一種具有致癢作用的芋蛋白提取物及其製備方法和應用的製作方法
2023-07-11 02:41:56 1
一種具有致癢作用的芋蛋白提取物及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有致癢作用的芋蛋白提取物，它的胺基酸序列為：Ser-Gln-Leu-Asn-Phe-Tyr-Gln-Gly-Lys-Gly-Gln-Gly-Asn-Phe-Leu-Val-Ala-Val-Asp。本發明通過採用超濾、離子交換層析、凝膠柱層析、超濾或透析除鹽等技術，製備得到純度高，具有很好致癢活性的芋蛋白提取物，該芋蛋白提取物可廣泛應用於致癢模型工具藥研究、生物檢測、疾病診斷和治療等方面，為芋資源的綜合高效利用提供基礎，具有重要的意義。
【專利說明】一種具有致癢作用的芋蛋白提取物及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種致癢工具藥物，具體涉及一種從天南星科植物芋中分離得到的具有致癢活性的蛋白提取物，屬於生物醫藥【技術領域】。
【背景技術】
[0002]癢是一種不愉快的感受，可引起搔抓欲望或搔抓反射，是獨立於痛覺之外的一種傷害性感受，它是皮膚病、自身免疫性疾病、某些藥物副作用的典型症狀，是一種慢性疾病，嚴重影響人們的生活質量，困擾人類達數千年之久。
[0003]臨床治療和日常生活中，癢的發生非常普遍，但對癢產生的病理、生理學機制知之甚少。芋是天南星科植物芋Colocasia esculenta(L.) S.的塊莖，又稱芋頭、芋艿、芋魁、土芝，多年生塊莖植物，營養價值高，是非洲和亞洲的中國、日本、印度、菲律賓等地區重要農作物。然而芋作為食物必須做熟才能食用，否則有毒。《名醫別錄》謂之「辛，平，有毒」，在處理生品時不能擦、敷到健康皮膚，否則會引起皮炎，主要症狀是局部皮膚紅腫，瘙癢。
[0004]鈣離子是機體的重要元素，同時作為細胞內第二信使通過與鈣調蛋白(Calmodulin, CaM)結合激活多種蛋白激酶(如腺苷酸環化酶，磷酸二酯酶，鈣調蛋白激酶等)及諸多蛋白水解酶和核酸酶，從而參與細胞代謝，細胞周期等多種細胞功能的調節，在細胞的許多生命活動中擔當者重要的角色。神經細胞中鈣離子濃度的動態變化可以反映神經細胞的興奮性，因此在實驗中可以用於推測致癢相關神經元的興奮狀態。
[0005]GCaMP小鼠是經過鈣調蛋白(CaM)，綠色螢光蛋白(GFP)和平滑肌細胞肌球蛋白輕鏈激酶片段M13融合重組構建成的轉基因小鼠。小鼠的背根節神經元(DRG)上表達出的三種蛋白有如下關係:受體未被激動時，胞外鈣離子濃度低，鈣調蛋白保持原始構相，GFP發光蛋白包裹在融合泛白的內部，在 激發光的激發下，顯示微弱的光；當受體被藥物激動時引起神經元興奮，胞外鈣離子濃度增加，與鈣調蛋白結合，引起鈣調蛋白構象的改變，而使GFP發光蛋白暴露在融合蛋白的表面，激發光激發時，螢光的亮度明顯增加。通過比較鈣離子結合和未結合狀態下螢光的亮度分析細胞中鈣離子的濃度變化，進而確定藥物致癢活性。
【發明內容】
[0006]發明目的:本發明的目的是在對芋現有研究的基礎之上，通過實驗篩選，採用現代生化技術手段，對芋中致癢活性成分進行跟蹤評價，通過超濾、凝膠色譜法、離子交換色譜法等分離純化方法製備得到一種具有致癢作用的蛋白提取物，實驗結果表明該蛋白提取物具有很好的致癢作用，可作為模型工具藥使用。
[0007]技術方案:為了實現以上目的，本發明採取的技術方案為:
[0008]一種具有致癢作用的芋蛋白提取物，它的胺基酸序列為:
