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無乳鏈球菌抗原Ⅰ和Ⅱ的製作方法

2023-04-24 20:39:51

專利名稱:無乳鏈球菌抗原Ⅰ和Ⅱ的製作方法
無乳鏈球菌抗原丨和I I本申請是2004年05月06日提交的2004800012219. 8號發明專利申請「無乳鏈球 菌抗原I和II」的分案申請。本發明涉及編碼無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)抗原的分離的核酸分 子,所述分子適合用於預防和治療無乳鏈球菌引起的細菌感染的藥物藥劑的製備無乳鏈球菌是革蘭氏陽性細菌,基於其血瓊脂上的溶血模式屬於B組鏈球菌 (GBS)。所述生物體是有莢膜的,莢膜是致病重要的元素。莢膜是抗原性的,並形成通過血 清型分類GBS的基礎。已經鑑定出九個截然不同的GBS血清型la、lb、II、III、IV、V、VI、 VII和VIII。顯示多數無乳鏈球菌血清型引起嚴重的疾病,估計兩個最普遍的血清型-in 和V型-負責世界上大多數的侵入性疾病。分級和血清型的流行因年齡組和地理範圍而不 同。在美國,GBS III型造成多於50%的嬰兒疾病,V型造成大約40%的非孕成人疾病,la 型造成大約三分之一任何患者群的疾病。無乳鏈球菌在極端年齡和有潛在疾病的那些人是很重要的人類疾病的原因。B組 鏈球菌是新生兒全身和局部感染的主要原因。自從二十世紀七十年代,GBS是美國新生兒 的主要病原體。細菌感染能導致威脅生命的疾病,例如敗血症、肺炎和腦膜炎。存活者變成 有聽力、學習和視力殘疾的終身殘廢。新生兒通常在分娩期或他們有GBS群集(colonized) 的母親生產時獲得所述生物體。另外,GBS也是懷孕婦女以及慢性疾病和年長患者感染的常 見原因,例如遭受糖尿病、惡性腫瘤、免疫缺陷性疾病等等的那些人(Baiter,S等的綜述, 革蘭氏陽性病原體,Fischetti V. A.等編輯,ASM Press 2000,154-160 頁)。10-35%懷孕婦女有GBS群集,但是無症狀。然而,因為垂直轉播的危險,GBS群集 很重要。50-70%有群集的婦女所生的新生兒-就是5-15%所有的新生兒-在分娩過程中 變成有GBS群集。群集是感染和疾病的先決條件。多數早產兒由於很低的母親抗體轉遞和 不成熟的免疫系統,對於侵入性疾病有最高的危險。懷孕時GBS的攜帶可以是慢性的、間 歇的或暫時的。很難評價攜帶的持續時間,因為婦女在從後三個月至出生前的檢查之中已 經被篩選過一次了。一些研究提示妊娠末三個月中和分娩時的群集狀態之間有相關性( 90%)。分離物的血清型指出相同類型的持續最普遍(Balter,S.等的綜述,革蘭氏陽性病 原體,Fischetti V. A.等編輯,ASM Press 2000,154-160 頁)。沒有預防性的幹預,1至2%所有的新生兒和15%有嚴重群集的婦女所分娩的新 生兒形成了侵入性疾病(敗血症、肺炎和/或腦膜炎)。在美國,GBS感染影響1-5個新生 兒/1000個安全出生兒。美國每年發生大約17,000個病例的GBS疾病,7,500個發生於預 防前的新生兒。GBS是細菌腦膜炎最普遍的原因,造成 40%這個年齡組報告的所有病例。 在美國侵入性GBS疾病的總發病率是0.2-0. 7/100,000。在歐洲稍微低些。侵入性疾病沒 有預防幹預的死亡率是6%,每16個感染的新生兒死亡,20%的倖存者終生殘疾。嚴重B組鏈球菌感染的比率在新生兒中要比任何其它年齡組中要高很多。然而, 嚴重的B組鏈球菌感染發生在男性和女性的其他年齡組。非孕成人中,嚴重疾病的比例在 每100,000個人4.1至7. 2個病例的範圍。侵入性感染(細菌進入通常不暴露於細菌的體 內部分的感染)平均死亡率對於年齡在18-64歲的成人是8-10%,在65歲及以上的成人
18是15-25%。死亡率在更年輕的成人和沒有其它疾病狀態的成人要低些。嚴重B組鏈球菌 疾病的比率隨著年齡而增加。非孕成人中病例的平均年齡是大約60歲。多數成人B組鏈 球菌疾病發生在有嚴重疾病狀態的成人中。這些包括糖尿病;肝臟疾病;中風史;癌症史; 或褥瘡。在年長者,嚴重B組鏈球菌疾病的比率在護理院居住者中和臥床住院病人更為普 遍。非孕成人中通常在新近外傷後或在接受例如手術的某些侵入性醫院操作後得B組鏈球 菌疾病({Farley, M. , 2001} ; {Jackson, L.等人,1995} ;www. cdc. gov/groupbstrep/)。預防前新生兒疾病的直接醫療花費是每年兩億九千四百萬美金,GBS仍然是相當 大的經濟負擔。無乳鏈球菌感染的確診一般依賴於生物體從子宮頸棉棒取樣、血或其它通常無菌 的身體位點的分離。也可利用檢測體液中莢膜多糖抗原的測試。青黴素G是已經確定的GBS病例的治療選擇。對於菌血症、肺炎和軟組織感染推 薦十天的治療,而對於腦膜炎推薦2-3周,對於骨髓炎3-4周。自從1994年在北美已經建立了預防,方法是通過在懷孕35-37周陰道和肛門直腸 棉棒採樣篩選攜帶GBS懷孕婦女或者通過在分娩入院時無培養物鑑別危險因子。為預防候 選者的婦女在分娩過程中給予產時抗生素治療以防止早期發作的新生兒疾病。在美國這個 預防的方法在1993至1999年之間使得GBS疾病的發生率從1. 7降低到0. 4/1000個安全 出生兒。儘管能通過產時預防(青黴素G或氨苄西林)預防多數新生兒GBS疾病,但是目 前可利用的策略不理想,尤其是對於早產嬰兒晚期發作(> 7天的年齡)的感染和疾病的 預防。總是有些個體由於一些原因逃脫攜帶的篩選,例如在32-35周測試陰性但是在分娩 時變陽性的間歇性攜帶者、未參加、疏忽或者篩選日期(32-35周)前分娩。最後,抗生素的廣泛使用通常誘導在一段時間後出現的抗株。已經顯示青黴素和 其它的抗生素的大量使用(每3-5個婦女接受高劑量治療)穩定增加了抗生素抗性臨床分 離物的百分比(ref)。另外,基於預防的抗生物的效率對於後期發作疾病不是那麼有效,因 為它是針對早期發作的(分娩後48小時內)。另一個關注是並未解決易感成人群的預防。缺乏對對抗GBS攜帶和疾病的保護性免疫元素足夠的了解阻礙了疫苗的發展。沒 有很好地理解攜帶與天然免疫的關係。另外,沒有很好地定義允許疾病在攜帶者發生的免 疫機制。然而,有提示病原體特異性抗體的母體血清水平與新生兒GBS疾病相關。已經很 堅定地確定分娩時母體抗莢膜多糖抗體水平和侵入性新生兒疾病負性相關。{Campbell, J.等人,2000}儘管對於GBS所有的株B組糖抗原很普遍,不幸地,它沒有很強的免疫原性並且 抗體也不保護實驗模型中致死攻擊(challenge)。由多糖製成的GBS莢膜本身是有免疫原 性的並且能夠誘導保護抗體。然而,這個保護是類型特異性的。儘管莢膜特異性抗體已經 顯示很高的保護性,什麼濃度的這些血清型特異性抗體可對抗疾病而有保護作用仍然不清 楚,就在最近,已經清楚調理活性和這些抗體的親合力是比濃度更關鍵的保護決定因素。已經理解了表面蛋白質對人類針對無乳鏈球菌的免疫中的重要性。很明顯所有 血清型表達帶有與宿主免疫防禦相關活性的表面蛋白質。a C蛋白質、0 C蛋白質、Rib和 Sip蛋白質在生化和基因上有很好地特徵描述,也在動物模型中顯示了免疫性和保護性 ({Michel, J.等人,1991} ; {Brodeur, B.等人,2000} ; {Larsson, C.等人,1999} ; {Cheng, Q.等人,2002})。這些蛋白質作為疫苗候選的主要問題似乎是它們在GBS的不同臨床分離物中的流行變異性。例如Rib蛋白質存在於III血清型GBS中,但是佔全世界疾病的重大部分的V型沒有。一些其它的表面蛋白質特徵在於是免疫原性的,但是對於鑑別多數GBS 免疫原性蛋白質只作了有限的系統工作。因而,預防或減輕GBS感染的有效治療仍然是需要的。疫苗不僅能預防GBS的感 染,也更加特異性地預防或減輕宿主組織(尤其是在產道)的群集,因而降低從母體到胚胎 傳播的發生。降低急性感染的發生和生物體的攜帶將導致新生兒中侵入性疾病-肺炎、菌 血症、腦膜炎和敗血症的預防。能夠顯示對造成人類感染的大多數無乳鏈球菌株交叉保護 作用的疫苗對於預防或減輕所有其它鏈球菌種類,也就是A、C和G組造成的感染也是有用 的。疫苗能含有全部的各種不同的抗原。抗原的實例是完全殺死的或減毒的生物體、 這些生物體/組織的細組分、蛋白質或者它們最簡單的形式肽。抗原也能以糖基化蛋白質 或肽的形式被免疫系統識別,也可以是或含有多糖或脂質。能使用短肽,因為例如細胞毒性 T細胞(CTL)識別連接於主要組織相容性抗原(MHC)的通常8-11個胺基酸長的短肽形式 的抗原。B細胞能識別短到4-5個胺基酸的線性表位以及三維結構(構象表位)。為了獲 得持續的抗原特異性免疫反應,佐劑需要激發包括免疫系統所有細胞的免疫級聯。起初,佐 劑起作用,但是不限於它們對所謂抗原遞呈細胞(APC)的作用的模式。這些細胞通常最先 遇到抗原,之後是加工的或未修飾的抗原呈遞給免疫效應細胞。也可以涉及中間細胞類型。 只有有適當特異性的效應細胞在生產免疫反應中被激活。佐劑也可以局部保留抗原和共注 射的其他因子。另外,佐劑可以起其它免疫細胞的化學趨化劑的作用,或者可以在局部和/ 或全身起免疫系統刺激劑的作用。自從二十世紀七十年代末,疫苗開發著重於莢膜多糖,但是仍然沒有安全有效的 產品。然而,對於開發和給予嬰兒和高危險成人,抗無乳鏈球菌的疫苗被列為最重要的之 一。目前抗所述感染的疫苗僅僅在開發的研究階段。成果著重於使用與或者不與蛋白質連 接的莢膜多糖(CPS)作為免疫原{Paoletti,L.等人,2002}。然而,有些爭論反對基於多糖 的疫苗的使用。多糖誘導IgG2抗體,IgG2抗體以比IgGl或IgG3抗體更低的效率穿過胚 胎。對於多數易感新生兒,流產兒,這尤其是個問題,因為在32-34周之前胎盤抗體轉移很 低。估計 10%的分娩發生在第34個孕周之前。蛋白質偶聯疫苗無疑是抗GBS疾病戰鬥增加的一個偉大的新武器,但是疫苗僅含 有有限數量的GBS血清型,給與足夠的生態學壓力,非免疫血清型替換的疾病仍然是真正 的威脅,尤其在有非常高的疾病負擔的區域。此外用於活性免疫的多糖抗原在人類中不提 供免疫記憶。CPS與非GBS相關免疫原性蛋白質載體結合(例如,破傷風類毒素、霍亂毒素 B亞單位等等)已經顯示在誘導疫苗接種者更高的抗體濃度是有利的,但是它不提供在真 正的感染過程中招募記憶B和T細胞以支持最有效宿主反應的病原體特異性B細胞和T細 胞表位。為了能夠用符合這些標準的蛋白質補充CPS疫苗,鑑別保守免疫原性GBS特異性 表面蛋白質是必須的。所有這些不足提示需要開發新一代疫苗,所述疫苗由蛋白質或其衍生物組成,其 在體內條件下由所有株表達,在人類有誘導調理和/或中和抗體的能力。基於被動抗體的治療有很大的潛力。為了預防已經嘗試使用人類靜脈內免疫球 蛋白(IVIG)的製備物。單克隆抗體生產技術的最新進展提供了產生人類抗體試劑和再引入抗體治療的方法,而避免與血清治療相關的毒性。免疫球蛋白是極端多樣類型的抗微生物蛋白質,能用於預防和治療出現的感染疾病。抗體治療抵抗各種不同的微生物是有效的 ({Burnie,J.等人,1998}的綜述)。抗GBS單克隆抗體能治療性地給予每一個顯現侵入性 疾病的新生兒或者預防性地給予低出生體重的和早產的新生兒。在過去十年,在一些動物模型中描述了一些GBS蛋白質的免疫原性和保護能力, 為了基於種屬共有蛋白質的疫苗的開發現在正在對這些進行探究。這樣的蛋白質是GBS表 面蛋白質 Sip{Brodeur,B.等人,2000}、rib,α 蛋白質和{Michel, J.等人,1991}。展示在顯著造成疾病發生的革蘭氏陽性生物體表面上的某些蛋白質或酶參與了 這些病原體引起的疾病過程。通常,這些蛋白質參與了與宿主組織直接的相互作用或隱 藏細菌表面以逃脫宿主防禦機制{Navarre,W.等人,1999}。無乳鏈球菌在這點上並不例 夕卜。一些表面蛋白質具有對GBS治病性很重要的毒力因子的特徵((革蘭氏陽性病原體 中 Paoletti, L. C 等人的綜述,Fischetti V. A 等人編輯,ASM Press2000,137-153 頁); {Paoletti, L.等人,2002})。