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蚓激酶乾粉的製備方法

2023-09-16 02:51:30 1

專利名稱:蚓激酶乾粉的製備方法
技術領域:
本發明涉及一種蚓激酶乾粉的製備方法。
背景技術:
蚓激酶乾粉是一種以活蚯蚓為原料的生物藥品,其為微黃色粉末。本藥品為多組分酶製劑,包含纖維蛋白溶酶(plasmin)和纖維蛋白溶酶原激活劑(plasminogenActivator)成分,具有直接溶解纖維蛋白和激活酶原間接溶解蛋白的作用。適用於治療心、腦血管栓塞性疾病以及預防纖維蛋白原增高和血小板聚集率增高的疾病。臨床試驗證明,本藥的膠囊劑對缺血性腦血管病、中風癱瘓肢體及語言障礙的恢復效果顯著,是一種安全的纖溶藥物。治療後病人纖維蛋白原明顯下降至正常水平,優球蛋白溶解時間明顯縮短,全血粘度明顯降低,並緩解病人血小板聚集功能的增強,對老年人患心、腦血管病具有明顯的預防作用。
目前用來製備蚓激酶乾粉的方法,都是以活蚯蚓為原料,大多是採用將蚯蚓除汙後,在太陽下脫水,然後直接磨成粉末使用,這種方法雖然簡單,但是除汙過程會使得藥效部分流失,而且得到的蚯蚓乾粉易黴爛、變質。申請號為88106168.9的專利公開了一種生產幹蚯蚓粉的方法,該方法使用水或略帶酸性的水溶液來將活蚯蚓除汙,然後將此活蚯蚓溼磨,凍幹,然後在80℃,低於10mmHg的真空下乾燥,製成幹蚯蚓粉。此方法的缺陷在於用此方法製得的幹蚯蚓粉有效組分含量低,雜質較多,易引起一些與冶療目的不一致的副作用。

發明內容
本發明的目的在於克服已有技術製備的蚓激酶乾粉中有效組分含量低,雜質較多的缺陷,從而提供一種可以使得產品蚓激酶乾粉中有效組分含量高、質量易控、且易於大規模工業生產的蚓激酶乾粉的製備方法。
本發明的目的是通過如下的技術方案實現的本發明提供一種蚓激酶乾粉的製備方法,包括如下步驟1)蚯蚓清洗將活蚯蚓用水清洗後,按每公斤蚯蚓加入0.1~0.3公斤糖,或0.2~0.4公斤氯化鈉,在室溫下攪拌均勻,靜置20~40分鐘,刺激蚯蚓將其消化道內的分泌物吐盡,然後用30~50℃的溫水將蚯蚓身上的糖或氯化鈉及汙物洗去;2)製漿加入蚯蚓體積的1~8倍的水,用珠磨、膠體磨機或高壓勻漿機將經步驟1)清洗過的蚯蚓進行細胞破碎,製成勻漿;3)除渣將步驟2)得到的勻漿通過過濾或離心除去其中的粗渣;4)澄清經步驟3)除渣後的勻漿液,採用高速離心機或微孔膜過濾器處理,得到澄清液;5)分離採用陰離子交換層析柱或親和層析柱分離步驟4)得到的蚯蚓澄清液,用0.01~0.8M的醋酸鹽溶液、磷酸鹽溶液及0.01~1.8M的氯化鈉溶液洗脫,收集活性峰部分的層析流出液;6)濃縮脫鹽將步驟5)收集的層析液過濾以除去無機鹽和小分子物質,脫去大部分水,使蛋白濃度達到20g/L,且濃縮液電導率≤0.15×103μs/cm時結束脫鹽,得到除鹽濃縮液;7)澄清過濾採用孔徑為0.45~2μm的深層微孔膜或摺疊式膜微孔膜過濾裝置,濾除步驟6)得到的除鹽濃縮液中的懸浮顆粒,得到澄清液;8)除菌採用0.22μm的除菌濾膜過濾裝置及輻照裝置處理步驟7)的澄清液,除去菌體;9)乾燥在無菌條件下將步驟8)除菌後的澄清液於-30~-40℃下冷凍8~12小時;然後在0.2mmHg的真空度下,升溫至25~30℃,乾燥10小時;繼續升溫至36~38℃,真空乾燥14~15小時,得到蚓激酶乾粉。