[0009]Ser-Gln-Leu-Asn-Phe-Tyr-Gln-Gly-Lys-Gly-Gln-Gly-Asn-Phe-Leu-Val-Ala-Val-Asp (絲氨酸-穀氨醯胺-亮氨酸-天冬醯胺-苯丙氨酸-酪氨酸-穀氨醯胺-甘氨酸-賴氨酸-甘氨酸-穀氨醯胺-甘氨酸-天冬醯胺-苯丙氨酸-亮氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸-天冬氨酸)。胺基酸序列表如序列表1。
[0010]本發明提供的具有致癢作用的芋蛋白提取物，其分子量約為9300Da，通過質譜分析，具有與 Lectin OS=Colocasia esculenta PE=4SV=1-[A5HMM7_C0LES] (A5HMM7)相同的肽段LTLTDYGELVIKNGDGSTVWR和GNYAAVLHPDGRLVVFGPSVFK，與凝集素具有同源性。本發明提供的芋蛋白提取物能誘導GCaMP小鼠DRG神經元細胞螢光增強，興奮部分DRG神經元，具有很好的致癢活性。
[0011]本發明所述的具有致癢作用的芋蛋白提取物的製備方法，其包括以下步驟:
[0012](I)將新鮮的芋頭切塊，加I~3倍水後，勻漿機粉碎，按固液比為1:3~1:8加入乙醇，攪拌浸泡I~6小時，過濾，濾渣常溫下揮幹乙醇後，按固液比為1:3~1:8加水，勻漿機粉碎，紗布過濾，得到濾液；
[0013](2)取步驟(1)濾液用超濾系統進行分級，所用濾膜截留分子量分別為3000Da和1000ODa,分別得到小於3000Da、3000-10000Da和大於1000ODa三個分子量段的芋頭蛋白粗提液，使用鈣離子成像實驗檢測致癢活性，得到分子量段為3000-10000Da具有致癢活性的提取物；
[0014](3)取步驟⑵所得的具有致癢活性的提取物於0~10°C，轉速1000~8000rpm下進行離心分離，取上清液，經離子交換柱層析，柱層析填料為強陰離子交換樹脂，用水與NaCl溶液為流動相，梯度洗脫，用鈣離子成像實驗檢測致癢活性，收集有致癢活性的組分；
[0015](4)取步驟(3)得到的有致癢活性的組分，上凝膠柱色譜柱，用水洗脫進行脫色除雜，再經超濾或透析除鹽，然後濃縮、冷凍乾燥，得具有致癢作用的芋蛋白提取物。
[0016]作為優選方案，以上`所述的具有致癢作用的芋蛋白提取物的製備方法，步驟(3)離子交換柱層析的洗脫液為水和lmol/LNaCl，梯度洗脫程序為:
[0017]0 ~20min，5% ~60% 體積比的 lmol/LNaCl ；
[0018]20 ~30min，60% ~100% 體積比的 lmol/LNaCl。
[0019]本發明通過超濾系統進行分級超濾得到分子量段為3000-10000Da具有致癢活性的提取物，其中蛋白含量2%-5% (考馬斯亮藍法)，糖含量40%-50% (硫酸苯酚法)；為了進一步提純具有致癢作用的活性成分，本發明繼續採用離子交換柱層析進行繼續提純分離，並且通過大量實驗篩選洗脫程序，製備得到具有高活性的芋蛋白活性成分。
[0020]作為優選方案，以上所述的具有致癢作用的芋蛋白提取物的製備方法，步驟(4)所述的超濾或透析除鹽的膜透過分子量小於等於1KD。
[0021]本發明所述的具有致癢作用的芋蛋白提取物在製備致癢模型工具藥物中的應用。
[0022]有益效果:本發明提供的具有致癢作用的芋蛋白提取物及其製備方法具有以下優
佔-
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[0023]本發明通過採用超濾、離子交換層析、凝膠柱層析、超濾或透析除鹽等技術，製備得到純度高，具有限好致癢活性的芋蛋白提取物，可廣泛應用於模型工具藥研究、生物檢測、疾病診斷和治療等方面，為芋資源的綜合高效利用提供了基礎，具有重要的意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為發明提供的具有致癢作用的芋蛋白提取物的酶解後胺基酸組成圖。
