抗日本血吸蟲病天然分子疫苗特異性單鏈抗體的製作方法

2023-08-12 15:38:56

專利名稱：：抗日本血吸蟲病天然分子疫苗特異性單鏈抗體的製作方法
技術領域：
：-本發明涉及基因工程抗體領域，具體涉及1種特異性抗日本血吸蟲病單鏈抗體，此種單鏈抗體可經或不經修飾(加上免疫毒素或抗血吸蟲病藥物)直接用做動物被動試驗，觀察血吸蟲病治療效果；也可以運用此種單鏈抗體篩選日本血吸蟲cDNA文庫，獲得編碼抗原分子SIEA26-28kDa的核苷酸序列，為大批量地生產抗日本血吸蟲病疫苗提供了可能性。
背景技術：
：血吸蟲病仍然在許多是一種嚴重危害人類身體健康和生命安全、阻礙疫區經濟發展和社會進步的人獸共患病。Chitsulo等報導，全世界74個國家，6億人受感染威脅，2億人被感染，其中1.2億人出現了症狀，2000萬人被嚴重感染。血吸蟲病病情的控制至今仍然是世界上急待解決的一個嚴重的公共衛生問題。過去的幾年中，在許多國家，尤其在中國。日本血吸蟲病的復發時有發生。雖然吡喹酮是治療血吸蟲病的首選藥物，但是很高的再感染率需要反覆的治療，從而增加了藥物抗性的可能。將化療與疫苗聯合運用於血吸蟲病的治療，為長遠有效地控制日本血吸蟲病的傳播帶來了希望。成熟血吸蟲卵是血吸蟲病的主要致病因素和傳播血吸蟲病的唯一因子。如採用免疫方法使雌蟲產卵量降低或蟲卵發育受阻，從而減少蟲卵的排出，對於控制血吸蟲病的發病及傳播具有重要意義。因此日本血吸蟲病的疫苗研究主要集中於抗生殖和抗卵胚免疫。十多年來，本課題組一直致力於抗日本血吸蟲雌蟲生殖免疫和抗卵胚疫苗的研究。研究結果表明，日本血吸蟲未成熟卵可溶性抗原(SIEA)具有明顯的抗蟲卵胚胎發育、抗雌蟲生殖產卵的作用，來源於SIEA的26-28kDa天然分子抗原(SIEA26-28kDa)是誘導宿主產生抗血吸蟲病保護性免疫力的主要組分。受衛生部委託，我國血吸蟲疫苗研究項目協調專家組對總理基金資助的疫苗課題進行了雙盲法、異地重複實驗的統一考核驗收工作。參加考核的共有16種日本血吸蟲疫苗。由本室研製的來源於未成熟蟲卵的亞單位分子疫苗(l號疫苗主要組分為SIEA26-28kDa)獲得了最佳的動物保護效果，其減卵率高達89.3%，減雌蟲合抱率達53.9%，且免疫組肝臟呈正常紅色，僅少許蟲卵結節，損害明顯減輕。諸多實驗結果表明，SIEA26-28kDa可作為一種抗卵胚發育及抗雌蟲生殖的候選抗原分子。.SIEA26-28kDa天然分子S具有很好的疫苗應用前景，但是要應用於現場，存在抗原需求量大、材料來源困難、製備工藝複雜等問題，從而限制了其廣泛應用。針對SIEA26-28kDa天然分子的特異性單克隆抗體不僅可以做為治療手段，而且利用其做為探針篩選日本血吸蟲cDNA文庫獲得編碼S正A26-28kDa分子相對應的基因序列，從而為日本血吸蟲基因疫苗的研究奠定了基礎。但是，製備單克隆抗體需要動物，專門的細胞培養設備和大量的時間和精力。而當應用於人體治療時，做為異種蛋白，鼠源性的單克隆抗體能引發人抗鼠反應，從IJ5降低或消除治療效果，甚至引發過敏反應或超敏反應。噬菌體單鏈抗體技術，從抗體角度解決了上述難題。PCR技術可擴增出無恆定區，由重鏈可變區與輕鏈可變區組成的單鏈抗體(scFv)，在保持與抗原結合特異性的同時，單鏈抗體還具有分子量小、穿透力好、半衰期短、免疫原性低、易於基因操作和基因工程大量生產、以及其它效應(如與毒素、酶等偶聯製備成雙功能抗體)等特點，使單鏈抗體在診斷和治療具有廣泛的應用前景。噬菌體表面展示技術把單鏈抗體(scFv)表達在噬菌體表面上，使表型和基因型聯合在一起，把識別抗原的能力和進行再擴增的能力結合在一起，使得抗體的篩選變得方便、快捷。scFv為日本血吸蟲病的診斷、預防及治療提供了更經濟的途徑。將單鏈抗體應用於血吸蟲病研究領域具有重要的意義。本發明的目的在於利用抗體高度特異性的特點，研製出抗SIEA26-28kDa單鏈抗體。通過抗體與SIEA26-28kDa的特異性結合，封閉阻斷相應抗原，造成胞內該抗原表型剔除，即可達到控制蟲卵卵胚發育^1雌蟲生殖的作用，從而達到減輕血吸蟲致病的作用。同樣，運用高度特異性的抗SIEA26-28kDa單鏈抗體做為探針篩選日本血吸蟲cDNA文庫即可獲得相對應的編碼基因，從而為日本血吸蟲基因工程疫苗的研製奠定了基礎。