所述步驟1)的糖包括砂糖、棉白糖、冰糖。
所述步驟3)的過濾是採用濾網孔徑為5~20mm的不鏽鋼過濾器過濾。
所述步驟5)的陰離子交換層析柱為DEAE-離子交換層析柱。
所述步驟5)的親和層析柱為DEAE Affi Gel Blue三嗪染料親和層析柱。
所述步驟5)的醋酸鹽包括醋酸鈉、醋酸鉀。
所述步驟5)的磷酸鹽溶液包括磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀。
所述步驟6)的過濾是採用標準截流分子量為0.5~50K的平板膜、卷式膜或中空纖維超濾裝置進行的。
所述的步驟9)也可以是在無菌條件下將步驟8)除菌後的澄清液用泵打入噴霧乾燥機內,經壓縮空氣霧化後在150~250℃熱風中脫水,得到蚓激酶乾粉。
本發明提供的方法與與已有技術相比,其優點在於本發明採用高速離心機及微孔膜分離技術,可以有效去除勻漿液中的懸浮顆粒物及脂類,然後通過離子交換層析和親和層析分離技術,可以有效去除雜蛋白、核酸等雜質,因而所得蚓激酶乾粉純度高,減少了其它方法因所產蚯蚓乾粉雜質含量高而引起的其它問題;而且本發明提供的方法易於工業放大。
具體實施例方式
實施例1、1)蚯蚓清洗將10公斤活蚯蚓用水清洗後,按每公斤蚯蚓加入0.2公斤棉白糖,在室溫下攪拌均勻,靜置40分鐘,剌激蚯蚓將其消化道內的分泌物吐盡,然後用30℃的溫水將蚯蚓身上的糖及汙物洗去;2)製漿加入蚯蚓體積的1倍的水,用高壓勻漿機將經步驟1)清洗過的蚯蚓進行細胞破碎30分鐘,製成勻漿;3)除渣將步驟2)得到的勻漿用濾網孔徑為5mm的不鏽鋼過濾器過濾,除去勻漿中的粗渣;4)澄清經步驟3)除渣後的勻漿液,採用高速離心機處理2小時,得到澄清液;5)分離採用DEAE-離子交換層析柱分離步驟4)得到的蚯蚓澄清液,用0.01M的醋酸鈉溶液洗脫,收集活性峰部分(第2個峰)的層析流出液;6)濃縮脫鹽採用標準截流分子量為0.5K的平板膜超濾裝置過濾步驟5)收集的層析液,濾除無機鹽和小分子物質,脫去大部分水,使蛋白濃度達到20g/L,濃縮液電導率≤0.15×103μs/cm時結束脫鹽,得到除鹽濃縮液;7)澄清過濾採用孔徑為2μm的深層微孔膜過濾裝置,濾除步驟6)得到的除鹽濃縮液中的懸浮顆粒,得到澄清液;
8)除菌採用0.22μm的除菌濾膜過濾裝置及輻照裝置輻照8小時處理步驟7)的澄清液,除去菌體;9)乾燥在無菌條件下將步驟8)除菌後的澄清液於-30℃下冷凍8小時;然後在0.2mmHg的真空度下,升溫至25℃,乾燥10小時;繼續升溫至36℃,真空乾燥15小時,得到65g蚓激酶乾粉,其含水量為7.5%、蛋白質含量為60%、酶活力為15000U/mg。
實施例2、1)蚯蚓清洗將10公斤活蚯蚓用水清洗後,按每公斤蚯蚓氯化鈉0.3公斤的比例加入氯化鈉,在室溫下攪拌均勻後靜置40分鐘,刺激蚯蚓將其消化道內的分泌物吐盡,然後用40℃的溫水將蚯蚓身上的氯化鈉及汙物洗去;2)製漿加入蚯蚓體積的8倍的水,用珠磨將經步驟1)清洗過的蚯蚓進行細胞破碎,製成勻漿;3)除渣將步驟2)得到的勻漿用離心機除去勻漿中的粗渣;4)澄清經步驟3)除渣後的勻漿液,採用高速離心機處理2小時,得到澄清液;5)分離採用DEAE-離子交換層析柱分離步驟4)得到的蚯蚓澄清液,用0.01M的醋酸鉀溶液洗脫,收集活性峰部分(第2個峰)的層析流出液;6)濃縮脫鹽採用標準截流分子量為50K的中空纖維膜超濾裝置過濾步驟5)收集的層析