[0025]圖2為芋蛋白提取物引起的DRG細胞螢光Ratio變化情況曲線圖。【具體實施方式】
[0026]下面結合具體實施例進一步闡明本發明，應理解這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍，在閱讀了本發明之後，本領域技術人員對本發明的各種等價形式的修改均落於本申請所附權利要求所限定的範圍。
[0027]實施例1具有致癢作用的芋蛋白提取物的製備方法，其包括以下步驟:
[0028](I)稱取5kg的新鮮芋頭，切塊，加5L 7jC，勻漿機粉碎lOmin，加入20L無水乙醇浸泡，以去除脂質、游離蛋白質，攪拌後靜置6小時，過濾，將濾渣中殘留的乙醇在通風櫥內揮幹，濾渣加20L純水，勻漿機粉碎IOmin後，紗布過濾，得到微黃色渾濁濾液；濾液用QuixStand benchtop超濾系統進行分級,所用濾膜截留分子量分別為3000Da和1000ODa,得到小於3000Da、3000-10000Da和大於1000ODa三個分子量段的芋蛋白提取液，分別命名為3K、3-10K和10K。各分子量段提取液進行致癢活性跟蹤測試，實驗結果表明，3-10K顯示有活性，為致癢芋提取物。並採用考馬斯亮藍法測得其蛋白含量為3.1%，硫酸苯酚法測得其多糖含量為44%。
[0029](2)離子交換樹脂柱層析分離:取步驟(1)製備得到的3-10K分子量段提取液於4°C，轉速8000rpm離心後，上清液過0.22 y m濾膜，用AKTA purifier進行離子交換柱層析，層析填料為GE Sepharose Q，洗脫液A為水，B為Imol / L NaCl，進樣量5mL，流速3mL /min，檢測波長 280nm。洗脫程序為:0 ~20min，5%~60% B ；20 ~30min，60%~100% B。收集各組分合併，冷凍乾燥。各組分進行致癢活性跟蹤測試，得致癢芋蛋白洗脫部分。
[0030](3)凝膠脫色、透析除鹽
[0031]取步驟(2)具有致癢活性的芋蛋白，以S印hadex-G25為填料，純水為流動相脫色處理後，然後裝入透析袋進行透析除鹽，膜透過分子量< lKDa，冷凍乾燥，即得具有致癢作用的芋蛋白0.49g。
[0032]實施例2致癢芋蛋白的序 列分析
[0033]取實施例1製備得到的致癢芋蛋白，採用ES1-QT0FMS/MS分析其胺基酸序列，質譜條件為=ESI源，掃描方式:正離子模式，質量掃描範圍:100~10000m/Z ;分析得到致癢芋分子量約為9300Da。N端測序得到的致癢芋蛋白胺基酸序列片段為=Ser-Gln-Leu-Asn-Phe-Tyr-Gln-Gly-Lys-Gly-Gln-Gly-Asn-Phe-Leu-Val-Ala-Val-Aspo N 端測序結果如圖1 所
/Jn o
[0034]致癢芋蛋白經胰酶酶解24小時後，採用LTQOrbitrap質譜儀分析其肽段序列，流動相為(A)含有2%體積乙腈濃度為0.1%甲酸的水溶液；(B)含有濃度0.1%甲酸的乙腈溶液，流速 300nL/min，洗脫程序為:0 ~50min，3% ~40%B ；50 ~55min，40% ~85%B; 55 ~60min, 85%B; 60~62min，85%~3%B。，質譜採用ESI源，掃描方式:正離子模式，質量掃描範圍:100~2000m/z，質譜數據採用軟體處理，經Uriprot在線資料庫匹配後，得出該致癢芋蛋白具有與 Lectin OS=Colocasia esculenta PE=4SV=1-[A5HMM7_C0LES] (A5HMM7)相同的肽段 LTLTDYGELVIKNGDGSTVWR 和 GNYAAVLHPDGRLVVFGPSVFK，相似度達 19.2%,與凝集素具有同源性。
[0035]實施例3致癢活性(鈣離子成像)實驗