發明內容本發明利用生物工程技術，研製出抗S正A26-28kDa基因工程抗體。所採用的技術方案如下以S正A免疫Balb/C鼠脾臟總RNA為材料，設計H鏈和L鏈可變區簡併引物，經RT-PCR擴增擴增出全套Ig的VH和VL基因，VH和VL基因通過具有一定彈性及蛋白酶抗性的多肽Linker(Gly4Ser)3相連，將連接好的VH和VL片段重組入噬菌粒載體pCANTAB5E，將含有單鏈抗體基因的重組質粒電轉化入宿主菌TG1後，在輔助噬菌體M13K07的幫助下與噬菌體外殼蛋白m形成融合蛋白，在噬菌體表面表達重組噬菌體單鏈抗體(scFv)。採用免疫親和篩選方法，將SDS-PAGE分離純化並經電洗脫後的SIEA26-28kDa包被於NC膜，經四輪吸附-再感染-援救後，從第四輪富集篩選後的培養皿中隨機挑取個單菌落，進行鑑定，挑取陽性克隆經IPTG誘導生成分子量約為32kDa的可溶性單鏈抗體，經Westernblot證實了S正A26-28kDa單鏈抗體與S正A的親和活性及特異性。特異」性抗S正A26-28kDascFv的獲得為日本血吸蟲病的治療以及日本血吸蟲疫苗的製備等奠定了基礎，S正A單鏈抗體庫的構建也為研究其它血吸蟲候選疫苗分子提供了便利。下面對本發明抗日本血吸蟲病有效天然分子疫苗S正A26-28kDa特異性單鏈抗體的實施例進行詳細說明具體實施例方式1、動物免疫及總RNA的提取將S正A與等體積弗氏完全佐劑充分混勻，每鼠腹腔注射100ugS正A。隔兩周後，改用弗氏不完全佐劑與等體積S正A充分混勻，隔兩周加強一次，共加強四次。未次免疫後第七天，取小鼠^靜脈血ELISA法測定效價。取效價達IO，OOO以上的小鼠脾臟，Trizol試劑提取脾臟總RNA。2、cDNA第一鏈的合成及全套VH和VL基因片段的擴增按照MBI公司RT試劑盒說明書以小鼠脾臟RNA為模板，oligo(dt)18為引物，M-mulv反轉錄酶反轉錄合:成-cDNA第一鏈。然後再以cDNA為模板，分別用VH和VL上下遊引物，擴增金套VH和VL基因。反應條件為94。C預變性3min;94°C，30sec，65°C，45sec，72°C，45sec;共30個循環。然後72°C延伸7min。瓊脂糖凝膠電泳檢跳PCR產物，並用Takara膠回收試劑盒回收VH和VL目的片段。引物如下VH(back):5，TTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG-3'-VH(for):5，-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTGCC-3'VL(back):5，-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGAGGCTCGGACATTGAGCTCACCCAGTCTC-3'VL(for):5，-GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTBAKYTCCARCTTKGTSCC-3'其中B=T，C，GK=T，GM=A，CR=A,GS=GCW=A，TY=C，T引物VH(Back)含SfiI酶切位點，VH(For)含(Gly4Ser)3連接肽部分序列；VL(For)含NotI酶切位點，VL(Back)含(Gly4Ser)3.連接肽部分序列，其中21個鹼基與VH(For)部分序列相重疊。(三)重疊PCR法拼接擴增scFv片段以等量(50ng)的VH和VL膠回收產物互為模板和引物，重疊PCR法擴增將VH和VL片段隨機拼接成scFv，反應條件為94。C預變性3min;94°C，30sec，65°C，45sec，72°C，45sec;共7個循環，然後72°C，3min。反應完畢後，50ul反應體系中補加VH(back)和VL(for)各lul，lOXbuffer0.5ul，在ddH20為2.5ul，使整個反應體系為55ul，PCR擴增，條件為94。C預變性3min;94°C，30sec，65°C，45sec，72。C，45sec;共30個循環。然後72°C延伸7min。凝膠電泳檢測PCR.產物，並用Takara膠回收試劑盒回收scFv目的片段。將回收純化的scFv為模板，VH(back)和VL(for)為引物，按照相同的PCR條件大量擴增，膠回收純化得到scFv。-(五)單鏈抗體庫的構建，將純化的scFv片段與pCANTAB5E噬菌體載體用Sfil、Notl雙酶切後純化，並用T4,酶16"C連接16小時。連接產物電轉化至於感受態TG1細胞，電轉化後立即加入2XYT-AG培養液中，於37T,250rpm培養l小時。