如果抗這些蛋白質的抗體對人類能提供比多糖更好的保護, 它們能提供新型基於蛋白質的GBS疫苗的來源以連接於或替代更加傳統的莢膜多糖疫苗 而使用。一些作為可能疫苗的抗原以及許多額外候選的上面描述的蛋白質的用途主要由基 於鑑別的容易或可獲得的機會的挑選產生。以更加全面的方式鑑別無乳鏈球菌相關抗原是 有需求的。本發明者已經開發了從特異性病原體尤其是從金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus^idermidis)鑑別、分離和生產超免疫血清反 應性抗原的方法(W002/059148)。然而,假設生物特性致病功能和遺傳背景的不同,無乳鏈 球菌與葡萄球菌株截然不同。重要地,為了鑑別無乳鏈球菌的抗原,血清的選擇不同於應用 於金黃色葡萄球菌篩選的那個。為了那個目的,收集了人類四個主要類型的抗體來源。首 先,GBS子宮頸和肛門直腸攜帶測試為陰性的健康懷孕婦女。這個供體組代表了抗體最重 要的來源。除了它們的血清樣品外,用子宮頸紗布收集的含有分泌型IgA(SlgA)的人子宮 頸分泌物也用於抗原的鑑別和確認。這個收集物的主要價值是SlgA能被認為是黏膜表面 上的主要免疫效應分子。其次,有GBS群集的健康懷孕婦女,其新生兒仍保持無GBS (儘管 用了抗生素預防)。第三,沒有臨床疾病的小於45歲的成人。第四,幼稚個體,5到10個月 之間的小孩,在他們已經失去母體抗體之後且由於GBS疾病的缺乏而沒有獲得GBS特異性 抗體。為了能夠挑選相關血清來源,用細菌裂解物和培養上清蛋白質進行了測量抗無乳 鏈球菌IgG和IgA抗體水平的一系列ELISA和免疫斑點實驗。來自高滴度攜帶者和非攜帶 者的血清包括在基於基因組的抗原鑑別。這個挑選人類血清的方法基本上與金黃色葡萄球 菌使用的方法非常不同,在這裡攜帶或非攜帶狀態不與抗體水平相關。本發明使用了高通量基因組方法以鑑別在感染和群集過程中有誘導人類抗體能 力的體內表達的病原體特異性蛋白質。兩個細菌種屬_無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌的基因組本身顯示了許多重要的 不同。無乳鏈球菌的基因組含有大約2. 2Mb,而金黃色葡萄球菌有2. 85Mb。它們分別具有 35. 7%和33%的平均GC含量,兩個病原體之間大約30%至45%的編碼基因不同。另外,對 於增殖兩個細菌種類需要不同的生長條件和培養基。兩個病原體造成的最重要疾病的列表顯示如下。金黃色葡萄球菌主要引起醫院的機會性感染膿皰病、毛囊炎、膿腫、癤子、感染 的傷口、心內膜炎、腦膜炎、膿毒性關節炎、肺炎、骨髓炎、皮膚燙傷綜合症(SSS)、毒性休克 綜合症。無乳鏈球菌主要引起新生兒感染和老年人的疾病,例如菌血症、敗血症、傷口感染、 骨髓炎和腦膜炎。指定為NEM316(ATCC 12403)的無乳鏈球菌莢膜血清型III的分離物的完全 基因組序列由隨機鳥槍測序策略測定(GenBank註冊號AL732656 ;見誦.tigr. org/ tigrscripts/CMR2/CMRHomePage. spl) {Glaser, P.等人,2002}。本發明潛在的難題是提供 開發例如抗無乳鏈球菌感染疫苗的藥劑的方法。更加特 別地,所述難題提供了能用於生產所述藥劑的一套有效、相關和全面的來自無乳鏈球菌的 核酸分子或超免疫血清反應性抗原。所以,本發明提供了編碼高免疫反應血清反應抗原或其片段的分離的核酸分子, 包含如下核酸序列,選自a)與選自Seq ID No 14,90,157-216的核酸分子至少具有70%序列相同性的核 酸分子,b)互補於a)的核酸分子的核酸分子,c)包含a)或b)的核酸分子至少15個連續鹼基的核酸分子d)在嚴格雜交條件下退火於a)、b)或C)的核酸分子的核酸分子e)由於遺傳密碼的簡併性,否則將雜交於a)、b)、c)或d)中定義的核酸分子的核 酸分子。根據本發明的優選實施方案,序列相同性是至少80 %,優選地至少95 %,尤其是 100%。此外,本發明提供了編碼超免疫血清反應性抗原或其片段的的分離的核酸分子, 包含如下核酸序列,選自a)與選自 Seq ID No 1,3,5-13,15,18-25,27-31,33-36,39-68,70-85,92-100, 103-126,128-145,147,149-156,217,435-448 和 463-474 的核酸分子至少具有 96% 或高於 96%,優選地至少98%,尤其是100%序列相同性的核酸分子,b)互補於a)的核酸分子的核酸分子,c)包含a)或b)的核酸分子至少15個連續鹼基的核酸分子d)在嚴格雜交條件下退火於a)、b)或C)的核酸分子的核酸分子e)由於遺傳密碼的簡併性,否則將雜交於a)、b)、c)或d)中定義的核酸分子的核 酸分子。根據另一個方面,本發明提供了編碼超免疫血清反應性抗原或其片段的分離的核 酸分子,包含如下核酸序列,選自a)與選自Seq ID No 32,86,91,101,127的核酸分子具有98%或高於98%,尤其 是100%序列相同性的核酸分子,b)互補於a)的核酸分子的核酸分子,c)由於遺傳密碼的簡併性,否則將雜交於a)、b)、c)或d)中定義的核酸分子的核 酸分子優選地,核酸分子是DNA或RNA。
根據本發明優選的實施方案,核酸分子從尤其是無乳鏈球菌基因組DNA的基因組DNA分離。根據本發明,提供了包含根據本發明的任一核酸分子的載體。在優選實施方案中,載體經改造以適於根據本發明的核酸分子編碼的超免疫血清 反應性抗原或其片段的重組表達。 本發明也提供了包含根據本發明的載體的宿主細胞。根據另一方面本發明進一步提供了包含根據本發明的核酸分子編碼的胺基酸序 列的超免疫血清反應性抗原。優選的實施方案中,胺基酸序列(多肽)選自Seq ID No 231,307,374-433。另一優選實施方案中胺基酸序列(多肽)選自Seq ID No 218,220,222-230,232, 235-242,244-248,250-253,256-285,287-302,309-317,320-343,345-362,364,366-373, 434,449-462 和 475-486。進一步優選的實施方案中,胺基酸序列(多肽)選自Seq ID No 249,303,308, 318,344ο根據另一方面,本發明提供了選自包含表IA 「推定的免疫原性胺基酸」和「鑑別的 免疫原性區域位置」縱欄的胺基酸序列的超免疫血清反應性抗原之片段的肽,尤其是包含 選自如下胺基酸的肽Seq ID No 218 的 4-20,35-44,65-70,73-87,92-98,112-137, 152-161,177-186,193-200,206-213,229-255,282-294,308-313,320-326,349-355, 373-384,388-406,420-425 和 115-199 ;Seq ID No 219 的 5-24,35-41,44-70,73-89, 103-109,127-143,155—161,185—190,192—207,212—219,246—262,304—336,372—382, 384-393,398-407,412-418,438-444,1-75,76-161 和 164-239 ;Seq ID No 220 的 4-10, 16-58,60-71,77-92,100-126,132-146,149-164,166-172,190-209,214-220,223-229, 241-256,297-312,314-319,337-343,351-359,378-387,398-418,421-428,430-437, 440-448,462-471,510-519,525-536,552-559,561-568,573-582,596-602,608-630, 637-649,651-665,681-702,714-732,739-745,757-778,790-805,807-815,821-829, 836-842,846-873,880-903,908-914,916-923,931-940,943-948,956-970,975-986, 996-1015,1031-1040,1051-1069,1072-1095,1114-1119,1130-1148, 1150-1157, 1169-1176,1229-1238 和 802-812 ;Seq ID No 221 的 5-12,14-26,35-47,52-67,72-78, 83-98,121-141,152-159,163-183,186-207,209-257,264-277,282-299,301-309, 312-318,324-339,358-368,372-378,387-397,425-431 和 46-291 ;Seq ID No 222 的 29-38,44-64,70-76,78-87,94-100,102-112,119-134,140-149,163-173, 178-186, 188-194,207-234,247-262,269-290 和 73-92 ;Seq ID No 223 的 10-28,36-63,77-87, 103-119,127-136,141—169,171—183,195—200,207—232,236—246,251—265,268—283, 287-297,314-322,335-343,354-363,384-390,405-411,419-436,443-455,467-473, 480-513,518-529,550-557,565-585,602-608,616-625,632-660,665-677,685-701, 726-736,738-747,752-761,785-796,801-813,838-853,866-871 和 757-774 ;Seq ID No224 的 31-38,61-66,74-81,90-115,123-145,154-167,169-179,182-193,200-206,238-244, 267-272 和 235-251 ;Seq ID No 225 的 19-25,38-54,56-64,66-72,74-92,94-100, 116-129,143-149,156-183,204-232,253-266,269-275,294-307 和 241-313 ;Seq ID No226 的 5-34,50-56,60-65,74-85,89-97,108-119,159-165,181-199,209-225,230-240, 245-251,257-262,274-282,300-305 和 64-75 ;Seq ID No 227 的 5-13,16-21,27-42, 45-52,58-66,74-87,108-114,119-131 和 39-51 ;Seq ID No 228 的 6-23,46-54,59-65, 78-84,100-120,128-133,140-146,159-165,171-183,190-204,224-232,240-248, 250-259,274-280,288-296,306-315 和 267-274 ;Seq ID No 229 的 5-12,15-24,26-36, 42-65,68-80,82-104,111-116,125-144,159-167,184-189,209-218,235-243,254-265, 269-283,287-300,306-316,318-336,338-352,374-392 和 162-174 ;Seq ID No 230 的 30-42,45-54 和 25-37 ;Seq ID No 231 的 10-30,53-59,86-95,116-130,132-147,169-189, 195-201,212-221,247-256,258-265,278-283,291-298,310-316,329-339,341-352, 360-367,388-396,398-411,416-432,443-452,460-466,506-512,515-521,542-548 和 419-431 ;Seq ID No 232 的 4_27,30-53,60-67,70-90,92-151,159-185,189-195, 198-210,215-239 和 173-189 ;Seq ID No 233 的 4-26,41-54,71-78,116-127,140-149,
