具有增加產量的植物及其生產方法

2024-02-25 02:29:15 2

專利名稱：具有增加產量的植物及其生產方法
技術領域：
本發明總的涉及分子生物學領域，並關注用於增加植物產量的方法。更特別地，本發明涉及通過將細胞周期蛋白A的核酸，優選地編碼細胞周期蛋白A蛋白的核酸導入植物來增加植物產量的方法，所述核酸有效地連接了種子偏愛的啟動子。本發明也涉及在植物種子組織中具有增加的細胞周期蛋白A核酸表達和/或在植物種子組織中具有細胞周期蛋白A蛋白的經調節的活性和/或水平的植物，該植物和相應的野生型植物相比以及和相應的其中組成型表達細胞周期蛋白A的轉基因植物相比，具有增加的產量。
不斷增加的世界人口和農業上可供利用的可耕作土地的供給不斷下降刺激了旨在提高農業效率的農業研究。常規的作物和園藝改進方法使用選擇育種技術來鑑定具有理想特性的植物。然而，這樣的選擇育種技術具有幾個缺點，即這些技術通常非常費力並且產生通常含有異源遺傳成分的植物，該異源遺傳成分並非總能引起可從親本植株傳遞的理想性狀。分子生物學上的進步已使人類能夠修飾動物和植物的種質。植物的基因工程使得能夠進行遺傳物質(通常以DNA或RNA的形式)的分離和操作，以及隨後將該遺傳物質導入植物。這樣的技術能夠產生具有各種改善的經濟、農藝或園藝性狀的作物或植物。尤其具有經濟價值的性狀是產量。產量通常定義為來自作物的可測量的產物經濟值。這可以數量和/或質量表示。產量直接依賴於幾個因素，例如器官的數量和大小、植物的結構(例如，分枝的數目)、種子的產量等。根的發育、營養的吸收和壓力耐受性在確定產量上也是重量的因素。可通過優化上述因素中的一種來增加作物產量，這種優化可通過修飾植物的內在生長機制來實現。
植物的內在生長機制存在於統稱為「細胞周期」的高度有序的事件序列中。通過細胞周期的推進是所有多細胞生物的生長和發育所必需的，對細胞的增殖是至關重要的。細胞周期的主要組成成分在酵母、哺乳動物和植物中是高度保守的。通常將細胞周期分為下列按順序發生的時期G0-G1-S-G2-M。DNA複製或合成通常發生在S期(「S」表示DNA合成)，而染色體的有絲分裂分離發生在M期(「M」表示有絲分裂)，其間間隔以間期，G1(DNA複製前細胞生長的時期)和G2(DNA複製後，細胞準備分裂的時期)。胞質分裂(M期的最後步驟)後，細胞分裂完成。已退出細胞周期和已變成靜止狀態的細胞被稱為處在G0期。可刺激處於該時期的細胞使之重新進入細胞周期的G1期。G1、G2和G0中的「G」表示「間期」。細胞周期過程的完成使細胞分裂期間的子細胞接受親本基因組的完全拷貝。
細胞分裂由兩個主要的細胞周期事件即DNA合成的起始和有絲分裂的起始所控制。這些關鍵事件的每一個轉換均由特定蛋白複合物(參與DNA的複製和分裂)代表的關卡(checkpoint)控制。在哺乳動物和植物細胞中，在G1/S邊界DNA合成所必需的基因的表達由轉錄因子的E2F家族調節(La Thangue，1994；Muller等人，2001；De Veylder等人.，2002)。細胞周期的進入由E2F/Rb複合物調節/觸發，該複合物可整合信號並使細胞周期基因的轉錄能夠被激活。細胞周期的不同時期之間的轉換，和由此產生的通過細胞周期的推進，是通過不同的異源二聚絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(通常稱作周期蛋白依賴性激酶(CDKs))的形成和激活來推動的。這些激酶活性的前提條件是與特定的細胞周期蛋白的物理結合，激活的時間選擇主要依賴於細胞周期蛋白的表達。細胞周期蛋白的結合誘導結合的CDK的N端末瓣(N-terminal lobe)發生構象變化，並促進該複合物的定位和底物特異性。當單體CDKs與周期蛋白結合時被激活，因此具有激酶活性。細胞周期蛋白水平在細胞周期中波動，從而代表確定CDK活化的時間選擇的主要因子。這些在細胞周期中含有細胞周期蛋白和CDK的複合物的周期性活化介導了細胞周期轉換(關卡)的時間調控。其他調節CDK活性的因子包括CDK抑制劑(CKIs或ICKs、KIPs、CIPs、INKs)、激活CDK的激酶(CAKs)、CDK磷酸酶(Cdc25)和CDK亞基(CKS)(Mironov等人1999；Reed 1996)。
已描述擬南芥A型周期蛋白(A1、A2和A 3)(包含10種周期蛋白)的三個不同亞類。在Vandepoele等人.(The Plant Cell，Vol.14，903-916，April 2002)中已報導了兩個A1型基因(CYCA1；1和CYCA1；2)、四個A2型基因(CYCA2；1、CYCA2；2、CYCA2；3和CYCA2；4)、和四個A3型基因(CYCA3；1、CYCA3；2、CYCA3；3和CYCA3；4)。
國際申請WO 01/85946描述了幾種細胞周期蛋白，包括細胞周期蛋白As。已提到細胞周期蛋白可在農業中用於改善植物的生長特性，例如特定組織或器官的生長速率或大小、植物的結構或形態、增加的作物產量、提高的對環境逆境條件(例如乾旱、鹽、溫度或營養缺乏)的耐受性、提高的對濫用細胞周期的植物病原體的耐受性或用作靶以幫助鑑定CCPs的抑制劑或激活劑，所述抑制劑或激活劑可用作除草劑或植物生長調節劑。
可通過許多方法增加產量，一些方法令人驚奇。例如，在20世紀60年代對小麥和水稻產量增加(所謂的綠色革命)作出貢獻的主要因素是植物高度的降低(Sakamoto和Matsuoka，Current Opinion inBiotechnology 2004，15144-147)。使用大量氮肥後，當時的常規品種生長過高從而產生倒伏，導致顯著的產量損失。相反地，綠色革命的半矮縮品種，由於其較矮的株高，具有抗倒伏性，從而導致作物產量的加倍。
現已驚奇地發現可通過向植物中導入細胞周期蛋白A核酸，優選地編碼細胞周期蛋白A蛋白的核酸來增加植物產量，該細胞周期蛋白A核酸有效地連接種子偏愛的啟動子。在種子偏愛的啟動子控制之下的細胞周期蛋白A核酸的表達導致比在植物中組成型表達的細胞周期蛋白A表達時獲得的產量更高的產量。
因此，根據本發明的一個實施方案，提供了用於增加植物產量的方法，其包括將細胞周期蛋白A核酸，優選地編碼細胞周期蛋白A蛋白的核酸導入植物，該細胞周期A核酸有效地連接了種子偏愛的啟動子。
本發明方法的實施導致增加的植物產量。此處定義的術語「增加的產量」包括和對照植物的生物量相比，植物一個或多個部分的生物量(重量)有增加。該術語也包括種子產量的增加，包括各和對照植物相比，種子生物量(種子重量)上的增加和/或種子(飽滿的)數量上的增加和/或種子大小上的增加和/或種子體積上的增加。種子大小和/或體積上的增加也可影響種子的組成。種子產量的增加可由花的數目和/或大小的增加造成。產量上的增加也可提高收穫指數，其表示為總生物量對可收穫部分例如種子的產量的比例。產量的增加也可提高千粒重(thousand Kernel weight，TKW)，其可通過計數得到的飽滿種子數目和其總重量推算出來。
以玉米為例子，產量的增加可以下列的一個或多個方面來表現每公頃或英畝的植物數量的增加、每顆植物的穗數目的增加、行(rows)數、每行粒數、粒重、千粒重、穗長/直徑的增加等。以水稻為例，產量的增加可通過下列的一個或多個方面的增加來表現每公傾或英畝的植物數量、每顆植物的圓錐花序(panicle)數目、每圓錐花序上的小穗數量、每圓錐花序的花數量的增加、種子飽滿率的增加、千粒重的增加等。
在雜交植物中可進一步增加產量或可進一步評估產量。作物例如玉米通常以雜種進行銷售。田間作物育種的目的是將存在於單個品種或雜種中的各種想要的性狀組合起來。通過利用植物的授粉方法(自花授粉，如在水稻的情況下，或異花授粉，如在玉米的情況下)的不同技術進行育種。穀物的育種通常包括自花授粉和異花授粉步驟。以玉米為例，新品種的產生通常需要近交親本系的開發、選擇和生產，所述近交親本系隨後用於生產具有某些想要的特性的雜交玉米。因此，玉米雜種的開發要求純合近交系的開發、這些系的雜交和對這些雜交(雜種)的評估。然後可通過雜交(基因導入)或通過轉化技術進行的分子導入來導入想要的性狀。為確定產物的田間表現，可對純合的近交植物的純合群體或對兩個純合近交系之間的雜種進行新作物的評估。上述技術在本領域是熟知的。
更特別地，增加的產量以下列的一個或多個方面來表現各自和對照植物相比，種子重量增加、飽滿種子數目增加、種子數目增加、種子大小增加、收穫指數增加、千粒重增加和經修飾的種子組成。因此，根據本發明，提供了用於增加植物產量的方法，其中增加的植物產量選自下列的一項或多項各自和對照植物相比，種子重量增加、飽滿種子數目增加、種子數目增加、種子大小增加、收穫指數增加、千粒重增加和經修飾的種子組成，該方法包括將細胞周期蛋白A核酸，優選地編碼細胞周期蛋白A蛋白的核酸導入植物，該細胞周期蛋白A核酸有效地連接了種子偏愛的啟動子。
因為本發明的轉基因植物具有增加的產量，因此和對照植物在其生命周期的相應階段的生長速率相比，這些植物可能表現生長速率增加(在其生命周期的至少部分時期)。增加的生長速率對於植物的一個或多個部分(包括種子)可以是特異的，或可以是基本上在整個植株上都如此。在種子特別是穀物種子的情況下，種子的成熟可能與完整地存在於植物上的種子的水分含量有關。因此，和對照植物相比，提供種子成熟指徵的含水量也是種子生長速率的一個指徵。對於任意給定的植物品種，本領域技術人員知道表示種子可以收穫的含水量。可使用已知的技術測量含水量。
此外，生長速率的增加可在植物生命周期的一個或多個階段上或基本上在整個植物生命周期中發生。在植物生命周期的早期階段生長速率增加可反映增加的活力。
