的靶細胞上表達的任何蛋白、糖蛋白、多糖、脂蛋白，等等，但通常是在靶細胞上獨特表達並且在正常或健康細胞上沒有表達的蛋白、或與正常或健康細胞相比較，在靶細胞上過度表達的蛋白，以便adc選擇性地靶向感興趣的具體細胞，例如，腫瘤細胞。正如技術人員所理解的那樣，具體抗原以及由此選擇的抗體取決於感興趣的目標靶細胞的特徵。在具體實施方案中，adc的抗體是適合於給予人類的抗體。

抗體(abs)和免疫球蛋白(igs)是具有相同結構特性的糖蛋白。儘管抗體對於具體靶點具有結合特異性，但免疫球蛋白包括抗體及沒有靶向特異性的其它抗體類分子。天然的抗體和免疫球蛋白通常是大約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白，由兩個相同的輕(l)鏈和兩個相同的重(h)鏈組成。每個重鏈在一端具有一個可變域(vh)，後面有許多恆定域。每個輕鏈在一端具有一個可變域(vl)，在它的另一端具有一個恆定域。

關於「vh」指的是抗體的免疫球蛋白重鏈的可變域，包括fv、scfv或fab的重鏈。關於「vl」指的是免疫球蛋白輕鏈的可變域，包括fv、scfv、dsfv或fab的輕鏈。

本文使用的術語「抗體」具有最廣義的含義，是指與具體抗原特異性結合或與具體抗原免疫反應的免疫球蛋白分子，並且包括多克隆抗體、單克隆抗體、基因工程抗體以及另外的抗體的修改型，包括但不局限於：鼠抗體、嵌合抗體、人源化的抗體、雜綴合抗體(例如，雙特異性抗體、雙抗體、三抗體和四抗體)和抗體的抗原結合片段，包括，例如，fab'、f(ab')2、fab、fv、rigg和scfv片段。術語「scfv」是指單鏈fv抗體，其中，源自於常規抗體的重鏈和輕鏈的可變域結合形成一個鏈。

抗體可以是鼠、人、人源化、嵌合抗體或衍生自其它物種的抗體。抗體是能夠辨別具體抗原並與其結合的免疫系統所產生的蛋白(janeway,c.,travers,p.,walport,m.,shlomchik(2001)immunobiology,5thed.,garlandpublishing,newyork)。靶點抗原通常具有許多結合位點，也稱為表位，由多個抗體上的cdr所識別。與不同表位特異性結合的每個抗體具有不同的結構。由此，一個抗原可以具有一個以上的對應抗體。抗體包括全長免疫球蛋白分子或全長免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，包含抗原結合位點的分子，所述抗原結合位點能夠免疫特異性結合感興趣的靶點或其一部分，這種靶點包括但不局限於：癌細胞或產生與自身免疫疾病有關的自身免疫抗體的細胞。本文公開的免疫球蛋白可以是免疫球蛋白分子的任何類型(例如，igg、ige、igm、igd和iga)、種類(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亞類。免疫球蛋白可以源自於任何物種。然而，在一方面，免疫球蛋白是人、鼠或兔子源的免疫球蛋白。

術語「抗體片段」是指全長抗體的一部分，通常是靶點結合或可變域。抗體片段的實例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段。「fv」片段是最小的抗體片段，它包含全部靶點識別和結合位點。這個域由一個重鏈可變域和一個輕鏈可變域的堅固的、非共價相關的二聚體(vh-vl二聚體)組成。在這個構型中，每個可變域的三個cdr相互作用，限定vh-vl二聚體表面上的靶點結合位點。通常，六個cdr賦予抗體靶點結合特異性。然而，在有些情況下，即使單個可變域(或只包含三個對於靶點特異性的cdr的fv的一半)也可以具有識別和結合靶點的能力。「單鏈fv」或「scfv」抗體片段在單個多肽鏈中包含抗體的vh和vl域。通常，fv多肽在vh和vl域之間進一步包含多肽連接子，能夠使scfv形成靶向結合的目標結構。「單域抗體」由單一vh或vl域組成，對於靶點表現出足夠的親合性。在一個具體實施方案中，單域抗體是camelized化的抗體(參見，例如，riechmann,1999,journalofimmunologicalmethods231:25-38)。

fab片段包含輕鏈的恆定域以及重鏈的第一個恆定域(ch1)。fab'片段由於在重鏈chl域的羧基端添加幾個殘基(包括一個或多個抗體絞鏈區的半胱氨酸)，它與fab片段不同。f(ab')片段是由在f(ab')2胃蛋白酶消化產物的鉸鏈半胱氨酸處的二硫鍵斷裂所產生的。本領域普通技術人員了解抗體片段的其它化學綴合。

輕鏈和重鏈可變域具有互補性決定區(cdr)，亦稱高變區。可變域的更加高度保守的部分被稱作骨架(fr)。正如本領域已知的那樣，根據上下文和本領域已知的各種定義，描繪抗體的高變區的胺基酸位置/邊界可以改變。可以把可變域內的一些位置看作混雜型高變位置，原因在於，根據一套標準，可以認為這些位置在高變區內，而根據一套不同的標準，可以認為這些位置在高變區的外面。還可以在延長的高變區中發現這些位置中的一個或多個。每個鏈中的cdr通過fr區近似緊密地結合在一起，與其它鏈的cdr一起，有助於形成抗體的靶點結合位點(參見，kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(nationalinstituteofhealth,bethesda,md.1987)。本文使用的免疫球蛋白胺基酸殘基編號，是按照kabat等人的免疫球蛋白胺基酸殘基編號系統進行編號的，除非另外說明。

在某些實施方案中，本公開的adc的抗體是單克隆抗體。術語「單克隆抗體」(mab)是指衍生自單一複製品或克隆體的抗體，包括，例如，任何真核、原核或噬菌體克隆體，並且不是指製備它的方法。優選，本公開的單克隆抗體以均勻或基本上均勻的形式存在。單克隆抗體包括能夠與蛋白特異性結合的完整分子以及抗體片段(例如，fab和f(ab')2片段)。與完整抗體相比，fab和f(ab')2片段缺少完整抗體的fc片段，能夠更加快速地從動物的循環中清除，並且非特異性的組織結合更少(wahl等人，1983,j.nucl.med.24:316)。可以使用本領域已知的多種技術，製備本公開使用的單克隆抗體，包括使用雜交瘤、重組和噬菌體展示技術，或其組合。本公開的抗體包括嵌合、靈長類化(primatized)、人源化或人類抗體。

儘管在大多數情況下，抗體只由遺傳編碼的胺基酸組成，但在一些實施方案中，為了控制與抗體連接的bcl-xl抑制劑的數目以及它們的位置，可以在特定位置引入非編碼的胺基酸。在下列文獻中，討論了可以引入到抗體中的、用於控制化學計量和連接位置的非編碼的胺基酸的實例，以及製備這種修飾的抗體的方法：tian等人，2014,procnat』lacadsciusa111(5):1766-1771，以及axup等人，2012,procnat』lacadsciusa109(40):16101-16106，，本文以引證的方式結合它們的全部內容。在某些實施方案中，非編碼的胺基酸將每個抗體的bcl-xl抑制劑的數目限定至大約1-8個或大約2-4個。

在某些實施方案中，本文所描述的adc的抗體是嵌合抗體。本文使用的術語「嵌合」抗體是指具有可變序列的抗體，其衍生自非人免疫球蛋白，例如大鼠或小鼠抗體，以及人免疫球蛋白恆定域，通常選自人免疫球蛋白模板。製備嵌合抗體的方法在本領域是已知的。參見，例如，morrison,1985,science229(4719):1202-7；oi等人，1986,biotechniques4:214-221；gillies等人，1985,j.immunol.methods125:191-202；美國專利us5,807,715；4,816,567；以及4,816397，本文以引證的方式結合它們的全部內容。

在某些實施方案中，本文所描述的adc的抗體是人源化的抗體。非人(例如，鼠)抗體的「人源化」形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如，fv、fab、fab'、f(ab')2或抗體的其它靶點結合子域)，其包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化的抗體包含基本上所有可變域、至少一個可變域，和典型地兩個可變域，其中，所有的或基本上所有的cdr區與非人免疫球蛋白的cdr區對應，所有或基本上所有的fr區是人免疫球蛋白序列的fr區。人源化的抗體還可以包含免疫球蛋白恆定區(fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白共有序列的恆定區的至少一部分。抗體人源化的方法在本領域是已知的方法。參見，例如，riechmann等人，1988,nature332:323-7；美國專利us5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370(queen等人)；ep239400；pct公開出版物wo91/09967；美國專利us5,225,539；ep592106；ep519596；padlan,1991,mol.immunol.,28:489-498；studnicka等人，1994,prot.eng.7:805-814；roguska等人，1994,proc.natl.acad.sci.91:969-973；以及美國專利us5,565,332，本文以引證的方式結合它們的全部內容。

在某些實施方案中，本文所描述的adc的抗體是人類抗體。對於人類患者的治療處理來說，需要完全「人類」抗體。本文使用的「人類抗體」包括具有人免疫球蛋白的胺基酸序列的抗體，包括從人免疫球蛋白庫、或從對於一或多種人免疫球蛋白是轉基因的並且不表達內源性免疫球蛋白的動物中分離出來的抗體。可以利用本領域已知的各種方法製備人類抗體，包括使用來源於人免疫球蛋白序列的抗體庫的噬菌體展示方法。參見美國專利us4,444,887、4,716,111、6,114,598、6,207,418、6,235,883、7,227,002、8,809,151和美國公開申請2013/189218，本文以引證的方式結合它們的全部內容。還可以使用不能表達功能性的內源性免疫球蛋白但可以表達人免疫球蛋白基因的轉基因小鼠製備人類抗體。參見，例如，美國專利us5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；5,939,598；7,723,270；8,809,051，以及美國公開申請2013/117871，本文以引證的方式結合它們的全部內容。另外，使用與上述技術相似的技術，可以使公司(例如，medarex(princeton，nj)、astellaspharma(deerfield，il)和regeneron(tarrytown，ny))提供直接針對所選擇的抗原的人類抗體。識別所選擇的表位的完全人類抗體，可以使用被稱為「導向選擇」的技術來產生。在這種方法中，所選擇的非人類單克隆抗體，例如，小鼠抗體，用於引導完全人類抗體的選擇，所述完全人類抗體識別相同的表位(jespers等人，1988,biotechnology12:899-903)。

在某些實施方案中，本文所描述的adc的抗體是靈長類化(primatized)的抗體。術語「靈長類化(primatized)的抗體」是指包含猴子可變區和人類恆定區的抗體。製備靈長類化(primatized)的抗體的方法在本領域是已知的方法。參見，例如，美國專利us5,658,570、5,681,722和5,693,780，本文以引證的方式結合它們的全部內容。

在某些實施方案中，本文所描述的adc的抗體是雙特異性抗體或雙可變域抗體(dvd)。雙特異性和dvd抗體是單克隆抗體，通常是人類或人源化的抗體，對於至少兩種不同的抗原具有結合特異性。例如，美國專利us7,612,181描述了dvd，本文以引證的方式結合其公開內容。

在某些實施方案中，本文所描述的adc的抗體是衍生的抗體。例如(但沒有限制性)，衍生的抗體通常是利用糖基化、乙醯化、peg化、磷酸化、醯胺化、通過已知的保護/封端基團衍生化、蛋白酶裂解、連接到細胞配體或其它蛋白上等等來進行修飾的。可以利用已知的技術，進行許多化學修飾的任何修飾，包括但不限於：特異性化學裂解、乙醯化、甲醯化、衣黴素的代謝合成，等等。另外，衍生物可以包含一個或多個非天然的胺基酸，例如，使用ambrx技術(參見，例如，wolfson,2006,chem.biol.13(10):1011-2)。

在某些實施方案中，本文描述的adc的抗體具有已被修飾的序列，相對於相應的野生型序列，這種修飾改變至少一個恆定區介導的生物效應子功能。例如，在一些實施方案中，可以修飾抗體，以相對於未修飾的抗體，減少至少一個恆定區介導的生物效應子功能，例如減少與fc受體(fcr)的結合。使抗體的免疫球蛋白恆定區片段在fcr相互作用所必需的特定區域發生突變，可以減少fcr結合(參見，例如，canfϊeldandmorrison,1991,j.exp.med.173:1483-1491；以及lund等人，1991,j.immunol.147:2657-2662)。

在某些實施方案中，修飾本文描述的adc的抗體，相對於未修飾的抗體，獲得或增加至少一個恆定區介導的生物效應子功能，例如增強fcγr相互作用(參見，例如，us2006/0134709)。例如，具有結合了fcγriia、fcγriib和/或fcγriiia的恆定區(比相應的野生型恆定區具有更大的親合性)的抗體，可以按照本文描述的方法製備。

在某些具體實施方案中，本文描述的adc的抗體是結合了腫瘤細胞的抗體，例如針對細胞表面受體或腫瘤相關的抗原(taa)的抗體。為了發現診斷和治療癌症的有效的細胞靶點，研究人員設法確定橫跨膜，或在一或多種具體類型的癌細胞的表面上特異性表達(與一或多種正常的非癌性細胞相比較)的橫跨膜或其它腫瘤相關的多肽。通常，與非癌性細胞的表面相比較，這種腫瘤相關的多肽更加充分地在癌細胞的表面上表達。這種細胞表面受體和腫瘤相關的抗原在本領域是已知的，並且可以使用本領域眾所周知的方法和信息製備它們，用於產生抗體。

5.3.1示範性的細胞表面受體和taa

本文描述的adc的抗體可以靶向的細胞表面受體和taa的實例包括但不局限於下列各種受體和taa。為方便起見，下面列出了與本領域已知的這些抗原有關的信息，包括名稱、別稱(alternativenames)、genbank登錄號和原始參考文獻，按照nationalcenterforbiotechnologyinformation(ncbi)的核酸和蛋白序列鑑定規則。列出的細胞表面受體和taa所對應的核酸和蛋白序列可在公共資料庫例如genbank中得到。

4-1bb

5ac

5t4

alpha-胎蛋白

血管生成素(angiopoietin)2

aslg659

tcl1

bmpr1b

brevican(bcan,behab)

c242抗原

c5

ca-125

ca-125(仿製品)

ca-ix(碳酸酐酶9)

ccr4

cd140a

cd152

cd19

cd20

cd200

cd21(c3dr)1)

cd22(b細胞受體cd22-b異構型)

cd221

cd23(ge受體)

cd28

cd30(tnfrsf8)

cd33

cd37

cd38(環狀adp核糖水解酶)

cd4

cd40

cd44v6

cd51

cd52

cd56

cd70

cd72(lyb-2，b細胞分化抗原cd72)

cd74

cd79a(cd79a,cd79α,免疫球蛋白相關的alpha)genbank登錄號（accessionno.）：np__001774.10)

cd79b(cd79b,cd79β,b29)

cd80

cea

cea-相關抗原

ch4d5

cldn18.2

cripto(cr,cr1,crgf,tdgf1畸胎癌衍生的生長因子)

ctla-4

cxcr5

dll4

dr5

e16(lat1,slc7a5)egfl7

egfr

epcam

ephb2r(drt,erk,hek5,epht3,tyro5)

episialin

erbb3

etbr(內皮素b型受體)

fcrh1(fc受體類蛋白1)

fcrh2(包含磷酸酶錨定蛋白的ifgp4、irta4、spap1、spap1b、spap1c、sh2域)

纖連蛋白額外域-b

葉酸受體1

突變型受體

gd2

gd3神經節苷脂

geda

gpnmb

her1

her2(erbb2)

her2/neu

her3

hgf

hla-dob

hla-dr

人類擴散因子受體激酶

igf-1受體

igg4

il-13

il20rα(il20ra,zcytor7)

il-6

ilgf2

ilfr1r

整聯蛋白α

整聯蛋白α5β1

整聯蛋白αvβ3

irta2(免疫球蛋白超家族受體遷移相關的2，基因染色體1q21)

lewis-y抗原

ly64(rp105)

mcp-1

mdp(dpep1)

mpf(msln、smr、間皮素(mesothelin)、巨核細胞強化因子)

ms4a1

msg783(rnf124、假定蛋白flj20315)

muc1

粘蛋白（mucin）canag

napi3(napi-3b、nptiib、slc34a2、ii型鈉依賴性磷酸轉運蛋白3b)

nca(ceacam6)

p2x5(嘌呤能受體p2x配體門控的離子通道5)

pd-1

pdcd1

pdgf-rα

前列腺特異性膜抗原

psca(前列腺幹細胞抗原前體物)

pscahlg

rankl

ron

sdc1

sema5b

slamf7(cs-1)

steap1

steap2(hgnc__8639、pcanap1、stamp1、steap2、stmp、前列腺癌相關的基因1)

tag-72

tem1

結合腕蛋白(tenascin)c

tenb2(tmeff2,tomoregulin,tpef,hpp1,tr)

tgf-β

trail-e2

trail-r1

trail-r2

trpm4(br22450、flj20041、trpm4、trpm4b，瞬時型受體電位陽離子通道子族m，成員4)

tactaa16.88

tweak-r

tyrp1(糖蛋白75)

vegf

vegf-a

egfr-1

vegfr-2

波形蛋白。

5.3.2示範性的抗體

本公開的adc所使用的示範性的抗體包括但不局限於：3f8(gd2)、阿巴伏單抗（abagovomab）(ca-125(仿製品))、adecatumumab(epcam)、阿夫土珠（afutuzumab）(cd20)、alacizumabpegol(vegfr2)、ald518(il-6)、阿侖單抗（alemtuzumab）(cd52)、阿替木單抗五鈉（altumomabpentetate）(cea)、amatuximab(間皮素(mesothelin))、anatumomabmafenatox(tag-72)、apolizumab(hla-dr)、arcitumomab(cea)、bavituximab(磷脂醯絲氨酸)、bectumomab(cd22)、貝利木單抗（belimumab）(baff)、besilesomab(cea-相關抗原)、貝伐單抗（bevacizumab）(vegf-a)、bivatuzumabmertansine(cd44v6)、blinatumomab(cd19)、brentuximabvedotin((cd30(tnfrsf8))、cantuzumabmertansine(mucincanag)、cantuzumabravtansine(muc1)、capromabpendetide(前列腺癌細胞)、carlumab(mcp-1)、卡曲單抗（catumaxomab）(epcam,cd3)、cc49(tag-72)、cbr96-doxadc(lewis-y抗原)、西妥昔單抗（cetuximab）(egfr)、citatuzumabbogatox(epcam)、cixutumumab(igf-1受體)、氯沙坦四氮四烯（clivatuzumabtetraxetan）(muc1)、conatumumab(trail-e2)、dacetuzumab(cd40)、dalotuzumab(胰島素樣生長因子i受體)、daratumumab((cd38(環狀adp核糖水解酶))、demcizumab(dll4)、狄諾塞麥（denosumab）(rankl)、detumomab(b-淋巴瘤細胞)、drozitumab(dr5)、dusigitumab(ilgf2)、ecromeximab(gd3神經節糖苷)、依庫珠單抗（eculizumab）(c5)、依決洛單抗（edrecolomab）(epcam)、elotuzumab(slamf7)、elsilimomab(il-6)、enavatuzumab(tweak受體)、enoticumab(dll4)、ensituximab(5ac)、依託米單抗（epitumomabcituxetan）(episialin)、依帕珠單抗（epratuzumab）(cd22)、ertumaxomab((her2/neu,cd3))、etaracizumab(整聯蛋白αvβ3)、farletuzumab(葉酸受體1)、fbta05(cd20)、ficlatuzumab(hgf)、figitumumab(igf-1受體)、flanvotumab((tyrp1(糖蛋白75))、fresolimumab(tgf-β)、galiximab(cd80)、ganitumab(igf-i)、吉妥珠單抗ozogamicin(cd33)、girentuximab((碳酸酐酶9(ca-ix))、glembatumumabvedotin(gpnmb)、ibritumomabtiuxetan(cd20)、icrucumab(vegfr-1)、igovomab(ca-125)、imab362(cldn18.2)、imgatuzumab(egfr)、indatuximabravtansine(sdc1)、intetumumab(cd51)、依託珠單抗ozogamicin(cd22)、易普利姆瑪（ipilimumab）(cd152)、iratumumab((cd30(tnfrsf8))、labetuzumab(cea)、lambrolizumab(pdcd1)、來沙木單抗（lexatumumab）(trail-r2)、林妥珠單抗（lintuzumab）(cd33)、洛伐單抗米黃丹（lorvotuzumabmertansine）(cd56)、lucatumumab(cd40)、lumiliximab((cd23(ige受體))、馬帕木單抗（mapatumumab）(trail-r1)、margetuximab(ch4d5)、馬妥珠單抗（matuzumab）(egfr)、milatuzumab(cd74)、mitumomab(gd3神經節苷脂)、莫加木珠單抗（mogamulizumab）(ccr4)、moxetumomabpasudotox(cd22)、nacolomabtafenatox(c242抗原)、naptumomabestafenatox(5t4)、narnatumab(ron)、那他珠單抗（natalizumab）(整聯蛋白α4)、necitumumab(egfr)、nesvacumab(血管生成素(angiopoietin)2)、尼妥珠單抗（nimotuzumab）(egfr)、nivolumab(igg4)、ocaratuzumab(cd20)、奧法木單抗（ofatumumab）(cd20)、olaratumab(pdgf-rα)、onartuzumab(人類擴散因子受體激醇)、ontuxizumab(tem1)、oportuzumabmonato(epcam)、oregovomab(ca-125)、otlertuzumab(cd37)、panitumumab(egfr)、pankomab(muc1的腫瘤特異性糖基化)、parsatuzumab(egfl7)、patritumab(her3)、pemtumomab(muc1)、培妥珠單抗（pertuzumab）(her2/neu)、pidilizumab(pd-1)、pinatuzumabvedotin(cd22)、pritumumab(波形蛋白)、racotumomab(n-羥乙醯基神經氨酸)、radretumab(纖連蛋白額外域-b)、ramucirumab(vegfr2)、利妥木單抗（rilotumumab）(hgf)、利妥昔單抗（rituximab）(cd20)、robatumumab(igf-1受體)、samalizumab(cd200)、satumomabpendetide(tag-72)、seribantumab(erbb3)、sibrotuzumab(fap)、sgn-cd19a(cd19)、sgn-cd33a(cd33)、siltuximab(il-6)、solitomab(epcam)、sonepcizumab(鞘氨醇-1-磷酸)、tabalumb(baff)、塔卡單抗四氮芥（tacatuzumabtetraxetan）(alpha-胎蛋白)、塔利珠單抗paptox（taplitumomabpaptox）（cd19）、tenatumomab(結合腕蛋白(tenascin)c)、teprotumumab(cd221)、tgn1412(cd28)、替尼米特單抗（ticilimumab）(ctla-4)、tigatuzumab(trail-r2)、tnx-650(il-13)、tovetumab(cd140a)、曲妥單抗（trastuzumab）(her2/neu)、trbs07(gd2)、tremelimumab(ctla-4)、tucotuzumabcelmoleukin(epcam)、ublituximab(ms4a1)、urelumab(4-1bb)、凡德他尼（vandetanib）(vegf)、vantictumab(突變型受體)、volociximab(整聯蛋白α5β1)、vorsetuzumabmafodotin(cd70)、votumumab(腫瘤抗原ctaa16.88)、扎魯木單抗（zalutumumab）(egfr)、扎木單抗（zanolimumab）(cd4)和zatuximab(her1)。

在某些實施方案中，adc的抗體結合egfr、ncam1或epcam。

5.4製備抗體的方法

可以通過免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因在宿主細胞中的重組表達，製備adc的抗體。例如，為了重組地表達抗體，用一或多種攜帶編碼抗體的免疫球蛋白輕鏈和重鏈的dna片段的重組表達載體轉染宿主細胞，使得輕鏈和重鏈在宿主細胞中表達，並且任選，分泌到培養宿主細胞的培養基中，可以從所述培養基中回收抗體。標準的重組dna方法用於獲得抗體重鏈和輕鏈基因，將這些基因結合到重組表達載體中，並且將載體引入到宿主細胞中，例如，下列文獻所描述的那些：molecularcloning;alaboratorymanual,secondedition(sambrook,fritschandmaniatis(eds),coldspringharbor,n.y.,1989),currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel,f.m.等人，eds.,greenepublishingassociates,1989)以及美國專利us4,816,397。

在一個實施方案中，fc變體抗體與它們的野生型同等物相似，但在它們的fc域方面有變化。為了產生編碼這種fc變體抗體的核苷酸，可以合成編碼野生型抗體的fc域或一部分fc域(稱為「野生型fc域」)的dna片段，並且用作使用常規誘變技術誘變產生本文所描述的抗體的模板；或者，可以直接合成編碼所述抗體的dna片段。

一旦獲得編碼野生型fc域的dna片段，可以利用標準重組dna技術，進一步操作這些dna片段，例如，將恆定區基因轉變為全長抗體鏈基因。在這些操作中，將ch-編碼的dna片段操作性地連接到編碼另一個蛋白的另一個dna片段上，例如，抗體可變區或撓性連接子。在這方面使用的術語「操作性地連接」是指連接兩個dna片段，使得這兩個dna片段編碼的胺基酸序列保留在框內。

為了表達fc變體抗體，將上述獲得的編碼部分或全長輕和重鏈的dna插入到表達載體中，使得基因操作性地連接到轉錄和轉譯控制序列上。在這種情況下，術語「操作性地連接」是指抗體基因連接到載體上，使得在載體內的轉錄和轉譯控制序列提供它們調節抗體基因的轉錄和轉譯的預期功能。選擇表達載體和表達控制序列，使它們與所使用的表達宿主細胞相容。可以將變體抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因插入到單獨的載體中，或更典型地是，將兩種基因插入到相同的表達載體中。

利用標準方法(例如，連接抗體基因片段和載體上的互補限制位點，或如果不存在限制位點，則進行平端連接)，將抗體基因插入表達載體中。在插入變體fc域序列之前，表達載體可以已經攜帶抗體可變域序列。另外或者可選地，重組表達載體可以編碼促進宿主細胞分泌抗體鏈的信號肽。可以將抗體鏈基因克隆到載體上，使得信號肽在框內與所述抗體鏈基因的氨基端連接。信號肽可以是免疫球蛋白信號肽或異源信號肽(即，源自於非免疫球蛋白的信號肽)。

除了抗體鏈基因之外，重組表達載體還攜帶控制抗體鏈基因在宿主細胞中表達的調節序列。術語「調節序列」意指包括啟動子、增強子及控制抗體鏈基因的轉錄或轉譯的其它表達控制要素(例如，聚腺苷酸化信號)。例如，這種調節序列描述在下列文獻中：goeddel,geneexpressiontechnology:methodsinenzymology185(academicpress,sandiego,ca,1990)。本領域技術人員能夠理解，可以根據下列因素來設計表達載體，包括調節序列的選擇：例如所轉染的宿主細胞的選擇、目標蛋白的表達水平，等等。哺乳動物宿主細胞表達的合適的調節序列包括：在哺乳動物細胞中引導蛋白高水平表達的病毒要素，例如啟動子和/或增強子，它們來源於巨細胞病毒(cmv)(例如，cmv啟動子/增強子)、猿猴病毒40(sv40)(例如，sv40啟動子/增強子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(admlp))和多瘤病毒。為了進一步說明病毒調控要素和其序列，參見，例如，美國專利us5,168,062(stinski)、美國專利us4,510,245(bell等人)和美國專利us4,968,615(schaffner等人)。

除了抗體鏈基因和調節序列之外，重組表達載體還可以攜帶其它序列，例如，調節載體在宿主細胞中複製(例如，複製起點)和選擇性標記基因的序列。選擇性標記基因便於選擇已經引入了載體的宿主細胞(參見，例如，美國專利us4,399,216、4,634,665和5,179,017(所述專利都屬於axel等人))。例如，通常，選擇性標記基因在已經引入載體的宿主細胞上會帶來抗藥性，例如，對於g418、嘌呤黴素、殺稻瘟菌素、潮黴素或氨甲喋呤的抗藥性。合適的選擇性標記基因包括二氫葉酸還原酶(dhfr)基因(用於帶有氨甲喋呤選擇/擴增的dhfr宿主細胞)和新基因(用於g418選擇)。為了表達輕和重鏈，利用標準技術，將編碼重和輕鏈的表達載體轉染到宿主細胞中。術語「轉染」的各種形式意在包括多種通常用於將外源性dna引入到原核或真核宿主細胞中的技術，例如電穿孔、脂轉染、磷酸鈣沉澱法、deae-葡聚糖轉染等等。

可能在原核或真核宿主細胞中表達抗體。在某些實施方案中，為了適當摺疊的和免疫活性的抗體的最佳分泌，在真核細胞中表達抗體，例如，在哺乳動物宿主細胞中表達。表達重組抗體的示範性的哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(cho細胞)(包括dhfr-cho細胞，描述在下列文獻中：urlaubandchasin,1980,proc.natl.acad.sci.usa77:4216-4220，與dhfr選擇性標記一起使用，例如，如kaufmanandsharp,1982,mol.biol.159:601-621所述)、ns0骨髓瘤細胞、cos細胞、293細胞和sp2/0細胞。當編碼抗體基因的重組表達載體被引入到哺乳動物宿主細胞中時，將宿主細胞在足以使抗體在宿主細胞中表達或使抗體分泌到宿主細胞所生長的培養基中的一段時間內培養，由此製備抗體。可以使用標準蛋白純化方法，從培養基中回收抗體。宿主細胞還可以用於製備完整抗體的一部分，例如，fab片段或scfv分子。

在一些實施方案中，adc的抗體可以是雙功能抗體。其中一個重鏈和一個輕鏈對於一個抗原具有特異性、另一個重鏈和輕鏈對於第二個抗原具有特異性的這種抗體，可以利用標準化學交聯方法，通過一個抗體與第二個抗體交聯來製備。雙功能抗體還可以通過表達設計為編碼雙功能抗體的核酸來製備。

在某些實施方案中，雙特異性抗體，即，使用相同結合位點，結合一個抗原與第二個無關的抗原的抗體，可以通過使輕鏈和/或重鏈cdr中的胺基酸殘基突變來製備。示範性的第二個抗原包括促炎細胞因子(例如，淋巴細胞毒素、幹擾素-γ或白介素-1)。例如，通過使抗原結合位點周圍的胺基酸殘基突變，可以製備雙特異性抗體(參見，例如，bostrom等人，2009,science323:1610-1614)。雙功能抗體可以通過表達設計為編碼雙特異性抗體的核酸來製備。

還可以通過化學合成來製備抗體(例如，利用solidphasepeptidesynthesis，第二版，1984，thepiercechemicalco.,rockford，ill.所描述的方法)。還可以使用無細胞的平臺產生抗體(參見，例如，chu等人，biochemiano.2,2001(rochemolecularbiologicals))。

flanagan等人(methodsinmolecularbiology，vol.378∶monoclonalantibodies∶methodsandprotocols)描述了fc融合蛋白的重組表達的方法。

一旦已經通過重組表達製備了抗體，則可以利用本領域已知的純化免疫球蛋白分子的任何方法，將抗體純化，例如，利用色譜(例如，離子交換色譜、親合色譜，尤其是通過a蛋白或g蛋白選擇之後對於抗原的親合性和sizing柱色譜)、離心、差異溶解度或純化蛋白的任何其它標準技術。

分離之後，如果需要的話，可以進一步純化抗體，例如，利用高效液相色譜(參見，例如，fisher，laboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology(workandburdon，eds.，elsevier，1980))，或凝膠過濾色譜(在superdextm75柱(pharmaciabiotechab，uppsala，sweden)上)。

5.5抗體-藥物綴合物合成子

抗體-藥物綴合物合成子是用於形成adc的合成中間體。所述合成子通常是按照結構式(iii)的化合物，

或其鹽，其中，d是如先前描述的bcl-xl抑制劑，l是如先前描述的連接子，rx是包含適合於共價連接合成子與抗體的官能團的部分。在具體實施方案中，合成子是按照結構式(iiia)的化合物或其鹽，其中，ar、r1、r2、r4、r10a、r10b、r10c、r11a、r11b、z1、z2和n如先前結構式(iia)所定義，l和rx如結構式(iii)所定義∶

為了合成adc，在官能團rx與抗體上的「互補」官能團fx反應的條件下，使按照結構式(iii)的中間體合成子或其鹽與感興趣的抗體接觸，形成共價連接基。

基團rx和fx的特徵取決於連接合成子與抗體所使用的化學過程。通常，使用的化學過程不應該改變抗體的完整性，例如，它結合它的靶點的能力。優選，綴合抗體的結合性能與非綴合抗體的結合性能極其類似。分子與生物分子(例如，抗體)綴合的各種化學過程和技術在本領域是已知的，尤其是與抗體綴合的各種化學過程和技術是眾所周知的。參見，例如，amon等人，「monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy,」inmonoclonalantibodiesandcancertherapy,reisfeld等人eds.,alanr.liss,inc.,1985；hellstrom等人，「antibodiesfordrugdelivery,」incontrolleddrugdelivery(robinson等人eds.,marceldekker,inc.,2nded.1987；thorpe,「antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy:areview,」inmonoclonalantibodies'84:biologicalandclinicalapplications,pinchera等人eds.,1985；「analysis,results,andfutureprospectiveofthetherapeuticuseofradiolabeledantibodyincancertherapy,」inmonoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy,baldwin等人eds.,academicpress,1985；以及thorpe等人，1982,immunol.rev.62:119-58；和wo89/12624。任何這些化學過程可以用於連接合成子與抗體。

在一個實施方案中，rx包含能夠連接合成子與抗體上的氨基的官能團。在另一個實施方案中，rx包含nhs-酯或異硫氰酸酯。在另一個實施方案中，rx包含能夠連接合成子與抗體上的巰基的官能團。在另一個實施方案中，rx包含滷代乙醯基或馬來醯亞胺。

通常，合成子連接抗體的胺基酸殘基的側鏈，包括，例如，可及的賴氨酸殘基的伯氨基，或可及的半胱氨酸殘基的巰基。通過還原鏈間二硫鍵，可以獲得游離巰基。

在一個實施方案中，lk是與抗體ab上的氨基形成的連接基。在另一個實施方案中，lk是醯胺或硫脲。在另一個實施方案中，lk是與抗體ab上的巰基形成的連接基。在另一個實施方案中，lk是硫醚。

在一個實施方案中，d選自w1.01、w1.02、w1.03、w1.04、w1.05、w1.06、w1.07和w1.08和其鹽；l選自連接子iva.1-iva.7、ivb.1-ivb.15、ivc.1-ivc.2、va.1-va.12、vb.1-vb.4、vc.1-vc.9、vd.1-vd.2、via.1、v1c.1-v1c.2、v1d.1-v1d.3和其鹽；lk選自醯胺、硫脲和硫醚；和m是1至8的整數。

很多官能團rx和用於連接合成子與可及的賴氨酸殘基的化學過程是已知的，並且包括，例如(沒有限制性)，nhs-酯和異硫氰酸酯。

很多官能團rx和用於連接合成子與可及的半胱氨酸殘基的游離巰基的化學過程是已知的，並且包括，例如(沒有限制性)，滷代乙醯基和馬來醯亞胺。

在一個實施方案中，d選自w1.01、w1.02、w1.03、w1.04、w1.05、w1.06、w1.07和w1.08和其鹽；l選自連接子iva.1-iva.7、ivb.1-ivb.15、ivc.1-ivc.2、va.1-va.12、vb.1-vb.4、vc.1-vc.9、vd.1-vd.2、via.1、v1c.1-v1c.2、v1d.1-v1d.3和其鹽；rx包含選自nhs-酯、異硫氰酸酯、滷代乙醯基和馬來醯亞胺的官能團。

然而，綴合化學不局限於合適的側鏈基團。合適的小分子與胺連接，側鏈(例如，胺)可以轉變為其它有用的基團，例如，羥基。通過多功能小分子與抗體可及的胺基酸殘基的側鏈的綴合，這個策略可用於增加抗體中的合適連接位點的數目。

也可以設計抗體，使其包括用於綴合的胺基酸殘基。下列文獻描述了設計抗體的方法，使抗體包括在adc環境下用於綴合藥物的非遺傳編碼的胺基酸殘基：axup等人，2003,procnatlacadsci109:16101-16106，以及tian等人，2014,procnatlacadsci111:1776-1771。

用於製備本文所描述的adc的示範性合成子包括但不局限於下列合成子∶

5.6抗體藥物綴合物

在合適的靶細胞的細胞試驗和/或體內試驗中，可以證明本文所描述的adc的bcl-xl抑制活性。可以用於證明靶向egfr、epcam或ncam1的adc的活性的具體試驗提供於實施例7和8中。通常，在這種細胞試驗中，adc的ec50值小於大約5000nm，不過，adc可以顯示出顯著更低的ec50值，例如，小於大約500、300或甚至小於100nm。使用表達特定靶點抗原的細胞所進行的類似的細胞試驗，可以用於證明靶向其它抗原的adc的bcl-xl抑制活性。

5.7合成方法

本文所描述的bcl-xl抑制劑以及合成子，可以使用已知的有機化學的標準技術來合成。下面提供了合成bcl-xl抑制劑以及合成子的常規反應路線，它們可以原樣使用，或進行修改，用於合成全部範圍的本文所描述的bcl-xl抑制劑以及合成子。合成示範性的bcl-xl抑制劑與合成子的可以用於指導的具體方法提供於實施例部分中。