151-158,161-175,190-196,201-208,220-226,240-252,266-281,298-305,308-318, 321-329,344-353,372-378,384-405,418-426,429-442,457-463,494-505,514-522 和 174-188 ;Seq IDNo 234 的 17—25,27—39,61—67,81—89,99—110,120—131,133—139, 147-161,167-172,179-185,192-198,203-213,226-238,243-258,261-267,284-290, 296-307,311-328,340-352,356-371 和 2 39-256 ;Seq ID No 235 的 8-30,40-49,67-80, 114-123,126-142,152-162,188-194 和 57-70 ;Seq ID No 236 的 4-23,28-34,36-47, 50-61,76-81,89-94,96-104,112-119,126-146,155-181,195-200,208-214,220-229, 244-260,263-276,282-288,292-300,317-323,336-351,353-359,363-375,382-399, 415-432, 444-455,458-471,476-481,484-492,499-517,522-529,535-541,543-568,
572-584,586-600,607-617,626-637,656-675和 282-297 ;Seq ID No 237 的 6-24,30-35, 38-45,63-91,134-140,146-160,167-188,214-220,226-234,244-250,260-270,286-301, 316-329,340-371,429-446,448-459,474-481,485-491,512-526,537-544,550-565,
573-583,596-613,621-630,652-658和 87-97 ;Seq ID No 238 的 8-20,26-48,56-67, 76-86,94-109,115-121,123-129,143-160,178-186,191-198,201-208,221-236,238-244, 260-268 和 237-247 ;Seq ID No 239 的 4-40,42-57,73-87,98-117,126-135,150-156, 166-174,196-217,231-236,248-258,276-284,293-301,307-313,339-347,359-365, 375-387, 395-402,428-440,445-456,485-490,497-505,535-541,547-555,610-625, 648-656,665-671 和 448-528 ;Seq ID No 240 的 10-18,39-45,51-61,80-96,98-106, 110-115,158-172,174-183,191-200,220-237,249-255,274-289,308-324,33卜341, 372-381,384-397,405-414 和 322-338 ;Seq ID No 241 的 30-36,38-56,85-108,134-147, 149-160,163-183,188-201,206-211,219-238,247-254 和 5-13 ;Seq ID No 242 的 11-40, 98-103,110-115,133-145,151-159,172-179,192-201,204-212,222-228,235-245, 258-268,283-296,298-309,322-329,342-351,354-362,372-378,385-393,407-418, 495-516 和 1-148 ;Seq ID No 243 的 5-19,21-36,73-94,112-119,122-137,139-145,
152-167,184-190,198-204,208-224,249-265,267-281,299-304,309-317,326-333, 356-364,368-374,381-389,391-414,419-425,430-435 和 113-140 ;Seq IDNo 244 的 45-54,59-67,78-91和 15-23 ;Seq ID No 245 的 11-22,33-47,52-80,88-112,124-129 和6-25 ;Seq ID No 246 的 26-41,51-63,80-89,93-115,150-163,187-193,220-237, 240-249,286-294,296-306,316-329,345-353,361-370,407-425,428-437,474-482, 484-494,504-517,533-541,549-558,595-613,616-625,660-668,673-685,711-726, 736-744,749-761,787-802,812-820,825-837,863-878,888-896,901-913,939-954, 964-972,977-989,1003-1008,1016-1022,1028-1034,1041-1053,1059-1074,1101-1122, 420-511 和 581-704 ;Seq ID No 247 的 18-25,27-55,71-83,89-95,102-113,120-146, 150-156,174-185 和 159-175 ;Seq ID No 248 的 24-30,38-56,63-68,87-93,136-142, 153-164,183-199,213-219,226-234,244-261,269-278,283-289,291-297,320-328, 330-336,340-346,348-356,358-366,382-387,401-408,414-419,449-455,468-491, 504-512,531-537,554-560,597-608,621-627,632-643,650-662,667-692,703-716, 724-737,743-758,783-794,800-818,846-856 和 806-884 ;Seq ID No 249 的4-14,21-39, 86-92,99-107,121-131,136-144,147-154,158-166,176-185,193-199,207-222,224-230 和 117-136 ;Seq ID No 250 的 65-76,85-97,103-109,115-121,125-146,163-169, 196-205,212-219,228-237,241-247,254-262,269-288,294-303,305-313,328-367, 395-401,405-412,418-429,437-447,481-488,506-513,519-524,530-541, 546-557 和 266-284 ;Seq ID No 251 的 5-14,37-42,49-71,78-92,97-112,127-136,147-154, 156-163,186-198,216-225,233-243,248-253,295-307,323-332,359-366,368-374,
380-398和 194-223 ;Seq ID No 252 的 4-11,33-39,45-72,100-113,119-129,136-144, 169-175,177-185,200-208,210-219,262-276,278-297,320-326,336-344,347-362,
381-394,443-453和 438-454 ;Seq ID No 253 的 4-29,31-52,55-61,95-110,138-158, 162-171,179-187,202-229,239-248,251-256,262-267,269-285,304-310,351-360, 362-368,381-388,415-428,435-440,448-458 和 161-178 ;Seq ID No 254 的 4-17,19-28, 32-43,47-59,89-110,112-126,128-134,140-148,152-161,169-184,191-204,230-235, 255-264,328-338,341-347,401-409,413-419,433-441,449-458,463-468,476-482, 486-492,500-506,529-545 和 305-381 ;Seq ID No 255 的 10-29,38-45,53-61,134-145, 152-160,163-170,202-208,219-229,248-258,266-275,282-288,315-320,328-334, 377-385,392-402,418-424,447-453,460-471,479-487,491-497,500-507,531-537, 581-594,615-623,629-635,644-652,659-666,668-678,710-717,719-728,736-741, 747-760,766-773,784-789,794-800,805-817,855-861,866-887 和 698-715 ;Seq IDNo 256 的 16-26,29-37,44-58,62-68,74-80,88-95,97-120,125-144,165-196 和 58-72 ;Seq ID No 257 的 14-21,23-46,49-60,63-74,78-92,96-103,117-129,134-161,169-211, 217-231,239-248,252-281,292-299,313-343 和 243-257 ;Seq ID No 258 的 11-27,46-52, 67-72,76-84,91-112,116-153,160-175,187-196,202-211,213-220 和 43-76 ;Seq ID No 259 的 5-29,37-56,78-86,108-118,152-161 和 120-130 ;Seq ID No 260 的 8-14,19-41, 52-66,75-82,87-92,106-121,127-133,136-143,158-175,180-187,196-204,221-228, 239-245,259-265,291-306,318-323,328-340,352-358,361-368,375-381,391-399, 411-418,431-442,446-455,484-496,498-510,527-533,541-549,558-565,575-585, 587-594,644-655,661-668,671-677 和 184-196 ;Seq ID No 261 的 4-22,29-38,55-62, 75-81,102-107,110-134,143-150,161-167,172-179,191-215,223-233,241-247,251-264,266-272,288-309,340-352,354-366,394-402,414-438 和 198-218 ;Seq ID No 262 的 24-44,49-70,80-91,105-118,128-136,140-154 和 77-92 ;Seq ID No 263 的 5-22,