生長速率的增加可改變植物的收穫周期，使得植物可能可以比生長速率未增加的植物更遲播種和/或更早收穫。此處定義的術語「收穫周期」是指植物的播種和收穫之間的時間。如果生長速率充分增加，可允許再次播種相同植物品種的種子(例如播種和收穫水稻植物後接著再次播種和收穫水稻植物都在一個常規的生長周期內)。類似地，如果生長速率充分增加，可能可以再次播種不同植物品種的種子(例如播種和收穫水稻植物後，播種和任選地收穫大豆、土豆或任何其他合適的植物)。在一些植物的情況下，對相同根狀莖的收穫可在一年中的額外時間發生。改變植物收穫周期的可能性可導致每英畝年生物量產量的增加(由於可生長和收穫任何特定植物的次數(比如一年內)增加)。生長速率的增加也可使轉基因植物在比其野生型對應物生長的地理範圍更廣的範圍內進行栽培，因為栽培植物的地域限制通常由在種植時間(早季節)或收穫時間(晚季節)上的不利環境條件確定。如果收穫周期縮短，那麼可避免這些不利的條件。
生長速率也可通過從描繪生長實驗的生長曲線推導出各種參數來確定，這些參數可以是T-Mid(植物達到其最大尺寸的50％所用的時間)和T-90(植物達到其最大尺寸的90％所用的時間)，等等。
根據本發明，本發明方法的實施產生生長速率改變的植物。因此，根據本發明，提供了用於增加植物生長速率的方法，該方法包括將細胞周期蛋白A核酸、優選地編碼細胞周期蛋白A蛋白的核酸導入植物，該細胞周期蛋白A核酸有效地連接了種子偏愛的啟動子。
產量和/或生長速率的增加也包括，和對照植物相比，在非壓力條件下和在逆境條件下植物有更好的表現。植物通常以更慢地生長來對暴露於逆境作出反應。在嚴重的逆境條件下，植物可完全停止生長。另一方面，中度的逆境此處定義為這樣的任何逆境，其中在該逆境條件下植物不完全停止生長。由於農業實踐的進步(灌溉、施肥、殺蟲劑處理)，通常在栽培作物植物中不會遇到嚴重的逆境。因此，由中度逆境誘導的生長降低常常是不想要的農業特性。中度逆境是植物可能遇到的典型逆境。這些逆境可以是植物面臨的日常生物和/或非生物逆境。典型的非生物或環境逆境包括由非典型的熱或冷/嚴寒溫度造成的溫度逆境、鹽逆境、水逆境(乾旱或過多的水)。非生物逆境也可由化學物質引起。生物逆境通常是由病原體例如細菌、病毒、真菌和昆蟲導致的逆境。
在本發明的一個實施方案中，要導入植物的細胞周期蛋白A是A2型細胞周期蛋白，優選地是細胞周期蛋白A22。
此處定義的「細胞周期蛋白A核酸」是指編碼這樣的蛋白的核酸，其在天然形式下包含基元1，該基元1表示為W L V/I E V S/A D/ED/E Y K/R/T L(基元1)，其中反斜線(/)表示『或』，即其中『V/I』表示V或I。胺基酸序列中基元1的存在使所述序列可被鑑定為細胞周期蛋白A而不是任何其他類型的細胞周期蛋白。
此處定義的術語「細胞周期蛋白A2核酸」是編碼這樣的蛋白的任何核酸，其在天然的形式下包含上面鑑定的基元1，並另外地包含基元2，所述基元2表示為E L T L V/I/T/M D/E/M Y T/S/H/P/GF R/L L/R/K/N F L P S(基元2)，其中所鑑定的殘基(--T-----F--F---)(和上面下劃線標出的)中的至少兩個殘基的存在可使序列被鑑定為A2型細胞周期蛋白而不是任何其他的細胞周期蛋白A。上面的破折號(-)表示胺基酸殘基，其中一個破折號等同於在基元2中對應位置上的一個胺基酸殘基。
此處定義的術語「細胞周期蛋白A2；2核酸」是編碼這樣的蛋白的任何細胞周期蛋白A核酸，其中所述蛋白按不斷增加的優選順序編碼與SEQ ID NO2所示的胺基酸序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的序列同一性或相似性的任何細胞周期蛋白A核酸。
此處定義的「細胞周期蛋白A胺基酸」或「細胞周期蛋白A蛋白」是指這樣的胺基酸，其在天然形式中包含基元1，所述基元1表示為W L V/I E V S/A D/E D/E Y K/R/T L(基元1)，其中反斜線(/)表示『或』，即其中『V/I』表示V或I。胺基酸序列中基元1的存在使該序列被鑑定為細胞周期蛋白A而不是鑑定為任何其他類型的周期蛋白。
此處定義的術語「細胞周期蛋白A2胺基酸」或「細胞周期蛋白A2蛋白」是任何這樣的胺基酸，其在天然形式中包含如上所鑑定的基元1和另外地包含基元2，所述基元2表示為E L T L V/I/T/M D/E/MY T/S/H/P/G F R/L L/R/K/N F L P S(基元2)，其中經鑑定的殘基(--T-----F--F---)(和上面下劃線標出的)中的至少兩個殘基的存在使序列被鑑定為A2型周期蛋白而不是任何其他的細胞周期蛋白A。上面的破折號(-)表示胺基酸殘基，其中一個破折號等同於在基元2中對應位置上的一個胺基酸殘基。
此處定義的術語「細胞周期蛋白A2；2胺基酸」或「細胞周期蛋白A2；2蛋白」是指這樣的細胞周期蛋白A，即該蛋白按逐漸增加的優選順序與SEQ ID NO2所示的胺基酸序列具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的序列同源性。
被導入植物的細胞周期蛋白A核酸可來源於任何來源，只要該核酸在植物種子組織中過量表達時導致增加的植物產量即可。被導入植物的核酸可分離自微生物來源，例如細菌、酵母或真菌，或分離自植物、藻類或動物來源。通過有意的人工操作，該核酸在組成和/或基因組環境方面由其天然形式得到實質性修飾。所述核酸序列優選地是同源核酸序列，即從植物獲得的核酸序列，無論來自相同的植物品種還是來自不同的品種。核酸序列可分離自單子葉植物或雙子葉植物品種，優選地分離自十字花科(Brassicaceae)家族，更優選地分離自擬南芥(Arabidopsis thaliana)。最優選地，細胞周期蛋白A是A2型周期蛋白，例如細胞周期蛋白A2；1、A2；2、A2；3或A2；4。在特別優選的實施方案中，細胞周期蛋白A2；2由SEQ ID NO1和SEQ ID NO2表示。
儘管本發明由SEQ ID NO1所示的核酸和由SEQ ID NO2所示的胺基酸舉例說明，也可使用細胞周期蛋白A胺基酸變體和細胞周期蛋白A核酸變體來進行所述方法。
用於實踐本發明方法的核酸和胺基酸序列變體包括(i)細胞周期蛋白A核酸的功能性部分；(ii)能夠和細胞周期蛋白A核酸/基因雜交的序列；(iii)細胞周期蛋白A核酸/基因的變通剪接變體；(iv)細胞周期蛋白A核酸/基因的等位基因變體；(v)由遺傳密碼簡併性產生的變體；和(vi)細胞周期蛋白A蛋白的同源物、衍生物和活性片段。
此處所用的術語「核酸」包括互補鏈和對應的RNA、DNA、cDNA和基因組DNA。核酸可以是雙鏈的或單鏈的。
對本領域技術人員來說很明顯的是全長細胞周期蛋白A DNA序列不是進行本發明方法的先決條件，也可使用細胞周期蛋白A的核酸的功能性部分。功能性部分是指來源於原始(更大的)DNA分子或從中製備的DNA片段，所述功能性DNA部分當導入植物並在植物中表達時，產生具有產量增加的植物。該部分可包含許多具有或不具有額外控制元件的基因，或可以只包含間隔序列。使用常規技術可容易地確定適合用於本發明方法的部分。例如，可對SEQ ID NO1的核酸序列進行一個或多個缺失和/或截短而不影響其在本發明的方法中執行功能的能力。使用常規技術，例如通過測定細胞周期蛋白A的活性和/或按照實施例部分描述的方法通過簡單地用待測定其功能性的部分替代真實實例中所用的序列，可容易地確定適合用於本發明方法的部分。用於本發明方法的優選的部分能夠編碼包含基元1和優選地另外包含基元2的蛋白。更優選地，所述部分是由SEQ ID NO1所示的細胞周期蛋白A核酸的部分。
因此，根據本發明的其他實施方案，提供了用於增加植物產量的方法，其包括將細胞周期蛋白A核酸(優選地SEQ ID NO1所示的核酸)的功能性部分導入植物，該功能性部分有效地連接了種子偏愛的啟動子。
能夠和細胞周期蛋白A核酸(例如由SEQ ID NO1所示的核酸)雜交的序列也可用於進行本發明的方法。此處定義的術語「雜交」是指這樣的過程，其中基本上同源互補的核苷酸序列相互退火。雜交過程可完全在溶液中(即兩條互補核酸都在溶液中)進行。依賴於該過程的分子生物學方法包括聚合酶鏈式反應(PCR；和所有基於此的方法)、減法雜交(subtractive hybridisation)、隨機引物延伸、S1核酸酶作圖(nuclease S1 mapping)、引物延伸、逆轉錄、cDNA合成、RNAs的差異顯示(differential display of RNAs)和DNA序列的確定。也可用固定在基質例如磁珠、瓊脂糖珠或任何其他樹脂上的互補核酸之一進行雜交過程。依賴於該過程的分子生物學方法包括poly(A+)mRNA的分離。另外，可通過用固定在固體支持物例如硝酸纖維素或尼龍膜上或通過例如光刻法固定在例如矽玻璃支持物(後者稱為核酸陣列或微陣列或稱為核酸晶片)上的互補核酸之一來進行雜交過程。依賴於該過程的分子生物學方法包括RNA和DNA凝膠印跡分析、菌落雜交(colony hybridization)、噬菌斑雜交、原位雜交和微陣列雜交。為了使雜交能夠發生，通常對核酸分子進行熱或化學變性以使雙鏈解鏈形成兩條單鏈和/或從單鏈核酸中除去髮夾或其他二級結構。雜交的嚴緊度受條件例如溫度、鹽濃度和雜交緩衝液組成影響。用於雜交的高嚴緊條件包括高溫和/或低鹽濃度(鹽包括NaCl和檸檬酸三鈉)和/或雜交緩衝液中甲醯胺的存在和/或降低雜交緩衝液中的化合物例如SDS(去垢劑)的濃度和/或從雜交緩衝液中除去化合物例如硫酸葡聚糖或聚乙二醇(促進分子聚集)。常規的雜交條件描述於例如Sambrook(2001)Molecular Cloninga laboratory manual，第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York中，但本領域技術人員認識到可根據核酸序列的已知或預期同源性和/或長度來設計許多不同的雜交條件。低嚴緊雜交條件對分離與前面定義的本發明DNA序列異源的核酸是特別優選的。低嚴緊條件的例子是在37-45℃下在4-6x SSC/0.1-0.5％w/v SDS中進行2-3小時。依賴於參與雜交的核酸的來源和濃度，可使用另外的嚴緊條件，例如中等嚴緊條件。中等嚴緊條件的例子包括在1-4x SSC/0.25％w/v SDS中在≥45℃下進行2-3小時。高度嚴緊條件的例子包括在0.1-1xSSC/0.1％w/v SDS中在60℃進行1-3小時。本領域技術人員知道在雜交和洗滌期間可改變的以及可維持或改變嚴緊條件的各種參數。引起異源性的因素包括等位性、遺傳密碼的簡併性和偏愛密碼子用法上的差異。