液,濾除無機鹽和小分子物質,脫去大部分水,使蛋白濃度達到20g/L,濃縮液電導率≤0.15×103μs/cm時結束脫鹽,得到除鹽濃縮液;7)澄清過濾採用孔徑為0.45μm摺疊式微孔濾膜過濾器,濾除步驟6)得到的除鹽濃縮液中的懸浮顆粒,得到澄清液;8)除菌採用0.22μm的除菌濾膜過濾裝置及輻照裝置輻照8小時處理步驟7)的澄清液,除去菌體;9)乾燥在無菌條件下將步驟8)除菌後的澄清液於-40℃下冷凍12小時;然後在0.2mmHg的真空度下,升溫至30℃,乾燥10小時;繼續升溫至38℃,真空乾燥14小時,得到65g蚓激酶乾粉,其含水量為7.6%、蛋白質含量為64%、酶活力為16000U/mg。
實施例3、1)蚯蚓清洗將10公斤活蚯蚓用水清洗後,按每公斤蚯蚓加入0.3公斤砂糖,在室溫下攪拌均勻,靜置20分鐘,刺激蚯蚓將其消化道內的分泌物吐盡,然後用50℃的溫水將蚯蚓身上的糖及汙物洗去;2)製漿加入蚯蚓體積的6倍的水,用膠體磨機將經步驟1)清洗過的蚯蚓進行細胞破碎30分鐘,製成勻漿;3)除渣將步驟2)得到的勻漿用濾網孔徑為20mm的不鏽鋼過濾器過濾,除去勻漿中的粗渣;4)澄清經步驟3)除渣後的勻漿液,採用微孔膜過濾器處理2小時,得到澄清液;5)分離採用DEAE Affi Gel Blue三嗪染料親和層析柱分離步驟4)得到的蚯蚓澄清液,用0.5M的醋酸鈉溶液洗脫,收集活性峰部分(第2個峰)的層析流出液;6)濃縮脫鹽採用標準截流分子量為20K的卷式膜超濾裝置過濾步驟5)收集的層析液,濾除無機鹽和小分子物質,脫去大部分水,使蛋白濃度達到20g/L,濃縮液電導率≤0.15×103μs/cm時結束脫鹽,得到除鹽濃縮液;7)澄清過濾採用孔徑為1μm的深層微孔膜過濾裝置,濾除步驟6)得到的除鹽濃縮液中的懸浮顆粒,得到澄清液;8)除菌採用0.22μm的除菌濾膜過濾裝置及輻照裝置輻照8小時處理步驟7)的澄清液,除去菌體;9)乾燥在無菌條件下將步驟8)除菌後的澄清液於-35℃下冷凍10小時;然後在0.2mmHg的真空度下,升溫至28℃,乾燥10小時;繼續升溫至37℃,真空乾燥15小時,得到65g蚓激酶乾粉,其含水量為7.3%、蛋白質含量為65%、酶活力為17000U/mg。
實施例4、1)蚯蚓清洗將10公斤活蚯蚓用水清洗後,按每公斤蚯蚓加入0.1公斤冰糖,在室溫下攪拌均勻,靜置30分鐘,刺激蚯蚓將其消化道內的分泌物吐盡,然後用40℃的溫水將蚯蚓身上的糖及汙物洗去;2)製漿加入蚯蚓體積的5倍的水,用膠體磨機將經步驟1)清洗過的蚯蚓進行細胞破碎30分鐘,製成勻漿;3)除渣將步驟2)得到的勻漿用濾網孔徑為5mm的不鏽鋼過濾器過濾,除去勻漿中的粗渣;4)澄清經步驟3)除渣後的勻漿液,採用微孔膜過濾器處理2小時,得到澄清液;5)分離採用DEAE Affi Gel Blue三嗪染料親和層析柱分離步驟4)得到的蚯蚓澄清液,用0.8M的磷酸氫二鈉溶液溶液洗脫,收集活性峰部分(第2個峰)的層析流出液;6)濃縮脫鹽採用標準截流分子量為20K的平板膜超濾裝置過濾步驟5)收集的層析液,濾除無機鹽和小分子物質,脫去大部分水,使蛋白濃度達到20g/L,濃縮液電導率≤0.15×103μs/cm時結束脫鹽,得到除鹽濃縮液;7)澄清過濾採用孔徑為1μm的深層微孔膜過濾裝置,濾除步驟6)得到的除鹽濃縮液中的懸浮顆粒,得到澄清液;8)除菌採用0.22μm的除菌濾膜過濾裝置及輻照裝置輻照8小時處理步驟7)的澄清液,除去菌體;9)乾燥在無菌條件下將步驟8)除菌後的澄清液用泵打入噴霧乾燥機內,經壓縮空氣霧化後在150℃的熱風中脫水,得到65g蚓激酶乾粉,其含水量為7.5%、蛋白質含量為64%、酶活力為16500U/mg。