也可以利用標準方法製備adc，例如，與下列文獻所描述的方法類似的方法：hamblett等人，2004,「effectsofdrugloadingontheantitumoractivityofamonoclonalantibodydrugconjugate,」clin.cancerres.10:7063-7070；doronina等人，2003,「developmentofpotentandhighlyefficaciousmonoclonalantibodyauristatinconjugatesforcancertherapy,」nat.biotechnol.21(7):778-784；以及francisco等人，2003,「caclo-vcmmae,ananti-cd30-monomethylauristatineconjugatewithpotentandselectiveantitumoractivity,」blood102:1458-1465。例如，每個抗體帶有四個藥物的adc，可以如下製備：在37℃下，使用過量的還原劑，例如，dtt或tcep，部分還原抗體30分鐘，然後，使用1mmdtpa/dpbs，通過sephadex®g-25樹脂洗脫，進行緩衝液交換。用dpbs進一步稀釋洗脫液，可以使用5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)[ellman's試劑]，測定抗體的硫醇濃度。在4℃下，加入過量(例如，5倍)的連接子-藥物合成子(經過1小時)，並通過加入實質上過量(例如，20倍)的半胱氨酸，淬滅該綴合反應。可以在sephadexg-25(在pbs中平衡)上純化所得到的adc混合物，除去未反應的合成子，如果需要的話，進行脫鹽，並且通過分子排阻色譜純化。然後，可以通過0.2μm過濾器，將得到的adc無菌過濾，如果需要的話，冷凍乾燥，儲存。在某些實施方案中，所有鏈間的半胱氨酸二硫鍵被連接子-藥物綴合物替代。

合成示範性的adc的具體方法提供於實施例部分中，可以用於合成全部範圍的本文所描述的adc。

5.7.1合成bcl-xl抑制劑的一般方法

5.7.1.1合成化合物(9)

反應路線1

。

反應路線1描述了吡唑中間體式(9)的合成方法。可以用bh3·thf處理3-溴-5,7-二甲基金剛烷甲酸(1)，提供3-溴-5,7-二甲基金剛烷甲醇(2)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑（例如但不局限於：四氫呋喃）中進行。在氰基亞甲基三丁基正膦的存在下，用1h-吡唑處理3-溴-5,7-二甲基金剛烷甲醇(2)，可以製備1-((3-溴-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基)甲基)-1h-吡唑(3)。該反應通常在升高的溫度下、在溶劑（例如但不局限於：甲苯）中進行。在鹼(例如但不局限於：三乙胺)的存在下，可以用乙烷-1,2-二醇處理1-((3-溴-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基)甲基)-1h-吡唑(3)，提供2-{[3,5-二甲基-7-(1h-吡唑-1-基甲基)三環[3.3.1.13,7]癸-1-基]氧基}乙醇(4)。該反應通常在升高的溫度下進行，並且該反應可以在微波條件下進行。可以用強鹼(例如但不局限於：正丁基鋰)處理2-{[3,5-二甲基-7-(1h-吡唑-1-基甲基)三環[3.3.1.13,7]癸-1-基]氧基}乙醇(4)，而後加入碘甲烷，提供2-({3,5-二甲基-7-[(5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙醇(5)。加入和反應通常在溶劑(例如但不局限於：四氫呋喃)中、在降低的溫度下進行，而後升溫至環境溫度進行後處理。可以用n-碘代琥珀醯亞胺處理2-({3,5-二甲基-7-[(5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙醇(5)，提供1-({3,5-二甲基-7-[2-(羥基)乙氧基]三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}甲基)-4-碘代-5-甲基-1h-吡唑(6)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑（例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺）中進行。在鹼（例如但不局限於：三乙胺）的存在下，1-({3,5-二甲基-7-[2-(羥基)乙氧基]三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}甲基)-4-碘代-5-甲基-1h-吡唑(6)與甲磺醯氯反應，而後加入胺h2nr4，可以製備式(7)的化合物。與甲磺醯氯的反應通常在低溫下進行，而後升高溫度用於與胺的反應，且該反應通常在溶劑（例如但不局限於：四氫呋喃）中進行。在4-二甲基氨基吡啶的存在下，可以使式(7)的化合物與二碳酸二叔丁基酯反應，提供式(8)的化合物。該反應通常在環境溫度下、在溶劑（例如但不局限於：四氫呋喃）中進行。式(8)的化合物的硼化以提供式(9)的化合物，可以在本文描述的條件下和容易在文獻中得到的條件下進行。

5.7.1.2合成化合物(14)

反應路線2

反應路線2描述了式(14)的中間體的合成方法。在鹼（例如但不局限於：n,n-二異丙基乙胺或三乙胺）的存在下，式(10)的化合物與3-溴-6-氟吡啶甲酸叔丁基酯(11)反應，可以製備式(12)的化合物。該反應通常在惰性氣氛中、在升高的溫度下、在溶劑（例如但不局限於：二甲亞碸）中進行。在本文或在文獻中所描述的硼化條件下，可以使式(12)的化合物與4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷(13)反應，提供式(14)的化合物。

5.7.1.3合成化合物(24)

反應路線3

反應路線3描述了製備中間體的方法，所述中間體包含與金剛烷連接的-nu(親核試劑)和以叔丁基酯形式保護的吡啶甲酸酯。在本文或文獻所描述的suzuki偶合條件下，可以使2-(6-(叔丁氧羰基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲酯(14)與1-({3,5-二甲基-7-[2-(羥基)乙氧基]三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}甲基)-4-碘代-5-甲基-1h-吡唑(6)反應，提供2-(6-(叔丁氧羰基)-5-(1-((3-(2-羥乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲酯(17)。可以用鹼(例如但不局限於：三乙胺)處理2-(6-(叔丁氧羰基)-5-(1-((3-(2-羥乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲酯(17)，而後用甲磺醯氯處理，提供2-(6-(叔丁氧羰基)-5-(1-((3,5-二甲基-7-(2-((甲磺醯基)氧基)乙氧基)金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲酯(18)。加入通常在溶劑(例如但不局限於：二氯甲烷)中在低溫下進行，而後升溫至環境溫度。可以使2-(6-(叔丁氧羰基)-5-(1-((3,5-二甲基-7-(2-((甲磺醯基)氧基)乙氧基)金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲酯(18)與式(19)的親核試劑(nu)反應，提供式(20)的化合物。親核試劑的實例包括但不局限於：疊氮化鈉、甲胺、氨和亞氨基二碳酸二叔丁基酯。可以使式(20)的化合物與氫氧化鋰反應，提供式(21)的化合物。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：四氫呋喃、甲醇、水或其混合物)中進行。在本文所描述或容易在文獻中獲得的醯胺化條件下，可以使式(21)的化合物與式(22)的化合物反應，其中，ar如本文所述，提供式(23)的化合物。在溶劑(例如但不局限於：二氯甲烷或二噁烷)中，可以用酸(例如，三氟乙酸或hcl)處理式(23)的化合物，提供式(24)的化合物。

5.7.1.4合成化合物(34)

反應路線4

反應路線4描述了化合物(34)的合成方法。在本文所描述或容易在文獻中獲得的醯胺化條件下，可以使式(25)的化合物與式(26)的化合物反應，其中，ar如本文所述，提供式(27)的化合物。在鹼(例如但不局限於：碳酸銫)的存在下，可以使式(27)的化合物與3-溴-6-氟吡啶甲酸叔丁基酯(11)反應，提供式(28)的化合物。該反應通常在升高的溫度下、在溶劑（例如但不局限於：n,n-二甲基乙醯胺）中進行。在本文或文獻所描述的suzuki偶合條件下，式(28)的化合物與式(29)的硼酸酯(或等效的硼酸)反應，可以製備式(30)的化合物。用三氟乙酸處理式(30)的化合物，可以製備式(31)的化合物。該反應通常在環境溫度下、在溶劑（例如但不局限於：二氯甲烷）中進行。可以使式(31)的化合物與2-甲氧基乙醛(32)反應，而後使用還原劑，例如但不局限於：硼氫化鈉，提供式(33)的化合物。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：二氯甲烷、甲醇或其混合物)中進行。在溶劑(例如但不局限於：二氯甲烷或二噁烷)中，可以用酸(例如，三氟乙酸或hcl)處理式(33)的化合物，提供式(34)的化合物。

5.7.2合成合成子的一般方法

在下面的反應路線中，變量ar2在式(iia)的化合物中代表，變量ar1在式(iia)的化合物中代表。

5.7.2.1合成化合物(89)

反應路線5

如反應路線5所示，在本文所描述或容易在文獻中得到的醯胺化條件下，式(77)的化合物，其中，pg是合適的對鹼不穩定的保護基，和aa(2)是cit、ala或lys，可以與4-(氨基苯基)甲醇(78)反應，提供化合物(79)。化合物(79)與鹼(例如但不局限於：二乙胺)反應，可以製備化合物(80)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺)中進行。在本文所描述或在文獻中容易得到的醯胺化條件下，化合物(81)，其中，pg是合適的對鹼或酸敏感的保護基，和aa(1)是val或phe，可以與化合物(80)反應，提供化合物(82)。視情況而定，用二乙胺或三氟乙酸處理化合物(82)，可以製備化合物(83)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑（例如但不局限於：二氯甲烷）中進行。化合物(84)，其中，sp是間隔基，可以與化合物(83)反應，提供化合物(85)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺)中進行。在鹼(例如但不局限於：n,n-二異丙基乙胺)的存在下，可以使化合物(85)與雙(4-硝基苯基)碳酸酯(86)反應，提供化合物(87)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺)中進行。在鹼(例如但不局限於：n,n-二異丙基乙胺)的存在下，可以使化合物(87)與化合物(88)反應，提供化合物(89)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺)中進行。

5.7.2.2合成化合物(94)和(96)

反應路線6

反應路線6描述了另一個mab-連接子與二肽合成子連接的方法。在鹼(例如但不局限於：n,n-二異丙基乙胺)的存在下，可以使化合物(88)與化合物(90)反應，提供化合物(91)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺)中進行。化合物(91)與二乙胺反應，可以製備化合物(92)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺)中進行。在本文所描述或容易在文獻中得到的醯胺化條件下，化合物(93)，其中，x1是cl、br或i，可以與化合物(92)反應，提供化合物(94)。在本文所描述或容易在文獻中獲得的醯胺化條件下，可以使化合物(92)與式(95)的化合物反應，提供化合物(96)。

5.7.2.3合成化合物(106)

反應路線7

反應路線7描述了乙烯基葡糖苷酸連接子中間體與合成子的合成方法。可以用氧化銀處理(2r,3r,4s,5s,6s)-2-溴-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(97)，而後使用4-溴-2-硝基苯酚(98)，提供(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(4-溴-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(99)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：乙腈)中進行。在鹼(例如但不局限於：碳酸鈉)和催化劑(例如但不局限於：三(二亞苄基丙酮)二鈀(pd2(dba)3))的存在下，可以使(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(4-溴-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(99)與(e)-叔丁基二甲基((3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)烯丙基)氧基)矽烷(100)反應，提供(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(4-((e)-3-((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)丙-1-烯-1-基)-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(101)。該反應通常在升高的溫度下、在溶劑(例如但不局限於：四氫呋喃)中進行。在酸(例如但不局限於：鹽酸)的存在下，(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(4-((e)-3-((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)丙-1-烯-1-基)-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(101)與鋅反應，可以製備(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(2-氨基-4-((e)-3-羥基丙-1-烯-1-基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(102)。加入通常在低溫下在溶劑(例如但不局限於：四氫呋喃、水或其混合物)中進行，而後升溫至環境溫度。在鹼(例如但不局限於：n,n-二異丙基乙胺)的存在下，可以使(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(2-氨基-4-((e)-3-羥基丙-1-烯-1-基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(102)與(9h-芴-9-基)甲基(3-氯-3-氧代丙基)氨基甲酸酯(103)反應，提供(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(2-(3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙醯胺基)-4-((e)-3-羥基丙-1-烯-1-基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(104)。加入通常在低溫下在溶劑(例如但不局限於：二氯甲烷)中進行，而後升溫至環境溫度。在鹼(例如但不局限於：n,n-二異丙基乙胺)的存在下，可以使化合物(88)與(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(2-(3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙醯胺基)-4-((e)-3-羥基丙-1-烯-1-基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(104)反應，而後進行後處理，並在鹼(例如但不局限於：n,n-二異丙基乙胺)的存在下與式(105)的化合物反應，提供化合物(106)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺)中進行。

5.7.2.4合成化合物(115)

反應路線8

反應路線8描述了代表性的2-醚葡糖苷酸連接子中間體與合成子的合成方法。在碳酸銀的存在下，可以使(2s,3r,4s,5s,6s)-2-溴-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(97)與2,4-二羥基苯甲醛(107)反應，提供(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(4-甲醯基-3-羥基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(108)。該反應通常在升高的溫度下、在溶劑(例如但不局限於：乙腈)中進行。可以用硼氫化鈉處理(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(4-甲醯基-3-羥基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(108)，提供(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(3-羥基-4-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(109)。加入通常在低溫下在溶劑(例如但不局限於：四氫呋喃、甲醇或其混合物)中進行，而後升溫至環境溫度。在咪唑的存在下，(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(3-羥基-4-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(109)與叔丁基二甲基甲矽烷基氯反應，可以製備(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(4-(((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)甲基)-3-羥基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(110)。該反應通常在低溫下、在溶劑(例如但不局限於：二氯甲烷)中進行。在三苯基膦和偶氮二甲酸酯(例如但不局限於：二氮烯-1,2-二甲酸二叔丁基酯)的存在下，(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(4-(((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)甲基)-3-羥基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(110)與(9h-芴-9-基)甲基(2-(2-羥乙氧基)乙基)氨基甲酸酯反應，可以製備(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(3-(2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-4-(((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(111)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑中進行，例如但不局限於：甲苯。可以用乙酸處理(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(3-(2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-4-(((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(111)，提供(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(3-(2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-4-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(112)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：水、四氫呋喃或其混合物)中進行。在鹼(例如但不局限於：n,n-二異丙基乙胺)的存在下，(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(3-(2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-4-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(112)與雙(4-硝基苯基)碳酸酯反應，可以製備(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(3-(2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(113)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺)中進行。在鹼(例如但不局限於：n,n-二異丙基乙胺)的存在下，可以用化合物(88)處理(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(3-(2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(113)，而後用氫氧化鋰處理，提供化合物(114)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺、四氫呋喃、甲醇或其混合物)中進行。在鹼(例如但不局限於：n,n-二異丙基乙胺)的存在下，化合物(114)與化合物(84)反應，可以製備化合物(115)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺)中進行。

5.7.2.5合成化合物(119)

反應路線9

反應路線9描述了將第二個增溶基團引入到糖連接子上的方法。在本文描述的或容易在文獻中得到的醯胺化條件下，可以使化合物(116)與(r)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-磺丙酸(117)反應，而後用鹼(例如但不局限於：二乙胺)處理，提供化合物(118)。在本文所描述或容易在文獻中獲得的醯胺化條件下，可以使化合物(118)與化合物(84)反應，其中，sp是間隔基，提供化合物(119)。

5.7.2.6合成化合物(129)

反應路線10

反應路線10描述了4-醚葡糖苷酸連接子中間體與合成子的合成方法。在鹼(例如但不局限於：碳酸鉀)的存在下，2,4-二羥基苯甲醛(120)與1-溴-2-(2-溴乙氧基)乙烷(121)反應，可以製備4-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)-2-羥基苯甲醛(122)。該反應通常在升高的溫度下、在溶劑(例如但不局限於：乙腈)中進行。可以用疊氮化鈉處理4-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)-2-羥基苯甲醛(122)，提供4-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-2-羥基苯甲醛(123)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺)中進行。在氧化銀的存在下，4-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-2-羥基苯甲醛(123)與(3r,4s,5s,6s)-2-溴-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(124)反應，可以製備(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(5-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-2-甲醯基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(125)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：乙腈)中進行。在pd/c的存在下，(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(5-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-2-甲醯基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(125)的氫化，提供(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(5-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-2-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(126)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑中進行，例如但不局限於：四氫呋喃。在鹼(例如但不局限於：n,n-二異丙基乙胺)的存在下，用(9h-芴-9-基)甲基氯甲酸酯處理(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(5-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-2-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(126)，可以製備(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(5-(2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-2-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(127)。該反應通常在低溫下、在溶劑(例如但不局限於：二氯甲烷)中進行。在鹼(例如但不局限於：n,n二異丙基乙胺)的存在下，可以使化合物(88)與(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(5-(2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-2-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(127)反應，而後用氫氧化鋰處理，提供化合物(128)。該反應通常在低溫下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺)中進行。在鹼(例如但不局限於：n,n-二異丙基乙胺)的存在下，化合物(128)與化合物(84)反應，可以製備化合物(129)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺)中進行。

5.7.2.7合成化合物(139)

反應路線11

反應路線11描述了氨基甲酸酯葡糖苷酸中間體與合成子的合成方法。可以用氫化鈉處理2-氨基-5-(羥甲基)苯酚(130)，而後與2-(2-疊氮基乙氧基)乙基4-甲基苯磺酸酯(131)反應，提供(4-氨基-3-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)苯基)甲醇(132)。該反應通常在升高的溫度下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺)中進行。在咪唑的存在下，(4-氨基-3-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)苯基)甲醇(132)與叔丁基二甲基氯矽烷反應，可以製備2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-4-(((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)甲基)苯胺(133)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑中進行，例如但不局限於：四氫呋喃。在鹼(例如但不局限於：三乙胺)的存在下，可以用光氣處理2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-4-(((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)甲基)苯胺(133)，而後在鹼(例如但不局限於：三乙胺)的存在下，與(3r,4s,5s,6s)-2-羥基-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(134)反應，提供(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(((2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-4-(((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)甲基)苯基)氨基甲醯基)氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(135)。該反應通常在溶劑(例如但不局限於：甲苯)中進行，加入通常在低溫下進行，加入光氣之後，升溫至環境溫度，並在加入(3r,4s,5s,6s)-2-羥基-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(134)之後，在升高的溫度下加熱。(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(((2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-4-(((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)甲基)苯基)氨基甲醯基)氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(135)與對甲苯磺酸一水合物反應，可以製備(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(((2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-4-(羥甲基)苯基)氨基甲醯基)氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(136)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑中進行，例如但不局限於：甲醇。在鹼(例如但不局限於：n,n-二異丙基乙胺)的存在下，可以使(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(((2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-4-(羥甲基)苯基)氨基甲醯基)氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(136)與雙(4-硝基苯基)碳酸酯反應，提供(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(((2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲醯基)氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(137)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺)中進行。在鹼(例如但不局限於：n,n-二異丙基乙胺)的存在下，可以使(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(((2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲醯基)氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(137)與化合物反應，而後用氫氧化鋰水溶液處理，提供化合物(138)。第一步通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺)中進行，第二步通常在低溫下、在溶劑(例如但不局限於：甲醇)中進行。可以用三(2-羧乙基))膦鹽酸鹽處理化合物(138)，而後在鹼(例如但不局限於：n,n-二異丙基乙胺)的存在下，與化合物(84)反應，提供化合物(139)。與三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽的反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：四氫呋喃、水或其混合物)中進行，與n-琥珀醯亞胺基6-馬來醯亞胺基(maleimido)己酸鹽的反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺)中進行。

5.7.2.8合成化合物(149)

反應路線12

反應路線20描述了半乳糖苷連接子中間體與合成子的合成方法。可以用乙酸中的hbr處理(2s,3r,4s,5s,6r)-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2h-吡喃-2,3,4,5-四基四乙酸酯(140)，提供(2r,3s,4s,5r,6s)-2-(乙醯氧基甲基)-6-溴四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(141)。該反應通常在環境溫度下、在氮氣氛圍中進行。在4-羥基-3-硝基苯甲醛(142)的存在下，用氧化銀(i)處理(2r,3s,4s,5r,6s)-2-(乙醯氧基甲基)-6-溴四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(141)，可以製備(2r,3s,4s,5r,6s)-2-(乙醯氧基甲基)-6-(4-甲醯基-2-硝基苯氧基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(143)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：乙腈)中進行。可以用硼氫化鈉處理(2r,3s,4s,5r,6s)-2-(乙醯氧基甲基)-6-(4-甲醯基-2-硝基苯氧基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(143)，提供(2r,3s,4s,5r,6s)-2-(乙醯氧基甲基)-6-(4-(羥甲基)-2-硝基苯氧基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(144)。該反應通常在低溫下、在溶劑(例如但不局限於：四氫呋喃、甲醇或其混合物)中進行。在鹽酸的存在下，用鋅處理(2r,3s,4s,5r,6s)-2-(乙醯氧基甲基)-6-(4-(羥甲基)-2-硝基苯氧基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(144)，可以製備(2r,3s,4s,5r,6s)-2-(乙醯氧基甲基)-6-(2-氨基-4-(羥甲基)苯氧基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(145)。該反應通常在低溫下、在氮氣氛圍中、在溶劑(例如但不局限於：四氫呋喃)中進行。在鹼(例如但不局限於：n,n-二異丙基乙胺)的存在下，(2r,3s,4s,5r,6s)-2-(乙醯氧基甲基)-6-(2-氨基-4-(羥甲基)苯氧基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(145)與(9h-芴-9-基)甲基(3-氯-3-氧代丙基)氨基甲酸酯(103)反應，可以製備(2s,3r,4s,5s,6r)-2-(2-(3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙醯胺基)-4-(羥甲基)苯氧基)-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(146)。該反應通常在低溫下、在溶劑(例如但不局限於：二氯甲烷)中進行。在鹼(例如但不局限於：n,n-二異丙基乙胺)的存在下，可以使(2s,3r,4s,5s,6r)-2-(2-(3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙醯胺基)-4-(羥甲基)苯氧基)-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(146)與雙(4-硝基苯基)碳酸酯反應，提供(2s,3r,4s,5s,6r)-2-(2-(3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙醯胺基)-4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(147)。該反應通常在低溫下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺)中進行。在鹼(例如但不局限於：n,n-二異丙基乙胺)的存在下，可以使(2s,3r,4s,5s,6r)-2-(2-(3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙醯胺基)-4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(147)與化合物(88)反應，而後用氫氧化鋰處理，提供化合物(148)。第一步通常在低溫下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺)中進行，第二步通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：甲醇)中進行。在鹼(例如但不局限於：n,n-二異丙基乙胺)的存在下，可以用化合物(84)處理化合物(148)，其中，sp是間隔基，提供化合物(149)。該反應通常在環境溫度下、在溶劑(例如但不局限於：n,n-二甲基甲醯胺)中進行。

5.8組合物

本文描述的bcl-xl抑制劑和/或adc可以是包含所述抑制劑或adc以及一或多種載體、賦形劑和/或稀釋劑的組合物形式。可以將所述組合物配製用於具體使用，例如獸用或在人類中的藥物用途。組合物的形式(例如，乾粉、液體製劑，等等)和所使用的賦形劑、稀釋劑和/或載體取決於所述抑制劑和/或adc的目標用途，對於治療用途，取決於給藥模式。

對於治療用途，bcl-xl抑制劑和/或adc組合物可以作為包括藥用載體的無菌藥物組合物的一部分來提供。這種組合物可以是任何合適的形式(取決於給予患者的目標方法)。可以通過各種途徑給予患者所述藥物組合物，例如口服、透皮、皮下、鼻內、靜脈內、肌肉內、鞘內、局部地（topically）或局部給藥（locally）。在任何給定的情況中，最合適的給藥途逕取決於具體bcl-xl抑制劑或adc、患者、疾病的性質和嚴重程度以及患者的實際條件。通常，口服或胃腸外給予bcl-xl抑制劑，靜脈內或皮下給予adc藥物組合物。

藥物組合物可以方便地存在於單位劑型中，每個劑量包含預定數量的本文所描述的bcl-xl抑制劑或adc。單位劑量所包括的抑制劑或adc的數量取決於所治療的疾病，以及本領域眾所周知的其它因素。對於bcl-xl抑制劑，這種單位劑量可以是片劑、膠囊劑、錠劑等等形式，其含有適合於單一給藥數量的bcl-xl抑制劑。對於adc，這種單位劑量可以是含有適合於單一給藥數量的adc的冷凍乾燥的乾粉形式，或液體形式。乾粉單位劑型可以包裝在具有注射器、合適數量的稀釋劑和/或用於給藥的其它組分的試劑盒中。液體形式的單位劑量，可以方便地以預先填充了適合於單一給藥數量的adc的注射器形式提供。

也可以提供散裝形式的、含有適合於多次給藥數量的adc的藥物組合物。

通過將具有目標純度的adc與任選的本領域通常使用的可藥用載體、賦形劑或穩定劑(所有這些在本文中被稱為「載體」)混合，即，緩衝劑、穩定劑、防腐劑、等滲劑(isotonifiers)、非離子型清洗劑、抗氧化劑及其它各種添加劑，可以將adc的藥物組合物製備為用於儲存的冷凍乾燥製劑或水溶液形式。參見remington’spharmaceuticalsciences,16thedition(osol,ed.1980)。這種添加劑在使用劑量和濃度下對於接受者應該是無毒的。

緩衝劑有助於保持ph值在接近生理條件的範圍內。它們的濃度範圍可以為大約2mm至大約50mm。本公開使用的合適的緩衝劑包括有機和無機酸以及其鹽，例如，檸檬酸鹽緩衝劑(例如，檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物，等等)、琥珀酸鹽緩衝劑(例如，琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物，等等)、酒石酸鹽緩衝劑(例如，酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物，等等)、富馬酸鹽緩衝劑(例如，富馬酸-富馬酸一鈉混合物、富馬酸-富馬酸二鈉混合物、富馬酸一鈉-富馬酸二鈉混合物，等等)、葡糖酸鹽緩衝劑(例如，葡糖酸-葡糖酸鈉混合物、葡糖酸-氫氧化鈉混合物、葡糖酸-葡糖酸鉀混合物，等等)、草酸鹽緩衝劑(例如，草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物，等等)、乳酸鹽緩衝劑(例如，乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物，等等)和乙酸鹽緩衝劑(例如，乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物，等等)。另外，可以使用磷酸鹽緩衝劑、組氨酸緩衝劑和三甲胺鹽，例如tris。

為了抑制微生物生長，可以加入防腐劑，加入數量可以為大約0.2%-1%(w/v)。本公開使用的合適的防腐劑包括：苯酚、苯甲醇、間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化銨、苯扎滷銨(benzalconiumhalides)(例如，苯扎氯銨、苯扎溴銨和苯扎碘銨)、氯化六烴季銨和對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇和3-戊醇。為了保證本公開的液體組合物的等滲性，可以加入等滲劑(isotonicifiers)(有時稱為「穩定劑」)，包括多羥基糖醇，例如，三元醇或高級糖醇，例如，丙三醇、赤蘚醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。穩定劑指的是廣泛類型的賦形劑，其功能範圍可以從填充劑至添加劑，其增溶治療劑，或有助於防止變性，或防止與容器壁粘附。典型的穩定劑可以是多羥基的糖醇(上面列舉的)；胺基酸，例如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、丙氨酸、鳥氨酸、l-亮氨酸、2-苯丙氨酸、穀氨酸、蘇氨酸，等等，有機糖或糖醇，例如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、衛矛醇、丙三醇等等，包括環醇，例如肌醇；聚乙二醇；胺基酸聚合物；含硫還原劑，例如脲、穀胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸鈉、硫代甘油、α-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(例如，10個殘基或殘基更少的肽)；蛋白，例如，人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性的聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮，單糖，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，例如乳糖、麥芽糖、蔗糖，以及三糖(trisaccacharides)，例如棉子糖；和多糖，例如葡聚糖。

可以加入非離子型表面活性劑或清洗劑(亦稱「潤溼劑」)，幫助溶解糖蛋白，以及保護糖蛋白避免攪拌引起的聚集，也可以使製劑受到剪切表面應力的影響，不會引起蛋白的變性。合適的非離子型表面活性劑包括聚山梨醇酯(20、80，等等)、泊洛沙姆(polyoxamers)(184、188，等等)、複合多元醇、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(tween®-20、tween®-80，等等)。可以存在大約0.05mg/ml至大約1.0mg/ml的非離子型表面活性劑，例如大約0.07mg/ml至大約0.2mg/ml。

其它各種賦形劑包括：填充劑(例如，澱粉)、螯合劑(例如，edta)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸、甲硫氨酸、維生素e)和共溶劑。

5.9使用方法

adc所包括的bcl-xl抑制劑，以及adc所提供的合成子，抑制bcl-xl活性，並且在表達bcl-xl的細胞中誘導細胞程序死亡。相應地，可以在抑制bcl-xl活性和/或在細胞中誘導細胞程序死亡的方法中，使用bcl-xl抑制劑和/或adc。

對於bcl-xl抑制劑，所述方法通常包括：使存活至少部分地取決於bcl-xl表達的細胞，與足以抑制bcl-xl活性和/或誘導細胞程序死亡數量的bcl-xl抑制劑接觸。對於adc，所述方法通常包括：在adc能結合抗原的條件下，使存活至少部分地取決於bcl-xl表達，且表達adc的抗體的細胞表面抗原的細胞與adc接觸。

在某些實施方案中，尤其是包含adc的bcl-xl抑制劑具有低或極低細胞滲透性的那些實施方案，adc的抗體結合能夠將adc內化到細胞中的靶點，在細胞中，它可以遞送它的bcl-xl抑制合成子。可以在抑制bcl-xl活性和/或抑制細胞程序死亡的細胞試驗中體外進行所述方法，或作為需要抑制細胞程序死亡和/或誘導細胞程序死亡的疾病的治療途徑來體內進行。

細胞程序死亡失調涉及各種疾病，包括，例如，自身免疫病症(例如，系統性紅斑狼瘡、類風溼性關節炎、移植物抗宿主病、重症肌無力或舍格倫氏症候群)、慢性炎性病症(例如，牛皮癬、哮喘或克羅恩氏病)、高增殖病症(例如，乳腺癌、肺癌)、病毒感染(例如，皰疹、乳頭狀瘤或hiv)，及其它病症，例如，骨關節炎和動脈粥樣硬化。本文所描述的bcl-xl抑制劑或adc可以用於治療或改善這些疾病中的任何疾病。這種治療通常包括：給予患有所述疾病的患者足以提供治療益處數量的本文所描述的bcl-xl抑制劑或adc。對於adc，所給予的adc的抗體的特徵取決於所治療的疾病，由此，抗體應該結合在受益於抑制bcl-xl活性的細胞類型中表達的細胞表面抗原。獲得的治療益處也取決於所治療的具體疾病。在某些情況下，當以單一療法給予時，bcl-xl抑制劑或adc可以治療或改善疾病本身，或疾病的症狀。在其它情況下，bcl-xl抑制劑或adc可以是整個治療方案的一部分，所述治療方案包括其它藥劑，所述其它藥劑和抑制劑或adc一起，用於治療或改善所治療的疾病，或所述疾病的症狀。可以輔助本文所描述的bcl-xl抑制劑和/或adc給予或與本文所描述的bcl-xl抑制劑和/或adc一起給予的、用於治療或改善具體疾病的藥劑，對於本領域技術人員來說是顯而易見的。

雖然絕對治癒始終是任何治療方案的目標，但提供治療益處不要求達到治癒效果。治療益處可以包括：終止或減緩疾病的進展、使沒有治癒的疾病衰退，和/或，改善或減緩疾病症狀的發展。延長存活時間(與統計平均數相比較)和/或改善生活品質也可以認為是治療益處。

涉及細胞程序死亡失調並且在世界範圍內是顯著的健康負擔的一個具體類別的疾病是癌症。在一個具體實施方案中，本文所描述的bcl-xl抑制劑和/或adc可以用於治療癌症。癌症可以是，例如，實體腫瘤或血液腫瘤。可以用本文所描述的adc治療的癌症包括但不局限於：膀胱癌、腦癌、乳腺癌、骨髓癌、子宮頸癌、慢性淋巴細胞性白血病、結腸直腸癌、食道癌、肝細胞癌、淋巴細胞性白血病、濾泡性淋巴瘤、t細胞或b細胞的淋巴惡性腫瘤、黑素瘤、粒細胞性白血病、骨髓瘤、口腔癌、卵巢癌、非小細胞肺癌、慢性淋巴細胞性白血病、骨髓瘤、前列腺癌、小細胞肺癌或脾癌。adc尤其有益於治療癌症，這是由於，抗體可用於靶向對於腫瘤細胞特異性的bcl-xl抑制合成子，由此潛在地避免或改善不合乎需要的、與全身性給予非綴合抑制劑相關的副作用和/或毒性。一個實施方案涉及治療涉及內在的細胞程序死亡失調的疾病的方法，所述方法包括：給予患有涉及細胞程序死亡失調的疾病的患者有效提供治療益處數量的本文所描述的adc，其中，adc的抗體結合內在的細胞程序死亡失調的細胞上的細胞表面受體。一個實施方案涉及治療癌症的方法，所述方法包括：給予患有癌症的患者有效提供治療益處數量的本文所描述的adc，所述adc能夠結合在癌細胞的表面上表達的細胞表面受體或腫瘤相關抗原。

在致瘤性癌症的環境中，治療益處，除了包括上述效果之外，還可以具體包括：終止或減緩腫瘤生長的進展、使腫瘤生長衰退、根除一或多種腫瘤和/或增加患者存活時間(與所治療癌症的類型和階段的統計平均數相比較)。在一個實施方案中，所治療的癌症是致瘤性癌症。

為了提供治療益處，可以以單一療法給予bcl-xl抑制劑和/或adc，或輔助其它化學治療劑和/或放射治療給予，或與它們一起給予。本文所描述的抑制劑和/或adc可以作為輔助治療的化學治療劑可以是靶向化學治療劑(例如，其它bcl-xl抑制劑或adc、蛋白激酶抑制劑，等等)或非靶向化學治療劑(例如，非特異性的細胞毒素藥劑，例如，放射性核苷(radionucleotides)、烷基化劑和嵌合劑)。可以輔助給予的本文所描述的抑制劑和/或adc的非靶向化學治療劑包括但不局限於：氨甲喋呤、紫杉酚、左旋天冬醯胺酶、巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、羥基脲、阿糖胞苷、環磷醯胺、異環磷醯胺、亞硝基脲、順鉑、卡鉑、絲裂黴素、達卡巴嗪、甲基苄肼(procarbizine)、託泊替康、氮芥、環磷醯胺、依託泊苷、5-氟尿嘧啶、bcnu、依立替康、喜樹鹼、博來黴素、多柔比星、伊達比星、柔紅黴素、放線菌素、普卡黴素、米託蒽醌、門冬醯胺酶、長春鹼、長春花新鹼、長春瑞濱、太平洋紫杉醇、刺孢黴素和多西他賽。

已經表明，升高的bcl-xl表達與耐受化學治療和放射治療有關。本文的數據證明，不能有效作為治療癌症的單一療法的bcl-xl抑制劑和/或adc，可以輔助其它化學治療劑或放射治療給予，或與它們一起給予，從而提供治療益處。儘管不受任何手術療法束縛，但人們相信，給予對於標準化學治療劑和/或放射治療變得耐受性的腫瘤本文所描述的bcl-xl抑制劑和/或adc，可以使腫瘤敏感，這樣就可以使它們再次對化學治療劑和/或放射治療作出響應。一個實施方案涉及給予有效使腫瘤細胞對於標準化學治療和/或放射治療敏感數量的本文所描述的adc的方法。相應地，在治療癌症的背景下，「治療益處」包括給予還沒有開始化學和/或放射治療的患者、或對於已經開始化學和/或放射治療但還沒有顯示出耐受性跡象的患者、或對於化學和/或放射治療已經開始顯示出耐受性的患者本文所描述的抑制劑和/或adc，所述抑制劑和/或adc可以作為化學治療劑和/或放射治療的輔助治療，或與它們一起給予所述患者，作為使腫瘤對於化學和/或放射治療敏感的方法。

5.10劑量和給藥方案

所給予的adc的數量將取決於各種因素，包括但不局限於：所治療的具體疾病、給藥模式、目標治療益處、疾病的階段或嚴重程度、患者的年齡、體重及其它特徵，等等。有效劑量的確定在本領域技術人員的能力範圍之內。

有效劑量可以最初用細胞試驗來評估。例如，可以配製人類使用的初劑量，達到adc的循環血液或血清濃度，希望這個濃度能夠使bcl-xl抑制劑的細胞濃度處於或高於特定抑制分子的ic50值或ed50值(在細胞試驗中測定)。

還可以用體內動物模型來評估人類使用的初始劑量。各種疾病的合適的動物模型在本領域是已知的。

當輔助其它藥劑(例如，其它化學治療劑)給予或與它們一起給予時，可以以與其它藥劑相同的時間表或不同的時間表，給予adc。當以相同時間表給予時，可以在給予其它藥劑之前、之後給予adc，或與其它藥劑同時給予。在一些實施方案中，如果adc作為標準化學和/或放射療法的輔助治療給予，或與它們一起給予，可以在標準治療之前開始給予adc，例如，在標準化學和/或放射治療開始之前一天、幾天、一周、幾周、一個月或甚至幾個月之前開始給予adc。

當輔助其它藥劑給予或與其它藥劑(例如，標準化學治療劑)一起給予時，其它藥劑通常是根據它的標準給藥時間表(途徑、劑量和頻率)給予的。然而，在有些情況下，當作為adc治療的輔助治療來給予時，達到效力所需要的數量可能需要少於標準數量。