能夠和細胞周期蛋白A核酸例如SEQ ID NO1所示的核酸雜交的優選序列是能夠編碼包含基元1和優選地另外包含基元2的蛋白的雜交序列。使用常規技術，例如通過測定細胞周期蛋白A的活性和/或按照實施例部分描述的方法通過簡單地用待測試其功能性的雜交序列替代真實實例中所用的序列，可容易地確定適合用於本發明方法的雜交序列。
因此，根據本發明的另外的實施方案，提供了用於增加植物產量的方法，其包括將能夠和在上文中定義的細胞周期蛋白A核酸，優選地與SEQ ID NO1所示的細胞周期蛋白A核酸雜交的核酸導入植物，該雜交序列有效地連接了種子偏愛的啟動子。
也可使用細胞周期蛋白A核酸(例如SEQ ID NO1所示的核酸)的變通剪接變體實踐本發明的方法。此處使用的術語「變通剪接變體」包括這樣的核酸序列變體，其中已切除、替換或加入了選定的內含子和/或外顯子。這些變體可以是這樣的變體，其中蛋白質的生物學活性未受影響，這可通過選擇性地保留由該核酸編碼的蛋白的功能性片段來實現。這樣的剪接變體可能在自然界中存在，或者可以人工製備。用於製備這些剪接變體的方法在本領域是已知的。優選的剪接變體編碼包含基元1和優選地另外包含基元2的蛋白。使用常規技術，例如通過測定細胞周期蛋白A的活性和/或按照實施例部分描述的方法通過簡單地用待測試其功能性的剪接變體替代真實實例中所用的序列，可容易地確定適合用於本發明方法的細胞周期蛋白A核酸的剪接變體。
因此，根據本發明的另外的實施方案，提供了用於增加植物產量的方法，其包括將細胞周期蛋白A核酸的剪接變體，優選地SEQ ID NO1所示核酸序列的剪接變體導入植物，該剪接變體有效地連接了種子偏愛的啟動子。
有利地，也可使用細胞周期蛋白A核酸的等位基因變體，優選地SEQ ID NO1所示細胞周期蛋白A核酸的等位基因變體，來實踐本發明的方法。等位基因變體存在於自然界中，本發明的方法包括這些天然等位基因的用途。等位基因變體包括單核苷酸多態性(SNPs)以及小的插入/缺失多態性(INDELs)。INDELs的大小通常小於100bp。SNPs和INDELs構成了大多數生物天然存在的多態品系(strain)中的最大序列變體集合。優選的等位基因變體編碼含有基元1和優選地另外含有基元2的蛋白。使用常規技術，例如通過測定細胞周期蛋白A的活性和/或按照實施例部分描述的方法通過簡單地用待測試其功能性的等位基因變體替代真實實例中所用的序列，可容易地確定適用於本發明方法的細胞周期蛋白A核酸的等位基因變體。
因此，根據本發明的另外的方面，提供了用於增加植物產量的方法，其包括將細胞周期蛋白A核酸的等位基因變體，優選地SEQ ID NO1所示細胞周期蛋白A核酸的等位基因變體導入植物，該等位基因變體有效地連接了種子偏愛的啟動子。
細胞周期蛋白A胺基酸變體的例子包括SEQ ID NO2所示細胞周期蛋白A的同源物、衍生物和活性片段。
細胞周期蛋白A蛋白的「同源物」包括，相對於未經修飾的所針對蛋白，具有胺基酸替代、缺失和/或插入並且具有與該未經修飾的蛋白相似的生物和功能活性的肽、寡肽、多肽、蛋白和酶，所述未經修飾的蛋白是其來源蛋白。為產生這些同源物，可用具有相似特性(例如相似的疏水性、親水性、抗原性、形成或斷裂α-螺旋結構或β-摺疊結構的傾向)的其他胺基酸替代該蛋白的胺基酸。保守替代表在本領域是熟知的(參見例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freemanand Company)。優選地，同源物按逐漸增加的優選順序與SEQ ID NO2所示細胞周期蛋白A具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的序列同一性(功能性同一性)。具有至少40％序列同一性的同源物包括細胞周期蛋白As，而不包括任何其他的細胞周期蛋白種類。
同源物的兩種特殊形式，直系同源物(ortholog)和旁系同源物(paralog)，是用於描述基因的祖先關係的進化概念。術語「旁系同源」涉及物種基因組內產生旁系同源基因的基因重複。術語「直系同源」涉及因祖先關係的原因而存在於不同生物體中的同源基因。
例如，通過進行所謂的交互式基本局部比對工具搜索(reciprocal blast search)可容易地發現單子葉植物物種中的直系同源物。可通過第一次基本局部比對來進行該方案，其包括將所關注序列(SEQ ID NO1或SEQ ID NO2)對任何序列資料庫例如可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov上找到的公共可獲得的NCBI資料庫進行基本局部比對。如果搜索水稻中的直系同源物，則將關注序列對例如在NCBI上可獲得的來自日本晴水稻(Oryza sativa Nipponbare)的28，469個全長cDNA克隆進行基本局部比對。當從核苷酸著手進行比較時可使用BLASTn，或者，當從蛋白開始時可使用TBLASTX，其中使用標準的默認值(期望值10，比對值50)。可過濾基本局部比對結果。然後反過來將經過濾的結果或未經過濾的結果的全長序列再對關注序列(SEQ ID NO1或2)進行基本局部比對(第二次基本局部比對)。然後比較第一和第二次基本局部比對的結果。在大家族的情況下，使用ClustalW，然後使用相鄰連接樹(neighbour joining tree)幫助顯示聚類。細胞周期蛋白A直系同源物的例子包括在下列錄入號下登載的序列在蛋白質錄入號AK106653(A3型細胞周期蛋白)下登載的水稻直系同源物、在蛋白質錄入號BAA86628(A1型細胞周期蛋白)下登載的水稻直系同源物和在錄入號AAC50013下登載的玉米直系同源物。
此處所用的術語「同源物」也包括可用於本發明方法中的蛋白的旁系同源物和直系同源物。
蛋白的「替代性變體」是指這樣的蛋白，其中胺基酸序列中的至少一個胺基酸殘基已被去除並且在其位點上插入了不同的殘基。胺基酸替代通常是單一殘基替代，但可以是成簇的胺基酸替代，這依賴於多肽上所置的功能性限制；插入通常是大約1至10個胺基酸殘基，而缺失通常在大約1至20個殘基的範圍內變動。優選地，胺基酸替代包括保守性胺基酸替代。
蛋白的「插入變體」是指這樣的蛋白，其中在蛋白質的預先確定的位點上引入一個或多個胺基酸殘基。插入可包括氨基末端和/或羧基末端融合以及單個或多個胺基酸的序列內插入。通常，胺基酸序列內的插入比氨基或羧基末端融合短，大約為1-10個殘基。氨基或羧基末端融合蛋白或肽的例子包括用於酵母雙雜交系統中的轉錄激活物的結合結構域或激活結構域、噬菌體衣殼蛋白、(組氨酸)6-標籤、穀胱甘肽S轉移酶-標籤、蛋白A、麥芽糖結合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag100表位、c-myc表位、FLAG-表位、lacZ、CMP(鈣調蛋白結合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
蛋白的「缺失變體」的特徵在於從該蛋白上去除一或多個胺基酸。使用本領域熟知的肽合成技術，例如固相肽合成法等，或通過重組DNA操作，可容易地製備蛋白的胺基酸變體。用於操作DNA序列以產生蛋白的替代、插入或缺失變體的方法在本領域是熟知的。例如，用於在DNA中預先確定的位點上產生替代突變的技術對本領域技術人員來說是熟知的，其包括M13誘變、T7-Gen體外誘變(USB，Cleveland，OH)、QuickChange定點誘變(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介導的定點誘變或其他定點誘變方案。
用於細胞周期蛋白A同源物的搜索和鑑定的方法在本領域技術人員的技術範圍之內。用於比較的序列比對方法在本領域是熟知的，這些方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48443-453，1970)的算法以找出兩個完整序列的比對，該比對使匹配的數目最大化並使缺口的數目最小化。BLAST算法用於計算兩個序列之間的百分比序列同一性和進行兩個序列之間的相似性統計學分析。進行BLAST分析的軟體可通過國家生物技術信息中心(National Centre for BiotechnologyInformation)公開獲得。
術語「衍生物」是指和細胞周期蛋白A(例如SEQ ID NO2所示的蛋白)胺基酸序列相比，包含天然和非天然發生的胺基酸殘基的替代、缺失或插入的肽、寡肽、多肽、蛋白和酶。細胞周期蛋白A蛋白的「衍生物」包括這樣的肽、寡肽、多肽、蛋白和酶，其與該多肽的天然發生形式的胺基酸序列相比，可包含天然發生的改變的、糖基化的、乙醯化的或非天然發生的胺基酸殘基。衍生物和其來源胺基酸序列相比，也可包含一個或多個非胺基酸替代，例如報告分子或其他配體，其與該胺基酸序列共價或非共價結合，例如結合其上以促進其檢測的報告分子還可包含和天然發生蛋白的胺基酸序列相比包含非天然發生的胺基酸殘基。
