一種通過促進活性蛋白聚集體解聚提高澱粉脫支酶產量的方法
2023-06-06 11:25:06 2
專利名稱：一種通過促進活性蛋白聚集體解聚提高澱粉脫支酶產量的方法
技術領域：
本發明涉及一種澱粉脫支酶的發酵生產方法，特別是一種通過促進活性蛋白聚集體解聚提高重組澱粉脫支酶胞外分泌的發酵生產方法。
背景技術：
澱粉脫支酶(E. C. 3. 2. I. 41)是一類能夠水解支鏈澱粉、a _極限糊精等分子中 a _1，6葡萄糖苷鍵的澱粉水解酶。澱粉脫支酶通常和其它澱粉酶復配用於生產葡萄糖、果糖、麥芽糖、麥芽糊精、低聚糖等產品。澱粉脫支酶可以切斷澱粉中的分支點，加速後續酶的反應，縮短反應時間，提高澱粉的轉化率，降低其它糖化用酶製劑的使用量，從而達到增加產量、提高設備利用率、降低生產成本的目的。目前能夠在最適溫度和最適PH上同時實現與糖化酶進行較好配合的商品化澱粉脫支酶主要是美國傑能科公司的Optimax L-1000。我國雖然對澱粉脫支酶進行了大量的研究，但是還沒有實現該酶的工業化生產，還需要依賴進口。近年來國內外學者把澱粉脫支酶的開發研究作為非常重要的研究主題。Bunzo Mikami等對來源於Klebsiella pneumoniae的澱粉脫支酶蛋白晶體結構進行解析,發現該酶具有GH13澱粉水解酶家族共有的(P/a)8桶狀結構。近年來國外學者從極端嗜熱微生物中分離出具有可以耐受接近100°C高溫的澱粉脫支酶，但是這些酶往往只有在pH 6.0以上才具有較高的活性。R Koch等從Fervidobacterium pennavorans中分離到最適pH在
4.5到5. 0，而且能夠在70°C條件下具有較高穩定性的澱粉脫支酶。國內主要研究了產澱粉脫支酶野生菌的篩選鑑定、重組菌構建、發酵條件優化以及在澱粉原料酶解中的應用。唐寶英等人從土壤中分離出一株產澱粉脫支酶芽孢桿菌，通過誘變和產酶條件優化，酶活從
I.6U/mL提高到8. 8U/mL，該酶最適反應溫度和pH分別為75°C和4. 6，在55°C反應條件下， 在pH4. 0-8. 0範圍內活性穩定。張明炎等將來源於地衣芽孢桿菌的澱粉脫支酶編碼基因克隆大腸桿菌中進行表達，搖瓶發酵產酶最高達到6. 5U/mL。蘇品等實現了來源於Thermotoga maritima的澱粉脫支酶編碼基因在枯草芽孢桿菌中的成功表達，該酶最適溫度90°C，最適 pH 6.0，發酵酶活可達89. lU/mL。但是這些菌株的產酶水平仍然較低，生產成本高。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種通過促進活性蛋白聚集體解聚提高澱粉脫支酶產量的方法，以解決現有發酵工藝中胞外酶活較低、生產成本高、無法實現工業化生產的問題。為解決上述問題，本發明的技術方案如下(I)重組菌構建根據NCBI上登錄的pulB的基因序列(Genbank號JN872757. I)，採用化學全合成方法合成澱粉脫支酶基因序列pulB。用於構建大腸桿菌表達載體的質粒是pET20b (+)，帶有17啟動子。將pET20b(+)質粒和含有pulB基因的質粒分別進行Nco I和HindIII雙酶切，酶切產物割膠回收後，再用T4連接酶連接，連接產物轉化E. coli JM109感受態細胞，經 37°C培養8h，挑轉化子在含有100mg/L氨苄青黴素液體的LB中振蕩培養，提取質粒，酶切驗證得到表達質粒pulB/pET20b (+)。將質粒pulB/pET20b(+)轉化E.coli BL21 (DE3)宿主菌，塗布含氨苄青黴素 (100mg/L)的LB平板上，37°C培養8h，命名為pulB/pET20b (+)/BL21 (DE3)。