6.實施例

實施例1.合成示範性的bcl-xl抑制劑

該實施例提供了示範性的bcl-xl抑制化合物w1.01-w1.08的合成方法。使用acd/name(2012年發行)(build56084，2012年4月5日，advancedchemistrydevelopmentinc.,toronto,ontario)，將bcl-xl抑制劑(w1.01-w1.08)和合成子(實施例2.1-2.53)命名。使用acd/name(2012年發行)(build56084，2012年4月5日，advancedchemistrydevelopmentinc.,toronto,ontario)，或chemdraw®ver.9.0.7(cambridgesoft，cambridge，ma)，或chemdraw®ultraver.12.0(cambridgesoft，cambridge，ma)，將bcl-xl抑制劑和合成子中間體命名。

1.1.合成6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-3-[1-({3,5-二甲基-7-[2-(甲基氨基)乙氧基]三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸(化合物w1.01)

1.1.1.3-溴-5,7-二甲基金剛烷甲酸

在50ml圓底燒瓶中，在0℃，加入溴(16ml)。然後加入鐵粉(7g)，並將該反應在0℃下攪拌30分鐘。然後加入3,5-二甲基金剛烷-1-甲酸(12g)。將該混合物升溫至室溫，並攪拌3天。將冰和濃hcl的混合物倒入該反應混合物中。將得到的懸浮液用na2so3(50g，在200ml水中)處理兩次，破壞溴，並用二氯甲烷提取三次。將合併的有機物用1nhcl水溶液洗滌，用na2so4乾燥，過濾，並濃縮，得到粗品標題化合物。

1.1.2.3-溴-5,7-二甲基金剛烷甲醇

向實施例1.1.1(15.4g)的四氫呋喃(200ml)溶液中加入bh3(1m，在四氫呋喃中，150ml)。將該混合物在室溫下攪拌過夜。然後逐滴加入甲醇，小心地淬滅該反應混合物。然後，真空濃縮該混合物，並將殘餘物在乙酸乙酯(500ml)和2nhcl水溶液(100ml)之間平衡。用乙酸乙酯進一步提取水層兩次，並將合併的有機提取物用水和鹽水洗滌，用na2so4乾燥，並過濾。蒸發溶劑，得到標題化合物。

1.1.3.1-((3-溴-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基)甲基)-1h-吡唑

向實施例1.1.2(8.0g)的甲苯(60ml)溶液中加入1h-吡唑(1.55g)和氰基亞甲基三丁基正膦(2.0g)。將該混合物在90℃下攪拌過夜。然後，濃縮該反應混合物，並將殘餘物用矽膠柱色譜純化(10∶1的庚烷∶乙酸乙酯)，得到標題化合物。ms(esi)m/e324.2(m+h)+。

1.1.4.2-{[3,5-二甲基-7-(1h-吡唑-1-基甲基)三環[3.3.1.13,7]癸-1-基]氧基}乙醇

向實施例1.1.3(4.0g)的乙烷-1,2-二醇(12ml)溶液中加入三乙胺(3ml)。將該混合物在150℃下、在微波條件(biotageinitiator)下攪拌45分鐘。將該混合物倒入水(100ml)中，並用乙酸乙酯提取三次。用水和鹽水洗滌合併的有機提取物，用na2so4乾燥，並過濾。蒸發溶劑，得到粗品，用矽膠色譜純化粗品，用20%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，而後用5%的甲醇/二氯甲烷洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e305.2(m+h)+。

1.1.5.2-({3,5-二甲基-7-[(5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙醇

向冷卻(-78℃)的實施例1.1.4(6.05g)的四氫呋喃(100ml)溶液中加入n-buli(40ml，2.5m，在己烷中)。將該混合物在-78℃下攪拌1.5小時。通過注射器加入碘甲烷(10ml)，並將該混合物在-78℃下攪拌3小時。然後，用nh4cl水溶液淬滅該反應混合物，用乙酸乙酯提取兩次，並將合併的有機提取物用水和鹽水洗滌。用na2so4乾燥之後，過濾該溶液，濃縮，並將殘餘物用矽膠柱色譜純化，用5%的甲醇/二氯甲烷洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e319.5(m+h)+。

1.1.6.1-({3,5-二甲基-7-[2-(羥基)乙氧基]三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}甲基)-4-碘代-5-甲基-1h-吡唑

向實施例1.1.5(3.5g)的n,n-二甲基甲醯胺(30ml)溶液中加入n-碘代琥珀醯亞胺(3.2g)。將該混合物在室溫下攪拌1.5小時。然後，用乙酸乙酯(600ml)稀釋該反應混合物，並用nahso3水溶液、水和鹽水洗滌。用na2so4乾燥之後，過濾該溶液，濃縮，並將殘餘物用矽膠色譜純化(20%的乙酸乙酯/二氯甲烷)，得到標題化合物。ms(esi)m/e445.3(m+h)+。

1.1.7.2-({3-[(4-碘代-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基甲磺酸酯

向冷卻的實施例1.1.6(6.16g)的二氯甲烷(100ml)溶液中加入三乙胺(4.21g)，而後加入甲磺醯氯(1.6g)。將該混合物在室溫下攪拌1.5小時。然後，用乙酸乙酯(600ml)稀釋該反應混合物，並用水和鹽水洗滌。用na2so4乾燥之後，過濾該溶液，並濃縮，不用進一步純化殘餘物，直接在下一個反應中使用。ms(esi)m/e523.4(m+h)+。

1.1.8.1-({3,5-二甲基-7-[2-(甲基氨基)乙氧基]三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}甲基)-4-碘代-5-甲基-1h-吡唑

在微波條件(biotageinitiator)下，將實施例1.1.7(2.5g)的2m甲胺/甲醇(15ml)溶液在100℃下攪拌20分鐘。真空濃縮該反應混合物。然後，用乙酸乙酯(400ml)稀釋殘餘物，並用nahco3水溶液、水和鹽水洗滌。用na2so4乾燥之後，過濾該溶液，並濃縮，不用進一步純化殘餘物，直接在下一個反應中使用。ms(esi)m/e458.4(m+h)+。

1.1.9.[2-({3-[(4-碘代-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基]甲基氨基甲酸叔丁基酯

向實施例1.1.8(2.2g)的四氫呋喃(30ml)溶液中加入二碳酸二叔丁基酯(1.26g)和催化數量的4-二甲基氨基吡啶。將該混合物在室溫下攪拌1.5小時，並用乙酸乙酯(300ml)稀釋。用飽和nahco3水溶液、水(60ml)和鹽水(60ml)洗滌該溶液。用na2so4乾燥有機層，過濾，並濃縮。將殘餘物用矽膠色譜純化，用20%的乙酸乙酯/二氯甲烷洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e558.5(m+h)+。

1.1.10.6-氟-3-溴吡啶甲酸

在5℃，用1小時將6-氨基-3-溴吡啶甲酸(25g)的400ml二氯甲烷/氯仿(1:1)漿液加入到二氯甲烷(100ml)中的四氟硼酸亞硝(18.2g)中，並將得到的混合物再攪拌30分鐘，然後升溫至35℃，並攪拌過夜。將該反應冷卻至室溫，而後用nah2po4水溶液調節至ph4。將得到的溶液用二氯甲烷提取三次，用鹽水洗滌合併的提取物，用硫酸鈉乾燥，過濾，並濃縮，提供標題化合物。

1.1.11.3-溴-6-氟吡啶甲酸叔丁基酯

在0℃，將對甲苯磺醯氯(27.6g)加入到實施例1.1.10(14.5g)和吡啶(26.7ml)的二氯甲烷(100ml)和叔丁醇(80ml)溶液中。將該反應攪拌15分鐘，升溫至室溫，並攪拌過夜。濃縮該溶液，並在乙酸乙酯和na2co3水溶液之間分配。分離各層，並用乙酸乙酯提取水層。將有機層合併，用na2co3水溶液和鹽水衝洗，用硫酸鈉乾燥，過濾，並濃縮，提供標題化合物。

1.1.12.2-(5-溴-6-(叔丁氧羰基)吡啶-2-基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲酯

向1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲酯鹽酸鹽(12.37g)和實施例1.1.11(15g)的二甲亞碸(100ml)溶液中加入n,n-二異丙基乙胺(12ml)。將該混合物在50℃下攪拌24小時。然後，用乙酸乙酯(500ml)稀釋該混合物，用水和鹽水洗滌，並用na2so4乾燥。過濾，蒸發溶劑，得到殘餘物，用矽膠色譜純化殘餘物，用20%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e448.4(m+h)+。

1.1.13.2-(6-(叔丁氧羰基)-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)吡啶-2-基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲酯

向實施例1.1.12(2.25g)和[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯鈀(ii)(205mg)的乙腈(30ml)溶液中加入三乙胺(3ml)和頻哪醇硼烷(2ml)。在回流下，將該混合物攪拌3小時。將該混合物用乙酸乙酯(200ml)稀釋，用水和鹽水洗滌，並用na2so4乾燥。過濾，蒸發溶劑，矽膠色譜(用20%的乙酸乙酯/庚烷洗脫)，得到標題化合物。ms(esi)m/e495.4(m+h)+。

1.1.14.2-(6-(叔丁氧羰基)-5-(1-((3-(2-((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲酯

向實施例1.1.13(4.94g)的四氫呋喃(60ml)和水(20ml)溶液中加入實施例1.1.9(5.57g)、1,3,5,7-四甲基-8-十四烷基-2,4,6-三氧雜-8-磷雜金剛烷(412mg)、三(二亞苄基丙酮)二鈀(0)(457mg)和k3po4(11g)。將該混合物在回流下攪拌24小時。冷卻該反應混合物，用乙酸乙酯(500ml)稀釋，用水和鹽水洗滌，並用na2so4乾燥。過濾，蒸發溶劑，得到殘餘物，用矽膠色譜純化殘餘物，用20%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e799.1(m+h)+。

1.1.15.2-(6-(叔丁氧羰基)-5-(1-((3-(2-((叔丁氧羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸

向實施例1.1.14(10g)的四氫呋喃(60ml)、甲醇(30ml)和水(30ml)溶液中加入氫氧化鋰一水合物(1.2g)。將該混合物在室溫下攪拌24小時。用2%hcl水溶液中和該反應混合物，並真空濃縮。將殘餘物用乙酸乙酯(800ml)稀釋，用水和鹽水洗滌，並用na2so4乾燥。過濾，蒸發溶劑，得到標題化合物。ms(esi)m/e785.1(m+h)+。

1.1.16.6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-3-{1-[(3-{2-[(叔丁氧羰基)(甲基)氨基]乙氧基}-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基)甲基]-5-甲基-1h-吡唑-4-基}吡啶-2-甲酸叔丁基酯

向實施例1.1.15(10g)的n,n-二甲基甲醯胺(20ml)溶液中加入苯並[d]噻唑-2-胺(3.24g)、氟-n,n,n',n'-四甲基甲脒(tetramethylformamidinium)六氟磷酸鹽(5.69g)和n,n-二異丙基乙胺(5.57g)。將該混合物在60℃下攪拌3小時。將該反應混合物用乙酸乙酯(800ml)稀釋，用水和鹽水洗滌，並用na2so4乾燥。過濾，蒸發溶劑，得到殘餘物，用矽膠色譜純化殘餘物，用20%的乙酸乙酯/二氯甲烷洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e915.5(m+h)+。

1.1.17.6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-3-[1-({3,5-二甲基-7-[2-(甲基氨基)乙氧基]三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基]吡啶-2-甲酸

向實施例1.1.16(5g)的二氯甲烷(20ml)溶液中加入三氟乙酸(10ml)。將該混合物攪拌過夜。真空蒸發溶劑，並將殘餘物溶於二甲亞碸/甲醇(1:1，10ml)中，通過反相色譜分離，使用analogix系統和c18柱(300g)，用10-85%的乙腈和0.1%三氟乙酸/水洗脫，得到標題化合物的tfa鹽。1hnmr(300mhz,二甲亞碸d6)δppm12.85(s,1h),8.13-8.30(m,2h),8.03(d,1h),7.79(d,1h),7.62(d,1h),7.32-7.54(m,3h),7.28(d,1h),6.96(d,1h),4.96(dd,1h),3.80-3.92(m,4h),3.48-3.59(m,1h),2.91-3.11(m,2h),2.51-2.59(m,4h),2.03-2.16(m,2h),1.21-1.49(m,6h),0.97-1.20(m,4h),0.87(s,6h)。ms(esi)m/e760.4(m+h)+。

1.2.合成6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-3-(1-{[(1r,3r,5s,7s)-3,5-二甲基-7-(2-{2-[2-(甲基氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)三環[3.3.1.13,7]癸-1-基]甲基}-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-甲酸(化合物w1.02)

1.2.1.2-(2-(2-(((3-((1h-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇

向實施例1.1.3(2.65g)的2,2'-(乙烷-1,2-二基雙(氧基))二乙醇(15g)溶液中加入三乙胺(3ml)。將該混合物在180℃下、在微波條件(biotageinitiator)下攪拌120分鐘。將該混合物用水和乙腈(1:1，40ml)稀釋。將粗品加入到反相柱(c18，sf65-800g)上，用10-100%的乙腈/水(含有0.1%三氟乙酸)洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e393.0(m+h)+。

1.2.2.2-(2-(2-((3,5-二甲基-7-((5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基)金剛烷-1-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇

向冷卻(0℃)的實施例1.2.1(2.69g)的四氫呋喃(20ml)溶液中加入n-buli(10ml，2.5m，在己烷中)。將該混合物在0℃下攪拌1.5小時。通過注射器加入碘甲烷(1ml)，並將該混合物在0℃下攪拌1.5小時。將該反應混合物用三氟乙酸(1ml)淬滅。蒸發溶劑之後，殘餘物直接用於下一步。ms(esi)m/e407.5(m+h)+。

1.2.3.2-(2-(2-((3-((4-碘代-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇

向冷卻(0℃)的實施例1.2.2(2.78g)的n,n-二甲基甲醯胺(30ml)溶液中加入n-碘代琥珀醯亞胺(1.65g)。將該混合物在室溫下攪拌2小時。將粗品加入到反相柱(c-18，sf65-800g)上，用10-100%的乙腈/水(含有0.1%三氟乙酸)洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e533.0(m+h)+。

1.2.4.2-(2-(2-((3-((4-碘代-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)氧基)乙氧基)乙氧基)-n-甲基乙胺

向冷卻(0℃)的實施例1.2.3(2.45g)的四氫呋喃(10ml)溶液中加入三乙胺(1ml)，而後加入甲磺醯氯(0.588g)。將該混合物在室溫下攪拌2小時。將甲胺(10ml，2m，在甲醇中)加入到該反應混合物中，並轉入到20ml微波管中。將該混合物在微波條件(biotageinitiator)下、在100℃下加熱60分鐘。冷卻至室溫之後，真空除去溶劑。將殘餘物加入到反相柱(c18，sf40-300g)上，用40-100%的乙腈/水(含有0.1%三氟乙酸)洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e546.0(m+h)+。

1.2.5.(2-(2-(2-((3-((4-碘代-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁基酯

向實施例1.2.4(1.41g)的四氫呋喃(20ml)溶液中加入二碳酸二叔丁基酯(1g)和4-二甲基氨基吡啶(0.6g)。將該混合物在室溫下攪拌3小時，並真空除去溶劑。將殘餘物用矽膠色譜純化，用10-100%的乙酸乙酯/己烷洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e645.8(m+h)+。

1.2.6.(2-(2-(2-((3,5-二甲基-7-((5-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)-1h-吡唑-1-基)甲基)金剛烷-1-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁基酯

向實施例1.2.5(1.25g)、二環己基膦基-2',6'-二甲氧基聯苯(0.09g)、頻哪醇硼烷(1.5ml)和三乙胺(1.5ml)的二噁烷(20ml)溶液中加入雙(苄腈)氯化鈀(ii)(0.042g)。脫氣之後，將該混合物在90℃下攪拌過夜。蒸發溶劑，矽膠柱純化(用20-100%的乙酸乙酯/己烷洗脫)，得到標題化合物。ms(esi)m/e646.1(m+h)+。

1.2.7.8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-甲酸叔丁基酯

向2-(叔丁氧羰基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸(6.8g)和苯並[d]噻唑-2-胺(5.52g)的二氯甲烷(80ml)溶液中加入1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]-碳二亞胺鹽酸鹽(9.4g)和4-二甲基氨基吡啶(6g)。將該混合物在室溫下攪拌過夜。將該反應混合物用二氯甲烷(400ml)稀釋，用5%hcl水溶液、水和鹽水洗滌，並用na2so4乾燥。過濾該混合物，並將濾液減壓濃縮，提供標題化合物。

1.2.8.n-(苯並[d]噻唑-2-基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲醯胺二鹽酸鹽

向實施例1.2.7(8.5g)的二氯甲烷(80ml)溶液中加入2nhcl/乙醚(80ml)。將該反應混合物在室溫下攪拌過夜，並減壓濃縮，提供標題化合物。

1.2.9.6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)-3-溴吡啶甲酸叔丁基酯

將實施例1.1.11(0.736g)、實施例1.2.8(1.62g)和cs2co3(4.1g)在12ml無水n,n-二甲基乙醯胺中、在120℃下攪拌12小時。然後，將冷卻的反應混合物用乙酸乙酯和10%檸檬酸稀釋。用檸檬酸洗滌有機相三次，用水和鹽水洗滌一次，並用na2so4乾燥。過濾，濃縮，得到粗品，在矽膠上色譜分離，使用0-40%的乙酸乙酯/己烷，提供標題化合物。

1.2.10.6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)-3-(1-(((1s,7s)-3,5-二甲基-7-((2,2,5-三甲基-4-氧代-3,8,11-三氧雜-5-氮雜十三烷-13-基)氧基)金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶甲酸叔丁基酯

向實施例1.2.6(0.135g)的四氫呋喃(1ml)和水(1ml)溶液中加入實施例1.2.9(0.12g)、1,3,5,7-四甲基-8-十四烷基-2,4,6-三氧雜-8-磷雜金剛烷(0.023g)、三(二亞苄基丙酮)二鈀(0)(0.015g)和k3po4(0.2g)。將該混合物在140℃下、在微波條件(biotageinitiator)下攪拌5分鐘。將該反應混合物用甲苯(5ml)稀釋，並過濾。蒸發溶劑，矽膠純化(20-100%的乙酸乙酯/庚烷)，得到標題化合物。ms(esi)m/e1004.8(m+h)+。

1.2.11.6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-3-(1-{[3,5-二甲基-7-(2-{2-[2-(甲基氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)三環[3.3.1.13,7]癸-1-基]甲基}-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-甲酸

將二氯甲烷(10ml)中的實施例1.2.10(1.42g)用三氟乙酸(6ml)處理，並將該反應在室溫下攪拌24小時。減壓除去揮發物。用反相色譜純化殘餘物，使用gilson系統(c18，sf40-300g)，用30-100%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將目標級分合併，冷凍乾燥，提供標題化合物的tfa鹽。1hnmr(300mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.85(br.s,1h),8.33(br.s,2h),8.03(d,1h),7.79(d,1h),7.62(d,1h),7.41-7.54(m,3h),7.32-7.40(m,2h),7.28(s,1h),6.95(d,1h),4.95(s,2h),3.85-3.93(m,2h),3.81(s,2h),3.60-3.66(m,2h),3.52-3.58(m,4h),3.45(s,3h),2.97-3.12(m,4h),2.56(t,2h),2.10(s,3h),1.34-1.41(m,2h),1.18-1.31(m,4h),0.95-1.18(m,6h),0.85(s,6h)。ms(esi)m/e848.2(m+h)+。

1.3.合成3-(1-{[3-(2-氨基乙氧基)-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基]甲基}-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]吡啶-2-甲酸(化合物w1.03)

1.3.1.2-(6-(叔丁氧羰基)-5-(1-((3-(2-羥乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲酯

向實施例1.1.13(2.25g)的四氫呋喃(30ml)和水(10ml)溶液中加入實施例1.1.6(2.0g)、1,3,5,7-四甲基-6-苯基-2,4,8-三氧雜-6-磷雜金剛烷(329mg)、三(二亞苄基丙酮)二鈀(0)(206mg)和磷酸三鉀(4.78g)。將該混合物回流過夜，冷卻，並用乙酸乙酯(500ml)稀釋。將得到的混合物用水和鹽水洗滌，用na2so4乾燥有機層，過濾，並濃縮。將殘餘物用快速色譜純化，用20%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，而後用5%的甲醇/二氯甲烷洗脫，提供標題化合物。

1.3.2.2-(6-(叔丁氧羰基)-5-(1-((3,5-二甲基-7-(2-((甲磺醯基)氧基)乙氧基)金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲酯

在冰浴中，向冷的實施例1.3.1(3.32g)的二氯甲烷(100ml)溶液中順序加入三乙胺(3ml)和甲磺醯氯(1.1g)。在室溫下攪拌該反應混合物1.5小時，用乙酸乙酯稀釋，並用水和鹽水洗滌。用na2so4乾燥有機層，過濾，濃縮，提供標題化合物。

1.3.3.2-(5-(1-((3-(2-疊氮基乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(叔丁氧羰基)吡啶-2-基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲酯

向實施例1.3.2(16.5g)的n,n-二甲基甲醯胺(120ml)溶液中加入疊氮化鈉(4.22g)。將該混合物在80℃下加熱3小時，冷卻，用乙酸乙酯稀釋，並用水和鹽水洗滌。用na2so4乾燥有機層，過濾，濃縮。用快速色譜純化殘餘物，用20%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，提供標題化合物。

1.3.4.2-(5-(1-((3-(2-疊氮基乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(叔丁氧羰基)吡啶-2-基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸

向在四氫呋喃(60ml)、甲醇(30ml)和水(30ml)的混合物中的實施例1.3.3(10g)的溶液中加入氫氧化鋰一水合物(1.2g)。將該混合物在室溫下攪拌過夜，並用2%hcl水溶液中和。將得到的混合物濃縮，將殘餘物溶於乙酸乙酯(800ml)中，並用水和鹽水洗滌。用na2so4乾燥有機層，過濾，濃縮，提供標題化合物。

1.3.5.3-(1-((3-(2-疊氮基乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸叔丁基酯

按照1.1.16所描述的方法，用實施例1.3.4替代實施例1.1.15，製備標題化合物。

1.3.6.3-(1-((3-(2-氨基乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸叔丁基酯

向實施例1.3.5(2.0g)的四氫呋喃(30ml)溶液中加入pd/c(10%，200mg)。將該混合物在氫氣氛圍中攪拌過夜。過濾該反應，並將濾液濃縮，提供標題化合物。

1.3.7.3-(1-{[3-(2-氨基乙氧基)-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基]甲基}-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]吡啶-2-甲酸

將二氯甲烷(3ml)中的實施例1.3.6(300mg)用三氟乙酸(3ml)處理過夜。濃縮該反應混合物，用反相色譜純化殘餘物，使用gilson系統(300gc18柱)，用10-70%的乙腈/0.1%三氟乙酸水溶液洗脫，提供標題化合物的三氟乙酸鹽。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.85(s,1h)8.03(d,1h)7.79(d,1h)7.59-7.73(m,4h)7.41-7.53(m,3h)7.32-7.40(m,2h)7.29(s,1h)6.96(d,1h)4.96(s,2h)3.89(t,2h)3.83(s,2h)3.50(t,2h)3.02(t,2h)2.84-2.94(m,2h)2.11(s,3h)1.41(s,2h)1.21-1.36(m,4h)1.08-1.19(m,4h)0.96-1.09(m,2h)0.87(s,6h)。ms(esi)m/e744.3(m-h)-。

1.4.合成3-[1-({3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基]-6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]吡啶-2-甲酸(化合物w1.04)

1.4.1.2-(2-((3-((1h-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)氧基)乙氧基)乙醇

如實施例1.1.4所述，用2,2'-氧基二乙醇替代乙烷-1,2-二醇，製備標題化合物。ms(esi)m/e349.2(m+h)+。

1.4.2.2-(2-((3,5-二甲基-7-((5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基)金剛烷-1-基)氧基)乙氧基)乙醇

如實施例1.1.5所述，製備標題化合物，用實施例1.4.1替代實施例1.1.4。ms(esi)m/e363.3(m+h)+。

1.4.3.2-(2-((3-((4-碘代-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)氧基)乙氧基)乙醇

如實施例1.1.6所述，製備標題化合物，用實施例1.4.2替代實施例1.1.5。ms(esi)m/e489.2(m+h)+。

1.4.4.2-(2-((3-((4-碘代-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)氧基)乙氧基)乙基甲磺酸酯

如實施例1.1.7所述，製備標題化合物，用實施例1.4.3替代實施例1.1.6。ms(esi)m/e567.2(m+h)+。

1.4.5.2-(2-((3-((4-碘代-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)氧基)乙氧基)乙胺

如實施例1.1.8所述，製備標題化合物，用實施例1.4.4替代實施例1.1.7，用7n氨/甲醇替代2n甲胺/甲醇。ms(esi)m/e488.2(m+h)+。

1.4.6.(2-(2-((3-((4-碘代-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯

如實施例1.1.9所述，製備標題化合物，用實施例1.4.5替代實施例1.1.8。ms(esi)m/e588.2(m+h)+。

1.4.7.2-(6-(叔丁氧羰基)-5-(1-((3-(2-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲酯

如實施例1.1.14所述，製備標題化合物，用實施例1.4.6替代實施例1.1.9。ms(esi)m/e828.5(m+h)+。

1.4.8.2-(6-(叔丁氧羰基)-5-(1-((3-(2-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸

如實施例1.1.15所述，製備標題化合物，用實施例1.4.7替代實施例1.1.14。ms(esi)m/e814.5(m+h)+。

1.4.9.6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)-3-(1-((3-(2-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶甲酸叔丁基酯

如實施例1.1.16所述，製備標題化合物，用實施例1.4.8替代實施例1.1.15。ms(esi)m/e946.2(m+h)+。

1.4.10.3-[1-({3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基]-6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]吡啶-2-甲酸

如實施例1.1.17所述，製備標題化合物，用實施例1.4.9替代實施例1.1.16。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.85(s,1h),7.99-8.08(m,1h),7.60-7.82(m,4h),7.20-7.52(m,5h),6.93-6.99(m,1h),4.96(s,2h),3.45-3.60(m,6h),2.09-2.14(m,4h),0.95-1.47(m,19h),0.81-0.91(m,6h)。ms(esi)m/e790.2(m+h)+。

1.5.合成6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-3-{1-[(3-{2-[(2-甲氧基乙基)氨基]乙氧基}-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基)甲基]-5-甲基-1h-吡唑-4-基}吡啶-2-甲酸(化合物w1.05)

1.5.1.6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)-3-(1-(((1r,3r)-3-(2-((2-甲氧基乙基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶甲酸叔丁基酯

將實施例1.3.6(0.050g)和2-甲氧基乙醛(6.93mg)的溶液在二氯甲烷(0.5ml)中在室溫下一起攪拌1小時。向該反應中加入硼氫化鈉(2mg)的甲醇(0.2ml)懸浮液。攪拌30分鐘之後，用二氯甲烷(2ml)稀釋該反應，並用飽和碳酸氫鈉水溶液(1ml)淬滅。分離有機層，用硫酸鎂乾燥，過濾，並濃縮，得到標題化合物。ms(elsd)m/e860.5(m+h)+。

1.5.2.6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-3-{1-[(3-{2-[(2-甲氧基乙基)氨基]乙氧基}-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基)甲基]-5-甲基-1h-吡唑-4-基}吡啶-2-甲酸

將實施例1.5.1的二氯甲烷(1ml)溶液用三氟乙酸(0.5ml)處理。攪拌過夜之後，濃縮該反應，溶於n,n-二甲基甲醯胺(1.5ml)和水(0.5ml)中，用製備hplc純化，使用gilson系統，用10-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將目標級分合併，冷凍乾燥，提供標題化合物的tfa鹽。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.85(s,2h),8.39(s,2h),8.03(d,1h),7.79(d,1h),7.62(d,1h),7.53-7.42(m,3h),7.40-7.33(m,2h),7.29(s,1h),6.96(d,1h),4.96(s,2h),3.89(t,2h),3.83(s,2h),3.61-3.53(m,10h),3.29(s,3h),3.17-3.09(m,2h),3.09-2.97(m,4h),2.10(s,3h),1.41(s,2h),1.35-1.23(m,4h),1.20-1.10(m,4h),1.10-0.98(m,2h)。ms(esi)m/e804.3(m+h)+。

1.6.合成3-(1-{[3-(2-氨基乙氧基)-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基]甲基}-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-5-氟-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]吡啶-2-甲酸(化合物w1.06)

1.6.1.3-氰基甲基-4-氟苯甲酸甲基酯

用20分鐘向三甲矽烷甲腈(1.49ml)的四氫呋喃(2.5ml)溶液中逐滴加入1m四丁基氟化銨(11.13ml)。然後，將該溶液在室溫下攪拌30分鐘。將4-氟-3-(溴甲基)苯甲酸甲酯(2.50g)溶於乙腈(12ml)中，並用10分鐘逐滴加入到第一個溶液中。然後，將該溶液加熱到80℃，保持60分鐘，並冷卻。減壓濃縮該溶液，用矽膠快速柱色譜純化，用20-30%的乙酸乙酯/庚烷洗脫。減壓蒸發溶劑，提供標題化合物。

1.6.2.3-(2-氨乙基)-4-氟苯甲酸甲基酯

將實施例1.6.1(1.84g)溶於四氫呋喃(50ml)中，並加入1m硼烷(在四氫呋喃中，11.9ml)。將該溶液在室溫下攪拌16小時，並慢慢地用甲醇淬滅。加入4m鹽酸水溶液(35ml)，並將該溶液在室溫下攪拌16小時。減壓濃縮該混合物，並使用固體碳酸鉀，將ph值調節至11和12之間。然後，用二氯甲烷(3x100ml)提取該溶液。將有機提取物合併，並用無水硫酸鈉乾燥。過濾該溶液，減壓濃縮，並將物質用矽膠快速柱色譜純化，用10-20%的甲醇/二氯甲烷洗脫。減壓蒸發溶劑，提供標題化合物。ms(esi)m/e198(m+h)+。

1.6.3.4-氟-3-[2-(2,2,2-三氟乙醯氨基)乙基]苯甲酸甲基酯

將實施例1.6.2(1.207g)溶於二氯甲烷(40ml)中，並加入n,n-二異丙基乙胺(1.3ml)。然後，逐滴加入三氟乙酸酐(1.0ml)。將該溶液攪拌15分鐘。加入水(40ml)，並將該溶液用乙酸乙酯(100ml)稀釋。加入1m鹽酸水溶液(50ml)，分離有機層，用1m鹽酸水溶液洗滌，而後用鹽水洗滌。用無水硫酸鈉乾燥該溶液。過濾後，減壓蒸發溶劑，提供標題化合物。

1.6.4.5-氟-2-(2,2,2-三氟乙醯基)-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲基酯

將實施例1.6.3(1.795g)和多聚甲醛(0.919g)放在燒瓶中，並加入濃硫酸(15ml)。將該溶液在室溫下攪拌一個小時。加入冷水(60ml)，並將該溶液用乙酸乙酯(2x100ml)提取。將提取物合併，用飽和碳酸氫鈉水溶液(100ml)和水(100ml)洗滌，並用無水硫酸鈉乾燥。過濾該溶液，減壓濃縮，並將物質用矽膠快速柱色譜純化，用10-20%的乙酸乙酯/庚烷洗脫。減壓蒸發溶劑，提供標題化合物。ms(esi)m/e323(m+nh4)+。

1.6.5.5-氟-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲基酯

將實施例1.6.4(685mg)溶於甲醇(6ml)和四氫呋喃(6ml)中。加入水(3ml)，而後加入碳酸鉀(372mg)。將該反應在室溫下攪拌三小時，而後用乙酸乙酯(100ml)稀釋。用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌該溶液，並用無水硫酸鈉乾燥。濾出溶劑，減壓蒸發，提供標題化合物。ms(esi)m/e210(m+h)+。

1.6.6.2-(5-溴-6-叔丁氧羰基吡啶-2-基)-5-氟-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲基酯

在1.1.12中，用實施例1.6.5替代1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲酯鹽酸鹽，製備標題化合物。ms(esi)m/e465,467(m+h)+。

1.6.7.2-[6-叔丁氧羰基-5-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧雜硼雜環戊烷-2-基)-吡啶-2-基]-5-氟-1,2,3,4-四氫-異喹啉-8-甲酸甲基酯

在實施例1.1.13中，用實施例1.6.6替代實施例1.1.12，製備標題化合物。ms(esi)m/e513(m+h)+。

1.6.8.2-((3-((4-碘代-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)氧基)乙胺

在微波條件(biotageinitiator)下，將實施例1.1.7(4.5g)的7n銨/甲醇(15ml)溶液在100℃下攪拌20分鐘。將該反應混合物真空濃縮，用乙酸乙酯(400ml)稀釋殘餘物，並用nahco3水溶液、水(60ml)和鹽水(60ml)洗滌。用無水na2so4乾燥有機層，過濾，並濃縮。殘餘物不用進一步純化，直接在下一個反應中使用。ms(esi)m/e444.2(m+h)+。

1.6.9.(2-((3-((4-碘代-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯

向實施例1.6.8(4.4g)的四氫呋喃(100ml)溶液中加入二碳酸二叔丁基酯(2.6g)和n,n-二甲基-4-氨基吡啶(100mg)。將該混合物攪拌1.5小時。然後，用乙酸乙酯(300ml)稀釋該反應混合物，並用nahco3水溶液、水(60ml)和鹽水(60ml)洗滌。乾燥之後(無水na2so4)，過濾該溶液，濃縮，並將殘餘物用矽膠柱色譜純化(20%的乙酸乙酯/二氯甲烷)，得到標題化合物。ms(esi)m/e544.2(m+h)+。

1.6.10.2-(6-叔丁氧羰基-5-{1-[5-(2-叔丁氧羰基氨基-乙氧基)-3,7-二甲基-金剛烷-1-基甲基]-5-甲基-1h-吡唑-4-基}-吡啶-2-基)-5-氟-1,2,3,4-四氫-異喹啉-8-甲酸甲基酯

在實施例1.1.14中，用實施例1.6.7替代實施例1.1.13，實施例1.6.9替代實施例1.1.9，製備標題化合物。ms(esi)m/e802(m+h)+。

1.6.11.2-(6-叔丁氧羰基-5-{1-[5-(2-叔丁氧羰基氨基-乙氧基)-3,7-二甲基-金剛烷-1-基甲基]-5-甲基-1h-吡唑-4-基}-吡啶-2-基)-5-氟-1,2,3,4-四氫-異喹啉-8-甲酸

在實施例1.1.15中，用實施例1.6.10替代實施例1.1.14，製備標題化合物。ms(esi)m/e788(m+h)+。

1.6.12.6-[8-(苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-5-氟-3,4-二氫-1h-異喹啉-2-基]-3-{1-[5-(2-叔丁氧羰基氨基-乙氧基)-3,7-二甲基-金剛烷-1-基甲基]-5-甲基-1h-吡唑-4-基}-吡啶-2-甲酸叔丁基酯

在實施例1.1.16中，用實施例1.6.11替代實施例1.1.15，製備標題化合物。ms(esi)m/e920(m+h)+。

1.6.13.3-(1-{[3-(2-氨基乙氧基)-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基]甲基}-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-5-氟-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]吡啶-2-甲酸

在實施例1.1.17中，用實施例1.6.12替代實施例1.1.16，製備標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.88(bs,1h),8.03(d,1h),7.79(d,1h),7.73(m,1h),7.63(m,2h),7.52(d,1h),7.48(t,1h),7.36(t,1h),7.28(dd,2h),7.04(d,1h),5.02(s,2h),3.95(t,2h),3.83(s,2h),3.49(t,2h),2.90(m,4h),2.11(s,3h),1.41(s,2h),1.35-1.23(m,4h),1.19-0.99(m,6h),0.87(bs,6h)。ms(esi)m/e764(m+h)+。

1.7合成3-(1-{[3-(2-氨基乙氧基)-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基]甲基}-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-6-氟-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]吡啶-2-甲酸

1.7.1(3-溴-5-氟-苯基)-乙腈

在實施例1.6.1中，用1-溴-3-(溴甲基)-5-氟苯替代4-氟-3-(溴甲基)苯甲酸甲酯，製備標題化合物。

1.7.22-(3-溴-5-氟-苯基)-乙胺

在實施例1.6.2中，用實施例1.7.1替代實施例1.6.1，製備標題化合物。

1.7.3[2-(3-溴-5-氟-苯基)-乙基]-氨基甲酸叔丁基酯

將實施例1.7.2(1.40g)和n,n-二甲基吡啶-4-胺(0.078g)溶於乙腈(50ml)中。加入二碳酸二叔丁基酯(1.54g)。將該溶液在室溫下攪拌30分鐘。將該溶液用乙醚(150ml)稀釋，用0.1mhcl水溶液(25ml)洗滌兩次，用鹽水(50ml)洗滌，並用無水硫酸鈉乾燥。過濾該溶液，減壓濃縮，並將粗品用矽膠快速柱色譜純化，用5-10%的乙酸乙酯/庚烷洗脫。減壓蒸發溶劑，提供標題化合物。