細胞周期蛋白A蛋白的「活性片段」包含至少基元1和優選地另外包含基元2，並保持和天然發生蛋白相似的生物學和/或功能性活性。
用包含目的序列(即細胞周期蛋白A核酸)的載體轉化植物，所述序列有效地連接了種子偏愛的啟動子。
因此，根據本發明的另外的實施方案，提供了這樣的構建體，其包含(i)細胞周期蛋白A核酸；(ii)種子偏愛的啟動子；和可選地(iii)轉錄終止序列。
細胞周期蛋白A核酸可以是任何前述的細胞周期蛋白A序列，包括細胞周期蛋白A變體序列。在下文中定義了合適的種子偏愛的啟動子。
術語「調控元件」、「控制序列」和「啟動子」在此都可互換使用，並且在廣義上是指能夠影響和其連接的序列表達的調控核酸序列。此處使用的術語「有效連接的」是指啟動子序列和目的基因之間的功能性連接，使得啟動子序列能夠起始目的基因的轉錄。
前述術語包括來源於經典的真核細胞基因組基因的轉錄調控序列(包括精確轉錄起始所需的TATA盒，具有或不具有CCAAT盒序列)和額外的調控元件(即上遊激活序列、增強子和沉默子)，其可響應於發育和/或外部刺激或者以組織特異性的方式來改變基因表達。所述術語還包括經典的原核生物基因的轉錄調控序列，在該情況下，其可包括-35盒序列和/或-10盒轉錄調控序列。術語「調控元件」也包括合成的融合分子或衍生物，其在細胞、組織或器官中提供、激活或增強核酸分子的表達。
有利地，可使用任何種子偏愛的啟動子進行本發明的方法。在本發明的上下文中，種子偏愛的啟動子是主要在種子組織中具有活性但不一定只在種子組織中具有活性的啟動子。種子組織包括種子的任何部分，包括種殼、糊粉層、胚乳(對單子葉植物和胚乳雙子葉植物(endospermic dicots)來說)、胚(對於單子葉植物來說包括盾蓋、外胚葉、胚芽、胚根；對於雙子葉植物來說包括子葉、下胚軸和胚根)。用於實踐本發明方法的優選的啟動子是在胚乳中具有活性的啟動子，例如來自水稻的α球蛋白啟動子、燕麥球蛋白啟動子、水稻或小麥谷蛋白啟動子、blz2、水稻轉錄因子RISBZ1。特別優選的是在胚乳中具有活性的啟動子，該啟動子優選地在萌發期間和萌芽之後具有活性，例如來自水稻的谷醇溶蛋白(prolamin)啟動子。
下述表1中列出了適於實施本發明方法的啟動子實例。
表1種子偏愛的啟動子
任選地，也可在導入植物的構建體中使用一個或多個終止子序列。術語「終止子」包括這樣的控制序列，其是轉錄單位末端的DNA序列，其為初始轉錄物的3』加工和聚腺苷醯化以及轉錄的終止提供信號。其他的調控元件可包括轉錄和翻譯增強子。本領域技術人員知道可適合用於進行本發明的終止子和增強子序列。本領域技術人員知道這些序列或可容易地獲得這些序列。
本發明的基因構建體可進一步包括複製序列起點，其是在特定細胞類型中保持和/或複製所需的序列。一個例子是當基因構建體需要在細菌細胞中作為游離體遺傳成分(例如質粒或粘粒分子)保持時的情況。優選的複製起點包括，但不限於f1-ori和colE1。
基因構建體可選地包含選擇標記基因。如此處所用的，術語「選擇標記基因」包括為它在其中表達的細胞提供表型以幫助鑑定和/或選擇被本發明的核酸構建體轉染或轉化的細胞的任何基因。合適的標記可選自提供抗生素或殺蟲劑抗性或導入新的代謝性狀或允許視覺選擇的標記。因而含有重組DNA的細胞能夠在殺死未轉化細胞的抗生素或殺蟲劑濃度存在的情況下存活。選擇標記基因的例子包括提供對殺蟲劑Basta的抗性的bar基因；提供對抗生素卡那黴素的抗性的npt基因；提供潮黴素抗性的hpt基因。視覺標記，例如綠色螢光蛋白(GFP，Haseloff等人，1997)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)或螢光素酶，也可用作選擇標記。
通過使用本領域技術人員熟知的重組DNA技術可構建用於本發明方法的構建體。可將基因構建體插入載體，所述載體可商購獲得，適合用於轉化入植物和適合用於在轉化細胞中表達目的基因。
可將細胞周期蛋白A蛋白自身和/或細胞周期蛋白核酸自身直接導入植物細胞或植物本身(包括導入組織、器官或植物的任何其他部分)。根據本發明的優選的特性，優選地通過轉化將核酸導入植物。
此處提到的術語「轉化」包括將外源多核苷酸轉移入宿主細胞，而與用於轉移的方法無關。能夠進行後續無性繁殖的植物組織，無論是器官發生的還是胚發生的，都可用本發明的基因構建體進行轉化並由此生成整株植物。所選擇的特定組織可依賴於可獲得的用於和最適合於待轉化的特定品種的無性繁殖系統而變。示例性組織靶包括葉盤、花粉、胚、子葉、下胚軸、雌配子體、愈傷組織、已有的分生組織(例如，頂端分生組織、腋芽、和根分生組織)、和誘導的分生組織(例如，子葉分生組織和下胚軸分生組織)。多核苷酸可被瞬時或穩定地導入宿主細胞，並可保持非整合形式，例如作為質粒保持。或者，其也可被整合入宿主基因組。然後可以本領域技術人員已知的方法將所得的經轉化的植物細胞用於再生轉化植物。
現在植物物種的轉化是非常常規的技術。有利地，可將幾種轉化方法中的任一種用於把目的基因導入合適的祖先細胞。轉化方法包括使用脂質體、電穿孔、增加游離DNA攝入的化學物質、將DNA直接注射入植物、顆粒槍轟擊法、使用病毒或花粉的轉化法和顯微注射法。方法可選自用於原生質體的鈣/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等人，1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等人，June 1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生質體的電穿孔法(Shillito R.D.等人，1985Bio/Technol 3，1099-1102)；向植物材料顯微注射(Crossway A.等人，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)；包被DNA或RNA的顆粒轟擊法(Klein T.M.等人，1987，Nature 327，70)；使用(非整合)病毒的感染法等。在水稻轉化的情況下，根據本發明的優選方法是按照Hiei等有關人.1994的方案。對於玉米轉化，包括玉米組織的基於農桿菌的轉化的方法之前已在EP0604662、EP0672752、EP0971578、EP0955371、EP0558676中進行了描述。優選的高效轉化玉米的方法是描述於Ishilda等人(High efficiency transformation of maize(Zea mays L.)mediated by Agrobacterium tumefaciens.NatBiotechnol.1996 Jun；14(6)745-50)和描述於Frame等人(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of maizeembryos using a standard binary Vector system.Plant Physiol.2002 May；129(1)13-22)中的方案。
通常在轉化後，就一個或多個標記的存在與否選擇植物細胞或細胞群(所述標記是由和目的基因一起共轉化的植物可表達基因編碼的)，然後將該被轉化材料再生成完整的植株。
在DNA轉移和再生後，可使用例如Southern分析法就目的基因的存在與否、拷貝數和/或基因組的組織對推定的轉化植物進行評估。可選擇地或另外地，可使用Northern和/或Western分析法監控新導入的DNA的表達水平，這兩個技術對本領域技術人員來說都是熟知的。
可通過各種方法，例如通過無性繁殖或經典的育種技術，來繁殖產生的轉化植物。例如，可將第一代(或T1)轉化植物自交以產生純合的第二代(或T2)轉化體，然後通過經典的育種技術將T2植物進行進一步繁殖。
所生成的轉化生物可採用多種形式。例如，其可以是轉化細胞和非轉化細胞的嵌合體；無性繁殖的轉化體(例如，所有細胞被轉化而含有表達盒)；轉化和未轉化組織的嫁接物(例如，在植物中，被轉化的砧木(rootstock)嫁接未轉化的接穗)。
很明顯本發明擴展至由此處描述的任一方法產生的任何植物細胞或植物，並擴展至其所有植物部分和繁殖體。本發明進一步擴展至包括通過前述方法中任一種方法產生的初級轉化或轉染的細胞、組織或整株植物的後代，唯一的要求是後代表現出和通過本發明的方法在親本中產生的基因型和/或表型特徵相同的基因型和/或表型特徵。本發明也包括含有分離的細胞周期蛋白A核酸分子，優選地編碼細胞周期蛋白A蛋白的核酸分子的宿主細胞。本發明的優選的宿主細胞是植物細胞。本發明也擴展至植物的可收穫部分，例如、但不限於種子、葉、果實、花、莖培養物、莖、根莖、根、塊莖和球莖。
此處所用的術語「植物」包括完整的植物、植物的祖先和後代以及植物的部分，包括種子、枝條、莖、根(包括塊莖)和植物細胞、組織和器官。因此術語「植物」也包括懸浮培養物、胚、分生組織區、愈傷組織、葉、種子、根、枝條、配子體、孢子體、花粉和小孢子。