31-36,41-47,67-74,83-90,105-122,135-143,160-167和 118-129 ;Seq ID No 264 的 4-25,33-73,81-93,96-106,114-120,122-128,130-172,179-208,210-241,251-283, 296-301 和 92-100 ;Seq ID No265 的 14-24,29-38,43-50,52-72,86-97,101-107,110-125, 127-141,145-157,168-175,177-184,186-195,205-226,238-250,255-261,284-290, 293-304,307-314,316-323,325-356,363-371,383-390,405-415,423-432,442-454, 466-485,502-511,519-527,535-556,558-565,569-574,612-634,641-655,672-686, 698-709,715-722,724-732,743-753,760-769,783-792,818-825,830-839,842-849, 884-896,905-918,926-940,957-969,979-1007,1015-1021,1049-1057 和 336-349 ;Seq ID No 266 的 6-16,26-31,33-39,62-73,75-85,87-100,113-123,127-152,157-164,168-181, 191-198,208-214,219-226,233-254,259-266,286-329 和 181-195 ;Seq I DNo 267 的 4-13,
32-39,53-76,99-108,110-116,124-135,137-146,149-157,162-174,182-190,207-231, 242-253, 255-264, 274-283,291-323,334-345,351-360,375-388,418-425,456-474, 486-492,508-517,520-536,547-560,562-577,31-45 和 419-443 ;Seq ID N0268 的 15-26, 30-37,42-49,58-90,93-99,128-134,147-154,174-179,190-197,199-205,221-230, 262-274,277-287,300-314,327-333,343-351,359-377,388-396,408-413,416-425, 431-446 和 246-256 ;Seq ID No 269 的 5-26,34-42,47-54,61-67,71-104,107-115, 131-138,144-153,157-189,196-202,204-210,228-245,288-309,316-329,332-341, 379-386,393-399,404-412,414-421,457-468,483-489,500-506,508-517,523-534, 543-557,565-580,587-605,609-617,619-627,631-636,640-646,662-668,675-682, 705-710, 716-723,727-732,750-758,784-789,795-809,869-874,14-138,166-286, 372-503,674-696 和 754-859 ;Seq ID No 270 的 5-17,32-38,40-47,80-89,113-119, 125-137,140-154,157-163,170-177,185-199,213-225,228-236,242-248,277-290, 292-305,323-333,347-353,364-370,385-394,399-406,423-433,441-451,462-474, 477-487 和 116-124 ;Seq ID No 271 的 7-16,18-30,32-49,53-61,63-85,95-101,105-115, 119-134,143-150,159-178,185-202,212-229,236-250,254-265,268-294 和 63-72 ;Seq ID No 272 的 4-12,19-47,73-81,97-103,153-169,188-198,207-213,217-223,236-242, 255-265,270-278,298-305,309-317,335-347,354-363,373-394,419-424,442-465, 486-492,500-507,542-549,551-558,560-572,580-589,607-614,617-623,647-653, 666-676,694-704,706-714,748-754,765-772,786-792,795-806 和 358-370 ;Seq IDNo 273 的 18-28,30-38,40-46,49-55,69-78,82-98,104-134,147-153,180-190,196-202, 218-236,244-261,266-273,275-286,290-295,301-314,378-387,390-395,427-434 和 290-305 ;Seq IDNo 274 的 4-13,20-31,39-51,54-61,69-84,87-105,117-124 和 108-125 ; Seq ID No 275 的 24-34,43-54,56-66,68-79 和 50-69 ;Seq ID No 276 的 5-43,71-77, 102-131,141-148,150-156,159-186,191-207,209-234,255-268,280-286,293-299, 317-323,350-357,363-372,391-397,406-418,428-435,455-465,484-497,499-505, 525-531,575-582,593-607,621-633,638-649,655-673,684-698,711-725,736-741, 743-752,759-769,781-793,813-831,843-853,894-905,908-916,929-946,953-963,970-978,1001-1007,1011-1033,165-178 和 818-974 ;Seq ID No 277 的16-44,63-86,
98-108,185-191,222-237,261-274,282-294,335-345,349-362,374-384,409-420, 424-430,440-447,453-460,465-473,475-504,522-534,538-551,554-560,567-582, 598-607,611-619,627-640,643-653,655-661,669-680,684-690,701-707,715-731, 744-750,756-763,768-804,829-837,845-853,855-879,884-890,910-928, 77-90,
144-212,279-355,434-536,782-810和 875-902 ;Seq ID No 278 的 4-22,29-41,45-51, 53-66,70-77,86-95,98-104,106-124,129-135,142-151,153-161,169-176,228-251,
284-299,331-337,339-370,380-387,393-398,406-411,423-433,440-452,461-469, 488-498,501-516,523-530,532-559,562-567,570-602,612-628,630-645,649-659, 666-672,677-696,714-723,727-747 和 212-227 ;Seq IDNo 279 的 4-9,17-31,35-41, 56-61,66-75,81-87,90-124,133-138,149-163,173-192,213-219,221-262,265-275, 277-282,292-298,301-307,333-346,353-363,371-378,419-430,435-448,456-469, 551-570,583-599,603-612 和 275-291 ;Seq ID No 280 的 28-34,53-58,72-81,100-128,
145-154,159-168,172-189,217-225,227-249,256-263,299-309,322-330,361-379, 381-388,392-401,404-417,425-436,440-446,451-464,469-487,502-511,543-551, 559-564,595-601,606-612,615-626,633-642,644-650,664-670,674-684,692-701, 715-723,726-734,749-756,763-771,781-787,810-843,860-869,882-889,907-917, 931-936,941-948,951-958,964-971,976-993,1039-1049,1051-1065,1092-1121, 1126-1132,1145-1151,1158-1173,1181-1192,1194-1208,1218-1223,1229-1243, 1249-1254,1265-1279,1287-1297,1303-1320,1334-1341,1343-1358,1372-1382, 1406-1417,1419-1425,1428-1434,1441-1448,1460-1473,1494-1504,1509-1514, 1529-1550,654-669 和 1400-1483 ;Seq IDNo 281 的 10-16,20-25,58-65,97-109,118-132, 134-146,148-155,186-195,226-233,244-262,275-284,295-310,317-322,330-339, 345-351,366-375,392-403,408-415,423-430,435-444,446-457,467-479,486-499, 503-510,525-537,540-585,602-612,614-623,625-634,639-645,650-669,700-707, 717-724,727-739,205-230 和 733-754 ;Seq ID No 282 的 5-22,37-43,72-81,105-113, 128-133,148-160,188-194,204-230,238-245,251-257 和 194-213 ;Seq IDNo 283 的 16-21,35-41,56-72,74-92,103-109 和 62-68 ;Seq IDNo 284 的 4-15,17-82,90-104, 107-159,163-170,188-221,234-245,252-265 和 220-235 ;Seq ID No 285 的 16-22,36-46, 61-75,92-107,113-121,139-145,148-160 和 30-42 ;Seq ID No 286 的 4-12,20-26,43-49, 55-62,66-78,121-127,135-141,146-161,164-170,178-189,196-205,233-238,269-279,
288-318,325-332,381-386,400-407和 328-346 ;Seq ID No 287 的 5-12,31-49,57-63, 69-79,89-97,99-114,116-127,134-142,147-154,160-173,185-193,199-204,211-222, 229-236,243-249,256-274 和 58-68 ;Seq ID No 288 的 10-20,28-34,39-53,68-79,84-90,