挑單菌落至液體LB中，37°C培養過夜，保存甘油管。(2)種子製備將_80°C甘油管保存的菌株接入種子培養基中，使用迴轉恆溫調速搖床進行培養， 控制轉速200rpm/min，培養溫度37°C，初始pH值7. 10，培養時間10小時。⑶發酵工藝將活化後的種子培養液接種入發酵培養基中，通過控制攪拌轉速和通風量使溶氧維持20-30 %，控制溫度為30土 1°C，流加質量濃度為25 %的氨水控制pH 7. 0±0. 5，培養 5-6小時；待溶氧上升至80-100%，以指數流加的方式補加補料液使溶氧維持在20-30%， 溫度維持在30± I °C，流加氨水控制pH 7. 0±0. 5，當菌體OD6tltl達到15-30時補加
0.75-1.5% (m/V)的甘氨酸；繼續培養至菌體吸光度OD6tltl達到45-60時，降溫至23_30°C，通過補加濃度為 200g/L乳糖溶液，使發酵液剩餘乳糖濃度控制在4-6g/L。同時溶氧控制在20-30 %，控制 pH 7. 0±0. 5，誘導15小時左右，添加0. 1-1. 0%濃度的Tween 80，繼續發酵1-10小時。所述種子培養基的組成為工業級蛋白腖10g/L，工業級酵母粉5g/L，NaCL IOg/ L，pH 7. 10，種子培養基還可以添加100mg/L氨苄青黴素。所述發酵培養基的組成為甘油6g/L，工業級蛋白腖12g/L，工業級酵母粉24g/L， KH2P042. 31g/L，K2HP043H20 16. 43g/L，微量元素液 10mL/L，發酵培養基還可以添加 100mg/L
氨苄青黴素。所述微量元素液為=FeSO4 7H20 10g/L，ZnSO4 7H20 2. 25g/L，CuSO4 5H20 I. Og/ L, MnSO4 4H20 0. 5g/L, Na2B4O7 IOH20,0. 23g/L, CaCl2 2. Og/L, (NH4)6Mo7O24O. lg/L。所述補料液為甘油500g/L，MgSO4 7H20 20g/L，蛋白腖15g/L，酵母粉30g/L。所述甘油補料液質量分數為50% (500g/L);甘油含量的測定方法採用HPLC : Zorbax Extend_C18 (4. 6mmX 250mm, 5 u m),柱溫 35 °C，進樣量10 u L,差不折光檢測器溫度35°C,流速1. OmL/min，流動相純水；發酵培養4小時後，每隔I小時,對發酵液中甘油濃度進行一次測定，根據測定結果加入一定體積的補料液，使發酵液中甘油濃度維持在
2-5g/L。所述發酵液中乳糖濃度的測定方法參見GB/T 5413. 5-1997 ;每隔I小時，對發酵液中乳糖濃度進行測定，根據結果加入一定體積的乳糖誘導液，使發酵液中乳糖濃度維持在 4-6g/L。本發明採用添加Tween 80結合其它發酵控制工業(如分段控溫發酵工藝、恆定溶氧控制工藝、PH控制工藝、補料分批發酵控制工藝、誘導控制工藝)，促進重組大腸桿菌活性蛋白聚集體解聚，實現了胞外高效發酵生產澱粉脫支酶，發酵結束後胞外重組澱粉脫支酶酶活為386U/mL。由於澱粉脫支酶分泌到培養基中，菌體經過簡單的過濾就可得到酶液，工藝簡單易行，減少了後續提取成本，適合工業化生產。