在琥珀終止密.碼子抑制表型的大腸桿菌TG1中，E-tag與g3基因之間琥珀終止密碼子發生通讀，表達g3-scFv-Etag融合蛋白。取少量菌液，用2XYT培養液以10倍梯度稀釋後，分別取100ul塗布SOBAG平板，30。C培養過夜，計算菌落數，測定庫容。剩下的菌液以100ul每板塗布SOBAG平板，30。C培養過夜，2XYT洗下菌落，加入甘油使終濃度為20%，混勻後於-70。C低溫冰箱保存。(六)單鏈抗體庫重組率的檢測及多樣性的鑑定8隨機挑取SOBAG平板上的菌落10個，分別加入5riU的2XYT培養基中，37°C，250rpm培養過夜，鹼裂解法提取質粒，以質粒為模板，以VH(back)和VL(for)為模板，PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。檢測是否含有插入子，算出實際庫容量。用BstNI酶切，凝膠電泳鑑定酶切產物，觀察每個質粒酶切片段的差異來確定單鏈抗體庫的多樣性。(七)單鏈抗體基因的表面呈現取適量單鏈抗體庫於2xYT-AG培養基中培養至對數生長期，加入感染複數為20的M13K07超感染，離心棄上清，2XYT-AK重懸沉澱，37°C，250rpm培養過夜。離心取上清，即為重組噬菌體表面展示抗體庫,加入l/5體積的PEG/NaCl沉澱上清中的重組噬菌體，2xYT培養基懸浮沉澱。(八)篩選將SDS-PAGE分離純化並經電洗脫後的S正A26-28kDa以20ug/ml的濃度包被於硝酸纖維膜上，經5MMPBS(含5W脫脂奶粉的PBS)封閉後，加入10。CFU預先用2。/。MPBS室溫封閉30分鐘的重組噬菌體，37°3正八單鏈抗體庫的庫容量為2.27又109，運用VH(back)，VL(for)引物從隨機挑選的IO個菌落均擴增出預期大小約7S0bp的片段，證實重組率為100%,見圖3，1-10:為1至10號菌PCR產物，M:DNAMarker。小量製備10個菌落噬菌粒DNA，用內切酶BstNI酶切，1.5%瓊脂糖凝膠電泳可見酶切圖譜呈多樣性，證實S正A單鏈抗體庫多樣性好，見圖4，1-10:為1至10號菌噬菌粒DNA酶切條帶，M:DNAMarker。、4、文庫的富集和篩選四輪富集後，針對S正A26-28kDa的噬菌體單鏈抗體約增加了1300倍，見tableseeoriginaldocumentpage12SDS-PAGE顯示，含重組噬菌體的陽性克隆經IPTG誘導可表達分子量約為32kDa的g3p-scFv-Etag融合蛋白。細胞周質提取物及全細胞提取物中均可見該融合蛋白的表達，而做為陰性對照的五co/z'HB2151經DPTG誘導後的細胞周質提取物中未見該融合蛋白條帶。見圖5，1:經IPTG誘導的EcoliHB215細胞周質提取物；2:陽性重組噬菌體經IPTG誘導後細胞周質提取物；3:陽性重組噬菌體經IPTG誘導後全細胞提取物；M:低分子量蛋白Marker。Westernblot可見，陽性重組噬菌體細胞周質及全細胞提取的g3p-scFv-Etag融合蛋白均能被HRP-antiE-tag抗體所識別，分子量約為32kDa，且條帶單一，而經EPTG誘導的EcoliHB215細胞周質提取物不被HRP-anti-Etag抗體識別。見圖6，1:經IPTG誘導的EcoliHB215細胞周瑪提取物；2:陽性重組噬菌體經IPTG誘導後細胞周質提取物；3:陽性重組噬菌體經IPTG誘導後全細胞提取物；M:低分子量蛋白Marker。6、陽性重組噬菌體特異性鑑定.Westernblot結果顯示，針對S正A26-28kDa天然分子的陽性重組噬菌體單鏈抗體識別S正A於26kDa的位置，結果證實，通過篩選，我們獲得了特異性高的抗S正A26-28kDa單鏈抗體。見圖7,1:抗S正A26-28kDa陽性單鏈抗體2:陰性對照(EcoliHB215)M:低分子量蛋白Marker。7、特異性抗SIEA26-28kDa單鏈抗體基因序列的測定和分析1)特異性抗SIEA26-28kDa-scFv基因序列測定對特異性抗S正A26-28kDa單鏈抗體進行核苷酸序列測定，結果表明，基因全長為726bp，VH基因長度為363bp，VL基因長度為318bp,Linker序列為45bp。