在本發明中特別有用的植物包括屬於植物界(Viridiplantae)超家族特別是單子葉植物和雙子葉植物的所有植物，包括選自下述的飼料或豆科飼料、觀賞植物、糧食作物、樹或灌木金合歡(Acaciaspp.)、槭(Acers pp.)、獼猴桃(Actinidia spp.)、七葉樹(Aesculusspp.)、紐西蘭貝殼杉(Agathis astralis)、Albizia amara、Alsophila tricolor、Andropogon spp.、落花生(Arachis spp)、檳榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、鷹嘴紫雲英(Astragaluscicer)、多小葉紅蘇木(Baikiaea plurijuga)、樺木(Betula spp.)、芸苔(Brassica spp.)、木欖(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkeaafricana、紫鉚樹(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱櫻花(Calliandra spp)、茶樹(Camellia sinensis)、美人蕉(Cannaindica)、辣椒(Capsicum spp.)、決明(Cassiaspp.)、Centroemapubescens、木瓜(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffeaa arabica)、繡球小冠花(Colophospermum mopane)、Coronillia varia、Cotoneaster serotina、山楂(Crataegus spp.)、香瓜(Cucumis spp.)、柏木(Cupressus spp.)、Cyathea dealbata、榲桲(Cydonia oblonga)、Cryptomeria japonica、香茅(Cymbopogonspp.)、Cynthea dealbata、榲桲(Cydonia oblonga)Dalbergiamonetaria、Davallia divaricata、山螞蝗(Desmodium spp.)、Dicksonia squarosa、Diheteropogon amplectens、Diocles spp、鐮扁豆(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、Echinochloapyramidalis、Ehrartia spp.、(Eleusine coracana)、Eragrestisspp.、刺桐類(Erythrina spp.)、桉樹(Eucalyptus spp.)、Eucleaschimperi、Eulalia villosa、蕎麥(Fagopyrum spp.)、南美稔(Feijoasellowiana)、草莓屬(Fragaria spp.)、千斤拔(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geranium thunbergii、銀杏(Ginkgo biloba)、Glycine javanica、Gliricidia spp、陸地棉(Gossypium hirsutum)、銀樺(Grevillea spp.)、Guibourtia coleosperma、巖黃芪(Hedysarumspp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、黃茅(Heteropogoncontortus)、大麥(Hordeum vulgare)、紅苞芽(Hyparrhenia rufa)、小連翹(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、Indigoincarnata、鳶尾(Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、Lespedizaspp.、Lettuca spp.、銀合歡(Leucaena leucocephala)、Loudetiasimplex、Lotonus bainesii、百脈根(Lotus spp.)、Macrotylomaaxillare、蘋果(Malus pp.)、木薯(Manihot esculenta)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、大蕉(Musa sapientum)、菸草(Nicotianum spp.)、驢食草(Onobrychisspp.)、Ornithopus spp.、稻(Oryza spp.)、Peltophorum africanum、狼尾草屬(Pennisetum spp.)、Persea gratissima、碧冬茄(Petuniaspp.)、菜豆(Phaseolus spp.)、Phoenix canariensis、紐西蘭劍麻(Phormium cookianum)、石楠(Photinia spp.)、Picea glauca、松樹(Pinus spp.)、豌豆(Pisum sativum)、紐西蘭羅漢松(Podocarpustotara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthria squarrosa、楊屬(Populus pp.)、瓜葉牧豆樹(Prosopis cineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、西洋梨(Pyruscommunis)、櫟(Quercus spp.)、Rhaphiolepsis umbellata、Rhopalostylis sapida、Rhus natalensis、Ribes grossularia、茶藨子(Ribes spp.)、刺槐(Robinia pseudoacacia)、薔薇(Rosaspp.)、懸鉤子(Rubus spp.)、柳(Salix spp.)、Schyzachyriumsanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、北美紅杉(Sequoiasempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、高粱(Sorghumbicolor)、菠菜(Spinacia spp.)、Sporobolus fimbriatus、Stiburusalopecuroides、Stylosanthos humilis、葫蘆茶(Tadehagi spp)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黃背草(Themeda triandra)、三葉草屬(Trifolium spp.)、小麥屬(Triticum spp.)、異葉鐵杉(Tsuga heterophylla)、越桔(Vaccinium spp.)、野豌豆(Viciaspp.)、葡萄(Vitis vinifera)、Watsonia pyramidata、馬蹄蓮(Zantedeschia aethiopica)、玉蜀黍(Zea mays)、覓菜(amaranth)、朝鮮薊(artichoke)、蘆筍(asparagus)、西蘭花(broccoli)、芽甘藍(Brussels sprouts)、圓白菜(cabbage)、芸苔(canola)、胡蘿蔔(carrot)、花椰菜(cauliflower)、芹菜(celery)、甘藍(collard greens)、亞麻(flax)、羽衣甘藍(kale)、小扁豆(lentil)、油籽油菜(oilseed rape)、秋葵(okra)、洋蔥(onion)、馬鈴薯(potato)、水稻、大豆、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、蕃茄、squashtea、樹和藻類等。
根據本發明的優選的實施方案，植物是作物植物，包括蕃茄、馬鈴薯、菸草、黑麥、大豆、向日葵、油菜、紫花苜蓿、油菜籽或棉花。更優選地，本發明的植物是單子葉植物，例如甘蔗。最優選的，所述植物是穀物，例如燕麥、黑麥、水稻、玉米、小麥、粟、高粱或大麥。
本發明也包括可通過本發明的方法獲得的植物。因此本發明提供了可通過本發明的方法獲得的植物，所述植物和對照植物相比具有增加的產量，其中所述植物在植物種子組織中也具有細胞周期蛋白A的優先表達。
根據本發明的另外的實施方案，提供了生產和對照植物相比具有增加的產量的轉基因植物的方法，所述方法包括將有效地連接了種子偏愛的啟動子的細胞周期蛋白A核酸導入植物。細胞周期蛋白A可以是SEQ ID NO1所示的核酸或可以是在上文中定義的細胞周期蛋白A核酸變體中的任一種，或可以是落在上文所述細胞周期蛋白A核酸的定義範圍內的任何核酸。
圖表描述現在參考下列圖表對本發明進行描述，其中


圖1.通過幾個全長細胞周期蛋白A蛋白序列(除了1部分水稻序列外)的比對產生的系統發生樹。使用聚類程序(Clustal program)利用默認設置進行比對並將比對顯示為系統發育圖。如圖所示，序列聚類在顯示的4個主要群體中。
圖2.用於在水稻(Oryza sativa)中在PROLAMIN啟動子控制下表達擬南芥細胞周期蛋白A2；2基因的二元載體。該載體含有來自Ti質粒、由左邊界(LB重複，LB Ti C58)和右邊界(RB重複，RB TiC58)界定的T-DNA。
圖3.是顯示在細胞周期蛋白A中發現的跨種保守性基元的表。基元1可用於區分細胞周期蛋白A和其他類型的細胞周期蛋白，基元1和基元2一起可用於區分A2細胞周期蛋白和任何其他A型周期蛋白。作為對照，顯示了在細胞周期蛋白B；1中發現的基元。
圖4.是用於本發明方法的序列表。
序列描述SEQ ID NO1表示用於本發明方法的細胞周期蛋白A2；2核酸。除了兩個替代外，其與以錄入號NM_121168保藏的序列的編碼序列相同，其中第一個替代在位點851上，為C替代成G，第二個替代在位點1295上，為C替代T。據認為這些變化不會產生任何後果。
SEQ ID NO2表示由SEQ ID NO1的核酸編碼的細胞周期蛋白A2；2的胺基酸序列。其與以錄入號NP_568248登載的序列相同，除了其含有兩個胺基酸替代外，其中第一個替代在位點284上，為脯氨酸替代精氨酸，第二替代在位點432上，為絲氨酸替代苯丙氨酸。據認為這些變化不產生任何後果。