99-106和 73-79 ;Seq ID No 289 的 14-37,45-50,61-66,77-82,93-98,109-114,125-130, 141-146,157-162,173-178,189-194,205-210,221-226,237-242,253-258,269-274,
285-290,301-306,316-332,349-359,371-378,385-406,34-307和 312-385 ;Seq ID No 290 的 4-10,17-38,50-85,93-99,109-116,128-185,189-197,199-210,223-256,263-287,
289-312,327-337,371-386,389-394,406-419,424-432,438-450,458-463,475-502,507-513,519-526,535-542,550-567 和 361-376 ;Seq IDNo 291 的 10-39,42-93,100-144, 155-176,178-224,230-244,246-255,273-282,292-301,308-325,332-351,356-361, 368-379,386-393,400-421 和 138-155 ;Seq ID No 292 的 5-11,17-34,40-45,50-55, 72-80,101-123,145-151,164-172,182-187,189-195,208-218, 220-241, 243-252, 255-270,325-331,365-371,391-398,402-418,422-428,430-435,443-452,463-469, 476-484,486-494,503-509,529-553,560-565,570-590,608-614,619-627,654-661, 744-750,772-780,784-790,806-816,836-853,876-885,912-918,926-933,961-975, 980-987,996-1006,1016-1028,1043-1053,1057-1062,994-1003 和 1033-1056 ;Seq ID No 293 的 17-45,64-71,73-81,99-109,186-192,223-238,262-275,283-295,336-346, 350-363,375-385,410-421,425-431,441-448,454-463,468-474,476-512,523-537, 539-552,568-583,599-608,612-620,628-641,644-654,656-662,670-681,685-695, 702-708,716-723,725-735,757-764,769-798,800-806,808-816,826-840,846-854, 856-862,874-881,885-902,907-928,274-350 和 443-513 ;Seq ID No 294 的 4-22,29-41, 45-51,53-61,70-76,85-92,99-104,111-122,134-140,142-154,163-174,224-232, 255-265,273-279,283-297,330-335,337-348,356-367,373-385,391-396,421-431, 442-455,475-485,493-505,526-538,544-561,587-599,605-620,622-651,662-670, 675-681,687-692,697-712,714-735 和 252-262 ;Seq ID No 295 的 4-12,15-35,40-46, 50-59,67-94,110-128,143-169,182-188,207-215,218-228,238-250 和 74-90 ;Seq ID No 296 的 9-18,42-58,78-85,88-95,97-106,115-122,128-134,140-145,154-181,186-202, 204-223,261-267,269-278,284-293,300-336,358-368 和 12-29 ;Seq ID No 297 的 7-34,
46-53,62-72,82-88,100-105,111-117,132-137,144-160,166-180,183-189,209-221, 231-236,246-253,268-282,286-293,323-336,364-372,378-392,422-433 和 388-405 ;Seq ID No 298 的 21-27,34-50,72-77,80-95,164-177,192-198,202-220,226-236,239-247, 270-279,285-292,315-320,327-334,348-355,364-371,388-397,453-476,488-497, 534-545,556-576,582-588,601-607,609-616,642-662,674-681,687-697,709-715, 721-727,741-755 和 621-739 ;Seq ID No 299 的 4-14,16-77,79-109 和 25-99 ;Seq ID No 300 的 4-9,17-23,30-37,44-55,65-72,77-93,102-121,123-132,146-153和 17-29 ;Seq ID No 301 的 4-18,25-41,52-60,83-92,104-112,117-123,149-155,159-167,170-192, 201-210,220-227,245-250 和 124-137 ;Seq ID No 302 的 8-25,50-55,89-95,138-143, 148-153,159-169,173-179,223-238,262-268,288-295,297-308,325-335,403-409, 411-417,432-446,463-475,492-501,524-530,542-548,561-574,576-593,604-609, 612-622,637-654,665-672,678-685,720-725,731-739,762-767,777-783,820-838, 851-865,901-908,913-920,958-970,1000-1006,1009-1015,1020-1026,1043-1052, 1055-1061,1-128,252-341,771-793 和 1043-1058 ;Seq ID No 303 的 16-26,33-46 和 64-76 ;Seq ID No 304 的 4-27,69-77,79-101,117-123,126-142,155-161,171-186, 200-206,213-231,233-244,267-273,313-329,335-344,347-370,374-379,399-408, 422-443,445-453,461-468,476-482,518-534,544-553,556-567,578-595,601-620, 626-636,646-658,666-681,715-721,762-768,778-785,789-803,809-819,22-108, 153-318,391-527 和 638-757 ;Seq ID No 305 的 6-21,32-43,62-92,104-123,135-141,145-152,199-216,218-226,237-247,260-269,274-283,297-303,1-72 和 127-211 ;Seq ID No 306 的 6-26,50-56,83-89,108-114,123-131,172-181,194-200,221-238,241-247, 251-259,263-271,284-292,304-319,321-335,353-358,384-391,408-417,424-430, 442-448,459-466,487-500,514-528,541-556,572-578,595-601,605-613,620-631, 635-648,660-670,673-679,686-693,702-708,716-725,730-735,749-755,770-777, 805-811,831-837,843-851,854-860,863-869,895-901,904-914,922-929,933-938, 947-952,956-963,1000-1005,1008-1014,1021-1030,1097-1103,1120-1130,1132-1140, 1-213,269-592 和 992-1120 ;Seq ID No 307 的 9-16,33-39,47-59,65-79,81-95,103-108, 115-123,138-148,163-171,176-185,191-196,205-211,213-221,224-256,261-276, 294-302,357-363,384-390,95-111 和 161-189 ;Seq ID No 308 的 21-27,35-45,70-76, 92-105,129-143,145-155,161-166,170-191,204-211,214-231,234-246,249-255, 259-275 和 1-18 ;Seq ID No 309 的 21-35,45-53,56-64,69-97 和 1-16 ;SeqID No 310 的 25-33,41-47,61-68,86-101,106-114,116-129,134-142,144-156,163-176,181-190, 228-251,255-261,276-292,295-305,334-357,368-380,395-410,424-429,454-460, 469-482,510-516,518-527,531-546,558-570,579-606,628-636,638-645,651-656, 668-674,691-698,717-734,742-754,765-770,792-797,827-835,847-859,874-881, 903-909,926-933,942-961,964-977,989-1004,1010-1028,1031-1047,1057-1075, 1081-1095,1108-1117,1138-1144,1182-1189,1193-1206,1220-1229,1239-1246, 1257-1267,1271-1279,1284-1301,1312-1320,1329-1335,1341-1347, 1358-1371, 1399-1404,1417-1426,1458-1463,1468-1476,1478-1485,1493-1506,1535-1541, 1559-1574,1583-1590,1595-1601,1603-1611,1622-1628,1634-1644, 1671-1685, 1689-1696,1715-1720,1734-1746,1766-1775,1801-1806,1838-1844,1858-1871, 1910-1917,1948-1955,1960-1974,2000-2015,2019-2036,2041-2063,748-847 禾P 1381-1391 ;Seq IDNo 311 的 5-12,18-24,27-53,56-63,96-113,119-124,131-136, 157-163,203-209,215-223,233-246,264-273,311-316,380-389,393-399,425-433, 