基因序列如下ATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGCTACTGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCACTGGTTATACTGAGTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACGCGACTATGATTACGACGGATACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGAGGCTCGGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAGCACTCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCATCAGCGGAGTAGTTACACGTTCGGAGGGGGGACAAAGCTGGAAATCAAACGG2)SIEA26-28kDa特異性單鏈抗體基因序列的計算機分析①VH基因同源性與胺基酸序列分析將陽性單鏈抗體VH基因序列與NCBI鼠源性基因資料庫中的已知基因進行同源性比較，其同源序列均為鼠Ig重鏈同變區基因，同源性達98%，且屬於Y鏈類型。VH基因長度為363bp編碼121個胺基酸，BlastanalysisofImmunoglobulinsequences進行同源性檢索顯示VH具有明確的4個1S架區(FRs)和3個抗原互補決定區(CDRs)，在第24位和96位含有抗體可變區特徵性的兩個半胱氨酸殘基，表明其結構符合鼠Ig重鏈可變區的胺基酸序列特徵。MAQVQLQESGAELAKP'GASVK^SC73KASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLECDR1WIGYINPS'TGYTEYNQKFKDKATLCDR2217actgcagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactgagcagcctgacatctgaggactctgcagtctatTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRDYDYDGYFDVWGAGTTVTVCDR3361tccS,■,②VL基因同源性與胺基酸序列分析將VL基因序列與NCBI鼠源性基因資料庫中的已知基因進行同源性比較，其同源序列均為鼠IgVk基因，同源性達97%，VL基因長度為318bp編碼106個胺基酸，BlastanalysisofImmunoglobulinsequences進行同源性檢索顯示VL具有明確的4個框架區(FRs)和3個抗原互補決定區(CDRs)。在第24位和88位含有抗體可變區特徵性的兩個半胱氨酸殘基,表明其結構符合鼠Ig輕鏈可變區的胺基酸序列特徵。，SDIELTQSPALMSASPGEKVTMTC73agtgccagctcaagtgtaagttacatgtactggtaccagcagaagccaggatcctcccccagactcctgattSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLICDR1YDTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSCDR25217ctcacaatcagcagcat〖;gaggctgaagatgctgccacttattactgccatcagcggagtagttacacgttcLTISSMEAEDAATYYCHQRSSYTFCDR3289gg3ggggggacaa3gctgg幼atc3a3cggGGGTKLEIKR權利要求1、一種特異性抗SIEA26-28kDa單鏈抗體，其特徵在於它是一種採用噬菌體抗體庫技術，從SIEA免疫的小鼠脾細胞出發，構建的抗SIEA全套單鏈抗體基因噬菌體抗體中篩選出具有特異性與SIEA26-28kDa結合的單鏈抗體，並可以大腸桿菌中進行可溶性表達。