具體實施例方式實施例I具體過程如下以構建的重組大腸桿菌pulB/pET20b(+)/BL21(DE3)為生產菌種。I、種子培養將_80°C甘油管保存的菌種接入種子培養基(工業級蛋白腖10g/L， 工業級酵母粉5g/L，NaCL 10g/L, pH 7. 10)中，使用恆溫搖床進行培養轉速200rpm/min， 溫度37°C，培養8小時。2、發酵產酶分批發酵階段將種子液以8%接種量接入發酵培養基(甘油8g/L，蛋白腖lg/L， 酵母粉 2g/L，KH2PO4 13. 5g/L，(NH4)2HPO4 4g/L，檸檬酸 I. 7g/L，MgSO4 0. 68g/L，微量元素液 10mL/L)，通過控制攪拌轉速和通風量使溶氧維持30%，控制溫度為30°C，流加質量濃度為 25%的氨水控制pH 7. 0，培養時間6個小時；補料發酵階段待溶氧上升至80-100%，批式培養結束後，以指數流加的方式補加以甘油為碳源的補料液(甘油500g/L，MgSO4 *7H20 20g/L，蛋白腖15g/L，酵母粉30g/L)， 使菌體以0. 21T1的比生長速率進行生長，控制溫度30°C，溶氧維持在30%，當菌體0D_達到15，採用一次性添加的方式，加入0. 75%甘氨酸(質量體積分數)，流加質量濃度為25% 的氨水控制pH 7. 0 ;誘導培養階段當菌體0D_達到50時，將溫度降為30°C，溶氧維持在30%，連續補加0. 3g L-1 IT1乳糖,每5h降低10%的乳糖流速,通過補加濃度為200g/L乳糖溶液， 使發酵液剩餘乳糖濃度控制在4-6g/L。同時溶氧控制在20-30%，控制pH 7.0±0. 5，誘導 20小時左右。發酵培養結束後，離心獲得菌體和胞外上清液，菌體經過超聲破碎後離心，得到超聲破碎上清和超聲破碎沉澱。超聲破碎沉澱用0. IM pH4. 5醋酸buffer懸浮。然後分別測定胞外上清液、超聲破碎上清和超聲破碎沉澱懸浮液的澱粉脫支酶活力。胞外上清酶活為 15. 5U/mL，超聲破碎上清酶活為98U/mL，超聲破碎沉澱懸浮液酶活為393U/mL。結果表明，胞外酶活較低，而超聲破碎沉澱中含有大量具有澱粉脫支酶活性的重組蛋白，經過分析發現這些蛋白是具有澱粉脫支酶活性的蛋白聚集體。實施例2具體過程如下以本實驗室構建的重組大腸桿菌ompA-pulA/pET24a/BL21(DE3) 為生產菌種。I、種子培養將_80°C甘油管保存的菌種接入種子培養基(工業級蛋白腖10g/L， 工業級酵母粉5g/L，NaCL 10g/L，100mg/L氨苄青黴素，pH 7. 10)中，使用恆溫搖床進行培養轉速200rpm/min，溫度37°C，培養8小時。2、發酵產酶分批發酵階段將種子液以8%接種量接入發酵培養基(甘油8g/L，蛋白腖lg/L， 酵母粉 2g/L，KH2PO4 13. 5g/L, (NH4) 2HP044g/L，檸檬酸 I. 7g/L，MgSO4 0. 68g/L，微量元素液 10mL/L,氨苄青黴素100mg/L)，通過控制攪拌轉速和通風量使溶氧維持30 %，控制溫度為 30°C，流加質量濃度為25%的氨水控制pH 7. 0，培養時間6個小時；
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補料發酵階段待溶氧上升至80-100%，批式培養結束後，以指數流加的方式補加以甘油為碳源的補料液(甘油500g/L，MgSO4 *7H20 20g/L，蛋白腖15g/L，酵母粉30g/L)， 使菌體以021T1的比生長速率進行生長，控制溫度30°C，溶氧維持在30%，當菌體0D_達到 15，採用一次性添加的方式，加入0. 75%甘氨酸(質量體積分數)，流加質量濃度為25%的氨水控制pH 7. 0 ；誘導培養階段當菌體0D_達到50時，將溫度降為25°C，溶氧維持在30%，連續補加0. 3g L-1 IT1乳糖,每5h降低10%的乳糖流速,通過補加濃度為200g/L乳糖溶液， 使發酵液剩餘乳糖濃度控制在4-6g/L。同時溶氧控制在20-30%，控制pH 7.0±0. 5，誘導 15小時左右，添加0. 5%濃度的Tween 80，繼續發酵5小時。發酵培養結束後，離心獲得菌體和胞外上清液，菌體經過超聲破碎後離心，得到超聲破碎上清和超聲破碎沉澱，沉澱用0. IM pH4. 5醋酸buffer懸浮。分別測定胞外上清液、 超聲破碎上清和超聲破碎沉澱懸浮液的澱粉脫支酶活力。胞外上清酶活為386U/mL，超聲破碎上清酶活為82U/mL，超聲破碎沉澱懸浮液酶活為51U/mL。結果表明，TweenSO的添加促進了胞內活性蛋白聚集體的解聚，提高了澱粉脫支酶的胞外分泌效率。