SEQ ID NO3是來自水稻的谷醇溶蛋白啟動子的代表。
SEQ ID NO4和SEQ ID NO5表示用於基因克隆的引物的序列。
實施例現在用下列實施例描述本發明，所述實施例只是用於說明目的。
DNA操作除非另外提到，根據在(Sambrook(2001)Molecular Cloningalaboratory manual，第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York)中或Ausubel等人.(1984)，Current Protocols inMolecular Biology，Current Protocols的第1和2卷中描述的標準方案進行重組DNA技術。在由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK)出版的R.D.D.Croy編著的Plant Molecular Biology Labfase(1993)中描述了用於植物分子操作的標準材料和方法。
實施例1基因克隆使用擬南芥幼苗cDNA文庫(Invitrogen，Paisley，UK)作為模板通過PCR擴增擬南芥細胞周期蛋白A2；2(內參照CDS95)。在對從幼苗提取的RNA逆轉錄後，將cDNAs克隆入pCMV Sport 6.0。文庫的平均插入片段大小為1.5kb，克隆的原始數目為1.59×107cfu。原始滴度經確定為9.6×105cfu/ml，第一輪擴增後為6×1011cfu/ml。在提取質粒後，在50μl PCR混合物中使用200ng模板。包含用於Gateway重組的AttB位點的引物prm582(正向引物，起始密碼子以粗體標示，AttB1位點以斜體標示5』ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcacaatgtattgctcttcttcgatgc 3』)和prm583(反向引物，互補物，終止密碼子以粗體標示，AttB2位點以斜體標示5』5』ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgcttggtgtcatcttgagaatag 3』)用於PCR擴增。使用Hifi Taq DNA聚合酶在標準條件下進行PCR。也使用標準的方法擴增和純化1311bp的PCR片段。然後進行Gateway方法(BP反應)的第一步驟，在此期間PCR片段與pDONR201質粒在體內重組，產生按照Gateway術語學被稱為「入門克隆(entry clone)」的p754。質粒pDONR201購自Invitrogen，作為Gateway技術的部分。
實施例2載體構建然後將含有細胞周期蛋白A2.2的入門克隆和用於水稻轉化的目的載體用於LR反應。該載體含有在T-DNA邊界內的功能性元件植物選擇性標記；視覺標記；和用於和已在入門克隆中克隆的目的序列進行LR體內重組的Gateway盒。用於過量表達的谷醇溶蛋白啟動子(PRO90)位於該Gateway盒的上遊。
在LR重組步驟後，將如圖2中所示的所得表達載體(細胞周期蛋白A2；2谷醇溶蛋白-上調)轉化入農桿菌中，然後再轉化入水稻植物。讓經轉化的水稻植物生長，然後就實施例3中描述的參數對其進行檢測。
實施例3評估和結果A.統計學分析F-檢驗將二因子ANOVA(變量分析)用作統計學模型進行植物表型性狀的總體評估。對針對用本發明的基因進行轉化的所有事件的所有植物測量的所有參數進行F檢驗。進行F檢驗以檢查基因對所有轉化事件的影響和確定基因的總體效應，也稱作「全局基因效應」。如果F檢驗的值顯示數據是顯著的，那麼可得出存在「基因」效應的結論，意味著不僅僅是基因的存在或位置導致了表型的差異。對於F檢驗，真實全局性基因效應的顯著性閾值設在5％的概率水平。
B.評估方案產生大約15至20株獨立的T0水稻轉化子。將初級轉化子從組織培養室轉移至溫室中培養並收穫T1種子。保留幾個這樣的事件，其中在所述事件中，T1後代中轉基因的存在/不存在以3∶1比例發生分離。對這些事件中的每一個事件，選擇大約10個含有轉基因(雜合子和純合子)T1幼苗，和大約10個缺少轉基因(零合子(nullizygotes))的T1幼苗。
(i)營養生長測量值將選擇的T1植物(大約10個具有轉基因的和大約10個無轉基因的)轉移至溫室中。各植物接受獨特的磁帶條形碼標記以明確地將表型確定數據和對應的植物關聯。在下列環境設置下將選擇的T1植物種植在直徑10cm花盆中的土壤上光周期＝11.5小時、日照強度＝30,000勒克斯或更多、日間溫度＝28℃或更高、夜間溫度＝22℃、相對溼度＝60-70％。將轉基因植物和相應的零合子以隨機的位置並行種植。從播種階段至成熟階段，將各植物數次通過數碼成像室並照象。在各時間點，從至少6個不同的角度對各植物進行數碼成像(2048×1536像素，1600萬種顏色)。使用圖象分析軟體以自動的方法從所有植物的數碼圖象推算出參數，例如地上部分面積。
(ii)種子相關參數測量值收穫、袋裝、磁帶條形碼標記成熟主穗(primary panicle)，然後在烘箱中在37℃下乾燥三天。然後將穗子脫粒，收集所有種子並計數。使用吹風設備將飽滿的殼和空殼分離。棄去空殼並對剩下的部分進行計數。在分析天秤上對飽滿的殼稱重。由該方法得到成套的下面描述的種子關聯參數。
(a)總的種子數目通過計數從植物收穫的殼的數目來測量總種子數目。來自在種子偏愛的啟動子(谷醇溶蛋白)控制之下表達細胞周期蛋白A2；2的植物的總種子數目的結果顯示於下面的表2中。
表2細胞周期蛋白A2；2種子偏愛的啟動子(谷醇溶蛋白)的總種子數目
來自在組成型啟動子控制之下表達細胞周期蛋白A2；2的植物的總種子數目(數據未顯示)少於獲自由谷醇溶蛋白啟動子驅動表達細胞周期蛋白A2；2基因的植物的總種子數目(如上所示，從F檢驗得到顯著的p值，表明存在總體基因效應)。
(b)飽滿種子數目通過計算在分離步驟後剩下的飽滿外殼的數目來確定飽滿種子數目。下面顯示來自在種子偏愛的啟動子(谷醇溶蛋白)控制之下表達細胞周期蛋白A2；2的植物的飽滿種子數目(表3為T1植物，表4為T2植物)以及來自在組成型啟動子控制之下表達細胞周期蛋白A2；2的植物的飽滿種子數的結果(表5)。
表3T1評估-細胞周期蛋白A2；2pProlamin的飽滿種子數目
結果顯示了顯著的總體基因效應(F檢驗中有顯著的p值)。和對照植物相比，T1轉基因植物表現出飽滿種子數目有顯著的增加。
表4T2評估-細胞周期蛋白A2；2pProlamin飽滿種子的數目
結果顯示有顯著的總體基因效應(F檢驗中有顯著的p值)。和對照植物相比，T2轉基因植物表現出飽滿種子數目有顯著的增加。
表5細胞周期蛋白A2；2pGOS2飽滿種子數目
相對於對照植物，在組成型啟動控制之下表達細胞周期蛋白A2；2的植物的飽滿種子數增加，然而在谷醇溶蛋白啟動子控制下表達細胞周期蛋白A2；2的植物顯示更多的飽滿種子數目(參見上面的表3和表4)。
(b)總種子產量通過稱量從植物中收穫的所有飽滿外殼的重量來測量每株植物的總種子產量。下面顯示了在谷醇溶蛋白啟動子(pProlamin)控制之下表達細胞周期蛋白A2；2的植物的總種子產量(對於T1評估結果參見表6，對於T2評估結果參見表7)和在pGOS2控制下表達細胞周期蛋白A2；2的植物的總種子產量(參見表8)的結果。
表6T1評估-細胞周期蛋白A2；2pProlamin總種子產量
T1評估的結果顯示有總體基因效應，在F檢驗中有顯著的p值。
表7T2評估-細胞周期蛋白A2；2pProlamin的總種子產量
T2評估的結果顯示有總體基因效應，在F檢驗中有顯著的p值。
表8細胞周期蛋白A2；2pGOS2的總種子產量
如表8所顯示的，組成型表達細胞周期蛋白A2；2的植物的總種子產量不如種子優選的表達的結果好(參見上面的表6和表7)。
(d)收穫指數此處定義收穫指數為總種子產量和地上面積(mm2)之間的比例乘以因數106。在種子偏愛的啟動子(谷酵溶蛋白)控制之下表達細胞周期蛋白A2；2的植物的收穫係數顯示於下列的表9中。
表9細胞周期蛋白A2；2pProlamin的收穫指數
細胞周期蛋白A2；2pProlamin表達植物的收穫指數顯示存在總體基因效應(參見來自F檢驗的p值)。在組成型啟動子控制之下表達細胞周期蛋白A2；2的植物的收穫指數(數據未顯示)不如上面表9中顯示的結果好。
(e)千粒重(TKW)從計算的飽滿種子數目和其總重量推算TKW。下面顯示表達細胞周期蛋白A2；2pProlamin的植物的TKW(參見表10)與表達細胞周期蛋白A2；2pGOS2的植物的TKW(參見表11)的結果。
表10細胞周期蛋白A2；2；pProlamin的TKW
上表顯示了來自F檢驗的顯著性p值，從中可明顯看出總體基因效應。
表11周期蛋白A2；2pGOS2的千粒重
細胞周期蛋白A2；2pGOS2的千粒重的結果顯示TKW有增加，但所述增加不如上面表10中顯示的增加大。
(iii)逆境評估細胞周期蛋白A2；2pProlamin播種種子，在10天後，將幼苗移栽至裝有1∶1溼沙和蛭石混合物的10cm直徑花盆中。將所述10cm直徑花盆插入12cm直徑花盆中，在兩個花盆之間放置一層塑料織物以阻止下土層流失。然後在移栽前用新鮮的水浸透花盆。在移栽一天後，使幼苗接受鹽條件。
每天在8am、12am、4pm和9pm用含有下列成分的鹽逆境誘導性營養物溶液澆灌花盆4次·NPK營養物混合物，濃度為1kg/m3的20-20-20Petersprofessional(Scotts)。