1.7.43-(2-叔丁氧羰基氨基-乙基)-5-氟-苯甲酸甲基酯

將實施例1.7.3(775mg)和二氯[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]鈀(ii)(36mg)加入到50ml耐壓瓶中。加入甲醇(10ml)和三甲胺(493mg)。將該溶液脫氣，並用氬氣吹掃三次，而後脫氣，用一氧化碳吹掃。在60psi一氧化碳條件下，將該反應加熱至100℃，保持16小時。再加入二氯[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]鈀(ii)(36mg)，並重複脫氣和吹掃過程。在60psi一氧化碳條件下，將該反應加熱至100℃，再保持16小時。減壓除去溶劑，並將殘餘物用矽膠快速柱色譜純化，用20-30%的乙酸乙酯/庚烷洗脫。減壓蒸發溶劑，提供標題化合物。

1.7.53-(2-氨基-乙基)-5-氟-苯甲酸甲基酯

將實施例1.7.4(292mg)溶於二氯甲烷(3ml)中。加入2,2,2-三氟乙酸(1680mg)，並將該溶液在室溫下攪拌兩個小時。減壓除去溶劑，提供標題化合物，其不用進一步純化，在下一步中直接使用。

1.7.63-氟-5-[2-(2,2,2-三氟-乙醯氨基)-乙基]-苯甲酸甲基酯

在實施例1.6.3中，用實施例1.7.5替代實施例1.6.2，製備標題化合物。

1.7.76-氟-2-(2,2,2-三氟-乙醯基)-1,2,3,4-四氫-異喹啉-8-甲酸甲基酯

在實施例1.6.4中，用實施例1.7.6替代實施例1.6.3，製備標題化合物。

1.7.86-氟-1,2,3,4-四氫-異喹啉-8-甲酸甲基酯

在實施例1.6.5中，用實施例1.7.7替代實施例1.6.4，製備標題化合物。

1.7.92-(5-溴-6-叔丁氧羰基-吡啶-2-基)-6-氟-1,2,3,4-四氫-異喹啉-8-甲酸甲基酯

在實施例1.1.12中，用實施例1.7.8替代1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲酯鹽酸鹽，製備標題化合物。ms(esi)m/e464,466(m+h)+。

1.7.10.2-[6-叔丁氧羰基-5-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧雜硼雜環戊烷-2-基)-吡啶-2-基]-6-氟-1,2,3,4-四氫-異喹啉-8-甲酸甲基酯

在實施例1.1.13中，用實施例1.7.9替代實施例1.1.12，製備標題化合物。ms(esi)m/e513(m+h)+,543(m+meoh-h)-。

1.7.11.亞胺二甲酸{2-[5-(4-碘代-5-甲基-吡唑-1-基甲基)-3,7-二甲基-金剛烷-1-基氧基]-乙基}-二叔丁基酯

將實施例1.1.6(5.000g)溶於二氯甲烷(50ml)中。加入三乙胺(1.543g)，並將該溶液在冰浴中冷卻。逐滴加入甲磺醯氯(1.691g)。將該溶液升溫至室溫，並攪拌30分鐘。加入飽和碳酸氫鈉水溶液(50ml)。分離各層，並將有機層用鹽水(50ml)洗滌。然後，將水溶液部分合併，並用二氯甲烷(50ml)反萃取。將有機部分合併，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，並濃縮。將殘餘物溶於乙腈(50ml)中。加入亞胺二甲酸二叔丁基酯(2.689g)和碳酸銫(7.332g)，並將該溶液回流16小時。冷卻該溶液，並加入到乙醚(100ml)和水(100ml)中。分離各層。將有機部分用鹽水(50ml)洗滌。然後，將水溶液部分合併，並用乙醚(100ml)反萃取。將有機部分合併，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，並減壓濃縮。將物質用矽膠快速柱色譜純化，用20%的乙酸乙酯/庚烷洗脫。減壓蒸發溶劑，提供標題化合物。ms(esi)m/e666(m+na)+。

1.7.12.2-(6-(叔丁氧羰基)-5-(1-((3-(2-(二-(叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-基)-6-氟-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲酯

在實施例1.1.14中，用實施例1.7.10替代實施例1.1.13，實施例1.7.11替代實施例1.1.9，製備標題化合物。ms(esi)m/e902(m+h)+。

1.7.13.2-(6-(叔丁氧羰基)-5-(1-((3-(2-(二-(叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-基)-6-氟-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸

在實施例1.1.15中，用實施例1.7.12替代實施例1.1.14，製備標題化合物。ms(esi)m/e888(m+h)+,886(m-h)-。

1.7.14.6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-6-氟-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)-3-(1-((3-(2-(二-(叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶甲酸叔丁基酯

在實施例1.1.16中，用實施例1.7.13替代實施例1.1.15，製備標題化合物。

1.7.15.3-(1-{[3-(2-氨基乙氧基)-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基]甲基}-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-6-氟-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]吡啶-2-甲酸

在實施例1.1.17中，用實施例1.7.14替代實施例1.1.16，製備標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm8.04(d,1h),7.79(d,1h),7.65(bs,3h),7.50(m,2h),7.40-7.29(m,3h),6.98(d,1h),4.91(d,2h),3.88(t,2h),3.83(s,2h),3.02(t,2h),2.89(t,4h),2.10(s,3h),1.44-1.20(m,6h),1.19-1.00(m,6h),0.86(bs,6h)。ms(esi)m/e764(m+h)+,762(m-h)-。

1.8合成3-(1-{[3-(2-氨基乙氧基)-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基]甲基}-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-7-氟-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]吡啶-2-甲酸

1.8.1[2-(3-溴-4-氟-苯基)-乙基]-氨基甲酸叔丁基酯

在實施例1.7.3中，用2-(3-溴-4-氟苯基)乙胺鹽酸鹽替代實施例1.7.2，製備標題化合物。

1.8.25-(2-叔丁氧羰基氨基-乙基)-2-氟-苯甲酸甲基酯

在實施例1.7.4中，用實施例1.8.1替代實施例1.7.3，製備標題化合物。ms(esi)m/e315(m+nh4)+。

1.8.35-(2-氨基-乙基)-2-氟-苯甲酸甲基酯

在實施例1.7.5中，用實施例1.8.2替代實施例1.7.4，製備標題化合物。

1.8.42-氟-5-[2-(2,2,2-三氟-乙醯氨基)-乙基]-苯甲酸甲基酯

在實施例1.6.3中，用實施例1.8.3替代實施例1.6.2，製備標題化合物。

1.8.57-氟-2-(2,2,2-三氟-乙醯基)-1,2,3,4-四氫-異喹啉-8-甲酸甲基酯

在實施例1.6.4中，用實施例1.8.4替代實施例1.6.3，製備標題化合物。ms(esi)m/e323(m+nh4)+。

1.8.67-氟-1,2,3,4-四氫-異喹啉-8-甲酸甲基酯

在實施例1.6.5中，用實施例1.8.5替代實施例1.6.4，製備標題化合物。ms(esi)m/e210(m+h)+,208(m-h)-。

1.8.72-(5-溴-6-叔丁氧羰基-吡啶-2-基)-7-氟-1,2,3,4-四氫-異喹啉-8-甲酸甲基酯

在實施例1.1.12中，用實施例1.8.6替代1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲酯鹽酸鹽，製備標題化合物。ms(esi)m/e465,467(m+h)+。

1.8.82-[6-叔丁氧羰基-5-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧雜硼雜環戊烷-2-基)-吡啶-2-基]-7-氟-1,2,3,4-四氫-異喹啉-8-甲酸甲基酯

在實施例1.1.13中，用實施例1.8.7替代實施例1.1.12，製備標題化合物。ms(esi)m/e513(m+h)+,543(m+meoh-h)-。

1.8.92-(6-(叔丁氧羰基)-5-(1-((3-(2-(二-(叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-基)-7-氟-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸甲酯

在實施例1.1.14中，用實施例1.8.8替代實施例1.1.13，實施例1.7.11替代實施例1.1.9，製備標題化合物。ms(esi)m/e902(m+h)+,900(m-h)-。

1.8.10.2-(6-(叔丁氧羰基)-5-(1-((3-(2-(二-(叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-基)-7-氟-1,2,3,4-四氫異喹啉-8-甲酸

在實施例1.1.15中，用實施例1.8.9替代實施例1.1.14，製備標題化合物。ms(esi)m/e788(m+h)+,786(m-h)-。

1.8.11.6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-7-氟-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)-3-(1-((3-(2-(二-(叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶甲酸叔丁基酯

在實施例1.1.16中，用實施例1.8.10替代實施例1.1.15，製備標題化合物。

1.8.12.3-(1-{[3-(2-氨基乙氧基)-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基]甲基}-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-7-氟-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]吡啶-2-甲酸

在實施例1.1.17中，用實施例1.8.11替代實施例1.1.16，製備標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm13.08(bs,1h),11.41(bs,1h),8.05(d,1h),7.81(d,1h),7.63(m,4h),7.55-7.22(m,6h),6.95(d,1h),4.78(s,2h),3.86(m,4h),3.50(m,2h),2.97(m,2h),2.90(m,2h),2.09(s,3h),1.48-1.40(m,2h),1.38-1.23(m,4h),1.20-1.01(m,6h),0.88(bs,6h)。ms(esi)m/e764(m+h)+,762(m-h)。

實施例2.合成示範性的合成子

該實施例提供了可以用於製備adc的示範性的合成子的合成方法。

2.1.合成n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-l-纈氨醯-n-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]苯基}-n5-氨基甲醯基-l-鳥氨醯胺(合成子e)

2.1.1.(s)-(9h-芴-9-基)甲基(1-((4-(羥甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基甲酸酯

將(s)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-脲基戊酸(40g)溶於二氯甲烷(1.3l)中。將(4-氨基苯基)甲醇(13.01g)、2-(3h-[1,2,3]三唑並[4,5-b]吡啶-3-基)-1,1,3,3-四甲基異脲六氟磷酸鹽(v)(42.1g)和n,n-二異丙基乙胺(0.035l)加入到該溶液中，並將得到的混合物在室溫下攪拌16小時。過濾收集產物，並用二氯甲烷衝洗。將合併的固體真空乾燥，得到標題化合物，其不用進一步純化，在下一步中直接使用。ms(esi)m/e503.3(m+h)+。

2.1.2.(s)-2-氨基-n-(4-(羥甲基)苯基)-5-脲基戊醯胺

將實施例2.1.1(44g)溶於n,n-二甲基甲醯胺(300ml)中。將該溶液用二乙胺(37.2ml)處理，並在室溫下攪拌一個小時。過濾該反應混合物，並將溶劑減壓濃縮。用鹼性氧化鋁色譜純化粗品，用0-30%的甲醇/乙酸乙酯的梯度進行洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e281.2(m+h)+。

2.1.3.((s)-1-(((s)-1-((4-(羥甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁基酯

將(s)-2-(叔丁氧羰基氨基)-3-甲基丁酸(9.69g)溶於n,n-二甲基甲醯胺(200ml)中。向該溶液中加入2-(3h-[1,2,3]三唑並[4,5-b]吡啶-3-基)-1,1,3,3-四甲基異脲六氟磷酸鹽(v)(18.65g)，並將該反應在室溫下攪拌一個小時。加入實施例2.1.2(12.5g)和n,n-二異丙基乙胺(15.58ml)，並將該反應混合物在室溫下攪拌16小時。減壓濃縮溶劑，用矽膠色譜純化殘餘物，用10%的甲醇/二氯甲烷洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e480.2(m+h)+。

2.1.4.(s)-2-((s)-2-氨基-3-甲基丁醯胺基)-n-(4-(羥甲基)苯基)-5-脲基戊醯胺

將實施例2.1.4(31.8g)溶於二氯甲烷(650ml)中，並向該溶液中加入三氟乙酸(4.85ml)。將該反應混合物在室溫下攪拌三小時。減壓濃縮溶劑，得到粗品標題化合物和4-((s)-2-((s)-2-氨基-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苄基2,2,2-三氟乙酸酯的混合物。將粗品溶於1:1的二噁烷/水溶液(300ml)中，並向該溶液中加入氫氧化鈉(5.55g)。將該混合物在室溫下攪拌三小時。真空濃縮溶劑，用反相hplc純化粗品，使用combiflash系統，用5-60%的乙腈/水(含有0.05%v/v氫氧化銨)的梯度進行洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e380.2(m+h)+。

2.1.5.1-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯胺基)-n-((s)-1-(((s)-1-((4-(羥甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺

向實施例2.1.4(1.5g)的n,n-二甲基甲醯胺(50ml)溶液中加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-3-氧代-7,10,13,16-四氧雜-4-氮雜十九烷-19-酸酯(2.03g)。將該混合物在室溫下攪拌三天。將粗品加入到反相柱(c18，sf65-800g)上，用20-100%的乙腈/水(含有0.1%三氟乙酸)洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e778.3(m+1)+。

2.1.6.4-((2s,5s)-25-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-5-異丙基-4,7,23-三氧代-2-(3-脲基丙基)-10,13,16,19-四氧雜-3,6,22-三氮雜二十五烷醯胺基)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯

向實施例2.1.5(2.605g)和n,n-二異丙胺(1.8ml)的n,n-二甲基甲醯胺(20ml)溶液中加入雙(4-硝基苯基)碳酸酯(1.23g)。將該混合物在室溫下攪拌16小時。將粗品加入到反相柱(c18，sf65-800g)上，用20-100%的乙腈/水(含有0.1%三氟乙酸)洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e943.2(m+1)+。

2.1.7.n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-l-纈氨醯-n-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]苯基}-n5-氨基甲醯基-l-鳥氨醯胺

在0℃，向實施例2.1.6(49.6mg)和實施例1.1.17(30mg)的n,n-二甲基甲醯胺(2ml)混合物中加入n,n-二異丙基乙胺(0.018ml)。將該反應混合物在室溫下攪拌過夜，用二甲亞碸稀釋，用rp-hplc純化，使用gilson系統，用20-70%的乙腈/0.1%三氟乙酸水溶液洗脫，提供標題化合物。ms(esi)m/e1563.4(m+h)+。

2.2.合成n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-l-纈氨醯-n-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]苯基}-n5-氨基甲醯基-l-鳥氨醯胺(合成子d)

向4-((s)-2-((s)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苄基4-硝基苯基碳酸酯(購買於synchem，57mg)和實施例1.1.17(57mg)的n,n-二甲基甲醯胺(6ml)溶液中加入n,n-二異丙基乙胺(0.5ml)。將該混合物攪拌過夜，而後真空濃縮。用甲醇(3ml)和乙酸(0.3ml)稀釋殘餘物，用rp-hplc(gilson系統，c18柱)純化，用30-70%的乙腈/水(含有0.1%三氟乙酸)洗脫。將產物級分冷凍乾燥，得到標題化合物。1hnmr(300mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.86(d,1h),9.98(s,1h),7.96-8.10(m,2h),7.74-7.83(m,2h),7.54-7.64(m,3h),7.31-7.52(m,6h),7.24-7.29(m,3h),6.99(s,2h),6.94(d,1h),4.96(d,4h),4.33-4.43(m,2h),4.12-4.24(m,2h),3.22-3.42(m,7h),2.77-3.07(m,7h),1.86-2.32(m,7h),0.92-1.70(m,22h),0.72-0.89(m,13h)。ms(esi)m/e1358.2(m+h)+。

2.3.合成n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-l-丙氨醯-n-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]苯基}-l-丙氨醯胺(合成子j)

2.3.1.(s)-2-((s)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙醯胺基)丙酸

將(s)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸酯(5g)的40ml二甲氧基乙烷溶液加入到l-丙氨酸(1.145g)和碳酸氫鈉(1.08g)水(40ml)溶液中。將該反應混合物在室溫下攪拌16小時。將檸檬酸水溶液(15%v/v，75ml)加入到該反應中。濾出沉澱，用水(2x250ml)洗滌，並真空乾燥。將固體進一步與乙醚(100ml)一起研磨，過濾，並用硫酸鈉乾燥，得到產物，其不用進一步純化，在下一步中直接使用。ms(esi)m/e383.0(m+h)+。

2.3.2.(9h-芴-9-基)甲基((s)-1-(((s)-1-((4-(羥甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸酯

將n-乙氧羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉(eedq)(6.21g)加入到實施例2.3.1(3.2g)和4-氨基苄醇(1.546g)的50ml二氯甲烷∶甲醇(2∶1)溶液中。將該反應在室溫下攪拌2天。真空濃縮溶劑。將殘餘物與75ml乙酸乙酯一起研磨，過濾收集固體，真空乾燥，得到標題化合物，其不用進一步純化，在下一步中直接使用。ms(esi)m/e488.0(m+h)+。

2.3.3.(s)-2-氨基-n-((s)-1-((4-(羥甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丙醯胺

將二乙胺(11.75ml)加入到實施例2.3.2(1.58g)的n,n二甲基甲醯胺(50ml)溶液中，並將該反應在室溫下靜置16小時。真空蒸發溶劑。將殘餘物與乙酸乙酯(100ml)一起研磨，過濾收集產物，真空乾燥，得到標題化合物，其不用進一步純化，在下一步中直接使用。ms(esi)m/e266.0(m+h)+。

2.3.4.1-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯胺基)-n-((s)-1-(((s)-1-((4-(羥甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-3,6,9,12-四氧雜十五烷-15-醯胺

將實施例2.3.3(1.033g)與2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-3-氧代-7,10,13,16-四氧雜-4-氮雜十九烷-19-酸酯(2g)在含有1%n,n-二異丙基乙胺的n,n-二甲基甲醯胺(19.5ml)中混合16小時。用反相hplc純化粗品反應物，使用gilson系統和c1825x100mm柱，用5-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將產物級分冷凍乾燥，得到標題化合物。ms(esi)m/e664.0(m+h)+。

2.3.5.4-((2s,5s)-25-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-2,5-二甲基-4,7,23-三氧代-10,13,16,19-四氧雜-3,6,22-三氮雜二十五烷醯胺基)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯

將實施例2.3.4(1.5g)與雙(4-硝基苯基)碳酸酯(1.38g)在含有1%n,n-二異丙基乙胺的n,n-二甲基甲醯胺(11.3ml)中混合。將該反應在室溫下攪拌16小時。用反相hplc純化粗品反應物，使用gilson系統和c1825x100mm柱，用5-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將產物級分冷凍乾燥，得到標題化合物。ms(esi)m/e829.0(m+h)+。

2.3.6.n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-l-丙氨醯-n-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]苯基}-l-丙氨醯胺

將實施例1.1.17的三氟乙酸鹽(15mg)與實施例2.3.5(21.3mg)在n,n-二甲基甲醯胺(1ml)和n,n-二異丙基乙胺(0.006ml)中混合。將該反應混合物在室溫下攪拌一個小時。用反相hplc純化粗品反應物，使用gilson系統和c1825x100mm柱，用5-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將產物級分冷凍乾燥，得到標題化合物。ms(esi)m/e1450.7(m+h)+。

2.4.合成n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-l-丙氨醯-n-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]苯基}-l-丙氨醯胺(合成子k)

2.4.1.6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-n-((s)-1-(((s)-1-((4-(羥甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)己醯胺

在實施例2.3.4中，用n-琥珀醯亞胺基6-馬來醯亞胺基(maleimido)己酸酯替代2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-3-氧代-7,10,13,16-四氧雜-4-氮雜十九烷-19-酸酯，製備標題化合物。ms(esi)m/e640.8(m+nh4)+。

2.4.2.4-((s)-2-((s)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯胺基)丙醯胺基)丙醯胺基)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯

在實施例2.3.5中，用實施例2.4.1替代實施例2.3.4，製備標題化合物。

2.4.3.n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-l-丙氨醯-n-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]苯基}-l-丙氨醯胺

在實施例2.3.6中，用實施例2.4.2替代實施例2.3.5，製備標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm9.56(s,1h),7.98(d,1h),7.76(d,1h),7.71-7.52(m,3h),7.51-7.21(m,4h),6.97-6.84(m,1h),4.98(d,2h),4.42(p,1h),4.27(p,1h),3.89(t,1h),3.80(s,2h),3.43(d,19h),3.03(t,7h),2.87(s,2h),2.32(s,1h),2.11(d,3h),1.52(h,2h),1.41-0.94(m,12h),0.84(s,3h)。ms(esi)m/e1244.2(m+h)+。

2.5.合成n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-l-纈氨醯-n-{4-[12-({(1s,3s)-3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)-4-甲基-3-氧代-2,7,10-三氧雜-4-氮雜十二烷-1-基]苯基}-n5-氨基甲醯基-l-鳥氨醯胺(合成子l)

2.5.1.(3-溴金剛烷-1-基)甲醇

在實施例1.1.2中，用3-溴金剛烷-1-甲酸替代實施例1.1.1，製備標題化合物。

2.5.2.1-((3-溴金剛烷-1-基)甲基)-1h-吡唑

在實施例1.1.3中，用實施例2.5.1替代實施例1.1.2，製備標題化合物。ms(esi)m/e295.2(m+h)+。

2.5.3.2-(2-(2-((3-((1h-吡唑-1-基)甲基)金剛烷-1-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇

在實施例1.2.1中，用實施例2.5.2替代實施例1.1.3，用硫酸銀替代三乙胺，製備標題化合物。ms(esi)m/e365.1(m+h)+。

2.5.4.2-(2-(2-((3-((5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基)金剛烷-1-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇

在實施例1.2.2中，用實施例2.5.3替代實施例1.2.1，製備標題化合物。ms(esi)m/e379.1(m+h)+。

2.5.5.2-(2-(2-((3-((4-碘代-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基)金剛烷-1-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇

在實施例1.2.3中，用實施例2.5.4替代實施例1.2.2，製備標題化合物。ms(esi)m/e504.9(m+h)+。

2.5.6.2-(2-(2-((3-((4-碘代-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基)金剛烷-1-基)氧基)乙氧基)乙氧基)-n-甲基乙胺

在實施例1.2.4中，用實施例2.5.5替代實施例1.2.3，製備標題化合物。ms(esi)m/e518.4(m+h)+。

2.5.7.(2-(2-(2-((3-((4-碘代-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基)金剛烷-1-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁基酯

在實施例1.2.5中，用實施例2.5.6替代實施例1.2.4，製備標題化合物。ms(esi)m/e617.9(m+h)+。

2.5.8.甲基(2-(2-(2-((3-((5-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)-1h-吡唑-1-基)甲基)金剛烷-1-基)氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁基酯

在實施例1.2.6中，用實施例2.5.7替代實施例1.2.5，製備標題化合物。ms(esi)m/e618.2(m+h)+。

2.5.9.6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)-3-(5-甲基-1-((3-((2,2,5-三甲基-4-氧代-3,8,11-三氧雜-5-氮雜十三烷-13-基)氧基)金剛烷-1-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡啶甲酸叔丁基酯

在實施例1.2.10中，用實施例2.5.8替代實施例1.2.6，製備標題化合物。ms(esi)m/e976.1(m+h)+。

2.5.10.6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)-3-(5-甲基-1-(((1s,3s)-3-(2-(2-(2-(甲基氨基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)金剛烷-1-基)甲基)-1h-吡唑-4-基)吡啶甲酸

在實施例1.2.11中，用實施例2.5.9替代實施例1.2.10，製備標題化合物。ms(esi)m/e820.3(m+h)+。

2.5.11.n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-l-纈氨醯-n-{4-[12-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)-4-甲基-3-氧代-2,7,10-三氧雜-4-氮雜十二烷-1-基]苯基}-n5-氨基甲醯基-l-鳥氨醯胺

在實施例2.2中，用實施例2.5.10替代實施例1.1.17，製備標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm9.96(br.s,1h),7.96-8.12(m,2h),7.73-7.83(m,2h),7.29-7.66(m,9h),7.17-7.30(m,3h),6.89-7.01(m,2h),4.86-5.01(m,4h),4.28-4.45(m,1h),4.12-4.21(m,1h),3.69-3.92(m,3h),3.27-3.62(m,9h),2.78-3.06(m,7h),2.01-2.23(m,7h),1.87-2.01(m,1h),1.54-1.72(m,4h),1.01-1.54(m,22h),0.72-0.89(m,6h)。ms(esi)m/e1418.4(m+h)+。

2.6.合成n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-l-纈氨醯-n-{4-[12-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)-4-甲基-3-氧代-2,7,10-三氧雜-4-氮雜十二烷-1-基]苯基}-n5-氨基甲醯基-l-鳥氨醯胺(合成子m)

在實施例2.1.7中，用實施例2.5.10替代實施例1.1.17，製備標題化合物。1hnmr(500mhz,二甲亞碸-d6)δppm9.97(s,1h),8.07-8.13(m,1h),7.97-8.05(m,2h),7.86(d,1h),7.78(d,1h),7.55-7.63(m,3h),7.40-7.51(m,3h),7.32-7.38(m,2h),7.25-7.30(m,2h),6.98(s,1h),6.93(d,1h),4.91-5.01(m,4h),4.31-4.41(m,1h),4.17-4.24(m,1h),3.83-3.91(m,2h),3.76(s,2h),3.30-3.62(m,21h),3.10-3.17(m,1h),2.89-3.05(m,4h),2.81-2.88(m,3h),2.42-2.47(m,1h),2.27-2.40(m,3h),2.04-2.15(m,5h),1.91-2.00(m,1h),1.30-1.72(m,16h),0.76-0.88(m,6h)。ms(esi)m/e1623.3(m+h)+。

2.7.合成n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-l-纈氨醯-n-{4-[12-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)-4-甲基-3-氧代-2,7,10-三氧雜-4-氮雜十二烷-1-基]苯基}-n5-氨基甲醯基-l-鳥氨醯胺(合成子v)

在實施例2.2中，用實施例1.2.11替代實施例1.1.17，製備標題化合物。1hnmr(500mhz,二甲亞碸-d6)δppm9.61(s,1h),7.97(d,1h),7.76(d,1h),7.67(d,1h),7.61(d,1h),7.51-7.57(m,2h),7.38-7.48(m,4h),7.29-7.36(m,2h),7.23-7.28(m,3h),6.86-6.94(m,2h),4.97(d,4h),4.38-4.45(m,1h),4.12-4.19(m,1h),3.89(t,2h),3.80(s,2h),3.47-3.54(m,5h),3.44(s,3h),3.33-3.41(m,6h),2.93-3.06(m,6h),2.87(s,2h),2.11-2.22(m,2h),2.08(s,3h),1.97-2.05(m,1h),1.70-1.81(m,2h),1.33-1.68(m,10h),0.95-1.32(m,14h),0.80-0.91(m,13h)。ms(+esi)m/e1446.3(m+h)+。

2.8.合成n-({2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙醯基)-l-纈氨醯-n-{4-[12-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)-4-甲基-3-氧代-2,7,10-三氧雜-4-氮雜十二烷-1-基]苯基}-n5-氨基甲醯基-l-鳥氨醯胺(合成子ds)

2.8.1.(s)-2-((s)-2-(2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-n-(4-(羥甲基)苯基)-5-脲基戊醯胺

在實施例2.1.5中，用2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙酸酯替代2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-3-氧代-7,10,13,16-四氧雜-4-氮雜十九烷-19-酸酯，製備標題化合物。

2.8.2.4-((2s,5s)-14-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-5-異丙基-4,7-二氧代-2-(3-脲基丙基)-9,12-二氧雜-3,6-二氮雜十四烷醯胺基)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯

在實施例2.3.5中，用實施例2.8.1替代實施例2.3.4，製備標題化合物。

2.8.3.n-({2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙醯基)-l-纈氨醯-n-{4-[12-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)-4-甲基-3-氧代-2,7,10-三氧雜-4-氮雜十二烷-1-基]苯基}-n5-氨基甲醯基-l-鳥氨醯胺

在實施例2.2中，用實施例1.2.11替代實施例1.1.17，用實施例2.8.2替代4-((s)-2-((s)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苄基4-硝基苯基碳酸酯，製備標題化合物。1hnmr(500mhz,二甲亞碸-d6)δppm9.64(s,1h),7.97(d,1h),7.92(d,1h),7.75(d,1h),7.60(d,1h),7.54(d,2h),7.45(d,2h),7.38-7.43(m,1h),7.29-7.36(m,2h),7.22-7.28(m,4h),6.88-6.93(m,2h),4.98(d,4h),4.39-4.46(m,1h),4.24-4.31(m,1h),3.86-3.93(m,4h),3.80(s,2h),3.46-3.61(m,15h),3.43-3.45(m,5h),3.33-3.38(m,4h),2.87(s,3h),1.99-2.11(m,4h),1.56-1.80(m,2h),1.34-1.50(m,4h),0.94-1.32(m,11h),0.80-0.91(m,13h)。ms(+esi)m/e1478.3(m+h)。

2.9.該段落特意留白。

2.10.合成n-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯基]-l-纈氨醯-n-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]苯基}-n5-氨基甲醯基-l-鳥氨醯胺(合成子bg)

2.10.1.(s)-2-((s)-2-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-n-(4-(羥甲基)苯基)-5-脲基戊醯胺

將實施例2.1.4(3g)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙酸酯(1.789g)溶於甲醇(30ml)中，並在室溫下攪拌三小時。減壓濃縮溶劑，並將殘餘物用矽膠色譜純化，用5-30%的甲醇/二氯甲烷的梯度進行洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e531.0(m+h)+。

2.10.2.4-((s)-2-((s)-2-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯

將雙(4-硝基苯基)碳酸酯(2.293g)、n,n-二異丙基乙胺(1.317ml)和實施例2.10.1(2g)溶於n,n-二甲基甲醯胺(30ml)中，並在室溫下攪拌16小時。減壓濃縮溶劑，並將殘餘物用矽膠色譜純化，用0-10%的甲醇/二氯甲烷的梯度進行洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e696.9(m+h)+。

2.10.3.n-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯基]-l-纈氨醯-n-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]苯基}-n5-氨基甲醯基-l-鳥氨醯胺

在實施例2.9.5中，用實施例2.10.2替代實施例2.9.4，製備標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.86(bs,1h),9.95(s,1h),8.10(d,1h),8.01(dd,2h),7.79(d,1h),7.65-7.56(m,3h),7.55-7.40(m,3h),7.40-7.33(m,2h),7.35-7.24(m,3h),6.99(s,2h),6.95(d,1h),4.42-4.28(m,1h),4.15(dd,1h),3.92-3.85(m,2h),3.83-3.77(m,2h),3.77-3.52(m,2h),3.45-3.38(m,2h),3.30-3.23(m,2h),3.08-2.90(m,4h),2.90-2.81(m,3h),2.09(s,3h),2.02-1.86(m,1h),1.79-1.52(m,2h),1.52-0.92(m,15h),0.91-0.75(m,13h)。ms(esi)m/e1316.1(m+h)+。

2.11.該段落特意留白。

2.12.合成n-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯基]-l-丙氨醯-n-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]苯基}-l-丙氨醯胺(合成子bi)

2.12.1.3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-n-((s)-1-(((s)-1-((4-(羥甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丙-2-基)丙醯胺

將實施例2.3.3(9g)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙酸酯(9.03g)在n,n-二甲基甲醯胺(50ml)中的混合物、在室溫下攪拌16小時。用水稀釋該反應混合物。將水層用二氯甲烷(3x100ml)反萃取。真空濃縮有機溶劑。將得到的粗品吸收到矽膠上，用矽膠色譜純化，用50:1的二氯甲烷/甲醇洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e439.1(m+na)+。

2.12.2.4-((s)-2-((s)-2-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯胺基)丙醯胺基)丙醯胺基)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯

在實施例2.10.2中，用實施例2.12.1替代實施例2.10.1，製備標題化合物。用矽膠色譜純化產物，用25%的四氫呋喃/二氯甲烷洗脫。ms(esi)m/e604.0(m+h)+。

2.12.3.n-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯基]-l-丙氨醯-n-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]苯基}-l-丙氨醯胺

在實施例2.9.5中，用實施例2.12.2替代實施例2.9.4，製備標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm9.51(s,1h),7.97(dd,1h),7.90-7.83(m,1h),7.76(d,1h),7.72-7.66(m,1h),7.64-7.57(m,1h),7.60-7.55(m,1h),7.55(s,1h),7.48-7.37(m,3h),7.37-7.29(m,2h),7.29-7.22(m,3h),6.91(d,1h),6.88(s,1h),4.98(s,2h),4.96(bs,2h),4.40(p,1h),4.24(p,1h),3.89(t,2h),3.79(s,2h),3.64(t,2h),3.44(t,2h),3.29-3.14(m,2h),3.02(t,2h),2.86(s,3h),2.08(s,3h),1.36(bs,2h),1.31(d,3h),1.29-0.94(m,14h),0.83(s,6h)。ms(esi)m/e1202.1(m+h)+。

2.13.該段落特意留白。

2.14.該段落特意留白。

2.15.該段落特意留白。

2.16.該段落特意留白。

2.17.合成n-[(2r)-4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-2-磺基丁醯基]-l-纈氨醯-n-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]苯基}-n5-氨基甲醯基-l-鳥氨醯胺(合成子bo)

2.17.1.3-(1-((3-(2-((((4-((s)-2-((s)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

在實施例2.3.6中，用(9h-芴-9-基)甲基((s)-3-甲基-1-(((s)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯替代實施例2.3.5，製備標題化合物。ms(esi)m/e1387.3(m+h)+。

2.17.2.3-(1-((3-(2-((((4-((s)-2-((s)-2-氨基-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

將實施例2.17.1(15mg)與30%的二乙胺/n,n-二甲基甲醯胺溶液(0.5ml)混合，並將該反應混合物在室溫下攪拌過夜。用反相hplc直接純化粗品反應混合物，使用c18柱和10-100%的乙腈/水(含有0.1%三氟乙酸)的梯度。將含有產物的級分冷凍乾燥，得到標題化合物的三氟乙酸鹽。ms(esi)m/e1165.5(m+h)+。

2.17.3.4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-1-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-1-氧代丁烷-2-磺酸酯

在用氮氣吹掃的100ml燒瓶中，將1-羧基-3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙烷-1-磺酸酯溶於二甲基乙醯胺(20ml)中。向此溶液中加入n-羥基琥珀醯亞胺(440mg，)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1000mg)，並將該反應在氮氣氛圍中、在室溫下攪拌16小時。減壓濃縮溶劑，並將殘餘物用矽膠色譜純化，用1-2%的甲醇/二氯甲烷(含有0.1%v/v乙酸)的梯度進行洗脫，得到標題化合物的～80%活化酯和20%酸的混合物，其不用進一步純化，在下一步中直接使用。ms(esi)m/e360.1(m+h)+。

2.17.4.n-[(2r)-4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-2-磺基丁醯基]-l-纈氨醯-n-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]苯基}-n5-氨基甲醯基-l-鳥氨醯胺

將實施例2.17.2的三氟乙酸鹽(6mg)與實施例2.17.3(16.85mg)和n,n-二異丙基乙胺(0.025ml)在n,n-二甲基甲醯胺(0.500ml)中混合，並將該反應混合物在室溫下攪拌過夜。用反相hplc純化該粗品反應混合物，使用gilson系統和c1825x100mm柱，用5-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將產物級分冷凍乾燥，得到在新增加的位置上立體化學構型不同的兩個非對映異構體(衍生自外消旋的實施例2.17.3)。在該中心處的兩個產物的立體化學構型是隨機指定的。ms(esi)m/e1408.5(m-h)-。

2.18.合成n-[(2s)-4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-2-磺基丁醯基]-l-纈氨醯-n-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]苯基}-n5-氨基甲醯基-l-鳥氨醯胺(合成子bp)

如實施例2.17.4所述，標題化合物是在製備實施例2.17.4期間分離的第二個非對映異構體。ms(esi)m/e1408.4(m-h)-。

2.19.該段落特意留白。

2.20.該段落特意留白。

2.21.合成n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-3-磺基-l-丙氨醯-l-纈氨醯-n-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基]氨基甲醯基}氧基)甲基]苯基}-l-丙氨醯胺(合成子iq)

2.21.1.(s)-(9h-芴-9-基)甲基(1-((4-(羥甲基)苯基)氨基-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸酯

向(s)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸(50g)的甲醇(400ml)和二氯甲烷(400ml)溶液中加入(4-氨基苯基)甲醇(23.73g)和2-乙氧基喹啉-1(2h)-甲酸乙酯(79g)，並將該反應在室溫下攪拌過夜。蒸發溶劑，並將殘餘物用二氯甲烷洗滌，得到標題化合物。

2.21.2.(s)-2-氨基-n-(4-(羥甲基)苯基)丙醯胺

向實施例2.21.1(10g)的n,n-二甲基甲醯胺(100ml)溶液中加入哌啶(40ml)，並將該反應攪拌2小時。蒸發溶劑，並將殘餘物溶於甲醇中。濾出固體，並濃縮濾液，得到粗品。

2.21.3.(9h-芴-9-基)甲基((s)-1-(((s)-1-((4-(羥甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯

向實施例2.21.2(5g)的n,n-二甲基甲醯胺(100ml)溶液中加入(s)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酸(10.48g)和2-(1h-苯並[d][1,2,3]三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基異脲六氟磷酸鹽(v)(14.64g)，並將該反應攪拌過夜。蒸發溶劑，用二氯甲烷洗滌殘餘物，濾出固體，得到粗品。

2.21.4.(9h-芴-9-基)甲基((s)-3-甲基-1-(((s)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯

在實施例2.10.2中，用實施例2.21.3替代實施例2.10.1，製備標題化合物。

2.21.5.3-(1-((3-(2-((((4-((s)-2-((s)-2-氨基-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)苄基)氧基)羰基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