2、一種編碼權利要求1所述特異性抗SIEA26-28kDa單鏈抗體的基因，由726個核苷酸組成，其核苷酸序列如下ATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGCTACTGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCACTGGTTATACTGAGTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACGCGACTATGATTACGACGGATACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGAGGCTCGGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAGCACTCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCATCAGCGGAGTAGTTACACGTTCGGAGGGGGGACAAAGCTGGAAATCAAACGG3、根據權利要求2所述的抗SIEA26-28kDa單鏈抗體，其特徵在於其中重鏈可變區基因由363個核苷酸組成，其序列是ATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAAACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGCTACTGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCACTGGTTATACTGAGTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACGCGACTATGATTACGACGGATACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGCACCACGGTCACCGTCTCC4、權利要求2所述特異性抗SIEA26-28kDa單鏈抗體，其特徵在於其中輕鏈可變區基因由318個核苷酸組成，其序列是TCGGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAGCACTCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGATCCTCCCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCATCAGCGGAGTAGTTACACGTTCGGAGGGGGGACAAAGCTGGAAATCAAACGG5、權利要求2或3所述特異性抗SIEA26-28kDa單鏈抗體，其特徵在於其中VH編碼121個胺基酸，胺基酸序列如下MAQVQLQESGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSTGYTEYNKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARRDYDYDGYFDVWGAGTTVTVS6、權利要求2或4所述特異性抗SIEA26-28kDa單鏈抗體，其特徵在於其中VL編碼106個胺基酸，胺基酸序列如下SDIELTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCH(JRSSYTFGGGTKLEIKR7、權利要求所述1所述單鏈抗體，其特徵在於是一種抗S正A26-28kDa的單鏈抗體。利用其作為單鏈抗體所具備的特點分子量小、穿透力好、半衰期短、免疫原性低、易於基因操作和基因工程大量生產、以及其它效應(如與毒素、酶等偶聯製備成雙功能抗體)等，為治療日本血吸蟲病打開了新的思路，同時我們可以通過運用此類特異性單鏈抗體，篩選日本血吸蟲成蟲cDNA文庫，可獲得SIEA26-28kD相應編碼基因，製備出基因工程疫苗。日本血吸蟲病有效天然分子疫苗S正A26-28kDa特異性單鏈抗體的獲得為日本血吸蟲病最終的消滅奠定了基礎。全文摘要本發明涉及基因工程抗體領域，首次構建了日本血吸蟲未成熟蟲卵可溶性抗原(SIEA)單鏈抗體庫。通過免疫親和篩選技術篩選SIEA單鏈抗體庫，獲得針對抗日本血吸蟲病有效天然分子疫苗SIEA26-28kDa的特異性單鏈抗體。此類特異性單鏈抗體的獲得為日本血吸蟲治療，以及利用特異性單鏈抗體作為探針篩選日本血吸蟲cDNA文庫，更方便快捷地獲得針對抗血吸蟲病有效疫苗分子相對應基因序列提供了基礎。文檔編號C40B40/10GK101429247SQ200710036039公開日2009年5月13日申請日期2007年11月5日優先權日2007年11月5日發明者卓何,劉明社,徐紹銳,曾少華,汪世平申請人:何卓;汪世平