[0036]將培養24小時的GCaMP小鼠DRG神經元置於細胞孵育槽中，鈣離子灌流液持續灌流。利用螢光顯微鏡找到視野中綠色螢光標記的細胞，移至視野中央。然後分別用485nm和509nm的激發光激發綠色螢光蛋白，曝光時間約5s。利用CCD相機持續記錄不同激發光下細胞的亮度變化。在記錄I分鐘的對照時間後，加入20 u L實施例1製備得到的致癢芋蛋白提取物的樣品水溶液(濃度為lmg/mL)，持續記錄細胞亮度的變化，直至致癢芋蛋白洗脫，細胞亮度恢復加樣前。停止記錄，圈選視野中的所有細胞，分析整個記錄過程中這些細胞Ratio的變化率(Ratio=485nm/509nm),從而推測細胞中鈣離子的流動。實驗結果表明實施例I製備得到的致癢芋蛋白提取物可誘導細胞螢光的增強，說明細胞中鈣離子的內流，興奮部分DRG神經元。致癢芋蛋白濃度為5mg/mL時，其引起的DRG細胞Ratio變化情況見圖2。
[0037]以上實驗結果表明，本發明從植物芋中經過優選方法製備得到的致癢蛋白提取物具有較強的致癢活性，在模型工具藥研究、生物檢測、疾病診斷和治療等方面有廣泛的應用前景，可實現資源的綜合高效利用，具有重要的經濟效應。
[0038]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。`
【權利要求】
1.一種具有致癢作用的芋蛋白提取物，其特徵在於，它的胺基酸序列為: Ser-Gln-Leu-Asn-Phe-Tyr-Gln-Gly-Lys-Gly-Gln-Gly-Asn-Phe-Leu-Val-Ala-Val-Asp0
2.權利要求1所述的具有致癢作用的芋蛋白提取物的製備方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)將新鮮的芋頭切塊，加I~3倍水後，勻漿機粉碎，按固液比為1:3~1:8加入乙醇，攪拌浸泡I~6小時，過濾，濾渣常溫下揮幹乙醇後，按固液比為1:3~1:8加水，勻漿機粉碎，紗布過濾，得到濾液； (2)取步驟(1)濾液用超濾系統進行分級，所用濾膜截留分子量分別為3000Da和lOOOODa，分別得到小於3000Da、3000-10000Da和大於1000ODa三個分子量段的芋頭蛋白粗提液，使用鈣離子成像實驗檢測致癢活性，得到分子量段為3000-10000Da具有致癢活性的提取物； (3)取步驟(2)所得的具有致癢活性的提取物於0~10°C，轉速1000~8000rpm下進行離心分離，取上清液，經離子交換柱層析，柱層析填料為強陰離子交換樹脂，用水與NaCl溶液為流動相，梯度洗脫，用鈣離子成像實驗檢測致癢活性，收集有致癢活性的組分； (4)取步驟(3)得到的有致癢活性的組分，上凝膠柱色譜柱，用水洗脫進行脫色除雜，再經超濾或透析除鹽，然後濃縮、冷凍乾燥，得具有致癢作用的芋蛋白提取物。
3.根據權利要求2所述的具有致癢作用的芋蛋白提取物的製備方法，其特徵在於，步驟(3)離子交換柱層析的洗脫液為水和lmol/L NaCl，梯度洗脫程序為:
0 ~20min, 5% ~60% 體積比的 lmol/L NaCl ；
20 ~30min,60% ~100% 體積比的 lmol/L NaCl。
4.根據權利要求2所述的具有致癢作用的芋蛋白提取物的製備方法，其特徵在於，步驟(4)所述的超濾或透析除鹽的膜透過分子量小於等於1KD。
5.權利要求1所述的具有致癢作用的芋蛋白提取物在製備致癢模型工具藥物中的應用。
【文檔編號】C07K1/18GK103483425SQ201310371658
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年8月23日 優先權日:2013年8月23日
【發明者】劉培, 唐宗湘, 段金廒, 楊雁, 劉睿, 於金高 申請人:南京中醫藥大學