將實施例1.3.7(0.102g)、實施例2.21.4(0.089g)和n,n-二異丙基乙胺(0.104ml)的n,n-二甲基甲醯胺(1ml)溶液在室溫下攪拌。攪拌過夜之後，加入二乙胺(0.062ml)，並將該反應再攪拌2小時。用水(1ml)稀釋該反應，用三氟乙酸淬滅，並用製備hplc純化，使用gilson系統，用10-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將目標級分合併，冷凍乾燥，提供標題化合物。

2.21.6.3-(1-((3-(2-((((4-((s)-2-((s)-2-((r)-2-氨基-3-磺基丙醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)苄基)氧基)羰基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

向(r)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-磺基丙酸(0.028g)和2-(3h-[1,2,3]三唑並[4,5-b]吡啶-3-基)-1,1,3,3-四甲基異脲六氟磷酸鹽(v)(0.027g)的n,n-二甲基甲醯胺(1ml)溶液中加入n,n-二異丙基乙胺(0.042ml)，並將該反應攪拌5分鐘。將該混合物加入到實施例2.21.5(0.050g)中，並將該混合物攪拌1小時。然後，將二乙胺(0.049ml)加入到該反應中，並繼續攪拌1小時。將該反應用n,n-二甲基甲醯胺(1ml)和水(0.5ml)稀釋，用三氟乙酸淬滅，用反相hplc純化，使用gilson系統，用10-88%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將目標級分合併，冷凍乾燥，提供標題化合物。ms(esi)m/e1214.4(m-h)-。

2.21.7.n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-3-磺基-l-丙氨醯-l-纈氨醯-n-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基]氨基甲醯基}氧基)甲基]苯基}-l-丙氨醯胺

向實施例2.21.6(0.030g)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己酸酯(8.34mg)的n,n-二甲基甲醯胺(0.5ml)溶液中加入n,n-二異丙基乙胺(0.020ml)，並將該反應攪拌1小時。將該反應用n,n-二甲基甲醯胺(1ml)和水(0.5ml)稀釋，用製備hplc純化，使用gilson系統，用10-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將目標級分合併，冷凍乾燥，提供標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.84(s,1h),9.41(s,1h),8.26(d,1h),8.11-7.95(m,3h),7.79(d,1h),7.68(d,2h),7.61(d,1h),7.57-7.27(m,6h),7.24(d,2h),7.12(t,1h),7.02-6.90(m,3h),4.94(d,4h),4.67(td,2h),4.34-4.22(m,2h),4.04-3.94(m,2h),3.88(t,2h),3.82(s,2h),3.42-3.27(m,4h),3.11-2.96(m,5h),2.84(dd,1h),2.30-1.98(m,6h),1.56-1.41(m,4h),1.41-0.79(m,28h)。ms(esi)m/e1409.1(m+h)+。

2.22.合成4-[(1e)-3-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)丙-1-烯-1-基]-2-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-β-丙氨醯}氨基)苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)(合成子db)

2.22.1.(e)-叔丁基二甲基((3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷-2-基)烯丙基)氧基)矽烷

在氮氣氛圍中，向裝有叔丁基二甲基(丙-2-炔-1-基氧基)矽烷(5g)和二氯甲烷(14.7ml)的燒瓶中逐滴加入4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼雜環戊烷(3.94g)。將該混合物在室溫下攪拌一分鐘，然後通過小管轉移到氮氣吹掃的、包含cp2zrclh(氯化雙(η5-環戊二烯基)氫化鋯，schwartz's試劑)(379mg)的燒瓶中。將得到的反應混合物在室溫下攪拌16小時。將該混合物小心地用水(15ml)淬滅，而後用乙醚(3x30ml)提取。用水(15ml)洗滌合併的有機相，用mgso4乾燥，過濾，濃縮，用矽膠色譜純化，用0-8%的乙酸乙酯/庚烷的梯度進行洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/z316.0(m+nh4)+。

2.22.2.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(4-溴-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

將(2r,3r,4s,5s,6s)-2-溴-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(5g)溶於乙腈(100ml)中。將ag2o(2.92g)加入到該溶液中，並將該反應在室溫下攪拌5分鐘。加入4-溴-2-硝基苯酚(2.74g)，並將該反應混合物在室溫下攪拌4小時。通過硅藻土過濾銀鹽殘餘物，並將濾液減壓濃縮。用矽膠色譜純化殘餘物，用梯度10-70%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。ms(esi+)m/z550.9(m+nh4)+。

2.22.3.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(4-((e)-3-((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)丙-1-烯-1-基)-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

將實施例2.22.2(1g)、碳酸鈉(0.595g)、三(二亞苄基丙酮)二鈀(0.086g)和1,3,5,7-四甲基-6-苯基-2,4,8-三氧雜-6-磷雜金剛烷(0.055g)在配備有回流冷凝器的50ml三頸圓底燒瓶中混合，並將該系統用氮氣脫氣。將實施例2.22.1(0.726g)的四氫呋喃(15ml)溶液用氮氣單獨脫氣30分鐘。將後面的溶液通過小管轉移到包含固體試劑的燒瓶中，而後通過注射器加入脫氣的水(3ml)。將該反應加熱至60℃，保持兩小時。將該反應混合物在乙酸乙酯(3x30ml)和水(30ml)之間分配。將合併的有機相干燥(na2so4)，過濾，並濃縮。用矽膠色譜純化殘餘物，用梯度0-35%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，提供標題化合物。ms(esi+)m/z643.1(m+nh4)+。

2.22.4.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(2-氨基-4-((e)-3-羥基丙-1-烯-1-基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

向配備有壓力平衡加入漏鬥的氮氣吹掃的500ml三頸燒瓶中加入鋅粉(8.77g)。通過小管，加入脫氣的實施例2.22.3(8.39g)的四氫呋喃(67ml)溶液。將得到的懸浮液在冰浴中冷卻，並通過加入漏鬥逐滴加入6nhcl(22.3ml)，加入速率應該使反應的內部溫度不超過35℃。加入完成之後，將該反應在室溫下攪拌兩個小時，通過硅藻土的墊過濾，用水和乙酸乙酯衝洗。用飽和nahco3水溶液處理濾液，直到水層不再是酸性為止，並過濾該混合物，取出所得到的固體。將濾液轉入分液漏鬥中，並分離各層。用乙酸乙酯(3x75ml)提取水層，並將合併的有機層用水(100ml)洗滌，用na2so4乾燥，過濾，並濃縮。將殘餘物與乙醚一起研磨，並過濾收集固體，提供標題化合物。ms(esi+)m/z482.0(m+h)+。

2.22.5.(9h-芴-9-基)甲基(3-氯-3-氧代丙基)氨基甲酸酯

向3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸(5.0g)的二氯甲烷(53.5ml)溶液中加入亞硫醯氯(0.703ml)。將該混合物在60℃下攪拌一小時。冷卻該混合物，並濃縮，得到標題化合物，其不用進一步純化，在下一步中直接使用。

2.22.6.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(2-(3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙醯胺基)-4-((e)-3-羥基丙-1-烯-1-基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

將實施例2.22.4(6.78g)溶於二氯甲烷(50ml)中，並將該溶液在冰浴中冷卻至0℃。加入n,n-二異丙基乙胺(3.64g)，而後逐滴加入實施例2.22.5(4.88g)的二氯甲烷(50ml)溶液。將該反應攪拌16小時，並使冰浴達到室溫。加入飽和nahco3水溶液(100ml)，並分離各層。將水層進一步用二氯甲烷(2x50ml)提取。用na2so4乾燥提取物，過濾，濃縮，用矽膠色譜純化，用梯度5-95%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到起始苯胺和目標產物的不可分離的混合物。將該混合物在1nhcl水溶液(40ml)和乙醚與乙酸乙酯的1:1混合物(40ml)之間分配，而後用乙酸乙酯(2x25ml)進一步提取水相。將有機相合併，用水(2x25ml)洗滌，用na2so4乾燥，過濾，並濃縮，得到標題化合物。ms(esi+)m/z774.9(m+h)+。

2.22.7.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(2-(3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙醯胺基)-4-((e)-3-(((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)丙-1-烯-1-基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

將實施例2.22.6(3.57g)溶於二氯甲烷(45ml)中，並加入雙(4-硝基苯基)碳酸酯(2.80g)，而後逐滴加入n,n-二異丙基乙胺(0.896g)。將該反應混合物在室溫下攪拌兩個小時。將矽膠(20g)加入到該反應溶液中，並將該混合物減壓濃縮至幹，保持浴溫等於或低於25℃。將矽渣加載到柱頂上，並用矽膠色譜純化產物，用梯度0-100%的乙酸乙酯-庚烷洗脫，提供部分純化的產物，它被硝基苯酚汙染。將該物質與甲基叔丁基醚(250ml)一起研磨，並將得到的漿液靜置1小時。過濾收集產物。以類似的方式，收集連續三批產物，得到標題化合物。ms(esi+)m/z939.8(m+h)+。

2.22.8.3-(1-((3-(2-(((((e)-3-(3-(3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙醯胺基)-4-(((2s,3r,4s,5s,6s)-3,4,5-三乙醯氧基-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苯基)烯丙基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

向冷(0℃)的實施例1.1.17的三氟乙酸鹽(77mg)和實施例2.22.7(83mg)的n,n-二甲基甲醯胺(3.5ml)溶液中加入n,n-二異丙基乙胺(0.074ml)。將該反應慢慢地升溫至室溫，並攪拌16小時。加入水和乙酸乙酯，淬滅該反應。分離各層，並用額外的乙酸乙酯提取水層兩次。將合併的有機物用無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮，得到標題化合物，其不用進一步純化，在隨後的步驟中直接使用。

2.22.9.3-(1-((3-(2-(((((e)-3-(3-(3-氨基丙醯胺基)-4-(((2s,3r,4s,5s,6s)-6-羧基-3,4,5-三羥基四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苯基)烯丙基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

向環境溫度的實施例2.22.8(137mg)的甲醇(3ml)溶液中加入2m氫氧化鋰溶液(0.66ml)。將該反應混合物在35℃下攪拌兩個小時，並加入乙酸(0.18ml)，淬滅該反應。將該反應濃縮至幹，並將殘餘物用甲醇稀釋。用反相hplc純化粗品，使用gilson系統和c1825x100mm柱，用20-75%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將產物級分冷凍乾燥，得到標題化合物的三氟乙酸鹽。ms(esi)m/e1220.3(m+na)+。

2.22.10.4-[(1e)-3-({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)丙-1-烯-1-基]-2-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-β-丙氨醯}氨基)苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)

向實施例2.22.9的三氟乙酸鹽(41.9mg)的n,n-二甲基甲醯胺(1ml)溶液中加入n-琥珀醯亞胺基6-馬來醯亞胺基(maleimido)己酸酯(9.84mg)和n,n-二異丙基乙胺(0.010ml)，並將該反應在室溫下攪拌16小時。用反相hplc純化粗品反應物，使用gilson系統和c1825x100mm柱，用5-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將產物級分冷凍乾燥，得到標題化合物。1hnmr(500mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.86(bs,2h),9.03(s,1h),8.25(bs,1h),8.03(d,1h),7.97-7.85(m,1h),7.79(d,1h),7.64-7.59(m,1h),7.56-7.39(m,3h),7.40-7.32(m,2h),7.28(s,1h),7.14-7.06(m,1h),7.04(d,1h),6.98(s,2h),6.95(d,1h),6.60-6.52(m,1h),6.22-6.12(m,1h),4.95(bs,2h),4.90-4.75(m,1h),4.63(d,2h),4.24-4.05(m,1h),4.08-3.62(m,8h),3.50-3.24(m,10h),3.04-2.97(m,2h),2.92-2.82(m,3h),2.11-2.06(m,3h),2.03(t,j=7.4hz,2h),1.53-1.39(m,4h),1.41-0.73(m,23h)。ms(esi)m/e1413.3(m+na)+。

2.23.合成4-{(1e)-3-[({2-[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙氧基]乙基}氨基甲醯基)氧基]丙-1-烯-1-基}-2-({n-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯基]-β-丙氨醯}氨基)苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)(合成子dm)

2.23.1.3-(1-((3-(2-(2-(((((e)-3-(3-(3-氨基丙醯胺基)-4-(((2s,3r,4s,5s,6s)-6-羧基-3,4,5-三羥基四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苯基)烯丙基)氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

向冷(0℃)的實施例2.22.7(94mg)和實施例1.4.10(90mg)的溶液中加入n,n-二異丙胺(0.054ml)。將該反應慢慢地加熱至室溫，並攪拌過夜。加入水和乙酸乙酯，淬滅該反應。分離各層，並用額外的乙酸乙酯提取水層兩次。將合併的有機物用無水硫酸鈉乾燥，過濾，並減壓濃縮。將粗品溶於四氫呋喃/甲醇/水(2:1:1，8ml)中，向其中加入氫氧化鋰一水合物(40mg)。將該反應混合物攪拌過夜。真空濃縮該混合物，用三氟乙酸酸化，並溶於二甲亞碸/甲醇中。用反相hplc純化該溶液，使用gilson系統和c18柱，用10-85%的乙腈/水中的0.1%三氟乙酸洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e1228.1(m+h)+。

2.23.2.4-{(1e)-3-[({2-[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙氧基]乙基}氨基甲醯基)氧基]丙-1-烯-1-基}-2-({n-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯基]-β-丙氨醯}氨基)苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)

向實施例2.23.1(20mg)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙酸酯(5.5mg)的n,n-二甲基甲醯胺(2ml)溶液中加入n,n-二異丙基乙胺(0.054ml)。將該反應攪拌過夜。將該反應混合物用甲醇(2ml)稀釋，並用三氟乙酸酸化。用反相hplc純化該溶液，使用gilson系統和c18柱，用10-85%的乙腈/水中的0.1%三氟乙酸洗脫，得到標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.85(s,1h),9.03(s,1h),8.24(s,1h),7.95-8.11(m,2h),7.79(d,1h),7.61(d,1h),7.32-7.52(m,5h),7.28(s,1h),7.02-7.23(m,3h),6.91-6.96(m,3h),6.57(d,1h),6.05-6.24(m,1h),4.95(s,2h),4.87(d,1h),4.59(d,2h),3.78-3.95(m,4h),3.13(q,2h),3.01(t,2h),2.51-2.57(m,2h),2.27-2.39(m,3h),2.11(s,3h),0.92-1.43(m,16h),0.83(s,6h)。ms(esi)m/e1379.2(m+h)+。

2.24.合成4-{(1e)-3-[({2-[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙氧基]乙基}氨基甲醯基)氧基]丙-1-烯-1-基}-2-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-β-丙氨醯}氨基)苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)(合成子dl)

向實施例2.23.1(20mg)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己酸酯(6.5mg)的n,n-二甲基甲醯胺(2ml)溶液中加入n,n-二異丙基乙胺(0.054ml)。將該反應混合物攪拌過夜。將該反應混合物用甲醇(2ml)稀釋，並用三氟乙酸酸化。用反相hplc純化該混合物，使用gilson系統和c18柱，用10-85%的乙腈/水中的0.1%三氟乙酸洗脫，得到標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.85(s,1h),9.03(s,1h),8.24(s,1h),8.03(d,1h),7.87(t,1h),7.78(s,1h),7.61(d,1h),7.32-7.55(m,5h),6.90-7.19(m,5h),6.56(d,1h),6.08-6.24(m,1h),4.91-4.93(m,1h),4.86(s,1h),4.59(d,2h),3.27-3.46(m,14h),3.13(q,3h),2.96-3.02(m,2h),2.50-2.59(m,3h),2.09(s,3h),2.00-2.05(m,3h),0.94-1.54(m,20h),0.83(s,6h)。ms(esi)m/e1421.2(m+h)+。

2.25.合成4-[(1e)-14-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)-6-甲基-5-氧代-4,9,12-三氧雜-6-氮雜十四碳-1-烯-1-基]-2-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-β-丙氨醯}氨基)苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)(合成子dr)

2.25.1.3-(1-((3-(((e)-14-(3-(3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙醯胺基)-4-(((2s,3r,4s,5s,6s)-3,4,5-三乙醯氧基-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苯基)-9-甲基-10-氧代-3,6,11-三氧雜-9-氮雜十四碳-13-烯-1-基)氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

向冷(0℃)的實施例2.22.7(90mg)和實施例1.2.11(92mg)溶液中加入n,n-二異丙胺(0.050ml)。除去冰浴，並將該反應攪拌過夜。加入水和乙酸乙酯，淬滅該反應。分離各層，並用額外的乙酸乙酯提取水層兩次。將合併的有機物用無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮，提供標題化合物，其不用進一步純化，在隨後的步驟中直接使用。ms(esi)m/e1648.2(m+h)+。

2.25.2.3-(1-((3-(((e)-14-(3-(3-氨基丙醯胺基)-4-(((2s,3r,4s,5s,6s)-6-羧基-3,4,5-三羥基四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苯基)-9-甲基-10-氧代-3,6,11-三氧雜-9-氮雜十四碳-13-烯-1-基)氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

向冷(0℃)的實施例2.25.1(158mg)的甲醇(2.0ml)溶液中加入2m氫氧化鋰水溶液(0.783ml)。將該反應攪拌4小時，並加入乙酸(0.1ml)，淬滅該反應。將該反應濃縮至幹，並將殘餘物色譜分離，使用biotageisoleraone系統和反相c1840g柱，用10-85%的乙腈/水中的0.1%三氟乙酸洗脫。將含有產物的級分冷凍乾燥，得到標題化合物的固體。ms(esi)m/e1286.2(m+h)+。

2.25.3.4-[(1e)-14-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)-6-甲基-5-氧代-4,9,12-三氧雜-6-氮雜十四碳-1-烯-1-基]-2-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-β-丙氨醯}氨基)苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)

向環境溫度的實施例2.25.2(9.03mg)的n,n-二甲基甲醯胺(1.0ml)溶液中加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己酸酯(4mg)和n,n-二異丙胺(0.020ml)，並將該反應攪拌過夜。用二甲亞碸和甲醇稀釋該反應，用rp-hplc(在biotageisolera色譜上，40gc18柱)純化，用梯度10至75%的乙腈/水(包含0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。通過冷凍乾燥，將含有產物的級分濃縮，得到標題化合物的固體。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.85(s,1h),8.04(d,1h),7.99(t,1h),7.79(d,1h),7.60(d,1h),7.53-7.41(m,3h),7.40-7.32(m,2h),7.28(s,1h),6.99(s,2h),6.98-6.92(m,1h),4.95(bs,2h),3.92-3.85(m,1h),3.81(s,2h),3.63-3.55(m,4h),3.55-3.31(m,28h),3.18-3.10(m,2h),3.05-2.98(m,2h),2.97(s,2h),2.80(s,2h),2.59-2.50(m,1h),2.32(t,2h),2.10(s,3h),1.39-1.34(m,2h),1.31-1.18(m,4h),1.20-0.92(m,6h),0.84(s,6h)。ms(esi)m/e1479.3(m+h)+。

2.26.合成4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-3-[2-(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]氨基}乙氧基)乙氧基]苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)(合成子dz)

2.26.1.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(4-甲醯基-3-羥基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

向2,4-二羥基苯甲醛(15g)和(2s,3r,4s,5s,6s)-2-溴-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(10g)的乙腈溶液中加入碳酸銀(10g)，並將該反應加熱至40℃。攪拌4小時之後，冷卻該反應，過濾，並濃縮。將粗品懸浮在二氯甲烷中，通過硅藻土過濾，並濃縮。用矽膠色譜純化殘餘物，用梯度10-100%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。

2.26.2.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(3-羥基-4-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

將實施例2.26.1(16.12g)的四氫呋喃(200ml)和甲醇(200ml)溶液冷卻至0℃，並分批加入硼氫化鈉(1.476g)。將該反應攪拌20分鐘，然後用水∶飽和碳酸氫鈉溶液的1:1混合物(400ml)淬滅。濾出所得到的固體，並用乙酸乙酯衝洗。分離各相，並用乙酸乙酯提取水層四次。將合併的有機層用硫酸鎂乾燥，過濾，並濃縮。通過矽膠色譜純化粗品，用梯度10-100%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e473.9(m+nh4)+。

2.26.3.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(4-(((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)甲基)-3-羥基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

在-5℃，向實施例2.26.2(7.66g)和叔丁基二甲基甲矽烷基氯(2.78g)/二氯甲烷(168ml)中加入咪唑(2.63g)，並將該反應混合物攪拌過夜，使得反應的內部溫度升至12℃。將該反應混合物倒入飽和氯化銨水溶液中，並用二氯甲烷提取四次。將合併的有機物用鹽水洗滌，用硫酸鎂乾燥，過濾，並濃縮。通過矽膠色譜純化粗品，用梯度10-100%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e593.0(m+na)+。

2.26.4.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(3-(2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-4-(((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

向實施例2.26.3(5.03g)和在甲苯(88ml)中的三苯基膦(4.62g)中加入偶氮二甲酸二叔丁基酯(4.06g)，並將該反應混合物攪拌30分鐘。加入(9h-芴-9-基)甲基(2-(2-羥乙氧基)乙基)氨基甲酸酯，並將該反應再攪拌1.5小時。將反應物直接加載到矽膠上，用梯度10-100%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。

2.26.5.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(3-(2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-4-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

將實施例2.26.4(4.29g)在3∶1∶1的乙酸∶水∶四氫呋喃溶液(100ml)中攪拌過夜。將該反應混合物倒入飽和碳酸氫鈉水溶液中，並用乙酸乙酯提取。將有機層用硫酸鎂乾燥，過濾，並濃縮。通過矽膠色譜純化粗品，用梯度10-100%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。

2.26.6.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(3-(2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

向實施例2.26.5(0.595g)和雙(4-硝基苯基)碳酸酯(0.492g)的n,n-二甲基甲醯胺(4ml)溶液中加入n,n-二異丙胺(0.212ml)。1.5小時之後，在高真空下濃縮該反應。用矽膠色譜純化殘餘物，用梯度10-100%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e922.9(m+na)+。

2.26.7.3-(1-((3-(2-((((2-(2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-4-(((2s,3r,4s,5s,6s)-3,4,5-三乙醯氧基-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

向實施例1.1.17(0.106g)和實施例2.26.6(0.130g)的n,n-二甲基甲醯胺(1.5ml)溶液中加入n,n-二異丙胺(0.049ml)。6小時之後，再加入n,n-二異丙胺(0.025ml)，並將該反應攪拌過夜。用乙酸乙酯(50ml)稀釋該反應，並用水(10ml)洗滌，而後用鹽水(15ml)洗滌四次。用硫酸鎂乾燥有機層，過濾，並濃縮，得到標題化合物，其不用進一步純化，在下一步中直接使用。

2.26.8.3-(1-((3-(2-((((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-4-(((2s,3r,4s,5s,6s)-6-羧基-3,4,5-三羥基四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

將實施例2.26.7(0.215g)的甲醇(2ml)懸浮液用2.0m氫氧化鋰水溶液(1ml)處理。攪拌1小時之後，加入乙酸(0.119ml)，淬滅該反應。用二甲亞碸(1ml)稀釋所得到的懸浮液，並用製備hplc純化，使用gilson系統，用10-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將目標級分合併，冷凍乾燥，提供標題化合物。

2.26.9.4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-3-[2-(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]氨基}乙氧基)乙氧基]苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)

向實施例2.26.8(0.050g)的n,n-二甲基甲醯胺(1ml)溶液中加入n,n-二異丙胺(0.037ml)，而後加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己酸酯(0.017g)，並在室溫下攪拌該反應。攪拌1小時之後，用水稀釋該反應，並用反相hplc純化，使用gilson系統，用10-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將目標級分合併，冷凍乾燥，提供標題化合物。1hnmr(500mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.86(s,1h),8.03(d,1h),7.82-7.77(m,2h),7.62(d,1h),7.53-7.41(m,3h),7.40-7.33(m,2h),7.28(s,1h),7.19(d,1h),6.98(s,2h),6.95(d,1h),6.66(s,1h),6.60(d,1h),5.06(t,1h),5.00-4.93(m,4h),4.18-4.04(m,2h),3.95-3.85(m,2h),3.85-3.77(m,2h),3.71(t,2h),3.41-3.30(m,4h),3.30-3.23(m,4h),3.19(q,2h),3.01(t,2h),2.85(d,3h),2.09(s,3h),2.02(t,2h),1.53-1.40(m,4h),1.40-0.78(m,24h)。ms(esi)m/e1380.5(m-h)-。

2.27.合成4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯基]氨基}乙氧基)乙氧基]苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)(合成子ea)

向實施例2.26.8(0.031g)的n,n-二甲基甲醯胺(1ml)溶液中加入n,n-二異丙胺(0.023ml)，而後加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙酸酯(9mg)，並在室溫下攪拌該反應。攪拌1小時之後，用水稀釋該反應，並用製備hplc純化，使用gilson系統，用10-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將目標級分合併，冷凍乾燥，提供標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.84(s,1h),8.03(d,1h),8.00(t,1h),7.79(d,1h),7.61(d,1h),7.54-7.41(m,3h),7.40-7.32(m,2h),7.28(s,1h),7.19(d,1h),6.97(s,2h),6.95(d,1h),6.66(s,1h),6.60(d,1h),5.11-5.02(m,1h),4.96(s,4h),4.18-4.02(m,2h),3.96-3.84(m,2h),3.80(s,2h),3.71(t,2h),3.43-3.22(m,12h),3.17(q,2h),3.01(t,2h),2.85(d,3h),2.33(t,2h),2.09(s,3h),1.44-0.76(m,18h)。ms(esi)m/e1338.5(m-h)-。

2.28.合成6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-3-{1-[(3-{2-[({[3-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-β-丙氨醯}氨基)-4-(β-d-吡喃半乳糖基氧基)苄基]氧基}羰基)(甲基)氨基]乙氧基}-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基)甲基]-5-甲基-1h-吡唑-4-基}吡啶-2-甲酸(合成子eo)

2.28.1.(2r,3s,4s,5r,6s)-2-(乙醯氧基甲基)-6-溴四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

將乾燥的100ml圓底燒瓶用氮氣吹掃，加入(2s,3r,4s,5s,6r)-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2h-吡喃-2,3,4,5-四基四乙酸酯(5g)，並在氮氣氛中，用橡膠隔片覆蓋。加入溴化氫的冰醋酸溶液(33%wt，11.06ml)，並將該反應在室溫下攪拌兩個小時。將該反應混合物用二氯甲烷(75ml)稀釋，並倒入250ml冰冷的水中。分離各層，並將有機層進一步用冰冷的水(3x100ml)和飽和碳酸氫鈉水溶液(100ml)洗滌。將有機層用mgso4乾燥，過濾，並減壓濃縮。通過與甲苯(3x50ml)共沸，除去殘餘的乙酸。減壓濃縮溶劑，得到標題化合物，其不用進一步純化，在下一步中直接使用。ms(esi)m/e429.8(m+nh4)+。

2.28.2.(2r,3s,4s,5r,6s)-2-(乙醯氧基甲基)-6-(4-甲醯基-2-硝基苯氧基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

將實施例2.28.1(5.13g)溶於乙腈(100ml)中。加入氧化銀(i)(2.89g)，並將該反應攪拌20分鐘。加入4-羥基-3-硝基苯甲醛(2.085g)，並將該反應混合物在室溫下攪拌四小時，而後通過millipore0.22μm過濾器真空過濾，除去銀鹽。減壓濃縮溶劑，得到標題化合物，其不用進一步純化，在下一步中直接使用。ms(esi)m/e514.9(m+nh4)+。

2.28.3.(2r,3s,4s,5r,6s)-2-(乙醯氧基甲基)-6-(4-(羥甲基)-2-硝基苯氧基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

向氮氣吹掃的乾燥1l圓底燒瓶中加入實施例2.28.2(5.0g，)細磨的粉末，並保持在氮氣氛中。加入四氫呋喃(70ml)，並將該溶液超聲處理兩分鐘，得到懸浮液。加入甲醇(140ml)，並將該懸浮液再超聲處理3分鐘。將該懸浮液放在冰浴中，並在氮氣氛圍中攪拌20分鐘，達到平衡(0℃)。用20分鐘分批加入硼氫化鈉(0.380g)，並將該冷的(0℃)反應攪拌30分鐘。將乙酸乙酯(200ml)加入到該反應混合物中，並放在冰浴中，加入300ml飽和氯化銨溶液，而後加入200ml水，淬滅該反應。用乙酸乙酯(3x300ml)提取該反應混合物，用鹽水(300ml)洗滌，用mgso4乾燥，過濾，並減壓濃縮溶劑，得到標題化合物。ms(esi)m/e516.9(m+nh4)+。

2.28.4.(2r,3s,4s,5r,6s)-2-(乙醯氧基甲基)-6-(2-氨基-4-(羥甲基)苯氧基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

在實施例2.22.3中，用實施例2.28.3替代實施例2.22.2，並取消研磨步驟，製備標題化合物。產物不用進一步純化，在下一步中直接使用。ms(esi)m/e469.9(m+h)+。

2.28.5.(2s,3r,4s,5s,6r)-2-(2-(3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙醯胺基)-4-(羥甲基)苯氧基)-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

在實施例2.22.5中，用實施例2.28.4替代實施例2.22.3，製備標題化合物。通過在二氯甲烷和水之間分配，淬滅該反應。分離各層，並用乙酸乙酯提取水層兩次。將合併的有機層用1n鹽酸水溶液和鹽水洗滌，用na2so4乾燥，過濾，並減壓濃縮。用矽膠色譜純化產物，用梯度10-100%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e762.9(m+h)+。

2.28.6.(2s,3r,4s,5s,6r)-2-(2-(3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙醯胺基)-4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

向環境溫度下的實施例2.28.5(3.2g)和雙(4-硝基苯基)碳酸酯(1.914g)的n,n-二甲基甲醯胺(20ml)溶液中逐滴加入n,n-二異丙基乙胺(1.10ml)。將該反應在室溫下攪拌1.5小時。減壓濃縮溶劑。用矽膠色譜純化粗品，用梯度10-100%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e927.8(m+h),950.1(m+na)+。

2.28.7.3-(1-((3-(2-((((3-(3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙醯胺基)-4-(((2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-三乙醯氧基-6-(乙醯氧基甲基)四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

在實施例2.22.8中，用實施例2.28.6替代實施例2.22.7，製備標題化合物。ms(esi)m/e1548.3(m+h)+。

2.28.8.3-(1-((3-(2-((((3-(3-氨基丙醯胺基)-4-(((2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-三羥基-6-(羥甲基)四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

在實施例2.22.8中，用實施例2.28.7替代實施例2.22.7，製備標題化合物。ms(esi)m/e1158.3(m+h)+。

2.28.9.6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-3-{1-[(3-{2-[({[3-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-β-丙氨醯}氨基)-4-(β-d-吡喃半乳糖基氧基)苄基]氧基}羰基)(甲基)氨基]乙氧基}-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基)甲基]-5-甲基-1h-吡唑-4-基}吡啶-2-甲酸

在實施例2.22.9中，用實施例2.28.8替代實施例2.22.8，製備標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.85(bs,1h),9.13(bs,1h),8.19(bs,1h),8.03(d,1h),7.88(d,1h),7.79(d,1h),7.62(d,1h),7.55-7.39(m,3h),7.41-7.30(m,2h),7.28(s,1h),7.14(d,1h),7.05-6.88(m,4h),4.96(bs,4h),3.57-3.48(m,1h),3.49-3.09(m,11h),3.08-2.57(m,7h),2.33(d,1h),2.14-1.97(m,6h),1.55-0.90(m,20h),0.86-0.79(m,6h)。ms(esi)m/e1351.3(m+h)+。

2.29.合成2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-5-[2-(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]氨基}乙氧基)乙氧基]苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)(合成子fb)

2.29.1.4-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)-2-羥基苯甲醛

將2,4-二羥基苯甲醛(1.0g)、1-溴-2-(2-溴乙氧基)乙烷(3.4g)和碳酸鉀(1.0g)的乙腈(30ml)溶液加熱至75℃，保持2天。冷卻該反應，用乙酸乙酯(100ml)稀釋，用水(50ml)和鹽水(50ml)洗滌，用硫酸鎂乾燥，過濾，並濃縮。用矽膠色譜純化殘餘物，用梯度5-30%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，提供標題化合物。ms(elsd)m/e290.4(m+h)+。

2.29.2.4-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-2-羥基苯甲醛

向實施例2.29.1(1.26g)的n,n-二甲基甲醯胺(10ml)溶液中加入疊氮化鈉(0.43g)，並將該反應在室溫下攪拌過夜。用乙醚(100ml)稀釋該反應，用水(50ml)和鹽水(50ml)洗滌，用硫酸鎂乾燥，過濾，並濃縮。用矽膠色譜純化殘餘物，用梯度5-30%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。ms(elsd)m/e251.4(m+h)+。

2.29.3.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(5-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-2-甲醯基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

將實施例2.29.2(0.84g)、(3r,4s,5s,6s)-2-溴-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(1.99g)和氧化銀(i)(1.16g)的乙腈(15ml)溶液一起攪拌。攪拌過夜之後，用二氯甲烷(20ml)稀釋該反應。加入硅藻土，過濾該反應，並濃縮。用矽膠色譜純化殘餘物，用梯度5-75%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。

2.29.4.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(5-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-2-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

將實施例2.9.3(0.695g)的甲醇(5ml)和四氫呋喃(2ml)溶液冷卻至0℃。加入硼氫化鈉(0.023g)，並將該反應升溫至室溫。總共攪拌1小時之後，將反應物倒入乙酸乙酯(75ml)和水(25ml)的混合物中，並加入飽和碳酸氫鈉水溶液(10ml)。分離有機層，用鹽水(50ml)洗滌，用硫酸鎂乾燥，過濾，並濃縮。用矽膠色譜純化殘餘物，用梯度5-85%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。ms(elsd)m/e551.8(m-h2o)-。

2.29.5.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(5-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-2-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

在50ml耐壓瓶中，向四氫呋喃(20ml)中的實施例2.29.4(0.465g)中加入5%pd/c(0.1g)，並將該混合物在30psi氫氣氛圍中搖動16小時。過濾該反應，並濃縮，得到標題化合物，其不用進一步純化，直接使用。ms(elsd)m/e544.1(m+h)+。

2.29.6.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(5-(2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-2-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

將實施例2.29.5(0.443g)的二氯甲烷(8ml)溶液冷卻至0℃，然後加入n,n-二異丙胺(0.214ml)和(9h-芴-9-基)甲基氯甲酸酯(0.190g)。1小時之後，濃縮該反應。用矽膠色譜純化殘餘物，用梯度5-95%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。ms(elsd)m/e748.15(m-oh)-。

2.29.7.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(5-(2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-2-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

向實施例2.29.6(0.444g)的n,n-二甲基甲醯胺(5ml)溶液中加入n,n-二異丙胺(0.152ml)和雙(4-硝基苯基)碳酸酯(0.353g)，並在室溫下攪拌該反應。5小時之後，濃縮該反應。用矽膠色譜純化殘餘物，用梯度5-90%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。

2.29.8.3-(1-((3-(2-((((4-(2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-2-(((2s,3r,4s,5s,6s)-3,4,5-三乙醯氧基-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

向實施例1.1.17(0.117g)和實施例2.29.7(0.143g)的n,n-二甲基甲醯胺(1.5m)溶液中加入n,n-二異丙胺(0.134ml)，並將該反應攪拌過夜。用乙酸乙酯(75ml)稀釋該反應，然後用水(20ml)洗滌，而後用鹽水(4x20ml)洗滌。用硫酸鎂乾燥有機層，過濾，並濃縮，得到標題化合物，其不用進一步純化，直接使用。

2.29.9.3-(1-((3-(2-((((4-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-2-(((2s,3r,4s,5s,6s)-6-羧基-3,4,5-三羥基四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

將實施例2.29.8(0.205g)的甲醇(2ml)懸浮液用氫氧化鋰水合物(0.083g)的水溶液(1ml)處理。攪拌1小時之後，通過加入乙酸(0.113ml)淬滅該反應，用二甲亞碸稀釋，並用製備hplc純化，使用gilson系統，用10-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將目標級分合併，冷凍乾燥，提供標題化合物。

2.29.10.2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-5-[2-(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]氨基}乙氧基)乙氧基]苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)

向實施例2.29.9(0.080g)的n,n-二甲基甲醯胺(1ml)溶液中加入n,n-二異丙胺(0.054ml)，而後加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己酸酯(0.025g)，並在室溫下攪拌該反應。攪拌1小時之後，用水(0.5ml)稀釋該反應，並用製備hplc純化(gilson系統)，用10-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將目標級分合併，冷凍乾燥，提供標題化合物。1hnmr(500mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.86(s,1h),8.03(d,1h),7.86-7.81(m,1h),7.79(d,1h),7.62(d,1h),7.52-7.41(m,3h),7.39-7.32(m,2h),7.28(s,1h),7.19(d,1h),6.99(s,2h),6.95(d,1h),6.68(d,1h),6.59(d,1h),5.09-4.99(m,3h),4.96(s,2h),4.05(s,2h),3.94(d,1h),3.88(t,2h),3.81(d,2h),3.47-3.24(m,15h),3.19(q,2h),3.01(t,2h),2.86(d,3h),2.09(s,3h),2.03(t,2h),1.51-1.41(m,4h),1.41-0.78(m,18h),ms(esi)m/e1382.2(m+h)+。

2.30.合成2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基]氨基甲醯基}氧基)甲基]-5-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯基]氨基}乙氧基)乙氧基]苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)(合成子kx)

2.30.1.3-(1-((3-(2-((((4-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-2-(((2s,3r,4s,5s,6s)-6-羧基-3,4,5-三羥基四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苄基)氧基)羰基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