實施例5、1)蚯蚓清洗將10公斤活蚯蚓用水清洗後,按每公斤蚯蚓氯化鈉0.4公斤的比例加入氯化鈉,在室溫下攪拌均勻後靜置20分鐘,刺激蚯蚓將其消化道內的分泌物吐盡,然後用50℃的溫水將蚯蚓身上的氯化鈉及汙物洗去;2)製漿加入蚯蚓體積的4倍的水,用高壓勻漿機將經步驟1)清洗過的蚯蚓進行細胞破碎,製成勻漿;3)除渣將步驟2)得到的勻漿用離心機除去勻漿中的粗渣;4)澄清經步驟3)除渣後的勻漿液,採用高速離心機處理2小時,得到澄清液;5)分離採用DEAE Affi Gel Blue三嗪染料親和層析柱分離步驟4)得到的蚯蚓澄清液,用0.8M的氯化鈉溶液洗脫,收集活性峰部分(第2個峰)的層析流出液;6)濃縮脫鹽採用標準截流分子量為20K的中空纖維超濾裝置過濾步驟5)收集的層析液,濾除無機鹽和小分子物質,脫去大部分水,使蛋白濃度達到20g/L,濃縮液電導率≤0.15×103μs/cm時結束脫鹽,得到除鹽濃縮液;7)澄清過濾採用孔徑為1.2μm的深層微孔膜過濾裝置,濾除步驟6)得到的除鹽濃縮液中的懸浮顆粒,得到澄清液;8)除菌採用0.22μm的除菌濾膜過濾裝置及輻照裝置輻照8小時處理步驟7)的澄清液,除去菌體;9)乾燥在無菌條件下將步驟8)除菌後的澄清液用泵打入噴霧乾燥機內,經壓縮空氣霧化後在250℃的熱風中脫水,得到66g蚓激酶乾粉,其含水量為7.1%、蛋白質含量為63%、酶活力為16500U/mg。
實施例6、1)蚯蚓清洗將10公斤活蚯蚓用水清洗後,按每公斤蚯蚓氯化鈉0.2公斤的比例加入氯化鈉,在室溫下攪拌均勻後靜置40分鐘,刺激蚯蚓將其消化道內的分泌物吐盡,然後用30℃的溫水將蚯蚓身上的氯化鈉及汙物洗去;2)製漿加入蚯蚓體積的1倍的水,用膠體磨機將經步驟1)清洗過的蚯蚓進行細胞破碎,製成勻漿;3)除渣將步驟2)得到的勻漿用離心機除去勻漿中的粗渣;4)澄清經步驟3)除渣後的勻漿液,採用高速離心機處理2小時,得到澄清液;5)分離採用DEAE離子交換層析柱分離步驟4)得到的蚯蚓澄清液,用0.01M的氯化鈉溶液洗脫,收集活性峰部分(第2個峰)的層析流出液;6)濃縮脫鹽採用標準截流分子量為15K的卷式膜超濾裝置過濾步驟5)收集的層析液,濾除無機鹽和小分子物質,脫去大部分水,使蛋白濃度達到20g/L,濃縮液電導率≤0.15×103μs/cm時結束脫鹽,得到除鹽濃縮液;7)澄清過濾採用孔徑為0.8μm的摺疊式膜微孔膜過濾裝置,濾除步驟6)得到的除鹽濃縮液中的懸浮顆粒,得到澄清液;8)除菌採用0.22μm的除菌濾膜過濾裝置及輻照裝置輻照8小時處理步驟7)的澄清液,除去菌體;9)乾燥在無菌條件下將步驟8)除菌後的澄清液用泵打入噴霧乾燥機內,經壓縮空氣霧化後在200℃的熱風中脫水,得到62g蚓激酶乾粉,其含水量為7.0%、蛋白質含量為66%、酶活力為16800U/mg。
權利要求