445-450,457-462,464-470,475-482,507-513,527-535,542-548,550-565,591-602, 607-613,627-642,644-664,673-712,714-732,739-764,769-782,812-818,826-838, 848-854,860-871,892-906,930-938,940-954,9 5 7 -973,990-998,1002-1021,1024-1033, 1037-1042,1050-1060,1077-1083,1085-1092,1100-1129,1144-1161,1169-1175, 1178-1189,1192-1198,1201-1207,1211-1221,1229-1239,1250-1270,1278-1292, 1294-1300,1314-1335,1344-1352,1360-1374,1394-1405,1407-1414,1416-1424, 1432-1452,1456-1462,1474-1497,1500-1510,1516-1522,1534-1542,1550-1559, 1584-1603,1608-1627,187-273 和 306-441 ;Seq ID No 312 的 70-80,90-97,118-125, 128-140,142-148,154-162,189-202,214-222,224-232,254-260,275-313,317-332, 355-360,392-398,425-432,448-456,464-470,476-482,491-505,521-528,533-546, 560-567,592-597,605-614,618-626,637-644,646-653,660-666,677-691 和 207-227 ;Seq ID No 313 的 5-19,26-34,37-55,57-66,69-83,86-102,115-134,138-143,154-172, 178-195,209-246,251-257,290-302,306-311 和 256-266 ;Seq ID No 314 的 10-20,22-28, 35-57,72-79,87-103,108-128,130-144,158-171, 190-198,225-242,274-291,301-315,317-324,374-385 和 353-365 ;Seq ID No 315 的 4-9,17-30,34-54,59-66,73-94,118-130, 135-150,158-171,189-198,219-239,269-275,283-301,89-106 和 176-193 ;Seq ID No 316 的 14-20,22-74,77-86,89-99,104-109,126-135,154-165,181-195,197-212, 216-224,264-275 和 107-118 ;Seq ID No 317 的 4-18,21-38,63-72,101-109,156-162, 165-179,183-192,195-210,212-218,230-239,241-256,278-290,299-311,313-322,
332-341,348-366,386-401,420-426,435-450,455-460,468-479,491-498,510-518, 532-538, 545-552,557-563,567-573,586-595,599-609,620-626,628-636,652-657, 665-681 和 1-198 ;Seq ID No 318 的 4-10,16-38,51-68,73-79,94-115,120-125,132-178, 201-208, 216-223,238-266,269-295,297-304,337-342,347-356,374-401,403-422, 440-447,478-504,510-516,519-530,537-544 和 191-206 ;Seq ID No 319 的 12-40,42-48, 66-71,77-86,95-102,113-120,129-137,141-148,155-174,208-214,218-225,234-240, 256-267,275-283,300-306,313-321,343-350,359-367,370-383,398-405,432-439, 443-461,492-508,516-526,528-535 和 370-478 ;Seq ID No 320 的 6-14,20-37,56-62, 90-95,97-113,118-125,140-145,161-170,183-202, 237-244,275-284,286-305,309-316,
333-359,373-401,405-412和 176-187 ;Seq ID No 321 的 33-44,50-55,59-80,86-101, 129-139,147-153,157—163,171—176,189—201,203—224,239—245,257—262,281—287, 290-297,304-320,322-331,334-350,372-390,396-401,71-88 和 353-372 ;Seq ID No 322 的 5-11,15-24,26-33,40-47,75-88,95-103,105-112 和 17-30 ;Seq ID No 323 的 5-11, 16-39,46-54,62-82,100-107,111-124,126-150,154-165,167-183,204-238,245-295, 301-313,316-335 和 8-16 ;Seq ID No 324 的 4-19,34-48,69-74,79-107,115-127, 129-135,143-153,160-169,171-182 和 142-153 ;Seq ID No 325 的 4-30,65-74,82-106, 110-120,124-132,135-140,146-175,179-184,190-196,217-223,228-233,250-267, 275-292,303-315,322-332 和 174-186 ;Seq IDNo 326 的 9-16,29-41,47-57,68-84, 87-109, 113-119, 162-180, 186-193, 195-201, 203-208, 218-230, 234-243, 265-271, 281-292,305-312,323-332,341-347,349-363,368-374,383-390,396-410,434-440, 446-452,455-464,466-473,515-522,529-542,565-570,589-600,602-613,618-623, 637-644,1019-1027,1238-1244,1258-1264,1268-1276,1281-1292,1296-1302 禾P 883-936 ;Seq IDNo 327 的 10-17,23-32,39-44,54-72,75-81,88-111,138-154,160-167, 178-185,201-210,236-252,327-334,336-342,366-376,388-400,410-430,472-482, 493-526,552-558,586-592,598-603,612-621,630-635,641-660 和 384-393 ;Seq ID No 328 的 4-22,24-39,50-59,73-84,100-105,111-117,130-138,155-161,173-178,182-189, 205-215,266-284,308-313,321-328,330-337,346-363,368-374,388-395,397-405, 426-434,453-459,482-492,501-507,509-515,518-523,527-544,559-590,598-612, 614-629,646-659,663-684,686-694,698-721 和 445-461 ;Seq ID No 329 的 14-22,27-33 和 3-17 ;Seq ID No 330 的 29-41,66-73,81-87,90-108,140-146,150-159,165-184, 186-196,216-226,230-238,247-253,261-269 和 126-140 ;Seq ID No 331 的 5-12,16-25, 27-33,36-45,60-68,83-88,103-126 和 86-101 ;Seq ID No 332 的 14-23,36-47,56-66, 84-89,94-105,111-127,140-153,160-174,176-183,189-203,219-225,231-237,250-257 和 194-227 ;Seq ID No 333 的 4-25,54-60,64-71,73-82,89-106,117-124,157-169,183-188,199-210,221-232,236-244,255-264 和 58-98 ;Seq ID No 334 的 13-19,26-36,
41-53,55-71,77-84,86-108,114-135,157-172,177-183,187-194,208-213,218-226, 110-125 和 156-170 ;Seq ID No 335 的 5-24,63-69,77-85,94-112,120-137,140-146, 152-159,166-172,179-187,193-199,206-212,222-228,234-240,244-252,257-264, 270-289,298-309,316-328,337-348,363-375,1-56 和 340-352 ;Seq ID No 336 的 18-39,
42-71,78-120,124-144,152-173,179-189,199-209,213-222,228-258,269-304,329-361, 364-372,374-389,396-441 和 313-327 ;Seq ID No 337 的 19-25,91-98,108-120,156-162, 168-174,191-204,211-216,232-266,272-278,286-308,316-321,327-333,344-355, 358-364,384-391,395-428,464-476,487-495,497-511,544-561,563-573,575-582, 588-594,10-25 和 322-338 ;Seq ID No 338 的 14-26,32-49,51-57,59-72,80-91,102-112, 119-125,147-161,164-173,175-183,188-213,217-222,246-254,260-276,282-303, 308-318,321-328,333-350,352-359,371-378,392-401, 407-414,416-443,448-463, 471-484,490-497,501-514,519-527,539-551,557-570,578-590,592-598,600-610, 618-629,633-647,654-667,676-689,702-709,718-726,728-737,741-760,764-780, 786-795,808-826,836-842,845-852,865-874,881-887,931-945,949-957,968-974, 979-986,1003-1009,1023-1029 和 90-103 ;Seq ID No 339 的 