向實施例1.3.7(0.071g)和實施例2.29.7(0.077g)的n,n-二甲基甲醯胺(0.5ml)溶液中加入n,n-二異丙胺(0.072ml)，並將該反應攪拌3小時。濃縮該反應，將得到的油溶於四氫呋喃(0.5ml)和甲醇(0.5ml)中，並用氫氧化鋰一水合物(0.052g)在水(0.5ml)中的溶液處理。攪拌1小時之後，用n,n-二甲基甲醯胺(1ml)稀釋該反應，並用製備hplc純化(使用gilson系統)，用10-75%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將目標級分合併，冷凍乾燥，提供標題化合物。ms(esi)m/e1175.2(m+h)+。

2.30.2.2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基]氨基甲醯基}氧基)甲基]-5-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯基]氨基}乙氧基)乙氧基]苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)

向實施例2.30.1(0.055g)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙酸酯(0.012g)的n,n-二甲基甲醯胺(0.5ml)溶液中加入n,n-二異丙胺(0.022ml)，並將在室溫下攪拌該反應。攪拌1小時之後，用n,n-二甲基甲醯胺和水的1:1溶液(2ml)稀釋該反應，並用製備hplc純化(使用gilson系統)，用10-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將目標級分合併，冷凍乾燥，提供標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.85(s,1h),8.07-8.00(m,2h),7.79(d,1h),7.62(d,1h),7.55-7.41(m,3h),7.40-7.32(m,2h),7.28(s,1h),7.20(d,1h),7.11(t,1h),6.98(s,2h),6.95(d,1h),6.66(s,1h),6.60(dd,1h),5.04(d,1h),5.00(s,2h),4.96(s,2h),4.10-4.03(m,2h),3.95(d,2h),3.88(t,2h),3.70(t,2h),3.59(t,2h),3.46-3.38(m,4h),3.36-3.25(m,4h),3.17(q,2h),3.08-2.98(m,4h),2.33(t,2h),2.10(s,3h),1.37(s,2h),1.25(q,4h),1.18-0.93(m,6h),0.84(s,6h),ms(esi)m/e1325.9(m+h)+。

2.31.合成4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-3-(3-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]氨基}丙氧基)苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)(合成子ff)

2.31.1.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(3-(3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙氧基)-4-甲醯基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

在0℃，向(9h-芴-9-基)甲基(3-羥丙基)氨基甲酸酯(0.245g)和三苯基膦(0.216g)的四氫呋喃(2ml)溶液中逐滴加入偶氮二甲酸二異丙基酯(0.160ml)。攪拌15分鐘之後，加入實施例2.26.1(0.250g)，除去冰浴，並將該反應升溫至室溫。2小時之後，濃縮該反應。用矽膠色譜純化殘餘物，用梯度5-70%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。ms(apci)m/e512.0(m-fmoc)-。

2.31.2.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(3-(3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙氧基)-4-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

向實施例2.31.1(0.233g)的甲醇(3ml)和四氫呋喃(1ml)懸浮液中加入硼氫化鈉(6mg)。30分鐘之後，將反應物倒入乙酸乙酯(50ml)和水(25ml)中，而後加入飽和碳酸氫鈉水溶液(5ml)。分離有機層，用鹽水(25ml)洗滌，用硫酸鎂乾燥，過濾，並濃縮。用矽膠色譜純化殘餘物，用梯度5-80%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。ms(apci)m/e718.1(m-oh)-。

2.31.3.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(3-(3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙氧基)-4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

向實施例2.31.2(0.140g)和雙(4-硝基苯基)碳酸酯(0.116g)的n,n-二甲基甲醯胺(1ml)溶液中加入n,n-二異丙胺(0.050ml)。1.5小時之後，在高真空下濃縮該反應。用矽膠色譜純化殘餘物，用梯度10-70%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。

2.31.4.3-(1-((3-(2-((((2-(3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙氧基)-4-(((2s,3r,4s,5s,6s)-3,4,5-三乙醯氧基-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

向實施例1.1.17(0.065g)和實施例2.31.3(0.067g)的n,n-二甲基甲醯胺(0.75ml)溶液中加入n,n-二異丙胺(0.065ml)。6小時之後，再加入n,n-二異丙胺(0.025ml)，並將該反應混合物攪拌過夜。用乙酸乙酯(50ml)稀釋該反應，並用水(20ml)洗滌，而後用鹽水(20ml)洗滌。用硫酸鎂乾燥乙酸乙酯層，過濾，並濃縮，得到標題化合物，其不用進一步純化，在下一步中直接使用。

2.31.5.3-(1-((3-(2-((((2-(3-氨基丙氧基)-4-(((2s,3r,4s,5s,6s)-6-羧基-3,4,5-三羥基四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

將實施例2.31.4(0.064g)溶於甲醇(0.75ml)中，並用氫氧化鋰一水合物(0.031g)在水(0.75ml)中的溶液處理。攪拌2小時之後，用n,n-二甲基甲醯胺(1ml)稀釋該反應，並用三氟乙酸(0.057ml)淬滅。用製備hplc純化該溶液，使用gilson系統，用10-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將目標級分合併，冷凍乾燥，提供標題化合物。

2.31.6.4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-3-(3-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]氨基}丙氧基)苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)

向實施例2.31.5(0.020g)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己酸酯(5.8mg)的n,n-二甲基甲醯胺(0.5ml)溶液中加入n,n-二異丙胺(0.014ml)。攪拌2小時之後，用n,n-二甲基甲醯胺(1.5ml)和水(0.5ml)稀釋該反應。用製備hplc純化該溶液，使用gilson系統，用10-75%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將目標級分合併，冷凍乾燥，提供標題化合物。1hnmr(500mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.83(s,1h),8.03(d,1h),7.83(t,1h),7.79(d,1h),7.62(d,1h),7.54-7.42(m,3h),7.37(d,1h),7.34(d,1h),7.28(s,1h),7.19(d,1h),6.98(s,2h),6.95(d,1h),6.64(d,1h),6.59(d,1h),5.05(t,1h),4.96(d,4h),4.02-3.94(m,2h),3.88(t,2h),3.46-3.22(m,14h),3.18(q,2h),3.01(t,2h),2.85(d,3h),2.09(s,3h),2.02(t,2h),1.81(p,2h),1.54-1.41(m,4h),1.41-0.78(m,18h)。ms(esi)m/e1350.5(m-h)-。

2.32.合成1-o-({4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-2-[2-(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]氨基}乙氧基)乙氧基]苯基}氨基甲醯基)-β-d-吡喃葡萄糖醛酸(glucopyranuronicacid)(合成子fu)

2.32.1.2-氨基-5-(羥甲基)苯酚

在-78℃，用5分鐘將二異丁基氫化鋁(1m，在二氯甲烷中，120ml)加入到4-氨基-3-羥基苯甲酸甲酯(10g)/50ml二氯甲烷中，並將該溶液升溫至0℃。將該反應混合物攪拌2小時。再加入60ml二異丁基氫化鋁(1m，在二氯甲烷中)，並將該反應在0℃下再攪拌一小時。小心地加入甲醇(40ml)。加入飽和酒石酸鉀鈉溶液(100ml)，並將該混合物攪拌過夜。用乙酸乙酯提取該混合物兩次，將合併的提取物濃縮至大約100ml的體積，並過濾該混合物。收集固體，將溶液濃縮至很少的體積，並過濾。將合併的固體乾燥，得到標題化合物。

2.32.2.2-(2-疊氮基乙氧基)乙基4-甲基苯磺酸酯

向環境溫度的2-(2-疊氮基乙氧基)乙醇(4.85g)、三乙胺(5.16ml)和n,n-二甲基吡啶-4-胺(0.226g)的二氯甲烷(123ml)溶液中加入4-甲苯-1-磺醯氯(7.05g)。將該反應攪拌過夜，通過加入二氯甲烷和飽和氯化銨水溶液，淬滅該反應。分離各層，並用鹽水洗滌有機層兩次。將有機層用無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮，提供標題化合物，其不用進一步純化，在隨後的反應中直接使用。ms(esi)m/e302.9(m+nh4)+。

2.32.3.(4-氨基-3-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)苯基)甲醇

向環境溫度的實施例2.32.1(0.488g)的n,n-二甲基甲醯胺(11.68ml)溶液中加入氫化鈉(0.140g)。將該混合物攪拌0.5小時，並加入實施例2.32.2(1.0g)的n,n-二甲基甲醯胺(2.0ml)溶液。將該反應加熱至50℃過夜。加入水和乙酸乙酯，淬滅該反應混合物。分離各層，並用乙酸乙酯提取水層兩次。將合併的有機物用無水硫酸鈉乾燥，過濾，並減壓濃縮。用矽膠色譜純化殘餘物，用梯度25-100%的乙酸乙酯洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e253.1(m+h)+。

2.32.4.2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-4-(((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)甲基)苯胺

向環境溫度的實施例2.32.3(440mg)和咪唑(178mg)的四氫呋喃(10.6ml)溶液中加入叔丁基二甲基氯矽烷(289mg)。將該反應混合物攪拌16個小時，並加入乙酸乙酯(30ml)和飽和碳酸氫鈉水溶液(20ml)，淬滅該反應。分離各層，並用乙酸乙酯提取水層兩次。將合併的有機物用無水硫酸鈉乾燥，過濾，並減壓濃縮。用矽膠色譜純化殘餘物，用梯度0至50%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e366.9(m+h)。

2.32.5.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(((2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-4-(((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)甲基)苯基)氨基甲醯基)氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

在50ml乾燥圓底燒瓶中，在高真空下，將實施例2.32.4(410mg)乾燥過夜。向冷(0℃浴溫)的實施例2.32.4(410mg)和三乙胺(0.234ml)的甲苯(18ml)溶液中加入光氣(0.798ml，1m，在二氯甲烷中)。將該反應慢慢地升溫至室溫，並攪拌一小時。將該反應冷卻(0℃浴溫)，並加入(3r,4s,5s,6s)-2-羥基-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(411mg)和三乙胺(0.35ml)的甲苯(5ml)溶液。將該反應升溫至室溫，並加熱到50℃，保持2小時。加入飽和碳酸氫鹽水溶液和乙酸乙酯，淬滅該反應。分離各層，並用乙酸乙酯提取水層兩次。將合併的有機層用無水硫酸鈉乾燥，過濾，並減壓濃縮。用矽膠色譜純化殘餘物，用梯度0-40%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e743.9(m+nh4)+。

2.32.6.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(((2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-4-(羥甲基)苯基)氨基甲醯基)氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

向實施例2.32.5(700mg)的甲醇(5ml)溶液中加入對甲苯磺酸一水合物(18.32mg)的甲醇(2ml)溶液。將該反應在室溫下攪拌1小時。加入飽和碳酸氫鈉水溶液和二氯甲烷，淬滅該反應。分離各層，並用額外的二氯甲烷提取水層。將合併的有機物用mgso4乾燥，過濾，減壓蒸發溶劑，得到標題化合物，其不用進一步純化，在隨後的步驟中直接使用。ms(esi)m/e629.8(m+nh4)+。

2.32.7.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(((2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲醯基)氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

將n,n-二異丙基乙胺(0.227ml)逐滴加入到環境溫度的實施例2.32.6(530mg)和雙(4-硝基苯基)碳酸酯(395mg)的n,n-二甲基甲醯胺(4.3ml)溶液中。將該反應混合物在環境溫度下攪拌1.5小時。減壓濃縮溶劑。用矽膠色譜純化殘餘物，用梯度0-50%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e794.9(m+nh4)+。

2.32.8.3-(1-((3-(2-((((3-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-4-(((((2s,3r,4s,5s,6s)-3,4,5-三乙醯氧基-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)羰基)氨基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

向冷(0℃)的實施例1.1.17的三氟乙酸鹽(111mg)和實施例2.32.7(98.5mg)的n,n-二甲基甲醯胺(3.5ml)溶液中加入n,n-二異丙基乙胺(0.066ml)。將該反應慢慢地升溫至室溫，並攪拌16小時。加入水和乙酸乙酯，淬滅該反應。分離各層，並用乙酸乙酯提取水層兩次。將合併的有機物用無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓濃縮，得到標題化合物，其不用進一步純化，在隨後的步驟中直接使用。ms(esi)m/e1398.2(m+h)+。

2.32.9.3-(1-((3-(2-((((3-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)-4-(((((2s,3r,4s,5s,6s)-6-羧基-3,4,5-三羥基四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)羰基)氨基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

向冷(0℃)的實施例2.32.8(150mg)的甲醇(3.0ml)溶液中加入2m氫氧化鋰溶液(0.804ml)。將該反應攪拌1小時，並在0℃，加入乙酸(0.123ml)，淬滅該反應。用反相hplc純化該粗品反應溶液，使用帶有c18柱的gilson系統，用梯度10-100%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將含有產物的級分冷凍乾燥，得到標題化合物。ms(esi)m/e1258.2(m+h)+。

2.32.10.3-(1-((3-(2-((((3-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-4-(((((2s,3r,4s,5s,6s)-6-羧基-3,4,5-三羥基四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)羰基)氨基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

向溶於2∶1的四氫呋喃∶水(0.3ml)中的實施例2.32.9(45mg)溶液中加入三(2-羧乙基))膦鹽酸鹽溶液(51.3mg，在0.2ml水中)。將該反應在室溫下攪拌16小時。部分地減壓濃縮溶劑，除去大部分四氫呋喃。用反相hplc純化粗品反應物，使用gilson系統和c1825x100mm柱，用5-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將產物級分冷凍乾燥，得到標題化合物的三氟乙酸鹽。ms(esi)m/e1232.3(m+h)+。

2.32.11.1-o-({4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-2-[2-(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]氨基}乙氧基)乙氧基]苯基}氨基甲醯基)-β-d-吡喃葡萄糖醛酸(glucopyranuronicacid)

向實施例2.32.10的三氟乙酸鹽(15mg)的1mln,n-二甲基甲醯胺溶液中加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己酸酯(4.12mg)和n,n-二異丙基乙胺(0.010ml)，並將該反應在室溫下攪拌16小時。用反相hplc純化該粗品反應混合物，使用gilson系統和c1825x100mm柱，用5-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將產物級分冷凍乾燥，得到標題化合物。1hnmr(500mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.84(s,1h),8.58(d,1h),8.03(d,1h),7.79(t,2h),7.68(s,1h),7.61(d,1h),7.40-7.54(m,3h),7.36(q,2h),7.27(s,1h),7.05(s,1h),6.97(s,2h),6.93(t,2h),5.41(d,hz,1h),5.38(d,1h),5.27(d,1h),4.85-5.07(m,4h),4.11(t,2h),3.87(t,2h),3.80(s,2h),3.71-3.77(m,3h),3.46(s,3h),3.22(d,2h),3.00(t,2h),2.86(d,3h),2.08(s,3h),2.01(t,2h),1.44(dd,4h),1.34(d,2h),0.89-1.29(m,16h),0.82(d,7h),3.51-3.66(m,3h)。ms(esi)m/e1447.2(m+na)+。

2.33.合成6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-3-(1-{[3-(2-{[({3-[(n-{[2-({n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-3-磺基-d-丙氨醯}氨基)乙氧基]乙醯基}-β-丙氨醯)氨基]-4-(β-d-吡喃半乳糖基氧基)苄基}氧基)羰基](甲基)氨基}乙氧基)-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基]甲基}-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-甲酸(合成子gh)

2.33.1.(r)-28-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-7,10,26-三氧代-8-(磺基甲基)-3,13,16,19,22-五氧雜-6,9,25-三氮雜二十八烷-1-酸

使用本文所描述的固相肽合成方法，合成標題化合物。將2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙酸(1543mg)溶於10ml二噁烷中，並減壓濃縮溶劑(將該過程重複兩次)。將該物質冷凍乾燥過夜。將二噁烷-乾燥的胺基酸溶於20ml分子篩乾燥的二氯甲烷中，並向其中加入n,n-二異丙基乙胺(4.07ml)。將該溶液加入到預先用分子篩乾燥的二氯甲烷洗滌(兩次)的2-氯三苯甲基固體載體樹脂(8000mg)中。將樹脂和胺基酸的混合物在環境溫度下搖動4小時，排出，用17∶2∶1的二氯甲烷∶甲醇∶n,n-二異丙基乙胺洗滌，並用n,n-二甲基甲醯胺洗滌三次。然後，將該混合物反覆用分子篩乾燥的二氯甲烷和甲醇交替再洗滌三次。將加載的樹脂在真空烘箱中、在40℃下乾燥。利用定量fmoc加載試驗，將通過用20%哌啶/n,n-二甲基甲醯胺處理而去保護已知數量的樹脂所獲得的溶液，在301nm下測定吸光度，測定樹脂加載量。通過用20%哌啶/n,n-二甲基甲醯胺處理樹脂20分鐘，進行所有的fmoc脫保護步驟，而後進行n,n-二甲基甲醯胺洗滌步驟。在n,n-二甲基甲醯胺中用4當量((1h-苯並[d][1,2,3]三唑-1-基)氧基)三(吡咯烷-1-基)鏻六氟磷酸鹽(v)和8當量n,n-二異丙基乙胺(n,n-diidopropylethylamine)將4當量胺基酸活化一分鐘，而後用樹脂培養一小時，使胺基酸(r)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-磺基丙酸與隨後的1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-3-氧代-7,10,13,16-四氧雜-4-氮雜十九烷-19-酸綴合。通過用5%三氟乙酸/二氯甲烷處理30分鐘，使標題化合物從樹脂上斷裂下來。濾出樹脂，並將濾液減壓濃縮，得到標題化合物，其不用進一步純化，在下一步中直接使用。ms(esi)m/e669.0(m+h)+。

2.33.2.6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-3-(1-{[3-(2-{[({3-[(n-{[2-({n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-3-磺基-d-丙氨醯}氨基)乙氧基]乙醯基}-β-丙氨醯)氨基]-4-(β-d-吡喃半乳糖基氧基)苄基}氧基)羰基](甲基)氨基}乙氧基)-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基]甲基}-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-甲酸

將實施例2.33.1(5.09mg)與2-(3h-[1,2,3]三唑並[4,5-b]吡啶-3-基)-1,1,3,3-四甲基異脲六氟磷酸鹽(v)(2.63mg)和n,n-二異丙基乙胺(0.004ml)在1mln,n-二甲基甲醯胺中混合，並攪拌兩分鐘。加入實施例2.28.8(8.8mg)，並將該反應混合物在室溫下攪拌1.5小時。用反相hplc純化該粗品反應混合物，使用gilson系統和c1825x100mm柱，用5-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將產物級分冷凍乾燥，得到標題化合物。ms(esi)m/e1806.5(m-h)-。

2.34.合成4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-3-[3-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-3-磺基-l-丙氨醯}氨基)丙氧基]苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)(合成子fx)

2.34.1.3-(1-((3-(2-((((2-(3-((r)-2-氨基-3-磺基丙醯胺基)丙氧基)-4-(((2s,3r,4s,5s,6s)-6-羧基-3,4,5-三羥基四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

向(r)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-磺基丙酸(0.019g)和2-(3h-[1,2,3]三唑並[4,5-b]吡啶-3-基)-1,1,3,3-四甲基異脲六氟磷酸鹽(v)(0.019g)的n,n-二甲基甲醯胺(0.5ml)溶液中加入n,n-二異丙胺(7.82µl)。攪拌2分鐘之後，在室溫下，將反應物加入到實施例2.31.5(0.057g)和n,n-二異丙胺(0.031ml)的n,n-二甲基甲醯胺(0.5ml)溶液中，並攪拌3小時。將二乙胺(0.023ml)加入到該反應中，並繼續攪拌2小時。用水(1ml)稀釋該反應，用三氟乙酸(0.034ml)淬滅，並用製備hplc純化該溶液，使用gilson系統，用10-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將目標級分合併，冷凍乾燥，提供標題化合物。ms(esi)m/e1310.1(m+h)+。

2.34.2.4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-3-[3-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-3-磺基-l-丙氨醯}氨基)丙氧基]苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)

向實施例2.34.1(0.0277g)和2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己酸酯(7.82mg)的n,n-二甲基甲醯胺(0.5ml)溶液中加入n,n-二異丙胺(0.018ml)，並在室溫下攪拌該反應。用製備hplc純化該反應，使用gilson系統，用10-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將目標級分合併，冷凍乾燥，提供標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.81(s,1h),8.02(d,1h),7.89-7.81(m,2h),7.78(d,1h),7.60(d,1h),7.53-7.40(m,3h),7.39-7.31(m,2h),7.29(s,1h),7.16(d,1h),6.98-6.92(m,3h),6.63(s,1h),6.56(d,1h),5.08-4.99(m,1h),4.95(s,4h),4.28(q,2h),3.90-3.85(m,4h),3.48-3.06(m,12h),3.00(t,2h),2.88-2.64(m,8h),2.08(s,3h),2.04(t,2h),1.80(p,2h),1.51-1.39(m,4h),1.39-0.75(m,18h)。ms(esi)m/e1501.4(m-h)-。

2.35.合成4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-2-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-β-丙氨醯}氨基)苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)(合成子h)

2.35.1.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(4-甲醯基-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

向(2r,3r,4s,5s,6s)-2-溴-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(4g)的乙腈(100ml)溶液中加入氧化銀(i)(10.04g)和4-羥基-3-硝基苯甲醛(1.683g)。將該反應混合物在室溫下攪拌4小時，並過濾。濃縮濾液，用矽膠色譜純化殘餘物，用5-50%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，提供標題化合物。ms(esi)m/e(m+18)+。

2.35.2.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(4-(羥甲基)-2-硝基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

向在氯仿(75ml)和異丙醇(18.75ml)的混合物中的實施例2.35.1(6g)溶液中加入0.87g矽膠。將得到的混合物冷卻到0℃，加入nabh4(0.470g)，並將得到的懸浮液在0℃下攪拌45分鐘。將該反應混合物用二氯甲烷(100ml)稀釋，並通過硅藻土過濾。用水和鹽水洗滌濾液，濃縮，得到粗品，其不用進一步純化，直接使用。ms(esi)m/e(m+nh4)+。

2.35.3.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(2-氨基-4-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

使用10%pd/c(1.535g)作為催化劑，將實施例2.35.2(7g)的乙酸乙酯(81ml)攪拌溶液在20℃、在1大氣壓h2中氫化12小時。通過硅藻土過濾該反應混合物，並將溶劑減壓蒸發。用矽膠色譜純化殘餘物，用95/5的二氯甲烷/甲醇洗脫，得到標題化合物。

2.35.4.3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸

在500ml燒瓶中，將3-氨基丙酸(4.99g)溶於10%na2co3水溶液(120ml)中，並用冰浴冷卻。向所得到的溶液中逐漸地加入(9h-芴-9-基)甲基氯甲酸酯(14.5g)/1,4-二噁烷(100ml)。將該反應混合物在室溫下攪拌4小時，然後加入水(800ml)。將水相層與反應混合物分離，並用乙醚(3x750ml)洗滌。將水層用2nhcl水溶液酸化到ph2，並用乙酸乙酯(3x750ml)提取。將有機層合併，並濃縮，獲得粗品。將粗品在乙酸乙酯∶己烷(1:2，300ml)的混合溶劑中重結晶，得到標題化合物。

2.35.5.(9h-芴-9-基)甲基(3-氯-3-氧代丙基)氨基甲酸酯

向實施例2.35.4的二氯甲烷(160ml)溶液中加入亞硫醯氯(50ml)。將該混合物在60℃下攪拌1小時。將該混合物冷卻，並濃縮，得到標題化合物。

2.35.6.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(2-(3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙醯胺基)-4-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

向實施例2.35.3(6g)的二氯甲烷(480ml)溶液中加入n,n-二異丙基乙胺(4.60ml)。加入實施例2.35.5(5.34g)，並將該混合物在室溫下攪拌30分鐘。將該混合物倒入飽和碳酸氫鈉水溶液中，並用乙酸乙酯提取。將合併的提取物用水和鹽水洗滌，並用硫酸鈉乾燥。過濾，濃縮，得到殘餘物，通過徑向色譜純化殘餘物，使用0-100%的乙酸乙酯/石油醚作為流動相，得到標題化合物。

2.35.7.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(2-(3-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙醯胺基)-4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

向實施例2.35.6(5.1g)和n,n-二甲基甲醯胺(200ml)的混合物中加入雙(4-硝基苯基)碳酸酯(4.14g)和n,n-二異丙基乙胺(1.784ml)。將該混合物在室溫下攪拌16小時，並減壓濃縮。將粗品溶於二氯甲烷中，並直接吸到1mm徑向色譜板上，用50-100%的乙酸乙酯/己烷洗脫，得到標題化合物。ms(esi)m/e(m+h)+。

2.35.8.3-(1-((3-(2-((((3-(3-氨基丙醯胺基)-4-(((2s,3r,4s,5s,6s)-6-羧基-3,4,5-三羥基四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

在0℃，向實施例1.1.17(325mg)和實施例2.35.7(382mg)的n,n-二甲基甲醯胺(9ml)溶液中加入n,n-二異丙胺(49.1mg)。將該反應混合物在0℃下攪拌5小時，並加入乙酸(22.8mg)。將所得到的混合物用乙酸乙酯稀釋，並用水和鹽水洗滌。用na2so4乾燥有機層，過濾，並濃縮。將殘餘物溶於四氫呋喃(10ml)和甲醇(5ml)的混合物中。在0℃，向此溶液中加入1m氫氧化鋰水溶液(3.8ml)。將得到的混合物在0℃下攪拌1小時，用乙酸酸化，並濃縮。將濃縮物冷凍乾燥，提供粉末。將該粉末溶於n,n-二甲基甲醯胺(10ml)中，在冰浴中冷卻，並在0℃下加入哌啶(1ml)。將該混合物在0℃下攪拌15分鐘，並加入1.5ml乙酸。通過反相hplc純化該溶液，使用gilson系統，用30-80%的乙腈/水(包含0.1%v/v三氟乙酸)洗脫，提供標題化合物。ms(esi)m/e1172.2(m+h)+。

2.35.9.4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-2-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-β-丙氨醯}氨基)苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)

在0℃，向n,n-二甲基甲醯胺(5ml)中的實施例2.35.8(200mg)中加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己酸酯(105mg)和n,n-二異丙基乙胺(0.12ml)。將該混合物在0℃下攪拌15分鐘，升溫至室溫，並在gilson系統上用反相hplc純化，使用100gc18柱，用30-80%的乙腈/水(包含0.1%v/v三氟乙酸)洗脫，提供標題化合物。1hnmr(500mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.85(s,2h)9.07(s,1h)8.18(s,1h)8.03(d,1h)7.87(t,1h)7.79(d,1h)7.61(d,1h)7.41-7.53(m,3h)7.36(q,2h)7.28(s,1h)7.03-7.09(m,1h)6.96-7.03(m,3h)6.94(d,1h)4.95(s,4h)4.82(t,1h)3.88(t,3h)3.80(d,2h)3.01(t,2h)2.86(d,3h)2.54(t,2h)2.08(s,3h)2.03(t,2h)1.40-1.53(m,4h)1.34(d,2h)0.90-1.28(m,12h)0.82(d,6h)。ms(esi)m/e1365.3(m+h)+。

2.36.合成4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-2-({n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜十九烷-1-醯基]-β-丙氨醯}氨基)苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)(合成子i)

使用實施例2.35.9的方法，用2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-3-氧代-7,10,13,16-四氧雜-4-氮雜十九烷-19-酸酯替代2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己酸酯，製備標題化合物。1hnmr(500mhz,二甲亞碸-d6)δppm8.95(s,1h)8.16(s,1h)7.99(d,1h)7.57-7.81(m,4h)7.38-7.50(m,3h)7.34(q,2h)7.27(s,1h)7.10(d,1h)7.00(d,1h)6.88-6.95(m,2h)4.97(d,4h)4.76(d,2h)3.89(t,2h)3.84(d,2h)3.80(s,2h)3.57-3.63(m,4h)3.44-3.50(m,4h)3.32-3.43(m,6h)3.29(t,2h)3.16(q,2h)3.02(t,2h)2.87(s,3h)2.52-2.60(m,2h)2.29-2.39(m,3h)2.09(s,3h)1.37(s,2h)1.20-1.29(m,4h)1.06-1.18(m,4h)0.92-1.05(m,2h)0.83(s,6h)。ms(esi)m/e1568.6(m-h)-。

2.37.合成4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-2-({n-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丁醯基]-β-丙氨醯}氨基)苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)(合成子kq)

使用實施例2.35.9的方法，用2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丁酸酯替代2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己酸酯，製備標題化合物。1hnmr(500mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.86(s,3h)9.08(s,2h)8.17(s,1h)8.03(d,1h)7.89(t,1h)7.79(d,1h)7.61(d,1h)7.46-7.53(m,1h)7.41-7.46(m,1h)7.31-7.40(m,1h)7.28(s,1h)7.03-7.10(m,1h)6.91-7.03(m,2h)4.69-5.08(m,4h)3.83-3.95(m,2h)3.74-3.83(m,2h)3.21-3.47(m,12h)2.95-3.08(m,1h)2.86(d,2h)1.98-2.12(m,3h)1.62-1.79(m,2h)0.90-1.43(m,8h)0.82(d,3h)。ms(esi)m/e1337.2(m+h)+。

2.38.合成4-[12-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)-4-甲基-3-氧代-2,7,10-三氧雜-4-氮雜十二烷-1-基]-2-{[n-({2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙醯基)-β-丙氨醯]氨基}苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)(合成子kp)

2.38.1.3-(1-((-((1-(3-(3-氨基丙醯胺基)-4-(((2s,3r,4s,5s,6s)-6-羧基-3,4,5-三羥基四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苯基)-4-甲基-3-氧代-2,7,10-三氧雜-4-氮雜十二烷-12-基)氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

在實施例2.35.8中，用實施例1.2.11替代實施例1.1.17，製備標題化合物。

2.38.2.4-[12-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)-4-甲基-3-氧代-2,7,10-三氧雜-4-氮雜十二烷-1-基]-2-{[n-({2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙醯基)-β-丙氨醯]氨基}苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)

在實施例2.35.9中，用實施例2.38.1替代實施例2.35.8，用2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙酸酯替代2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己酸酯，製備標題化合物。1hnmr(500mhz,二甲亞碸-d6)δppm8.92(s,1h),8.12-8.15(m,1h),7.97(d,1h),7.76(d,1h),7.61(d,1h),7.28-7.49(m,6h),7.25(s,1h),7.09(d,1h),6.97-7.02(m,1h),6.88-6.94(m,2h),4.97(d,4h),4.75(d,1h),3.76-3.93(m,9h),3.47-3.60(m,16h),3.32-3.47(m,15h),2.88(s,3h),2.59(t,2h),2.08(s,3h),1.38(s,2h),0.93-1.32(m,11h),0.84(s,6h)。ms(esi)m/e1485.2(m+h)+。

2.39.合成4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-2-[(n-{6-[(乙烯基磺醯基)氨基]己醯基}-β-丙氨醯)氨基]苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)(合成子ha)

2.39.1.6-(乙烯基磺醯胺基)己酸甲酯

在0℃向6-甲氧基-6-氧代己-1-銨氯化物(0.3g)和三乙胺(1.15ml)的二氯甲烷溶液中逐滴加入乙磺醯氯(0.209g)。將該反應混合物升溫至室溫，並攪拌1小時。將該混合物用二氯甲烷稀釋，並用鹽水洗滌。用硫酸鈉乾燥有機層，過濾，並濃縮，提供標題化合物。ms(esi)m/e471.0(2m+h)+。

2.39.2.6-(乙烯基磺醯胺基)己酸

將在四氫呋喃(1ml)和水(1ml)的混合物中的實施例2.39.1(80mg)和氫氧化鋰一水合物(81mg)溶液攪拌2小時，然後用水(20ml)稀釋，並用乙醚(10ml)洗滌。用1nhcl水溶液將水層酸化至ph4，並用二氯甲烷(3x10ml)提取。用鹽水(5ml)洗滌有機層，用硫酸鈉乾燥，過濾，濃縮，提供標題化合物。

2.39.3.2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(乙烯基磺醯胺基)己酸酯

將實施例2.39.2(25mg)、1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]-碳二亞胺鹽酸鹽(43.3mg)和1-羥基吡咯烷-2,5-二酮(15.6mg)在二氯甲烷(8ml)中的混合物攪拌過夜，用飽和氯化銨水溶液和鹽水洗滌，並濃縮，提供標題化合物。

2.39.4.4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-2-[(n-{6-[(乙烯基磺醯基)氨基]己醯基}-β-丙氨醯)氨基]苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)

使用實施例2.35.9的方法，用實施例2.39.3替代2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己酸酯，製備標題化合物。1hnmr(500mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.85(s,2h)9.07(s,1h)8.18(s,1h)8.03(d,1h)7.87(t,1h)7.79(d,1h)7.61(d,1h)7.41-7.53(m,3h)7.33-7.39(m,2h)7.28(s,1h)7.17(t,1h)7.04-7.08(m,1h)6.98-7.03(m,1h)6.95(d,1h)6.65(dd,1h)5.91-6.04(m,2h)4.96(s,4h)4.82(s,1h)3.22-3.48(m,11h)3.01(t,2h)2.86(d,3h)2.73-2.80(m,2h)2.51-2.57(m,2h)1.99-2.12(m,5h)1.29-1.52(m,6h)0.90-1.29(m,12h)0.82(d,6h)。ms(esi)m/e1375.3(m+h)+。

2.40.合成4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-2-({n-[6-(乙烯基磺醯基)己醯基]-β-丙氨醯}氨基)苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)(合成子hb)

2.40.1.6-((2-羥乙基)硫代)己酸乙酯

將6-溴己酸乙酯(3g)、2-巰基乙醇(0.947ml)和k2co3(12g)在乙醇(100ml)中的混合物攪拌過夜，並過濾。濃縮濾液。將殘餘物溶於二氯甲烷(100ml)中，並用水和鹽水洗滌。用na2so4乾燥有機層，過濾，濃縮，提供標題化合物。

2.40.2.6-((2-羥乙基)硫代)己酸

使用實施例2.39.2的方法，用實施例2.40.1替代實施例2.39.2，製備標題化合物。ms(esi)m/e175.1(m-h2o)-。

2.40.3.6-((2-羥乙基)磺醯基)己酸

向在水(40ml)和1,4-二噁烷(160ml)的混合物中的實施例2.40.2(4g)的攪拌溶液中加入oxone®(38.4g)。將該混合物攪拌過夜。過濾該混合物，並將濾液濃縮。用二氯甲烷提取剩餘的水層。將提取物合併，用na2so4乾燥，過濾，濃縮，提供標題化合物。

2.40.4.6-(乙烯基磺醯基)己酸

在氬氣氛圍中，在0℃，向實施例2.40.3(1g)的二氯甲烷(10ml)攪拌溶液中加入三乙胺(2.8ml)，而後加入甲磺醯氯(1.1ml)。將該混合物攪拌過夜，並用水和鹽水洗滌。用硫酸鈉乾燥有機層，過濾，並濃縮，提供標題化合物。

2.40.5.2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(乙烯基磺醯基)己酸酯

向實施例2.40.4(0.88g)的二氯甲烷(10ml)攪拌溶液中加入1-羥基吡咯烷-2,5-二酮(0.54g)和n,n'-二環己基碳二亞胺(methanediylidenedicyclohexanamine)(0.92g)。將該混合物攪拌過夜，並過濾。濃縮濾液，並用快速色譜純化，用10-25%的乙酸乙酯/石油醚洗脫，提供標題化合物。ms(esi)m/e304.1(m+h)+。

2.40.6.4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-2-({n-[6-(乙烯基磺醯基)己醯基]-β-丙氨醯}氨基)苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)

使用實施例2.35.9的方法，用實施例2.40.5替代2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己酸酯，製備標題化合物。1hnmr(500mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.84(s,2h)9.07(s,1h)8.18(s,1h)8.03(d,1h)7.89(t,1h)7.79(d,1h)7.61(d,1h)7.41-7.53(m,3h)7.32-7.40(m,2h)7.28(s,1h)7.04-7.11(m,1h)6.98-7.03(m,1h)6.88-6.97(m,2h)6.17-6.26(m,2h)4.95(s,4h)4.82(s,1h)3.74-3.99(m,8h)3.41-3.46(m,8h)3.24-3.41(m,8h)2.97-3.08(m,4h)2.86(d,3h)2.54(t,2h)2.00-2.13(m,5h)1.43-1.64(m,4h)0.89-1.40(m,15h)0.82(d,6h)。ms(esi)m/e1360.2(m+h)+。

2.41.合成4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-5-氟-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基]氨基甲醯基}氧基)甲基]-3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯基]氨基}乙氧基)乙氧基]苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)(合成子lb)

2.41.1.3-(1-((3-(2-((((2-(2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-4-(((2s,3r,4s,5s,6s)-3,4,5-三乙醯氧基-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苄基)氧基)羰基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-5-氟-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

在實施例2.26.7中，用實施例1.6.13替代實施例1.1.17，製備標題化合物。

2.41.2.3-(1-((3-(2-((((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-4-(((2s,3r,4s,5s,6s)-6-羧基-3,4,5-三羥基四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苄基)氧基)羰基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-5-氟-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

在實施例2.26.8中，用實施例2.41.1替代實施例2.26.7，製備標題化合物。ms(esi)m/e1193(m+h)+,1191(m-h)-。

2.41.3.4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-5-氟-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基]氨基甲醯基}氧基)甲基]-3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯基]氨基}乙氧基)乙氧基]苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)