·Magnesium chelate，333.33ml/m3的Chelal Mg(BMS，Bornem，Belgium)·Iron chelate，21.67g/m3的Libfer(CIBA，Bradford，UK)·1.425kg/m3的NaCl在每周的基礎上監控鹽濃度，需要時加入鹽。在鹽逆境條件下培養植物直至穀粒充盈開始。在此時間點上，將其轉移至溫室的不同區室中，在那裡每天用新鮮的水澆灌其直至種子收穫。然後以和上面(a)至(e)中針對非逆境植物所述相同的方式測量和記錄下列參數。
表12細胞周期蛋白A2；2pProlamin的總種子產量
由針對在以鹽逆境為例的逆境條件下細胞周期蛋白A2；2pProlamin植物進行的F-檢驗的P值可明顯看出，表12中的結果顯示有顯著的基因效應。
表13細胞周期蛋白A2；2pProlamin的飽滿種子數目
表13中的結果顯示有顯著的基因效應，這由針對在以鹽逆境為例的逆境條件下細胞周期蛋白A2；2pProlamin植物進行的F-檢驗的P值可明顯看出這一點。
表14細胞周期蛋白A2；2pProlamin的種子總數
表14中的結果表明，相對於對照植物，種子總數有增加。
表15細胞周期蛋白A2；2pProlamin的收穫係數
表15中的結果顯示，相對於對照植物，收穫指數有增加。
表16細胞周期蛋白A2；2pProlamin的TKW
由針對在以鹽逆境為例的逆境條件下細胞周期蛋白A2；2pProlamin植物進行的F-檢驗的P值可明顯看出，表16中的結果顯示有顯著的基因效應。
實施例4本發明在玉米中的應用此處描述的本發明也可用於玉米。在適合用於土壤桿菌介導的玉米轉化的植物轉化載體中，將細胞周期蛋白A克隆在種子偏愛的啟動子的控制之下。在文獻(EP0604662、EP0672752、EP0971578、EP0955371、EP0558676；Ishida等人，1996；Frame等人，2002)中已描述了這些用於玉米轉化的載體和方法。
將由這些方法產生的轉基因植物在溫室中進行培養以生產T1種子。通過定量實時PCR和Southern印跡分析法檢測轉基因的遺傳能力和拷貝數，並通過逆轉錄PCR和Northern分析法確定轉基因的表達水平。選擇具有轉基因單拷貝插入和具有不同轉基因表達水平的轉基因系用於生產T2種子。在適合玉米的條件(16:8的光周期、26-28℃日間溫度和22-24℃夜間溫度)下以及在缺水、缺氮和過量NaCl的條件下，在溫室中萌發和培養後代種子。
在自交的情況下，來自相同親本系的無效分離子以及相同栽培品種的野生型植物用作對照。就不同的生物量和生長參數對通過自交或雜交產生的後代植物進行評估，所述生長參數包括植物高度、稈/莖粗度、葉片數目、總地上面積、葉片綠度、成熟時間、抽絲時間、開花時間、穗數目、穗長度、行數(row number)、穀粒數目、穀粒大小、穀粒含油量、穀粒成熟度、收穫時間。選擇對於上述參數中任一種獲得最顯著提高的系進行進一步的田間檢測和標誌輔助育種(marker-assisted breeding)，目的是將田間驗證的轉基因性狀轉移入商業化種質中。在本領域內已很好地建立了在田間檢測和玉米生長和產量相關的參數的方法以及用於將特定基因座(含有轉基因的基因座)從一種種質漸滲入另一種種質的技術。這也包括將感興趣的性狀從經轉化的近交系轉移至具有想要的農藝或營養或藥物價值的商業化雜種中。
序列表110CropDesign N.V.
120具有增加產量的植物及其生產方法130CD-106-PCT150US 60/532,2871512003-12-221605170PatentIn version 3.321012111311212DNA213擬南芥(Arabidopsis thaliana)220
221misc_feature223以錄入號NM_121168登載的序列的編碼序列變體在第851位含有G而不是C，在第1295位含有T而不是C4001atgtattgct cttcttcgat gcatccaaat gcaaacaaag aaaatatctc tacttcagat60gtacaggaga gttttgtacg aataacgaga tcacgagcta aaaaagccat gggaagagga120gtatcaatac ctccaacaaa accttctttt aaacagcaaa agagacgtgc agtacttaag180gatgtgagta atacctctgc agatattatt tattcagaac ttcgaaaggg aggcaacatc240aaggcaaaca gaaaatgtct aaaagagcct aaaaaagcag caaaggaagg tgctaacagt300gccatggata ttctggtaga tatgcataca gaaaaatcaa aattagcaga agatttgtcc360aagatcagga tggctgaagc ccaagatgtc tctctttcaa actttaaaga tgaagaaatt420actgagcaac aagaagatgg atcaggtgtc atggagttac ttcaagttgt agatattgat480tccaacgtcg aagatccaca gtgttgcagc ttgtatgctg ctgatatata tgacaacata540catgttgcag agcttcaaca acgacccttg gctaattata tggagcttgt gcagcgagat600atcgacccag acatgagaaa gattctgatt gactggcttg tagaagtttc tgacgactac660aagctggttc cagatacgct ttaccttaca gtgaatctta tcgaccggtt tctgtccaac720agttacattg aaaggcaaag actccagctc cttggtgtct cttgcatgct tatagcttca780aaatatgaag agctttccgc accaggggtg gaggagtttt gcttcattac ggccaacaca840tacacaagac cagaagtgct gagcatggag attcaaattc taaattttgt gcactttaga900ttatcggttc ctaccaccaa aacatttctg aggcggttca ttaaagcagc tcaagcttcg960tacaaggtgc ctttcattga actggagtat ttagcaaact atctcgccga attgacactg1020gtggaatata gtttcctaag gttcctgcca tcactaattg ctgcttcagc tgttttccta1080gcccgatgga cactcgacca aactgaccat ccttggaacc ctactctgca acactacacc1140agatatgagg tagctgagct gaagaacaca gttctcgcca tggaggactt gcagctcaac1200accagtggct gtactctcgc tgccacccgt gagaaataca accaaccaaa gtttaagagc1260gtggcaaagc tgacatctcc caaacgagtc acatcactat tctcaagatg a 1311
2102211436212PRT213擬南芥220
221MISC_FEATURE223以錄入號NP_568248登載的序列變體在第284位含有精氨酸而非脯氨酸，在第432位含有苯丙氨酸而非絲氨酸4002Met Tyr Cys Ser Ser Ser Met His Pro Asn Ala Asn Lys Glu Asn Ile1 5 10 15Ser Thr Ser Asp Val Gln Glu Ser Phe Val Arg Ile Thr Arg Ser Arg20 25 30Ala Lys Lys Ala Met Gly Arg Gly Val Ser Ile Pro Pro Thr Lys Pro35 40 45Ser Phe Lys Gln Gln Lys Arg Arg Ala Val Leu Lys Asp Val Ser Asn50 55 60Thr Ser Ala Asp Ile Ile Tyr Ser Glu Leu Arg Lys Gly Gly Asn Ile65 70 75 80Lys Ala Asn Arg Lys Cys Leu Lys Glu Pro Lys Lys Ala Ala Lys Glu85 90 95Gly Ala Asn Ser Ala Met Asp Ile Leu Val Asp Met His Thr Glu Lys100 105 110Ser Lys Leu Ala Glu Asp Leu Ser Lys Ile Arg Met Ala Glu Ala Gln115 120 125Asp Val Ser Leu Ser Asn Phe Lys Asp Glu Glu Ile Thr Glu Gln Gln130 135 140Glu Asp Gly Ser Gly Val Met Glu Leu Leu Gln Val Val Asp Ile Asp145 150 155 160Ser Asn Val Glu Asp Pro Gln Cys Cys Ser Leu Tyr Ala Ala Asp Ile165 170 175Tyr Asp Asn Ile His Val Ala Glu Leu Gln Gln Arg Pro Leu Ala Asn180 185 190Tyr Met Glu Leu Val Gln Arg Asp Ile Asp Pro Asp Met Arg Lys Ile195 200 205