權利要求
1.一種通過促進活性蛋白聚集體解聚提高澱粉脫支酶產量的方法，其特徵在於以含有重組澱粉脫支酶編碼基因的大腸桿菌為生產菌株，發酵工藝如下將活化後的種子培養液接入發酵培養基中，通過控制攪拌轉速和通風量使溶氧維持 20-30%，控制溫度為25-37 °C，流加氨水控制pH 7. 0±0. 5，培養5_6小時；待溶氧上升至80-100%，以指數流加的方式補加補料液使溶氧維持在20-30%，溫度維持在25-37°C，流加氨水控制pH 7. 0±0. 5，當菌體0D600達到15-30時補加0. 75-1. 5% (m/V)的甘氨酸；繼續培養至菌體吸光度0D600達到45-60時，降溫至23_30°C，通過補加乳糖溶液，使發酵液剩餘乳糖濃度控制在4-6g/L ;同時溶氧控制在20-30%，控制pH 7. 0±0. 5，誘導5_20 小時，添加吐溫80後再繼續發酵1-10小時。
2.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於所述Tween80的添加量為l_10g/L。
3.根據權利要求2所述的方法，其特在在於菌體吸光度0D600達到45-60時，降溫至 25。。。
4.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於種子活化用培養基的組成為工業級蛋白腖 10g/L，工業級酵母粉 5g/L，NaCL 10g/L, pH 7. 10。
5.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於所述發酵培養基的組成為甘油6g/L，工業級蛋白腖 12g/L，工業級酵母粉 24g/L，KH2P04 2. 31g/L，K2HP04 3H20 16. 43g/L，微量元素液 10mL/Lo
6.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述種子培養基中還含有氨苄青黴素，濃度為 100mg/L。
7.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述發酵培養基中還含有氨苄青黴素濃度為 100mg/L。
全文摘要
本發明公開了一種通過促進活性蛋白聚集體解聚提高澱粉脫支酶產量的方法，屬於發酵工程技術領域。本發明以重組大腸桿菌pulB/pET20b(+)/BL21(DE3)為生產菌株，在工業級發酵培養基中連續流加甘油進行分批補料發酵，發酵後期通過添加Tween 80來促進活性蛋白聚集體解聚提高酶的分泌，發酵35小時，胞外酶活可達386U/mL。採取本策略進行發酵實現了酶的高效胞外表達，大幅提高了生產強度。由於酶分泌到培養基中，菌體經過簡單的過濾就可得到酶液，工藝簡單易行，減少了後續提取成本，適合工業化生產。
文檔編號C12R1/19GK102533701SQ201210035298
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月16日 優先權日2012年2月16日
發明者吳敬, 段緒果, 陳堅, 陳晟 申請人:江南大學