在實施例2.27中，用實施例2.41.2替代實施例2.26.8，製備標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.88(bs,1h),8.03(d,1h),8.02(t,1h),7.78(d,1h),7.73(1h),7.53(d,1h),7.47(td,1h),7.35(td,1h),7.29(s,1h),7.26(t,1h),7.26(t,1h),7.19(d,1h),7.02(d,1h),6.98(s,1h),6.65(d,1h),6.59(dd,1h),5.07(d,1h),5.01(s,1h),4.92(1h),4.08(m,2h),3.94(t,2h),3.90(d,2h),3.87(s,2h),3.70(m,6h),3.60(m,6h),3.44(t,2h),3.39(t,2h),3.32(t,1h),3.28(dd,1h),3.17(q,2h),3.03(q,2h),2.92(t,2h),2.33(t,2h),2.10(s,3h),1.37(s,2h),1.25(q,4h),1.11(q,4h),1.00(dd,2h),0.83(s,6h)。ms(esi)m/e1366(m+na)+,1342(m-h)-。

2.42.合成4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-3-{2-[2-({n-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯基]-3-磺基-l-丙氨醯}氨基)乙氧基]乙氧基}苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)(合成子nf)

2.42.1.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(4-甲醯基-3-羥基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

將2,4-二羥基苯甲醛(15g)和(2s,3r,4s,5s,6s)-2-溴-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯(10g)溶於乙腈中，而後加入碳酸銀(10g)，並將該反應加熱至49℃。攪拌4小時之後，冷卻該反應，過濾，並濃縮。將粗品標題化合物懸浮在二氯甲烷中，通過硅藻土過濾，並濃縮。用矽膠色譜純化殘餘物，用1-100%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，提供標題化合物。

2.42.2.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(3-羥基-4-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

將實施例2.42.1(16.12g)的四氫呋喃(200ml)和甲醇(200ml)溶液冷卻至0℃，並分批加入硼氫化鈉(1.476g)。將該反應攪拌20分鐘，並用水∶飽和碳酸氫鈉溶液的1:1混合物(400ml)淬滅。濾出所得到的固體，並用乙酸乙酯衝洗。分離各相，並用乙酸乙酯提取水層四次。將合併的有機層用硫酸鎂乾燥，過濾，並濃縮。通過矽膠色譜純化粗品標題化合物，用1-100%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，提供標題化合物。ms(esi)m/e473.9(m+nh4)+。

2.42.3.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(4-(((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)甲基)-3-羥基苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

在-5℃，向實施例2.42.2(7.66g)和在二氯甲烷(168ml)中的叔丁基二甲基甲矽烷基氯(2.78g)中加入咪唑(2.63g)，並將該反應混合物攪拌過夜，使得反應的內部溫度升至12℃。將該反應混合物倒入飽和氯化銨水溶液中，並用二氯甲烷提取四次。將合併的有機物用鹽水洗滌，用硫酸鎂乾燥，過濾，並濃縮。通過矽膠色譜純化粗品標題化合物，用1-50%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，提供標題化合物。ms(esi)m/e593.0(m+na)+。

2.42.4.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(3-(2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-4-(((叔丁基二甲基甲矽烷基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

向實施例2.42.3(5.03g)和在甲苯(88ml)中的三苯基膦(4.62g)中加入偶氮二甲酸二叔丁基酯(4.06g)，並將該反應攪拌30分鐘。加入(9h-芴-9-基)甲基(2-(2-羥乙氧基)乙基)氨基甲酸酯，並將該反應再攪拌1.5小時。將反應物直接加載到矽膠上，用1-50%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，提供標題化合物。

2.42.5.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(3-(2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-4-(羥甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

將實施例2.42.4(4.29g)在3∶1∶1的乙酸∶水∶四氫呋喃溶液(100ml)中攪拌過夜。將反應物倒入飽和碳酸氫鈉水溶液中，並用乙酸乙酯提取。將有機層用硫酸鎂乾燥，過濾，並濃縮。通過矽膠色譜純化粗品標題化合物，用1-50%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，提供標題化合物。

2.42.6.(2s,3r,4s,5s,6s)-2-(3-(2-(2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)乙氧基)乙氧基)-4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧羰基)四氫-2h-吡喃-3,4,5-三基三乙酸酯

向實施例2.42.5(0.595g)和雙(4-硝基苯基)碳酸酯(0.492g)的n,n-二甲基甲醯胺(4ml)溶液中加入n-乙基-n-異丙基丙-2-胺(0.212ml)。1.5小時之後，在高真空下濃縮該反應。將反應物直接加載到矽膠上，使用1-50%的乙酸乙酯/庚烷洗脫，提供標題化合物。ms(esi)m/e922.9(m+na)+。

2.42.7.3-(1-((3-(2-((((2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-4-(((2s,3r,4s,5s,6s)-6-羧基-3,4,5-三羥基四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

將實施例1.1.17(92mg)溶於二甲基甲醯胺(0.6ml)中。加入實施例2.42.6(129mg)和n-乙基-n-異丙基丙-2-胺(0.18ml)。將該反應在室溫下攪拌一小時。然後，濃縮該反應，並將殘餘物溶於四氫呋喃(0.6ml)和甲醇(0.6ml)中。加入lioh水溶液(1.94n，0.55ml)，並將該混合物在室溫下攪拌一小時。用反相色譜純化(c18柱)，用10-90%的乙腈/水中的0.1%tfa洗脫，提供標題化合物的三氟乙酸鹽。ms(esi)m/e1187.4(m-h)-。

2.42.8.3-(1-((3-(2-((((2-(2-(2-((r)-2-氨基-3-磺基丙醯胺基)乙氧基)乙氧基)-4-(((2s,3r,4s,5s,6s)-6-羧基-3,4,5-三羥基四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

在實施例2.34.1中，用實施例2.26.8替代實施例2.31.5，製備標題化合物。ms(esi)m/e1338.4(m-h)-。

2.42.9.6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)-3-(1-((3-(2-((((4-(((2s,3r,4s,5s,6s)-6-羧基-3,4,5-三羥基四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)-2-(2-(2-((r)-2-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯胺基)-3-磺基丙醯胺基)乙氧基)乙氧基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶甲酸

在實施例2.34.2中，用實施例2.42.2替代實施例2.34.1，用2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙酸酯替代2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己酸酯，製備標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm8.06(d,1h),8.02(d,1h),7.80(m,2h),7.61(d,1h),7.52(d,1h),7.45(m,2h),7.36(m,2h),7.30(s,1h),7.18(d,1h),6.97(s,2h),6.96(m,2h),6.66(d,1h),6.58(dd,1h),5.06(brm,1h),4.96(s,4h),4.31(m,1h),4.09(m,2h),3.88(m,3h),3.80(m,2h),3.71(m,2h),3.59(t,2h),3.44(m,6h),3.28(m,4h),3.19(m,2h),3.01(m,2h),2.82(brm,3h),2.72(m,1h),2.33(m,2h),2.09(s,3h),1.33(brm,2h),1.28-0.90(m,10h),0.84,0.81(boths,total6h)。ms(esi-)m/e1489.5(m-1)。

2.43.合成4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-3-{2-[2-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-3-磺基-l-丙氨醯}氨基)乙氧基]乙氧基}苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)(合成子ng)

在實施例2.34.2中，用實施例2.42.1替代實施例2.34.1，製備標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm8.02(d,1h),7.87(d,1h),7.80(m,2h),7.61(d,1h),7.52(d,1h),7.45(m,2h),7.36(m,2h),7.30(s,1h),7.18(d,1h),6.97(s,2h),6.96(m,2h),6.66(d,1h),6.58(dd,1h),5.06(brm,1h),4.96(s,4h),4.31(m,1h),4.09(m,2h),3.88(m,3h),3.80(m,2h),3.71(m,2h),3.59(t,2h),3.44(m,6h),3.28(m,4h),3.19(m,2h),3.01(m,2h),2.82(brm,3h),2.72(m,1h),2.09(s,3h),2.05(t,2h),1.46(brm,4h),1.33(brm,2h),1.28-0.90(m,12h),0.84,0.81(兩個都是s,共6h)。ms(esi-)m/e1531.5(m-1)。

2.44.合成6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-3-{1-[(3-{[22-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-3-甲基-4,20-二氧代-7,10,13,16-四氧雜-3,19-二氮雜二十二烷-1-基]氧基}-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基)甲基]-5-甲基-1h-吡唑-4-基}吡啶-2-甲酸(合成子as)

向實施例1.1.17(56.9mg)和n,n-二異丙基乙胺(0.065ml)的n,n-二甲基甲醯胺(1.0ml)溶液中加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-3-氧代-7,10,13,16-四氧雜-4-氮雜十九烷-19-酸酯(50mg)。將該反應攪拌過夜，並用反相hplc純化該溶液，使用gilson系統，用20-80%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將目標級分合併，冷凍乾燥，提供標題化合物。1hnmr(400mhz二甲亞碸-d6)δppm12.85(s,1h),8.08-7.95(m,1h),7.79(d,1h),7.62(d,1h),7.55-7.40(m,3h),7.40-7.32(m,2h),7.28(s,1h),7.01-6.89(m,3h),4.95(s,2h),3.89(s,2h),3.81(s,2h),3.55-3.25(m,23h),3.14(d,2h),2.97(t,4h),2.76(d,2h),2.57(s,1h),2.31(d,1h),2.09(s,3h),1.35(s,2h),1.30-0.93(m,12h),0.85(d,6h)。ms(esi)m/e1180.3(m+na)+。

2.45.合成6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-3-{1-[(3-{[28-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-9-甲基-10,26-二氧代-3,6,13,16,19,22-六氧雜-9,25-二氮雜二十八烷-1-基]氧基}-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基)甲基]-5-甲基-1h-吡唑-4-基}吡啶-2-甲酸(合成子at)

向實施例1.2.11(50mg)和n,n-二異丙基乙胺(0.051ml)的n,n-二甲基甲醯胺(1.0ml)溶液中加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-3-氧代-7,10,13,16-四氧雜-4-氮雜十九烷-19-酸酯(39mg)。將該反應攪拌過夜，並用反相hplc純化，使用gilson系統，用20-80%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將目標級分合併，冷凍乾燥，提供標題化合物。1hnmr(400mhz二甲亞碸-d6)δppm12.85(s,1h),8.04(d,1h),7.99(t,1h),7.79(d,1h),7.60(d,1h),7.53-7.41(m,3h),7.40-7.32(m,2h),7.28(s,1h),6.99(s,2h),6.98-6.92(m,1h),4.95(bs,2h),3.92-3.85(m,1h),3.81(s,2h),3.63-3.55(m,4h),3.55-3.31(m,28h),3.18-3.10(m,2h),3.05-2.98(m,2h),2.97(s,2h),2.80(s,2h),2.59-2.50(m,1h),2.32(t,2h),2.10(s,3h),1.39-1.34(m,2h),1.31-1.18(m,4h),1.20-0.92(m,6h),0.84(s,6h)。ms(esi)m/e1268.4(m+na)+。

2.46.合成6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-3-{1-[(3-{2-[2-(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基](甲基)氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基)甲基]-5-甲基-1h-吡唑-4-基}吡啶-2-甲酸(合成子au)

向實施例1.2.11(50mg)和n,n-二異丙基乙胺(0.051ml)的n,n-二甲基甲醯胺(1.0ml)溶液中加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己酸酯(18mg)。將該反應攪拌過夜，並用反相hplc純化，使用gilson系統，用20-80%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將目標級分合併，冷凍乾燥，提供標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.92-12.82(m,1h),8.03(d,1h),7.79(d,1h),7.62(d,1h),7.53-7.41(m,3h),7.40-7.32(m,2h),7.28(s,1h),7.01-6.97(m,2h),6.98-6.92(m,1h),4.95(bs,2h),4.04-3.84(m,3h),3.86-3.75(m,3h),3.49-3.32(m,10h),3.01(s,2h),2.95(s,2h),2.79(s,2h),2.31-2.19(m,2h),2.10(s,3h),1.52-1.40(m,4h),1.36(s,2h),1.31-0.94(m,14h),0.84(s,6h)。ms(esi)m/e1041.3(m+h)+。

2.47.合成6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-3-(1-{[3-(2-{[4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-2-磺基丁醯基](甲基)氨基}乙氧基)-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基]甲基}-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-甲酸(合成子bk)

2.47.1.4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-1-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-1-氧代丁烷-2-磺酸酯

在用氮氣吹掃的100ml燒瓶中，將1-羧基-3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙烷-1-磺酸酯溶於二甲基乙醯胺(20ml)中。向此溶液中加入n-羥基琥珀醯亞胺(440mg，)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1000mg)，並將該反應在氮氣氛圍中、在室溫下攪拌16小時。減壓濃縮溶劑，並將殘餘物用矽膠色譜純化，用1-2%的甲醇/二氯甲烷(在溶劑中含有0.1%v/v乙酸)的梯度進行洗脫，得到標題化合物的～80%活化酯和20%酸的混合物，其不用進一步純化，在下一步中直接使用。ms(esi)m/e360.1(m+h)+。

2.47.2.6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-3-(1-{[3-(2-{[4-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-2-磺基丁醯基](甲基)氨基}乙氧基)-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基]甲基}-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶-2-甲酸

向實施例1.1.17(5mg)和實施例2.47.1(20.55mg)的n,n-二甲基甲醯胺(0.25ml)溶液中加入n,n-二異丙基乙胺(0.002ml)，並將該反應在室溫下攪拌16小時。用反相hplc純化該粗品反應混合物，使用gilson系統和c1825x100mm柱，用5-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將產物級分冷凍乾燥，得到標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm8.01-7.95(m,1h),7.76(d,1h),7.60(dd,1h),7.49-7.37(m,3h),7.37-7.29(m,2h),7.28-7.22(m,1h),6.92(d,1h),6.85(s,1h),4.96(bs,2h),3.89(t,2h),3.80(s,2h),3.35(bs,5h),3.08-2.96(m,3h),2.97-2.74(m,2h),2.21(bs,1h),2.08(s,4h),1.42-1.38(m,2h),1.31-1.23(m,4h),1.23-1.01(m,6h),0.97(d,1h),0.89-0.79(m,6h)。ms(esi)m/e1005.2(m+h)+。

2.48.合成6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-3-{1-[(3-{[34-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-3-甲基-4,32-二氧代-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧雜-3,31-二氮雜三十四烷-1-基]氧基}-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基)甲基]-5-甲基-1h-吡唑-4-基}吡啶-2-甲酸(合成子bq)

如實施例2.44所述，用2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-3-氧代-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧雜-4-氮雜三十一烷-31-酸酯(mal-dpeg8-nhs-酯)替代2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-3-氧代-7,10,13,16-四氧雜-4-氮雜十九烷-19-酸酯，製備標題化合物。ms(esi)m/e1334.3(m+h)+。

2.49.合成6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-3-{1-[(3-{[28-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-3-甲基-4,26-二氧代-7,10,13,16,19,22-六氧雜-3,25-二氮雜二十八烷-1-基]氧基}-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基)甲基]-5-甲基-1h-吡唑-4-基}吡啶-2-甲酸(合成子br)

如實施例2.44所述，用2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-3-氧代-7,10,13,16,19,22-六氧雜-4-氮雜二十五烷-25-酸酯(mal-dpeg6-nhs-酯)替代2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)-3-氧代-7,10,13,16-四氧雜-4-氮雜十九烷-19-酸酯，製備標題化合物。ms(esi)m/e1246.3(m+h)+。

2.50合成2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-5-{2-[2-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-3-磺基-l-丙氨醯}氨基)乙氧基]乙氧基}苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)

2.50.1.3-(1-((3-(2-((((4-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-2-(((2s,3r,4s,5s,6s)-6-羧基-3,4,5-三羥基四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

在實施例2.30.1中，用實施例1.1.17替代實施例1.3.7，製備標題化合物。ms(esi)m/e1189.5(m+h)+。

2.50.2.3-(1-((3-(2-((((4-(2-(2-((r)-2-氨基-3-磺基丙醯胺基)乙氧基)乙氧基)-2-(((2s,3r,4s,5s,6s)-6-羧基-3,4,5-三羥基四氫-2h-吡喃-2-基)氧基)苄基)氧基)羰基)(甲基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

在實施例2.34.1中，用實施例2.50.1替代實施例2.31.5，製備標題化合物。ms(esi)m/e1339.5(m+h)+。

2.50.3.2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-5-{2-[2-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-3-磺基-l-丙氨醯}氨基)乙氧基]乙氧基}苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)

在實施例2.34.2中，用實施例2.50.2替代實施例2.34.1，製備標題化合物。1hnmr(500mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.83(s,2h);8.01(dd,1h),7.86(d,1h),7.80-7.71(m,2h),7.60(dd,1h),7.52-7.26(m,7h),7.16(d,1h),6.94(d,3h),6.69(d,1h),6.61-6.53(m,1h),5.09-4.91(m,5h),3.46-3.08(m,14h),2.99(t,2h),2.88-2.63(m,5h),2.13-1.94(m,5h),1.52-0.73(m,27h)。ms(esi)m/e1531.4(m-h)-。

2.51合成n2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-n6-(37-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十七烷-37-基)-l-賴氨醯基-l-丙氨醯-l-纈氨醯-n-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基]氨基甲醯基}氧基)甲基]苯基}-l-丙氨醯胺

2.51.1.(s)-6-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-2-((叔丁氧羰基)氨基)己酸

向冷(冰浴)的(s)-6-氨基-2-((叔丁氧羰基)氨基)己酸(8.5g)溶液(在5%nahco3水溶液(300ml)和1,4-二噁烷(40ml)的混合物中)中逐滴加入(9h-芴-9-基)甲基吡咯烷-1-基碳酸酯(11.7g)的1,4-二噁烷(40ml)溶液。將該反應混合物升溫至室溫，並攪拌24小時。額外準備三個上述管瓶。反應完成之後，將四個反應混合物合併，並真空除去有機溶劑。用鹽酸水溶液(1n)將水層酸化至ph3，並用乙酸乙酯(3×500ml)提取。將合併的有機層用鹽水洗滌，用硫酸鎂乾燥，過濾，並真空濃縮，得到粗品化合物，用甲基叔丁基醚重結晶，得到標題化合物。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ11.05(br..s.,1h),7.76(d,2h),7.59(d,2h),7.45-7.27(m,4h),6.52-6.17(m,1h),5.16-4.87(m,1h),4.54-4.17(m,4h),3.26-2.98(m,2h),1.76-1.64(m,1h),1.62-1.31(m,14h)。

2.51.2.17-羥基-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1-酸叔丁基酯

向3,6,9,12-四氧雜十四烷-1,14-二醇(40g)的甲苯(800ml)溶液中分批加入叔丁醇鉀(20.7g)。將該混合物在室溫下攪拌30分鐘。將2-溴乙酸叔丁基酯(36g)逐滴加入到該混合物中。將該反應在室溫下攪拌16小時。額外準備兩個上述管瓶。反應完成之後，將三個反應混合物合併。將水(500ml)加入到合併的混合物中，並將體積濃縮至1升。用二氯甲烷提取該混合物，並用1n叔丁醇鉀水溶液(1l)洗滌。將有機層用無水硫酸鈉乾燥，過濾，並減壓濃縮。用矽膠柱色譜純化殘餘物，用50∶1的二氯甲烷∶甲醇洗脫，獲得標題化合物。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ4.01(s,2h),3.75-3.58(m,21h),1.46(s,9h)。

2.51.3.17-(甲苯磺醯基氧基)-3,6,9,12,15-五氧雜十七烷-1-酸叔丁基酯

在0℃，在氮氣氛圍中，向實施例2.51.2(30g)的二氯甲烷(500ml)溶液中逐滴加入4-甲苯-1-磺醯氯(19.5g)和三乙胺(10.3g)的二氯甲烷(500ml)溶液。將該混合物在室溫下攪拌18小時，並倒入水(100ml)中。用二氯甲烷(3×150ml)提取該溶液，並將有機層用鹽酸(6n，15ml)洗滌，然後用nahco3(5%水溶液，15ml)洗滌，而後用水(20ml)洗滌。用無水硫酸鈉乾燥有機層，過濾，濃縮，獲得殘餘物，用矽膠柱色譜純化殘餘物，用石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)至二氯甲烷∶甲醇(5∶1)洗脫，獲得標題化合物。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ7.79(d,2h),7.34(d,2h),4.18-4.13(m,2h),4.01(s,2h),3.72-3.56(m,18h),2.44(s,3h),1.47(s,9h)。

2.51.4.2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十七烷-37-酸

在0℃，向實施例2.51.3(16g)的四氫呋喃(300ml)溶液中加入氫化鈉(1.6g)。將該混合物在室溫下攪拌4小時。在室溫下，將2,5,8,11,14,17-六氧雜十九烷-19-醇(32.8g)的四氫呋喃(300ml)溶液逐滴加入到該反應混合物中。將得到的反應混合物在室溫下攪拌16小時，並加入水(20ml)。將該混合物在室溫下再攪拌3小時，完成叔丁基酯的水解。將最終反應混合物減壓濃縮，除去有機溶劑。將水性殘餘物用二氯甲烷(2×150ml)提取。將水層酸化至ph3，而後用乙酸乙酯(2×150ml)提取。最後，濃縮水層，獲得粗品，用矽膠柱色譜純化，用石油醚∶乙酸乙酯(1∶1)至二氯甲烷∶甲醇(5∶1)的梯度進行洗脫，獲得標題化合物。1hnmr(400mhz,氯仿-d)δ4.19(s,2h),3.80-3.75(m,2h),3.73-3.62(m,40h),3.57(dd,2h),3.40(s,3h)。

2.51.5.(43s,46s)-43-((叔丁氧羰基)氨基)-46-甲基-37,44-二氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜-38,45-二氮雜四十七烷-47-酸

使用標準fmoc固相肽合成方法和2-氯三苯甲基樹脂，合成實施例2.51.5。具體地說，在14℃下，將2-氯三苯甲基樹脂(12g)，(s)-2-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)丙酸(10g)和n,n-二異丙基乙胺(44.9ml)在無水、分子篩乾燥的二氯甲烷(100ml)中搖動24小時。過濾該混合物，並將濾餅用二氯甲烷(3×500ml)、n,n-二甲基甲醯胺(2×250ml)和甲醇(2×250ml)洗滌(每個步驟5分鐘)。向上述樹脂中加入20%哌啶/n,n-二甲基甲醯胺(100ml)，除去fmoc基團。向該混合物中鼓入氮氣15分鐘，並過濾。再用20%哌啶/n,n-二甲基甲醯胺(100ml)洗滌樹脂五次(每個洗滌步驟5分鐘)，用n,n-二甲基甲醯胺(5×100ml)洗滌，得到脫保護的l-ala加載的樹脂。

向實施例2.51.1(9.0g)的n,n-二甲基甲醯胺(50ml)溶液中加入羥基苯並三唑(3.5g)、2-(6-氯-1h-苯並三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基銨六氟磷酸鹽(9.3g)和n,n-二異丙基乙胺(8.4ml)。將該混合物在20℃下攪拌30分鐘。將上述混合物加入到l-ala加載的樹脂中，並在室溫下鼓入氮氣90分鐘，進行混合。過濾該混合物，並用n,n-二甲基甲醯胺(每個步驟5分鐘)洗滌樹脂。向上述樹脂中加入大約20%哌啶/n,n-二甲基甲醯胺(100ml)，除去fmoc基團。向該混合物中鼓入氮氣15分鐘，並過濾。用20%哌啶/n,n-二甲基甲醯胺(100mlx5)和n,n-二甲基甲醯胺(100mlx5)洗滌樹脂(每個洗滌步驟5分鐘)。

向實施例2.51.4(11.0g)的n,n-二甲基甲醯胺(50ml)溶液中加入羥基苯並三唑(3.5g)、2-(6-氯-1h-苯並三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基銨六氟磷酸鹽(9.3g)和n,n-二異丙基乙胺(8.4ml)，並將該混合物加入到樹脂中，在室溫下鼓入氮氣3小時，進行混合。過濾該混合物，用n,n-二甲基甲醯胺(5×100ml)、二氯甲烷(8×100ml)洗滌殘餘物(每個步驟5分鐘)。

向最終的樹脂中加入1%三氟乙酸/二氯甲烷(100ml)，並鼓入氮氣5分鐘，進行混合。過濾該混合物，並收集濾液。將這種裂解操作重複四次。使用nahco3，將合併的濾液調到ph7，並用水洗滌。將有機層用無水硫酸鈉乾燥，過濾，並濃縮，獲得標題化合物。1hnmr(400mhz,甲醇-d4)δ4.44-4.33(m,1h),4.08-4.00(m,1h),3.98(s,2h),3.77-3.57(m,42h),3.57-3.51(m,2h),3.36(s,3h),3.25(t,2h),1.77(br..s.,1h),1.70-1.51(m,4h),1.44(s,9h),1.42-1.39(m,3h)。

2.51.6.3-(1-((3-(2-((((4-((s)-2-((s)-2-氨基-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)苄基)氧基)羰基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

在室溫下，將實施例1.3.7的三氟乙酸鹽(0.102g)、實施例2.21.4(0.089g)和n,n-二異丙基乙胺(0.104ml)在n,n-二甲基甲醯胺(1ml)中的溶液攪拌16小時。加入二乙胺(0.062ml)，並將該反應在室溫下攪拌2小時。用水(1ml)稀釋該反應，用三氟乙酸(0.050ml)淬滅，並用反相hplc純化，使用gilson系統和c18柱，用5-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將產物級分冷凍乾燥，得到標題化合物。ms(lc-ms)m/e1066.5(m+h)+。

2.51.7.6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)-3-(1-((3-(2-((((4-((43s,46s,49s,52s)-43-((叔丁氧羰基)氨基)-49-異丙基-46,52-二甲基-37,44,47,50-四氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜-38,45,48,51-四氮雜五十三烷醯胺基)苄基)氧基)羰基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)吡啶甲酸

將實施例2.51.5(16.68mg)與1-[雙(二甲基氨基)亞甲基]-1h-1,2,3-三唑並[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(7.25mg)和n,n-二異丙基乙胺(0.015ml)在n-甲基吡咯烷酮(1ml)中混合10分鐘，並加入到實施例2.51.6(25mg)和n,n-二異丙基乙胺(0.015ml)的n-甲基吡咯烷酮(1.5ml)溶液中。將該反應混合物在室溫下攪拌兩個小時。用反相hplc純化該反應混合物，使用gilson系統和c18柱，用5-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將產物級分冷凍乾燥，得到標題化合物。ms(esi)m/e961.33(2m+h)2+。

2.51.8.3-(1-((3-(2-((((4-((43s,46s,49s,52s)-43-氨基-49-異丙基-46,52-二甲基-37,44,47,50-四氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜-38,45,48,51-四氮雜五十三烷醯胺基)苄基)氧基)羰基)氨基)乙氧基)-5,7-二甲基金剛烷-1-基)甲基)-5-甲基-1h-吡唑-4-基)-6-(8-(苯並[d]噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基)吡啶甲酸

將實施例2.51.7(25mg)用1ml三氟乙酸處理5分鐘。利用溫和的氮氣流，除去溶劑。將殘餘物用1:1的乙腈∶水冷凍乾燥，得到標題化合物，其不用進一步純化，在下一步中直接使用。ms(lc-ms)m/e1822.0(m+h)+。

2.51.9.n2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己醯基]-n6-(37-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧雜三十七烷-37-基)-l-賴氨醯基-l-丙氨醯-l-纈氨醯-n-{4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基]氨基甲醯基}氧基)甲基]苯基}-l-丙氨醯胺

向實施例2.51.8，(23mg)、n-琥珀醯亞胺基6-馬來醯亞胺基(maleimido)己酸酯(4.40mg)和羥基苯並三唑(0.321mg)的n-甲基吡咯烷酮(1.5ml)溶液中加入n,n-二異丙基乙胺(8.28μl)。將該反應混合物在室溫下攪拌16小時。用反相hplc純化該反應混合物，使用gilson系統和c18柱，用5-85%的乙腈/水(含有0.1%v/v三氟乙酸)洗脫。將產物級分冷凍乾燥，得到標題化合物。1hnmr(400mhz,二甲亞碸-d6)δppm7.76(dq,3h),7.64-7.51(m,5h),7.45(dd,4h),7.35(td,hz,3h),4.97(d,5h),3.95-3.79(m,8h),3.57(d,46h),3.50-3.30(m,14h),1.58-0.82(m,59h)。ms(lc-ms)m/e1007.8(2m+h)2+。

2.52合成2-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-5-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯基]氨基}乙氧基)乙氧基]苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)

在實施例2.30.2中，用實施例2.50.1替代實施例2.30.1，製備標題化合物。1hnmr(500mhz,二甲亞碸-d6)δppm12.87(s,2h);8.06-7.98(m,1h),7.78(d,1h),7.61(dd,1h),7.52-7.41(m,2h),7.39-7.26(m,2h),7.18(d,1h),7.01-6.91(m,2h),6.68(d,1h),6.59(d,1h),5.08-4.98(m,2h),4.95(s,1h),3.59(t,1h),3.46-3.36(m,3h),3.34-3.22(m,2h),3.16(q,1h),3.01(t,1h),2.85(d,2h),2.32(t,1h),2.09(s,2h),1.44-0.71(m,10h)。ms(esi)m/e1338.4(m-h)-。

2.53合成4-[({[2-({3-[(4-{6-[8-(1,3-苯並噻唑-2-基氨基甲醯基)-3,4-二氫異喹啉-2(1h)-基]-2-羧基吡啶-3-基}-5-甲基-1h-吡唑-1-基)甲基]-5,7-二甲基三環[3.3.1.13,7]癸-1-基}氧基)乙基](甲基)氨基甲醯基}氧基)甲基]-3-[3-({n-[3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙醯基]-3-磺基-l-丙氨醯}氨基)丙氧基]苯基β-d-吡喃葡糖苷酸(glucopyranosiduronicacid)

如實施例2.34.2所述，用2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)丙酸酯替代2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1h-吡咯-1-基)己酸酯，n-甲基-2-吡咯烷酮替代n,n-二甲基甲醯胺，製備標題化合物。ms(esi)m/e1458.0(m-h)-。

實施例3.合成示範性的bcl-xl抑制性的adc

使用如下所述的四個示範性方法中的一個方法，合成示範性的adc。表1涉及合成每個示範性的adc所使用的方法。

方法a.將tcep溶液(10mm，0.017ml)加入到預熱至37℃的抗體溶液(10mg/ml，1ml)中。將該反應混合物在37℃下保持1小時。將還原的抗體溶液加入到連接子-彈頭有效載荷(linker-warheadpayload)溶液(3.3mm，0.160ml，在dmso中)中，並平緩地混合30分鐘。將該反應溶液加載到脫鹽柱(pd10，在使用之前，用dpbs洗滌三次)上，而後使用dpbs(1.6ml)，並用額外的dpbs(3ml)洗脫。將純化的adc溶液通過0.2微米的結合了低蛋白的13mm針筒式濾器過濾，並在4℃下保存。

方法b.將tcep溶液(10mm，0.017ml)加入到預熱至37℃的抗體溶液(10mg/ml，1ml)中。將該反應混合物在37℃下保持1小時。加入硼酸緩衝劑(0.05ml，0.5m，ph8)，將還原的抗體的溶液調節至ph=8，加入到連接子-彈頭有效載荷溶液(3.3mm，0.160ml，在dmso中)中，並平緩地混合4小時。將該反應溶液加載到脫鹽柱(pd10，在使用之前，用dpbs洗滌三次)上，而後使用dpbs(1.6ml)，並用額外的dpbs(3ml)洗脫。將純化的adc溶液通過0.2微米的結合了低蛋白的13mm針筒式濾器過濾，並在4℃下保存。

方法c.使用perkinelmerjanus(ajl8m01部分)機器人液體處理系統進行綴合，所述處理系統配備有i235/96尖端模塊化分配技術(mdt)、包含夾臂（7400358部分）的一次性頭部(70243540部分)和8個尖端varispan移液臂(7002357部分)(在延伸板上)。使用winprep版本的4.8.3.315軟體，控制perkinelmerjanus系統。

使用mdt，用100μl1xdpbs預先溼潤pall濾板5052。給濾板抽真空10秒鐘，而後放空5秒鐘，以便從濾板上除去dpbs。將50%的a蛋白樹脂(gemabselectsure)的dpbs漿液倒入配備有磁性球的8孔儲液器中，並通過傳遞儲液器板下面的移動磁鐵，使樹脂混合。使用配備有1ml傳導端的8尖端varispan臂，吸出樹脂(250μl)，並轉入96孔濾板中。進行2個循環的抽真空，除去大部分緩衝劑。使用mdt，吸出150μl1xpbs，並分配到容納樹脂的96孔濾板中。進行抽真空，從樹脂中除去緩衝劑。將衝洗/抽真空循環重複3次。將2ml的96孔採集板安裝在janus面板上，mdt將450μl的5xdpbs轉移至採集板上，用於隨後的使用。如上麵條件a所述，製備還原的抗體(2mg)的dpbs溶液(200μl)，並預加載到96孔板中。將還原的抗體的溶液轉入到含有樹脂的濾板孔中，並通過100μl體積在孔內的重複抽吸/分配(每個循環45秒鐘)，用mdt將該混合物混合。在5分鐘時間內，將抽吸/分配循環總共重複5次。對濾板進行2個循環的抽真空，由此除去過量的抗體。用水衝洗mdt端部，衝洗5個循環(200μl，總體積1ml)。使mdt吸出150μldpbs，並分配到含有樹脂結合的抗體的濾板孔中，並進行兩個循環的抽真空。將洗滌和抽真空程序再重複兩次。最後一次抽真空循環之後，將100μl的1xdpbs分配到含有樹脂結合的抗體的孔中。然後，mdt收集各30μl3.3mm的合成子的二甲亞碸溶液(塗覆在96孔板上)，並分配到含有樹脂結合的抗體(在dpbs中)的濾板上。通過在孔內的100μl體積的重複抽吸/分配，將含有綴合混合物的孔用mdt混合，每個循環45秒鐘。在5分鐘時間內，將抽吸/分配程序總共重複5次。進行2個循環的抽真空，除去過量的合成子至廢料。用水衝洗mdt端部，衝洗5個循環(200μl，總體積1ml)。mdt吸出dpbs(150μl)，並分配到綴合混合物中，進行兩個循環的抽真空。將洗滌和抽真空程序再重複兩次。然後，mdt夾鉗移動濾板，並夾持到支持工作站（holdingstation）。mdt放置2ml採集板，板中含有450μl的10xdpbs(在真空歧管內部)。通過放置濾板，並夾持，mdt重新裝配真空歧管。用水衝洗mdt端部，衝洗5個循環(200μl，總體積1ml)。mdt吸出100μl的igg洗脫緩衝劑3.75(pierce)，並分配到綴合混合物中。一分鐘之後，進行2個循環的抽真空，並將洗脫液收集在含有450μl5xdpbs的接收板中。將抽吸/分配程序再重複3次，輸送adc樣品，濃度在1.5-2.5mg/ml範圍內(ph7.4，在dpbs中)。

方法d.使用perkinelmerjanus(ajl8m01部分)機器人液體處理系統進行綴合，所述處理系統配備有i235/96尖端模塊化分配技術(mdt)、包含夾臂(7400358部分)的一次性頭部(70243540部分)和8個尖端varispan移液臂(7002357部分)(在延伸板上)。使用winprep版本的4.8.3.315軟體，控制perkinelmerjanus系統。

使用mdt，用100μl1xdpbs預先溼潤pall濾板5052。給濾板抽真空10秒鐘，而後放空5秒鐘，以便從濾板上除去dpbs。將50%的a蛋白樹脂(gemabselectsure)的dpbs漿液倒入配備有磁性球的8孔儲液器中，並通過傳遞儲液器板下面的移動磁鐵，使樹脂混合。使用配備有1ml傳導端的8尖端varispan臂，吸出樹脂(250μl)，並轉入96孔濾板中。對濾板進行2個循環的抽真空，除去大部分緩衝劑。mdt吸出150μl的dpbs，並分配到含有樹脂的濾板的孔中。將洗滌和抽真空程序再重複兩次。將2ml的96孔採集板安裝在janus面板上，mdt將450μl的5xdpbs轉移至採集板上，隨後使用。如上麵條件a所述，製備還原的抗體(2mg)的dpbs溶液(200μl)，並分配到96孔板中。然後，mdt收集各30μl3.3mm的合成子的二甲亞碸溶液(塗覆在96孔板上)，並分配到加載了還原的抗體(在dpbs中)的濾板上。通過在孔內的100μl體積的重複抽吸/分配，將該混合物用mdt混合。五分鐘之後，將綴合反應混合物(230μl)轉移到含有樹脂的96孔濾板中。通過在孔內的100μl體積的重複抽吸/分配，將含有綴合混合物和樹脂的孔用mdt混合，每個循環45秒鐘。在5分鐘時間內，將抽吸/分配程序總共重複5次。進行2個循環的抽真空，除去過量的合成子和蛋白至廢料。用水衝洗mdt端部，衝洗5個循環(200μl，總體積1ml)。mdt吸出dpbs(150μl)，並分配到綴合混合物中，進行兩個循環的抽真空。將洗滌和抽真空程序再重複兩次。然後，mdt夾鉗移動濾板，並夾持到支持工作站（holdingstation）。mdt放置2ml採集板，板中含有450μl的10xdpbs(在真空歧管內部)。通過放置濾板，並夾持，mdt重新裝配真空歧管。用水衝洗mdt端部，衝洗5個循環(200μl，總體積1ml)。mdt吸出100μl的igg洗脫緩衝劑3.75(p)，並分配到綴合混合物中。一分鐘之後，進行2個循環的抽真空，並將洗脫液收集在含有450μl5xdpbs的接收板中。將抽吸/分配程序再重複3次，輸送adc樣品，濃度在1.5-2.5mg/ml範圍內(ph7.4，在dpbs中)。