1.一種蚓激酶乾粉的製備方法,包括如下步驟1)蚯蚓清洗將活蚯蚓用水清洗後,按每公斤蚯蚓加入0.1~0.3公斤糖,或0.2~0.4公斤氯化鈉,在室溫下攪拌均勻,靜置20~40分鐘,然後用30~50℃的溫水將蚯蚓身上的糖或氯化鈉及汙物洗去;2)製漿加入蚯蚓體積的1~8倍的水,用珠磨、膠體磨機或高壓勻漿機將經步驟1)清洗過的蚯蚓進行細胞破碎,製成勻漿;3)除渣將步驟2)得到的勻漿通過過濾或離心除去其中的粗渣;4)澄清經步驟3)除渣後的勻漿液,採用高速離心機或微孔膜過濾器處理,得到澄清液;5)分離採用陰離子交換層析柱或親和層析柱分離步驟4)得到的蚯蚓澄清液,用0.01~0.8M的醋酸鹽溶液、磷酸鹽溶液及0.01~1.8M的氯化鈉溶液洗脫,收集活性峰部分的層析流出液;6)濃縮脫鹽將步驟5)收集的層析液過濾以除去無機鹽和小分子物質,脫去大部分水,使蛋白濃度達到20g/L,且濃縮液電導率≤0.15×103μs/cm時結束脫鹽,得到除鹽濃縮液;7)澄清過濾採用孔徑為0.45~2μm的深層微孔膜或摺疊式膜微孔膜過濾裝置,濾除步驟6)得到的除鹽濃縮液中的懸浮顆粒,得到澄清液;8)除菌採用0.22μm的除菌濾膜過濾裝置及輻照裝置處理步驟7)的澄清液,除去菌體;9)乾燥在無菌條件下將步驟8)除菌後的澄清液於-30~-40℃下冷凍8~12小時;然後在0.2mmHg的真空度下,升溫至25~30℃,乾燥10小時;繼續升溫至36~38℃,真空乾燥14~15小時,得到蚓激酶乾粉。
2.如權利要求1所述的蚓激酶乾粉的製備方法,其特徵在於,所述步驟1)的糖包括砂糖、棉白糖、冰糖。
3.如權利要求1所述的蚓激酶乾粉的製備方法,其特徵在於,所述步驟3)的過濾是採用濾網孔徑為5~20mm的不鏽鋼過濾器過濾。
4.如權利要求1所述的蚓激酶乾粉的製備方法,其特徵在於,所述步驟5)的陰離子交換層析柱為DEAE-離子交換層析柱。
5.如權利要求1所述的蚓激酶乾粉的製備方法,其特徵在於,所述步驟5)的親和層析柱為DEAE Affi Gel Blue三嗪染料親和層析柱。
6.如權利要求1所述的蚓激酶乾粉的製備方法,其特徵在於,所述步驟5)的醋酸鹽包括醋酸鈉、醋酸鉀,磷酸鹽溶液包括磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀。
7.如權利要求1所述的蚓激酶乾粉的製備方法,其特徵在於,所述步驟6)的過濾是採用標準截流分子量為0.5~50K的平板膜、卷式膜或中空纖維超濾裝置進行的。
8.如權利要求1所述的蚓激酶乾粉的製備方法,其特徵在於,所述的步驟9)是在無菌條件下將步驟8)除菌後的澄清液用泵打入噴霧乾燥機內,經壓縮空氣霧化後在150~250℃熱風中脫水,得到蚓激酶乾粉。
全文摘要
本發明涉及一種蚓激酶乾粉的製備方法,該方法包括如下步驟將活蚯蚓用水清洗後,置於糖或氯化鈉中,在室溫下靜置,剌激蚯蚓將其消化道內的分泌物吐盡;然後加入蚯蚓體積的1~8倍的水,進行細胞破碎,製成的勻漿經過除渣、澄清處理後,採用陰離子交換層析柱或親和層析柱分離,收集活性峰部分的流出液,濃縮脫鹽後再過濾、除菌;將得到的澄清液於-30~-40℃下冷凍;然後在真空下乾燥,得到蚓激酶乾粉,或是在無菌條件下將澄清液於噴霧乾燥機內,經壓縮空氣霧化後脫水,得到蚓激酶乾粉。該方法得到的蚓激酶乾粉中有效組分含量高、質量易控、且易於大規模工業生產。
文檔編號A61P9/10GK1657098SQ20041003918
公開日2005年8月24日 申請日期2004年2月20日 優先權日2004年2月20日
發明者萬興中 申請人:北京百奧藥業有限責任公司

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