Leu Ile Asp Trp Leu Val Glu Val Ser Asp Asp Tyr Lys Leu Val Pro210 215 220Asp Thr Leu Tyr Leu Thr Val Asn Leu Ile Asp Arg Phe Leu Ser Asn225 230 235 240Ser Tyr Ile Glu Arg Gln Arg Leu Gln Leu Leu Gly Val Ser Cys Met245 250 255Leu Ile Ala Ser Lys Tyr Glu Glu Leu Ser Ala Pro Gly Val Glu Glu260 265 270Phe Cys Phe Ile Thr Ala Asn Thr Tyr Thr Arg Pro Glu Val Leu Ser275 280 285Met Glu Ile Gln Ile Leu Asn Phe Val His Phe Arg Leu Ser Val Pro290 295 300Thr Thr Lys Thr Phe Leu Arg Arg Phe Ile Lys Ala Ala Gln Ala Ser305 310 315 320Tyr Lys Val Pro Phe Ile Glu Leu Glu Tyr Leu Ala Asn Tyr Leu Ala325 330 335Glu Leu Thr Leu Val Glu Tyr Ser Phe Leu Arg Phe Leu Pro Ser Leu340 345 350Ile Ala Ala Ser Ala Val Phe Leu Ala Arg Trp Thr Leu Asp Gln Thr355 360 365Asp His Pro Trp Asn Pro Thr Leu Gln His Tyr Thr Arg Tyr Glu Val370 375 380Ala Glu Leu Lys Asn Thr Val Leu Ala Met Glu Asp Leu Gln Leu Asn385 390 395 400Thr Ser Gly Cys Thr Leu Ala Ala Thr Arg Glu Lys Tyr Asn Gln Pro405 410 415Lys Phe Lys Ser Val Ala Lys Leu Thr Ser Pro Lys Arg Val Thr Ser420 425 430Leu Phe Ser Arg4352103211654212DNA
213Oryza sativa4003cttctacatc ggcttaggtg tagcaacacg actttattat tattattatt attattatta60ttattttaca aaaatataaa atagatcagt ccctcaccac aagtagagca agttggtgag120ttattgtaaa gttctacaaa gctaatttaa aagttattgc attaacttat ttcatattac180aaacaagagt gtcaatggaa caatgaaaac catatgacat actataattt tgtttttatt240attgaaatta tataattcaa agagaataaa tccacatagc cgtaaagttc tacatgtggt300gcattaccaa aatatatata gcttacaaaa catgacaagc ttagtttgaa aaattgcaat360ccttatcaca ttgacacata aagtgagtga tgagtcataa tattattttc tttgctaccc420atcatgtata tatgatagcc acaaagttac tttgatgatg atatcaaaga acatttttag480gtgcacctaa cagaatatcc aaataatatg actcacttag atcataatag agcatcaagt540aaaactaaca ctctaaagca accgatggga aagcatctat aaatagacaa gcacaatgaa600aatcctcatc atccttcacc acaattcaaa tattatagtt gaagcatagt agta 654210421156212DNA213人工序列220
223序列PRM5824004ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgtat tgctcttctt cgatgc56210521152212DNA213人工序列220
223引物PRM5834005ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtg cttggtgtca tcttgagaat ag5權利要求
1.用於增加植物產量的方法，其包括將細胞周期蛋白A核酸，優選地編碼細胞周期蛋白A蛋白的核酸導入植物，該細胞周期蛋白A核酸有效地連接了種子偏愛的啟動子。
2.權利要求1的方法，其中所述植物產量選自下列中的一項或多項各相對於對應的對照植物而言，有增加的種子重量、增加的飽滿種子數目、增加的種子數目、增加的種子大小、增加的收穫指數、增加的千粒重和經修飾的種子組成。
3.權利要求1或2的方法，其中所述細胞周期蛋白A蛋白包含由WLV/IEVS/AD/ED/EYK/R/TL構成的基元。
4.權利要求1至3中任一項的方法，其中所述細胞周期蛋白A核酸是選自細胞周期蛋白A2；1、細胞周期蛋白A；2；2、細胞周期蛋白A2；3和細胞周期蛋白A2；4的細胞周期蛋白A2。
5.權利要求4的方法，其中所述細胞周期蛋白A2包含由WLV/IEVS/AD/ED/EYK/R/TL構成的基元和由ELTLV/I/T/M D/E/MY T/S/H/P/GFR/L L/R/K/NFLPS構成的、具有殘基(--T-----F--F---)中的至少兩個殘基的基元。
6.權利要求1至5中任一項的方法，其中所述細胞周期蛋白A是選自下列的細胞周期蛋白A序列變體(i)細胞周期蛋白A核酸的功能性部分；(ii)能和細胞周期蛋白A核酸/基因雜交的序列；(iii)細胞周期蛋白A核酸/基因的變通剪接變體；(iv)細胞周期蛋白A核酸/基因的等位基因變體；(v)由於遺傳密碼的簡併性產生的變體；和(vi)細胞周期蛋白A蛋白的同源物、衍生物和活性片段。
7.權利要求6的方法，其中(i)至(v)的細胞周期蛋白A變體能夠編碼包含由WLV/IEVS/AD/ED/EYK/R/TL構成的基元和由ELTLV/I/T/M D/E/M YT/S/H/P/GFR/L L/R/K/NFLPS構成的、具有殘基(--T-----F--F---)中至少兩個殘基的基元的蛋白質。
8.權利要求6的方法，其中所述(vi)的細胞周期蛋白A變體包含由WLV/IEVS/AD/ED/EYK/R/TL構成的基元和由ELTLV/I/T/MD/E/M YT/S/H/P/GFR/L L/R/K/NFLPS構成的、具有殘基(--T-----F--F---)中至少兩個殘基的基元。
9.權利要求1至8中任一項的方法，其中所述種子偏愛的啟動子是在胚乳中具有活性的啟動子。
10.權利要求9的方法，其中所述啟動子是谷醇溶蛋白啟動子。
11.權利要求1至10中任一項的方法，其中所述增加的產量在最適和亞最適的生長條件下獲得。
12.權利要求11的方法，其中所述亞最適生長條件包括非生物逆境條件，例如鹽逆境。
13.權利要求1至12中任一項的方法，其中所述植物選自水稻、玉米、小麥、大麥、大豆、向日葵、芸苔、甘蔗、紫花苜蓿、粟、大麥、油籽油菜(rapeseed)、高粱和棉花。
14.可通過權利要求1至13中任一項的方法獲得的植物。
16.構建體，其包含(i)編碼下述蛋白質的核酸，該蛋白質包含由WLV/IEVS/AD/ED/EYK/R/TL構成的基元和任選地另外包含由ELTLV/I/T/MD/E/M YT/S/H/P/GFR/L L/R/K/NFLPS構成的、具有殘基(--T-----F--F---)中至少兩個殘基的基元；(ii)種子偏愛的啟動子；和可選地(iii)轉錄終止子序列。
16.權利要求15的構建體，其中所述種子偏愛的啟動子是在胚乳中有活性的啟動子。
17.權利要求16的構建體，其中所述啟動子是谷醇溶蛋白啟動子。
18.在種子偏愛的啟動子控制下表達細胞周期蛋白A的植物，其中所述細胞周期蛋白A包含由WLV/IEVS/AD/ED/EYK/R/TL構成的基元以及可選地另外包含由ELTLV/I/T/M D/E/M YT/S/H/P/GFR/L L/R/K/NFLPS構成的、具有殘基(--T-----F--F---)中至少兩個殘基的基元，該植物和相應的野生型植物以及和組成型表達細胞周期蛋白A的轉基因植物相比，具有增加的產量。
19.權利要求18的植物，其中所述種子偏愛的啟動子是在胚乳中有活性的啟動子。
20.權利要求19的植物，其中所述啟動子是谷醇溶蛋白啟動子。
全文摘要
本發明涉及通過將細胞周期蛋白A的核酸，優選地編碼細胞周期蛋白A蛋白的核酸導入植物來增加植物產量的方法，該細胞周期蛋白A的核酸有效地連接至種子偏愛的啟動子上。通過使用該方法，在最適和亞最適生長條件下可增加植物的產量。由該方法生成了相對於相應的野生型植物和相對於組成型地表達細胞周期蛋白A的轉基因植物而言，具有增加的產量的植株。
文檔編號A01H5/00GK1906304SQ200480040587
公開日2007年1月31日 申請日期2004年12月22日 優先權日2003年12月22日
發明者V·弗朗卡德, V·米羅諾夫 申請人:作物培植股份有限公司