方法e.在室溫下，將tcep溶液(10mm，0.017ml)加入到抗體溶液(10mg/ml，1ml)中。將該反應混合物加熱到37℃，保持75分鐘。將還原的抗體的溶液冷卻到室溫，並加入到合成子溶液(10mm，0.040ml，在dmso中)中，而後加入硼酸緩衝劑(0.1ml，1m，ph8)。在室溫下，將該反應溶液靜置3天，加載到脫鹽柱(pd10，在使用之前，用3x5mldpbs洗滌)上，而後使用dpbs(1.6ml)，並用額外的dpbs(3ml)洗脫。將純化的adc溶液通過0.2微米的結合了低蛋白的13mm針筒式過濾器過濾，並在4℃下保存。

下面的表1表明說明了通過哪種示範性的方法來合成哪種示範性的adc。下列文獻描述了被稱為epcam(ing-1)的epcam的單克隆抗體：studnicka等人，1994,proteinengineering,7:805-814，以及ammons等人，2003,neoplasia5:146-154。下列文獻描述了被稱為n901的ncam-1抗體：roguska等人，1994,procnatlacadsciusa91:969-973。wo2009/134776(參見120頁)描述了被稱為ab033的egfr抗體。

實施例4.示範性的bcl-xl抑制劑結合bcl-xl

使用時間分辨的螢光共振能量轉移(tr-fret)試驗，證明實施例1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7和1.8(分別為化合物w1.01-w1.08)的示範性的bcl-xl抑制劑結合bcl-xl的能力。tb-抗gst抗體購買於invitrogen(目錄編號：pv4216)。

4.1探針合成

4.1.1試劑

所有的試劑使用供應商提供的形式，除非另作說明。包括二異丙基乙胺(diea)、二氯甲烷(dcm)、n-甲基吡咯烷酮(nmp)、2-(1h-苯並三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽(hbtu)、n-羥基苯並三唑(hobt)和哌啶的肽合成試劑，是從appliedbiosystems,inc.(abi),fostercity,ca或americanbioanalytical,natick,ma獲得的。

從abi或anaspec,sanjose,ca獲得預加載的9-芴甲氧羰基(fmoc)胺基酸柱(fmoc-ala-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-asp(tbu)-oh、fmoc-glu(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-pro-oh、fmor-gln(trt)-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh)。

從novabiochem,sandiego,ca獲得肽合成樹脂(fmoc-rink醯胺mbha樹脂)和fmoc-lys(mtt)-oh。

從anaspec獲得單一異構體6-羧基螢光素琥珀醯亞胺基酯(6-fam-nhs)。

從oakwoodproducts,westcolumbia,sc獲得三氟乙酸(tfa)。

從aldrichchemicalco.,milwaukee,wi獲得苯甲硫醚、苯酚、三異丙基矽烷(tis)、3,6-二氧雜-1,8-辛烷二硫醇(dodt)和異丙醇。

在appliedbiosystemsvoyagerde-proms)上記錄基質輔助的雷射解吸電離質譜(maldi-ms)。

在finniganssq7000(finnigancorp.,sanjose,ca)上，以陽離子和陰離子兩種模式記錄電噴霧質譜(esi-ms)。

4.1.2.固相肽合成(spps)的一般方法

在abi433a肽合成儀上，使用250µmol規模的fastmoc™綴合循環，每個容器使用至多250µmol的預加載的wang樹脂，合成肽。使用含有1mmol標準fmoc-胺基酸的預加載的柱，螢光團的連接位置除外，其中，將1mmolfmoc-lys(mtt)-oh放置在所述柱中，並用傳導性反饋監測。在標準偶合條件下，在柱中使用1mmol乙酸，實現n端乙醯化。

4.1.3.從賴氨酸上除去4-甲基三苯甲基(mtt)

使用二氯甲烷，將源自於合成器的樹脂洗滌三次，並保持溼潤。用30分鐘，使150ml95:4:1的二氯甲烷∶三異丙基矽烷∶三氟乙酸流過樹脂床。該混合物變成深黃色，然後褪色至淺黃色。用15分鐘使100mldmf流過該床。然後，用dmf洗滌樹脂三次，並過濾。茚三酮試驗顯示了對於伯胺的強信號。

4.1.4.用6-羧基螢光素-nhs(6-fam-nhs)標記樹脂

在1%diea/dmf中，用2當量的6-fam-nhs處理樹脂，並在環境溫度下攪拌或搖動過夜。當完成時，瀝乾樹脂，用dmf洗滌三次，用(1×二氯甲烷和1×甲醇)洗滌三次，乾燥，提供橙色樹脂，茚三酮試驗顯示該樹脂呈陰性。

4.1.5.樹脂結合的肽的斷裂和脫保護的一般方法

在環境溫度下，在由80%tfa、5%水、5%苯甲硫醚、5%苯酚、2.5%tis和2.5%edt組成的斷裂混合物(1ml/0.1g樹脂)中，搖動3小時，使肽從樹脂上斷裂下來。過濾取出樹脂，並用tfa衝洗兩次。從濾液中蒸發出tfa，用醚(10ml/0.1g樹脂)沉澱出產物，離心回收產物，用醚(10ml/0.1g樹脂)洗滌兩次，並乾燥，得到粗品肽。

4.1.6.純化肽的一般方法

在運行unipoint®分析軟體(gilson，inc.，middleton，wi)的gilson製備hplc系統的徑向壓縮柱上純化粗品肽，所述柱包括兩個25x100mm部分，柱中填充了delta-paktmc1815μm顆粒，孔徑100å，並用下文列出的梯度法之一進行洗脫。每次注射純化一至兩毫升粗品肽溶液(10mg/ml，在90%dmso/水中)。收集每次操作的含有產物的峰，並冷凍乾燥。在20ml/min的條件下進行所有的製備操作，洗脫液為緩衝劑a∶0.1%tfa-水和緩衝劑b∶乙腈。

4.1.7.分析hplc的一般方法

利用具有二極體陣列檢測器和hewlett-packard1046a螢光檢測器的hewlett-packard1200串聯繫統進行分析hplc，運行hplc3dchemstation軟體版本a.03.04(hewlett-packard.paloalto，ca)，使用4.6x250mmymc柱，柱中填充有ods-aq5μm顆粒，孔徑120å，在起始條件下預先平衡7分鐘之後，用下文列出的梯度法之一洗脫。洗脫液是緩衝劑a∶0.1%tfa-水和緩衝劑b∶乙腈。所有梯度的流速是1ml/min。

4.1.8.合成探針f-bak

如下所述，合成結合bcl-xl的肽探針f-bak。在n端，將探針f-bak乙醯化，在c端醯胺化，並且具有胺基酸序列gqvgrqlaiigdkinr。使用6-fam，將它在賴氨酸殘基(k)處螢光素化。探針f-bak可以縮寫如下∶乙醯基-gqvgrqlaiigdk(6-fam)inr-nh2。

為了製備探針f-bak，使用常規肽合成方法，使fmoc-rink醯胺mbha樹脂延長，提供保護的樹脂結合的肽(1.020g)。除去mtt基團，用6-fam-nhs標記，並按照上文描述的方法，進行斷裂和脫保護，提供粗品的橙色固體(0.37g)。利用rp-hplc，將產物純化。利用分析rp-hplc，檢驗整個主峰的級分，分離出純的級分，並冷凍乾燥，主峰提供標題化合物(0.0802g)的黃色固體；maldi-msm/z=2137.1[(m+h)+]。

4.1.9.肽探針f-bak的另一種合成方法

在另一種方法中，在運行fastmoctm綴合循環的appliedbiosystems433a自動肽合成儀上，在0.25mmolfmoc-rink醯胺mbha樹脂(novabiochem)上組裝保護的肽，使用預加載的1mmol胺基酸柱，螢光素(6-fam)標記的賴氨酸除外，其中將1mmolfmoc-lys(4-甲基三苯甲基)稱到柱中。在柱中放入1mmol乙酸，並如上文所述進行綴合，引入n端乙醯基。使95:4:1的dcm:tis:tfa(v/v/v)溶液流過樹脂15分鐘，而後用二甲基甲醯胺流淬滅，選擇性除去4-甲基三苯甲基。在1%diea/dmf中，使單一異構體6-羧基螢光素-nhs與賴氨酸側鏈反應，並通過茚三酮試驗證明反應完成。通過用80:5:5:5:2.5:2.5的tfa/水/苯酚/苯甲硫醚/三異丙基矽烷∶3,6-二氧雜-1,8-辛烷二硫醇(v/v/v/v/v/v)處理，使肽從樹脂上斷裂並進行側鏈脫保護，並通過用乙醚沉澱，回收粗品肽。通過反相高效液相色譜純化粗品肽，並利用分析反相高效液相色譜和基質輔助的雷射解吸質譜，證明它的純度和特徵(m/z=2137.1((m+h)+)。

4.2.時間分辨的螢光共振能量轉移(tr-fret)試驗

使用時間分辨的螢光共振能量轉移(tr-fret)結合試驗，說明示範性的bcl-xl抑制劑w1.01-w1.08與探針f-bak競爭結合bcl-xl的能力。

4.2.1.方法

對於該試驗，將試驗化合物在dmso中連續稀釋，起始濃度為50μm(2x起始濃度；10%dmso)，並將10μl轉移到384孔板中。然後，將10μl的蛋白/探針/抗體混合物加入到每個孔中，最終濃度如下∶

然後，將樣品在振蕩器上混合1分鐘，並在室溫下再培養2小時。對於每個試驗板，分別包括探針/抗體和蛋白/抗體/探針混合物作為陰性和陽性對照。使用340/35nm激發濾片以及520/525(f-bak)和495/510nm(tb標記的抗his抗體)發射濾片，在envision(perkinelmer)上測定螢光。使用wang's方程式，測定解離常數(ki)(wang,1995,febslett.360:111-114)。在不同濃度的人血清(hs)或胎牛血清(fbs)的存在下，可以進行tr-fret試驗。在沒有hs和存在1%hs的兩種條件下，檢驗化合物。

4.2.2.結果

結合試驗的結果(ki，納摩爾)提供於下面表2中∶

實施例5.示範性的bcl-xl抑制劑在molt-4細胞活力試驗中抑制bcl-xl

在基於細胞的殺傷試驗中，使用各種細胞系和小鼠腫瘤模型，可以測定示範性的bcl-xl抑制劑的能力。例如，可以利用培養的致瘤和非致瘤細胞系，以及原代小鼠或人類細胞群體，評估它們對於細胞活力的活性。在使用了molt-4細胞的細胞活力試驗中，證明了示範性的bcl-xl抑制劑的bcl-xl抑制活性。

5.1.方法

在一組示範性的條件下，將molt-4(atcc，manassas，va)人類急性淋巴母細胞性白血病細胞塗覆在384孔組織培養板(corning，corning，ny)中，每個孔12,500個細胞，組織培養基的總體積為25µl，補充有10%人類血清(sigma-aldrich，st.louis，mo)，並用感興趣的化合物的3倍連續稀釋物處理(從10µm至0.0005µm)。每個濃度（一式兩份）至少單獨的檢驗3次。使用celltiter-glo®發光法細胞活力檢測，按照生產商的建議(promegacorp.，madison，wi)，測定化合物處理48小時之後的活細胞數目。在10%hs的存在下，檢驗化合物。

5.2.結果

對於實施例1.1-1.6的示範性的bcl-xl抑制劑(分別為化合物w1.01-w1.08)，在10%hs的存在下進行的molt-4細胞活力試驗的結果(ec50，納摩爾)提供於下面表3中。

nt=沒有檢驗。

實施例6.示範性的adc的dar和聚集

分別利用lc-ms和分子排阻色譜(sec)，測定按照上面實施例3合成的示範性的adc的dar和聚集百分比。

6.1.lc-ms常規方法

使用與agilentlc/msdtof6220esi質譜儀連接的agilent1100hplc系統，進行lc-ms分析。使用5mm(最後濃度)bond-breaker®tcep溶液(thermoscientific，rockford，il)，將adc還原，加載到proteinmicrotrap(michrombioresorces，auburn，ca)脫鹽柱上，並在環境溫度下，用10%b至75%b的梯度洗脫0.2分鐘。流動相a是水(含有0.1%甲酸(fa))，流動相b是乙腈(含有0.1%fa)，流速是0.2ml/min。使用agilentmasshunter(tm)acquisition軟體，獲得共同洗脫輕和重鏈的電噴霧電離飛行時間質譜。使用themaximumentropyfeatureofmasshunter軟體將提取強度vs.m/z光譜進行解卷積(deconvoluted)，測定每個還原抗體片段的質量。通過輕鏈和重鏈的裸峰和修飾峰的強度加和，通過強度乘以所連接的藥物數目來進行歸一化，由解卷積(deconvoluted)的光譜計算dar。將加和的、歸一化強度除以強度的和，兩個輕鏈和兩個重鏈的加和結果產生全部adc的最終平均dar值。

6.2.尺寸排阻色譜常規方法

在含有0.25mm氯化鉀和15%ipa的0.2m磷酸鉀(ph6.2)中，流速0.75ml/min，使用shodexkw802.5柱，進行尺寸排阻色譜。通過將曲線下的面積積分，測定在280nm下每個高分子量和單體洗脫液的峰面積吸光度。通過用高分子量洗脫液的峰面積吸光度(280nm)除以280nm下高分子量和單體洗脫液的峰面積吸光度的和，再乘以100%，測定綴合樣品的%聚集部分。

6.3.結果

表4報導了上述lc-ms方法測定的平均dar值，以及示範性的adc的%聚集部分。在試驗中，評價靶向epcam的包含單克隆抗體ing-1的adc(參見，studnicka等人，1994，proteinengineering，7:805-814，和ammons等人，2003，neoplasia5:146-154)。wo2009/134776描述了靶向egfr的抗體ab033。roguska等人(1994，procnatlacadsciusa91:969-973)描述了單克隆抗體n901(靶向ncam-1)。

實施例7.靶向egfr的adc體外抑制癌細胞的生長

評價某些包含抗體ab033的示範性的adc。抗體ab033靶向人類egfr。wo2009/134776(參見120頁)描述了抗體ab033的可變的重和輕鏈序列。使用mcl-1-/-小鼠胚胎纖維母(mef)細胞，表明抗體ab033抑制癌細胞生長的能力。mcl-1-/-mef的存活依賴於bcl-xl(lessene等人，2013,naturechemicalbiology9:390-397)。為了評價示範性的靶向ab033的bcl-xl-adc的效果，使人類egfr在mcl-1-/-mef中過度表達。

7.1.方法

使用fugene6轉染試劑(rochemolecularbiochemicals，mannheim，germany)，用含有huegfr序列的逆轉錄病毒結構plvc-ires-hygro(clontech)或空載體轉染gp2-293包裝細胞系(clontech)，製備逆轉錄病毒上清液。培養48小時之後，採集含有病毒的上清液，並在75cm2培養瓶中，在聚凝胺(8µg/ml；sigma)的存在下，施加於mcl-1-/-mef(每個燒瓶0.5x106個)中，並進一步培養48小時。3天之後，使用250μg/ml潮黴素b(invitrogen)(在完全補充的培養基中)，洗滌mcl-1-/-mef，並選擇。利用流式細胞術，確定huegfr的表達，並與母體細胞系或空載體轉染的細胞系相比較。

在含有10%fbs的dmem中，用靶向ab033的bcl-xl-adc、單獨的ab033或靶向msl109的bcl-xl-adc處理表達huegfr的mcl-1-/-mef或plvx空載體(vct對照)96小時。對於該試驗，將細胞塗覆在384孔組織培養板(corning，corning，ny)的總體積25µl的試驗培養基(dmem和10%hifbs)中，每個孔250個細胞。利用echo550聲波液體處理器(labcyte)，將塗覆的細胞用感興趣的抗體藥物綴合物的4倍連續稀釋物(從1µm至1pm)處理。在mcl-1-/-mefhuegfr細胞系的12個平行測定和mcl-1-/-mef載體細胞系的6個平行測定中，檢驗每個濃度。使用celltiter-glo®發光法細胞活力檢測，按照生產商的建議(promegacorp.，madison，wi)，在37℃和5%co2中，在抗體藥物綴合物處理96小時之後，測定活細胞部分。使用螢光方案，積分時間0.5sec，將板在perkinelmerenvision中讀數。將每個稀釋點的平行測定值平均，使用graphpadprism5(graphpadsoftware,inc.)，使用線性回歸y=((底部-頂部)/(1+((x/k)n)))+頂部，將數據與s形曲線模型擬合，得到抗體藥物綴合物的ec50值，其中，y是測定的響應值，x是化合物濃度，n是hill斜率，k是ec50值，底部和頂部分別是較低和較高的漸近線。肉眼觀察曲線，用於證實曲線擬合結果。由walterandelizahallinstituteofmedical的davidc.s.huang，獲得mcl-1-/-mef。

7.2.結果

代表性的實施例的細胞活力試驗結果(ec50值，納摩爾)提供於下面表5中。

nt=沒有檢驗。

代表性的實施例3.28、3.29和3.35針對mcl-1-/-mef載體細胞系的細胞活力試驗結果(ec50值，納摩爾)分別是67nm、69nm和249nm。

實施例8.靶向epcam-和ncam1-的抗體藥物綴合物體外抑制癌細胞的生長

使用表達內源性epcam蛋白的ncc38細胞，人類乳腺癌細胞系，表明含有靶向人類細胞粘附分子(epcam)的抗體的某些示範性的adc抑制bcl-xl和誘導細胞程序死亡的能力。在表達內源性ncam-1的nci-h146細胞(人類小細胞肺癌系)中，表明靶向人類神經細胞粘著分子ncam1的某些示範性的adc的細胞毒性。

8.1.方法

對於該試驗，在含有10%fbs的rpmi1640培養基(invitrogen，#11995)中，培養hcc38和nci-h146兩個細胞系。在試驗之前，將細胞再懸浮在培養基中，4x104個細胞/ml，而後加入到96孔組織培養板，75µl細胞/孔，最後濃度為3,000個細胞/孔。然後，將試驗板在37℃和5%co2條件下培養過夜。在第二天，將epcam、ncam-1或陰性對照(msl109)adc在培養基中連續稀釋，並加入到試驗板中，25µl/孔。然後，將試驗板在37℃和5%co2條件下培養72小時。利用celltiterglo®發光法細胞活力檢測試劑盒(promega，#g7573)，測定細胞活力。

8.2.結果

使用graphpadprism軟體，分析數據。ic50值(達到細胞的最大生長抑制的50%時的adc的濃度)分別報導於表6和7中。

如表6所示，靶向epcam的adc有效地殺傷hcc38乳腺癌細胞(ic50≤0.4nm)，而陰性對照adcmsl109-db的活性弱。如表7所示，ncam1-db和ncam1-hadc對於nci-146小細胞肺癌細胞顯示了特異性活性(ic50值～20nm)。

實施例9.靶向egfr的bcl-xl抑制性抗體藥物綴合物(adc)，單獨以及與多西他賽聯合，體內抑制非小細胞肺癌(nsclc)異種移植物的生長

在兩個nsclc異種移植模型nci-h1650和ebc-1中，說明靶向腫瘤相關抗原(taa)(例如，egfr)的示範性的bcl-xl抑制性adc(本文還稱為bcl-xliadc)的效果和選擇性。正如免疫組織化學所揭示的那樣，在下面表8中，舉例說明了抗原在異種移植腫瘤上的膜表達。

實施例10.靶向egfr的bcl-xl抗體藥物綴合物體內抑制nsclc腫瘤細胞的生長

在由nsclc細胞系、nci-h1650和ebc-1獲得的異種移植模型中，說明某些示範性的靶向egfr的adc在小鼠中選擇性抑制表達egfr的腫瘤細胞的能力。

10.1.方法

nsclc細胞系nci-h1650購買於americantypeculturecollection(atcc，manassas，va)。在補充有胎牛血清(fbs，hyclone，logan，ut)的rpmi1640培養基(invitrogen，carlsbad，ca)中，將細胞培養成為單層細胞。從japanesecollectionofresearchbiosources(jcrb，osaka，japan)獲得鱗狀肺癌細胞系ebc-1。在補充有10%胎牛血清(fbs，hyclone，logan，ut)的mem培養基(invitrogen，carlsbad，ca)中，將細胞培養成為單層細胞。為了產生異種移植物，將5*106個活細胞皮下接種到免疫缺乏的雌性scid/bg小鼠(charlesriverlaboratories，wilmington，ma)的右肋部。注射劑體積是0.2ml，並且由s-mem和基質膠(bd，franklinlakes，nj)的1:1混合物組成。使腫瘤大小匹配為大約200mm3。在磷酸鹽緩衝鹽水(pbs)中，配製抗體和綴合物，並腹膜內注射。注射體積不超過400µl。在腫瘤大小匹配之後24小時之內，開始治療。在治療開始時，小鼠重量大約25g。每周評估兩至三次腫瘤體積。通過電子卡鉗，測定腫瘤的長度(l)和寬度(w)，並按照下列方程式計算體積：v=lxw2/2。當腫瘤體積達到3,000mm3或出現皮膚潰瘍時，使小鼠安樂死。每個籠中放置八個至十隻小鼠。食品和水不限量。在開始實驗之前，使小鼠適應動物設備至少一周時間。在12小時照明∶12小時黑暗計劃(在06:00開始照明)的照明階段，檢驗動物。按照abbvie'sinstitutionalanimalcareandusecommittee以及nationalinstitutesofhealthguideforcareanduseoflaboratoryanimals的原則，在associationfortheassessmentandaccreditationoflaboratoryanimalcare認可的設備中，進行所有實驗。

10.2.結果說明和分析

為了指出治療劑的效果，使用治療劑響應的幅度(tgimax)、持久性(tgd)和響應頻率(cr、pr、or)的參數。

tgimax是在實驗期間的最大腫瘤生長抑制。利用100*(1-tv/cv)計算腫瘤生長抑制，其中tv和cv分別是治療和對照組的平均腫瘤體積。

tgd或腫瘤生長延遲是所治療的腫瘤達到1cm3體積需要延長的時間(相對於對照組)。通過100*(tt/ct-1)來計算tgd，其中，tt和ct分別是治療和對照組的達到1cm3的中值時間周期。

響應幅度在特定組中的分布是通過完全響應者(cr)、部分響應者(pr)和全部響應者的頻率得到的。cr是在腫瘤負荷為25mm3(至少三次測定)的組內的小鼠的百分比。pr是在腫瘤負荷大於25mm3但小於治療開始時的一半體積(至少三次測定)的組內的小鼠的百分比。or是cr和pr的和。

雙尾student's檢驗和kaplan-meier對數秩檢驗分別用於測定tgimax和tgd的差異的顯著性。

10.3.肺腺癌模型nci-h1650(下文稱為h1650)的生長抑制

10.3.1.靶向egfr的adc

對於靶向egfr的adc，分別如實施例3.2、3.35和3.36所述，將實施例2.2(合成子d)、實施例2.35(合成子h)和實施例2.36(合成子i)的合成子與靶向egfr的抗體ab033綴合，分別得到adcab033-d、ab033-h和ab033-i。合成子h、db或i與靶向巨細胞病毒(cmv)的抗體msl109的綴合物(msl109-h、msl109-db或msl-109-i)用作被動式靶向對照物。這些綴合物下文還稱為『非靶向』adc，這是由於載體抗體不能識別腫瘤相關抗原。msl109描述於下列文獻中：drobyski等人，1991,transplantation51:1190-1196，以及美國專利us5,750,106。靶向破傷風類毒素的抗體(抗體ab095)用作給予igg的效果的對照物。參見larrick等人，1992,immunologicalreviews69-85。

10.3.2.靶向egfr的adc的結果

下面圖1和表9說明了靶向egfr的adc抑制h1650異種移植物生長的效果和選擇性。在圖1中，圖例中列舉了每次給藥的數量。在接種腫瘤細胞後的第16天，開始治療。治療的腫瘤的平均尺寸是210mm3。ab095、ab033-h、ab033-i、msl109-h和msl109-i的方案是q4dx6。使用7.5mg/kg劑量(qdx1)的標準療法（standard-of-care）化學治療劑多西他賽(dtx)，作為單一藥劑使用，或與adc聯用。腹膜內注射抗體和綴合物。靜脈內給予dtx。曲線的每個點代表5個腫瘤的平均值。誤差線描述了平均值的標準誤差。

通過57%的tgimax和78%的tgd(表9)可以說明，給予小分子bcl-xl抑制劑a-1331852(leverson等人，2015，sci.transl.med.7:279ra40)顯著地抑制異種移植物生長。與非靶向的adcmsl109h和裸的抗egfr抗體相比，以單一藥劑形式給予靶向egfr的bcl-xliadc(30mg/kg，q4dx6)，抑制腫瘤生長(tgimax)大約1.5倍。通過非靶向的adcmsl109-h和msl109-i，增強dtx治療的生長抑制和響應的持久性。靶向egfr的adcab033-h和ab033-i，當加入到dtx中時，與加入非靶向adc相比，導致更持久的腫瘤衰退(表9和圖1)。

前面的實驗表明，靶向egfr的bcl-xl抑制性adc顯著地抑制h1650的生長。因此，這個模型適於進一步探索這些綴合物的最小有效劑量，以及鑑定其它有效的bcl-xl抑制劑。表10和圖2說明了靶向egfr的bcl-xliadc(ab033-h和ab033-db)的劑量響應關係。在接種腫瘤細胞後的第12天，開始治療。治療的腫瘤的平均尺寸是215mm3。抗體和綴合物的方案是q4dx6。圖例中列舉了每次給藥的數量。腹膜內注射抗體和綴合物。圖2的曲線的每個點代表10個腫瘤的平均值。誤差線描述了平均值的標準誤差。

雖然載體抗體ab033抑制腫瘤生長，但adc的bcl-xl抑制劑-連接子部分主要負責綴合物的效果。ab033的抑制的持久性是劑量響應性的，並且在q4dx6方案中，在3mg/kg和30mg/kg劑量下，tgd位於44和80%之間。與ab033-h和ab033-db的效果相比較，這個效果顯著地更低。劑量為3mg/kg時，這些綴合物(ab033-db)的最低的tgd是160%。此外，用ab033治療不會產生可測的響應率，而bcl-xladc，即使在3mg/kg條件下，也會引起最小90%的總響應率。靶向egfr的綴合物的效果也不太可能由消極靶點的效果所引起，這是由於，使用msl109作為載體抗體，在沒有任何響應率的情況下，只會產生微不足道的生長抑制。

表11總結了單一劑量的、與ab033連接的各種bcl-xl抑制劑對於h1650異種移植物生長的抑制。在接種腫瘤細胞後的第11天，開始治療。治療的腫瘤的平均尺寸是216mm3。抗體和綴合物的方案是qdx1。給予10mg/kg的單劑量。腹膜內給予抗體和綴合物。每個治療組由8隻小鼠組成。

靶向egfr的bcl-xliadc一致地比對照物綴合物更有效。儘管給予單一劑量，如所示，但靶向adc引起持久的響應，tgd的範圍是133%至>507%。

在單獨的實驗中，評價了與ab033連接的兩個其它bcl-xl抑制劑對於h1650異種移植物生長的抑制(表12)。在接種腫瘤細胞後的第12天，開始治療。治療的腫瘤的平均尺寸是213mm3。抗體和綴合物的方案是qdx1，給予的劑量為10mg/kg。腹膜內給予抗體和綴合物。每個治療組由8隻小鼠組成。

10.4.鱗狀nsclc模型ebc-1的生長抑制

10.4.1.靶向egfr的adc的方法

形成異種移植物、監測腫瘤生長和數據分析的一般方法提供於實施例2中。對於靶向egfr的adc，分別如實施例3.2、3.35和3.36所述，將實施例2.2(合成子d)、實施例2.35(合成子h)和實施例2.36(合成子i)的合成子與靶向egfr的抗體ab033綴合，分別得到adcab033-d、ab033-h和ab033-i。合成子h與靶向cmv的抗體msl109的綴合物(msl109-h)用作消極靶點對照物。靶向破傷風類毒素的抗體(抗體ab095)用作給予igg的效果的對照物。

10.4.2.使用靶向egfr的adc的結果

當治療鱗狀細胞癌ebc-1的異種移植模型時，也觀察到靶向egfr的adc的治療效能。使用靶向egfr的adc的這個實驗的結果示於下面圖3和表13中。在圖3中，圖例列舉了每次給藥的劑量。曲線的每個點代表5個腫瘤的平均值。誤差線描述了平均值的標準誤差。在接種腫瘤細胞後的第9天，開始治療。治療的腫瘤的平均尺寸是215mm3。ab095、ab033、ab033-d、ab033-h、ab033-i和msl109-h的方案是q4dx6。在qdx1條件下，給予dtx。腹膜內注射抗體和綴合物。靜脈內給予dtx。

靶向cmv的adc(msl109-h，劑量：30mg/kg)抑制腫瘤生長(43%)，由此顯示出與消極靶點相關的抗腫瘤活性。在整個實驗中，使用7.5mg/kg劑量的標準療法化學治療劑多西他賽(dtx)，作為單一藥劑使用，或與adc聯用。作為單一藥劑，dtx產生76%的tgi。在與dtx的聯用藥中，msl109-h(30mg/kg)使tgi從76%升高至83%，和tgd從44%升高至89%(表13，圖3a)。被動式靶向達到的效果不如使用egfr靶向抗體ab033的adc所看到的效果。靶向egfr的adc(ab033-h，30mg/kg)的tgimax是64%(圖3c)。向dtx中加入ab033-h(30mg/kg)，使tgimax從76%升高至98%，tgd從44%升高至178%。給予ab033-i，引起66%的最大腫瘤生長抑制(圖3d)。當給予聯用藥時，這種綴合物分別使dtx的tgimax和tgd升至98%和178%。當以單一藥劑形式給予ab033-d時，ab033-d的效果有限(tgimax=49%)。儘管如此，向dtx中加入這種綴合物，能夠使dtx的tgimax和tgd分別升高至94%和156%(表13，圖3b)。值得注意的是，給予10mg/kg的靶向egfr的綴合物，也會提高dtx的效果(表13)。向dtx中加入靶向的bcl-xliadc的治療益處是，持久性提高，而不是增加響應的幅度。

實施例11.單獨和與bcl-2-選擇性抑制劑聯用的靶向ncam-1的bcl-xl抑制性adc，體內抑制小細胞肺癌(sclc)腫瘤的生長

在兩個小細胞肺癌(sclc)異種移植模型nci-h146和nci-h1963.fp5中，單獨和與化合物abt-199(bcl-2的小分子選擇性抑制劑)聯用的靶向ncam1的示範性的bcl-xliadc抑制腫瘤細胞生長的效果。

11.1.方法

sclc細胞系nci-h146(下文稱為h146)購買於americantypeculturecollection(atcc，manassas，va)。在補充有10%胎牛血清(fbs，hyclone，logan，ut)的rpmi-1640培養基(invitrogen，carlsbad，ca)中，將細胞培養成為單層細胞。sclc癌細胞系nci-h1963.fp5(下文稱為h1963.fp5)源自於在免疫受損小鼠的肋部經過5次連續傳代後的nci-h1963(atcc)。在補充有胎牛血清(fbs，hyclone，logan，ut)的rpmi-1640培養基(invitrogen，carlsbad，ca)中，將細胞培養成為單層細胞。為了產生異種移植物，將5*106個活細胞皮下接種到免疫缺乏的雌性scid/bg小鼠(charlesriverlaboratories，wilmington，ma)的右肋部。注射體積是0.2ml，並且由s-mem和基質膠(bd，franklinlakes，nj)的1:1混合物組成。使腫瘤大小匹配為大約200mm3。在磷酸鹽緩衝鹽水(pbs)中，配製抗體和綴合物，並腹膜內注射。注射體積不超過400µl。在腫瘤大小匹配之後24小時之內，開始治療。在治療開始時，小鼠稱重大約25g。如實施例10所述，進行腫瘤體積確定和動物管理。

對於該試驗，使用靶向ncam1的adcα-ncam1-h(也稱為n901-h)。所評價的adc包含單克隆抗體ncam-1(n901)(參見roguska等人，1994,procnatlacadsciusa91:969-973)。靶向的腫瘤相關抗原ncam1在h146和h1963.fp5細胞的表面上表達。對於先前的實驗，抗體ab095用作陰性對照。給予單一藥劑和與abt-199聯用的bcl-xliadc。

11.2.結果

11.2.1.靶向ncam-1的adc對於h146sclc異種移植物的生長的效果

在接種腫瘤細胞後的第10天，開始治療。治療的腫瘤的平均尺寸是216mm3。ab095和α-ncam-1-h的方案是q4dx6，abt-199的方案是qdx21。實驗的結果示於圖4和表14中。給予單一藥劑和與abt-199聯用的bcl-xladc。腹膜內注射抗體和綴合物。口服給予abt-199。在圖4中，圖例列舉了每次給藥的數量。曲線的每個點代表10個腫瘤的平均值，只不過包含7隻小鼠的msl109-h治療組除外。誤差線描述了平均值的標準誤差。

當以單一藥劑形式給予時，靶向ncam1的bcl-xliadc抑制腫瘤生長。靶向的adcα-ncam1-h抑制腫瘤生長(88%)，並且使腫瘤達到1cm3體積的時間提高了144%(圖4，表14)。ncam1-hadc的效果具有選擇性，這是因為它的效果顯著地高於裸抗體α-ncam1或非靶向對照物msl109-h的效果(表14)。另外，當用α-ncam1-h治療與給予選擇性bcl-2抑制劑abt-199聯用時，出現顯著的加合效應。tgi、tgd和完全響應率分別從88、144和0%提高至98、204和80%。

11.2.2.靶向ncam-1的adc對於h1963.fp5sclc異種移植物的生長的效果

使用h1963異種移植物，進行其它異種移植物實驗。這些異種移植物表達ncam1。在接種腫瘤細胞後的第15天，開始治療。治療的腫瘤的平均尺寸是233mm3。ab095和α-ncam1-h的方案是q4dx6，abt-199的方案是qdx21。實驗的結果示於圖5和表15中。給予單一藥劑和與abt-199聯用的bcl-xliadc。腹膜內注射抗體和綴合物。口服給予abt-199。在圖5中，圖例列舉了每次給藥的劑量。曲線的每個點代表9個腫瘤的平均值，只不過包含5隻小鼠的αmsl109-h治療組除外。誤差線描述了平均值的標準誤差。

11.2.3.結果

h1963.fp5異種移植物實驗的結果提供於下面表15中。當以單一藥劑形式給藥時，靶向ncam1的綴合物抑制腫瘤生長。α-ncam1-h(n901-h)抑制腫瘤生長(74%，圖5，表15)。α-ncam1-h(也稱為n901-h)的效果具有選擇性，這是因為它的效果顯著地高於裸抗體或非靶向對照物msl109-h的效果(表15)。與在h146異種移植物中所觀察到的效果相似，當用α-ncam1-h治療與給予選擇性bcl-2抑制劑abt-199聯用時，出現顯著的加合效應。

實施例12.bcl-xl抗體-藥物綴合物減輕全身性毒性

12.1.防止血小板減少

給予bcl-xliadc作為抗體藥物綴合物，可以通過選擇性地靶向腫瘤，規避小分子的全身性毒性。用這樣的方式，通過兩種合適的機制，adc可以避開全身性毒性，並且達到腫瘤特異性效果。第一，對於具有細胞膜滲透性bcl-xl抑制劑的adc，與載體抗體的結合，可以限制與小分子的全身性接觸。第二，adc可以促進非滲透性bcl-xl抑制劑的內化，並由此選擇性地影響攜帶靶向抗原的腫瘤細胞。第一個機制的證據提供於圖6中。

12.1.1.方法和結果

在小鼠中，單一腹膜內注射之後，檢驗兩種bcl-xl抑制性adc(bcl-xliadc)對於循環血小板的數目的影響(抑制性adc含有抗egfr抗體ab033，並且被稱為ab033-h和ab033-i)。抗破傷風類毒素抗體ab095用作陰性對照。navitoclax(abt-263，雙重bcl-2和bcl-xl抑制劑)、a-1331852(選擇性的bcl-xl抑制劑，leverson等人，2015，sci.transl.med.7:279ra40.)和非綴合的bcl-xl抑制劑導致血小板減少，在注射化合物之後6小時，血小板減少達到最大值。0.61mg/kg的劑量(等同於在30mg/kg的bcl-xladc中存在的bcl-xl抑制劑的數量)，使血小板數量降低100倍，從大約6*105個/mm3的正常數降低至6*103個/mm3。

[0569]相比之下，給藥之後6小時(表16)，或在14天的觀察期的任何時間點，bcl-xl抑制性adc都沒有使血小板實質性地減少。隨後的觀察結果提出：由adc緩慢釋放抑制劑所引起的血小板減少的誘導作用是不太可能的。

儘管已經說明和描述了各個具體實施方案，但應理解，在不背離本公開的精神和範圍的條件下，可以進行各種改變。