11-16,37-56,60-66,69-77, 80-88,93-106,117-139,166-171 和 72-90 ;Seq ID No 340 的 59-84,123-133,145-150, 161-167,178-189 和 115-128 ;Seq ID No 341 的 15-33,39-46,52-64,74-87,108-124, 127-144,150-156,173-179,184-194,201-208,219-236,243-269,272-295,302-309, 343-349, 356-361,370-379,405-411,414-423,430-451,457-464,466-475,477-483, 496-502,507-522,541-548,557-563,571-577,579-585,590-605,626-642,650-662, 671-691,7 0 4 -7 1 0 , 751-7 6 9 , 7 7 5 - 781,7 8 6 - 791,7 9 4 -8 2 9 , 851-8 5 8 , 868 -8 7 8 , 8 8 4 -9 0 4, 913-919,931-939 和 132-142 ;Seq ID No 342 的 33-58,64-71,74-80,83-88,96-120, 122-139,146-157,167-177,207-213,220-225,236-242,264-279,300-305,326-336, 340-347,350-360,97-115 和 199-211 ;Seq ID No343 的 4-26,43-57,70-99,102-117, 121-133,142-148,151-168,170-183,192-220,235-249,258-279 和 30-41 ;Seq ID No 344 的 34-42,48-58,70-94,110-130,154-160,164-172,178-183,195-203,211-222,229-250, 256-261,274-284,286-292,312-323 和 222-233 ;Seq ID No 345 的 4-9,15-36,38-45, 49-74,78-88,100-112,136-191,211-220,226-233,239-246,254-274,287-307,316-322, 342-353,356-366,373-378,384-393,405-431,449-457,459-468,487-511,515-524, 529-541,544-552,562-568,571-576 和 208-280 ;Seq IDNo 346 的 10-27,31-37,39-54, 71-108,124-143 和 2-107 ;Seq IDNo 347 的 16-27,38-57,64-70,90-102,104-113, 116-137,160-166 和 1-80 ;Seq ID No 348 的 13-21,31-36,56-67,127-136,153-171, 173-180,184-200,214-222,225-231,239-263,267-273 和 135-159 ;Seq ID No 349 的 12-27,31-51,68-74,77-87,94-101,108-114,117-123,127-134,138-168,173-196, 201-207,212-217,227-237,247-257,264-280 和 205-223 ;Seq ID No 350 的 17-22,25-54, 70-76,92-100 和 98-110 ;Seq ID No 351 的 7-29,40-50,60-67,87-96,105-111,119-164, 172-199,206-212,220-227,237-259,272-279,282-293,295-309,313-319,321-328, 345-363,376-386 和 159-176 ;Seq ID No 352 的 4-19,24-30,36-43,50-68,71-89,93-106,141-152,154-172,179-197,199-215,229-239,246-252,255-263,281-298,319-325, 329-356, 358-368,374-390,397-409,420-429,432-444,450-456,459-475,483-494, 496-502,520-528,532-556 和 362-377 ;Seq ID No 353 的 18-25,40-62,77-85,91-97, 105-116,123-133,139-184,189-197 和 122-140 ;Seq ID No 354 的 4-49,52-58,62-70, 79-105, 109-133,142-150,163-168,206-214,220-228,233-240,243-254,274-281, 303-311,327-338,357-373,378-396,403-413,420-436,441-453,461-467,475-481, 484-498,506-512,514-521,523-529,562-579,589-595,598-603,615-648,714-722, 728-742,749-758,777-792,795-807 和 643-658 ;Seq IDNo 355 的 8-27,37-48,51-56, 72-79,87-106,120-138,140-147,167-176,187-197,205-216,222-229,234-239,243-249, 277-288,292-315,334-343,347-353,363-391,398-404,430-447,461-467,478-492, 498-507 和 456-470 ;Seq ID No 356 的 5-12,18-24,59-69,80-93,95-109,119-125, 130-137,139-1 47,158-163,168-176,182-202,206-215,222-239,241-249,267-277, 291-298, 311-318,321-327,338-344,348-355,373-386,393-406,411-417,434-443, 446-465,473-484,514-521,532-553,584-594 和 221-237 ;Seq IDNo 357 的 4-14,27-34, 50-58,63-72,79-106,109-114,121-142,146-154,161-167,169-175,178-201,223-238, 249-254,259-264,278-292,294-312,319-330 和 167-191 ;Seq ID No 358 的 7-28,36-42, 50-61,63-80,122-152,161-174,176-191 和 140-190 ;SeqID No 359 的 20-57,59-65, 70-78,86-102,119-133,142-161,163-173,177-188,192-202,204-220,222-236,240-253, 279-319,326-331,337-383,390-399,406-412,420-427,431-438 和 381-395 ;Seq ID No 360 的 13-18,28-34,37-43,50-59,75-81,83-97,105-121,139-147,200-206,209-227, 231-247,260-271,318-327,366-381,388-394,399-406 和 182-201 ;Seq ID No 361 的 6-29,37-43,51-56,70-77,82-102,110-119,127-143,178-190,201-209,216-243, 261-269,281-292,305-313,327-339,341-354,356-373,391-397,423-429,438-445, 450-478和 21-314 ;Seq ID No 362 的 4-12,15-21,32-41,59-76,80-89,96-104和90-103 ; Seq ID No 363 的 9-28,30-41,44-54,69-74,77-82,90-97,104-123,125-135,149-155, 164-173,177-184,217-226,230-235,238-244,258-272,282-297,300-305,309-315, 317-322,327-336,348-362,368-374,380-387,400-411,414-424,451-458,460-466, 483-494, 497-503,506-511,521-528,540-553,569-587,598-606,628-642,661-681, 688-700,718-733,740-749,752-764,769-783,823-834,848-854,862-872,878-884, 886-898,915-920,938-951,954-961,963-972,982-989,996-1003,1010-1016,1021-1032, 1038-1044,1047-1057,1060-1070,1079-1088,1094-1102,1117-1127,1129-1135, 1142-1153,1158-1204,1212-1229,1234-1263,1269-1277,1308-1313,1327-1338, 1344-1376,1400-1415,1436-1443,1448-1458,1497-1504,1511-1522,1544-1566,3-82 和 509-576 ;Seq ID No 364 的 8-36,40-64,71-79,88-94,102-109,118-127,138-148, 151-159,163-174,192—198,200—206,220—233,268—273,290—301,304—309,316—323, 331-349,378-391,414-420,427-437,455-475,494-510,541-547,549-555,616-640,1-60, 55-139,212-308,386-458 和 458-624 ;Seq ID No 365 的 16-31,35-42,70-77,91-101, 120-130,132-140,143-153,185-190,195-202,215-222,228-238,241-251,257-264, 268-277,288-302,312-324,326-333,341-348,364-382,415-429,438-454,458-466,491-499,501-521 和 273-281 ;Seq ID No 366 的 8-14,32-57,74-149,155-177,179-212, 221-266, 271-296,304-324,329-346,349-359,368-401,413-419,426-454,465-478, 493-510 和 466-490 ;Seq ID No 367 的 22-28,33-51,64-89,96-119,126-132,138-146, 152-159,161-169,172-179,193-198,205-211,221-231,235-254,273-280,297-303, 312-320,328-346,351-373,378-384,391-398,448-454,460-468,470-481,516-558, 574-593,597-602,613-623,626-646,649-656,668-673,675-683,696-708,715-722, 724-739,745-751,759-777,780-804,816-822 和 102-113 ;Seq ID No 368 的 12-28,41-91, 98-107,112-120,125-131,151-193,215-221,240-250,263-280 和 128-138 ;Seq ID No 369 的 16-24,32-38,46-62,68-81,90-105,127-133,144-150,160-166,178-184,186-202, 210-219,232-240,252-258,264-273,293-324,337-344,349-357,360-369,385-398, 410-416,419-427,441-449,458-476,508-515,523-539,544-549,562-569,571-579, 96-109 和 127-139 ;Seq ID No 370 的 19-25,28-34,56-61,85-97,110-116 和 39-53 ;Seq ID No 371 的 4-37,41-50,62-72,91-97,99-109,114-125,136-141,149-158,160-166, 201-215 和 27-225 ;Seq ID No 372 的 15-31,44-51,96-105,122-130,149-157,162-168, 178-183,185-192,198-204,206-213,221-234,239-245,248-255,257-266,289-335, 349-357,415-422,425-441,448-454,462-468 和 463-481 ;Seq ID No 373 的 5-31,39-55, 63-72,76-99,106-155,160-177,179-199,207-217,223-240,245-255,261-267,294-316, 321-343,354-378,382-452,477-488,529-536,555-569,584-591,593-612,620-627, 632-640,647-654,671-680,698-704,723-730,732-750,769-775,781-788,822-852 和 505-525 ;Seq ID No 374 的 3-18 ;Seq ID No 375 的 4-14 和 12-24 ;Seq ID No 376 的 4-11,22-30 和 12-25 ;Seq ID No377 的 5-12 和 4-18 ;Seq ID No 378 的 4-28 和 7-14 ;Seq ID No379 的 6-16 和 8-16 ;Seq ID No 380 的 4-15,18-33 和 24-36 ;Seq ID No 381 的 4-10, 16-21和 20-31 ;Seq ID No 382 的 6-19 ;Seq ID No 383 的 11-18和 3-10 ;Seq ID No 384 的 13-24 和 3-15 ;Seq ID No 385 的 15-27 和 7-16 ;Seq ID No 386 的 11-16 和 1-15 ;Seq ID No 387 的 4-16 和 9-21 ;Seq ID No 388 的 4-24,40-48,54-67 和 22-39 ;Seq ID No 389 的 6-30,34-55,62-68,78-106 和 68-74 ;Seq ID No 390 的 3-14 ;Seq ID No 391 的 9-19 和 6-21 ;Seq ID No 392 的 4-17 和 1-9 ;Seq ID No 393 的 5-30 和 1-8 ;SeqID No 394 的 4-16, 23-46,51-56 和 45-55 ;Seq ID No 395 的 7-16 ;Seq ID No 396 的 2-14 ;Seq ID No 397 的 4-36,43-65 和 50-62 ;Seq ID No 398 的 10-30 和 14-21 ;Seq ID No 399 的 9-17 和 1-10 ; Seq ID No 400 的 4-12 和 3-16 ;Seq ID No 401 的 4-15 和 5-23 ;Seq ID No 402 的 10-21 ; Seq ID No 403 的 6-16 ;Seq ID No 404 的 4-29,31-38 和 2-14 ;Seq ID No 405 的 4-35 和 33-42 ;Seq ID No406 的 2-17 ;Seq ID No 407 的 9-18,30-35 和 15-33 ;Seq ID No408 的 4-9 和 6-12 ;Seq ID No 409 的 3-17 ;Seq ID No 410 的 12-21,37-44,52-61,72-80 和 38-48 ;Seq ID No 411 的 4-10,29-44,54-61,69-78 和 13-27 ;Seq ID No 412 的 13-23, 36-53和 2-15 ;Seq ID No 413 的 4-25,28-46,56-72,81-99,120-132,134-142,154-160和 129-141 ;Seq ID No 414 的 4-15,24-33,35-41,64-86 和 21-33 ;Seq ID No 415 的 9-15 和 4-13 ;Seq ID No 416 的 4-11,13-19,34-48 和 15-32 ;Seq ID No 417 的 4-21 和 11-31 ;Seq ID No 418 的 23-57 和 38-50 ;Seq ID No 419 的 4-32 和 3-13 ;Seq ID No 420 的 4-10, 13-25,32-42,56-68,72-84 和 26-38 ;SeqID No 421 的 4-20,31-48,52-58,65-71,80-93,99-108,114-123和 37-49 ;Seq ID No 422 的 6-12,14-20和 3-25 ;Seq ID No 423 的 14-25, 27-38 和 5-14 ;Seq ID No 424 的 4-41,57-105,109-118,123-136,144-152 和 86-99 ;Seq ID No 425 的 6-19 ;Seq ID No 426 的 2-19 ;Seq ID No 427 的 14-47 和 1-14 ;Seq ID No 428 的 4-21,29-44 和 2-18 ;Seq ID No 429 的 23-29 和 10-28 ;Seq ID No 430 的 6-16, 22-36 和 11-22 ;Seq ID No 431 的 4-19,30-44 和 18-27 ;Seq ID No 432 的 5-15,37-45, 58-65 和 38-47 ;Seq ID No 433 的 4-15,23-34 和 4-15 ;Seq ID No 434 的 30-36,44-54, 79-85,101-114,138-152,154-164,170-175,179-200,213-220, 223-240, 243-255, 258-264,268-284和10-28 ;包含表IB的「相同區域」縱欄的胺基酸序列的肽,尤其是包含 如下胺基酸的肽Seq ID No 449 的 210-226 和 738-753 ;Seq ID No 450 的 326-344,
326-348,338-354,371-392,801-809和877-901;Seq ID No 451 的893-906 ;Seq ID No452 的 51-69 ;Seq ID No 453 的 110-125 ;Seq ID No 454 的 291-305 ;Seq ID No 455 的 210-226 和 738-753 ;Seq ID No 456 的 326-344,326-348,338-354,371-392,801-809 和 877-901 ;Seq ID No 457 的 893-906 ;Seq ID No 458 的 51-69 ;Seq ID No 459 的 110-125 ; SeqID No 460 的 291-305 ;Seq ID No 461 的 32-44 ;Seq ID No 462 的 399-410 ;表 2 的「氨 基酸從」到「胺基酸至」縱欄中指定的血清反應性表位,尤其是包含如下胺基酸的肽Seq ID No 218 的 120-143,138-161 和 156-179 ;Seq ID No 219 的 110-129 和 168-184 ;Seq ID No 222 的 74-90 ;Seq ID No 223 的 759-773 ;Seq ID No 224 的 237-260;Seq ID No 225 的 265-284 ;Seq ID No 226 的 65-74 ;Seq ID No 227 的 41-50 ;Seq ID No 229 的 163-174 ; Seq ID No 230 的 26-37 ;Seq ID No 232 的 174-189 ;Seq ID No 234 的 240-256 ;Seq ID No236 的 285-297 ;Seq ID No 238 的 238-247 ;Seq ID No 239 的 491-519 ;Seq ID No 243 的 114-140 ;Seq ID No 250 的 267-284 ;Seq ID No 252 的 439-453 ;Seq ID No 253 的 162-178 ;Seq ID No254 的 347-364 ;Seq ID No 255 的 699-715 ;Seq ID No 256 的 60-71 ; Seq ID No 257 的 244-257 ;Seq ID No 258 的 44-63 和 57-76 ;Seq ID No 260 的 185-196 ; Seq ID No 263 的 119-129 ;SeqID No 266 的 182-195 ;Seq ID No 267 的 32-44和 424-442 ; Seq IDNo 268 的 247-256 ;Seq ID No 269 的 678-694,785-805,55-77 和 72-94 ;Seq ID No 281 的 210-226 ;Seq ID No 289 的 37-59 ;SeqID No 296 的 13-29 ;Seq ID No 348 的 136-159 ;Seq ID No 349 的 205-222 ;Seq ID No 350 的 99-110 ;Seq ID No 351 的 160-176 ;Seq ID No 355 的 457-470 ;Seq ID No 356 的 221-237 ;Seq ID No357 的 167-190 ;Seq ID No 361 的 96-120 ;Seq ID No 364 的 399-417,503-519 和 544-563 ;Seq ID No 371 的 46-68,159-183 和 184-198 ;Seq ID No 372 的 463-481 ;表 4 的「胺基酸從」 到「胺基酸至」縱欄中指定的免疫原性表位;尤其是包含如下胺基酸的肽Seq ID No219的 110-129 和 168-184 ;Seq ID No 277 的 877-901,333-354,326-344 和 801-809 ;Seq ID No 347 的 l_54;Seq ID No 364 的 544-563,31-51,107-119,399-417 和 503-519 ;Seq ID No 218 的 120-198 ;Seq ID No 219 的 20-35 ;Seq ID No 221 的 118-201 ;SeqID No 242 的 48-132 ;Seq ID No 249 的 118-136 ;Seq ID No 253 的 162-178 ;Seq ID No 254 的 347-364 ;Seq ID No 255 的 699-715 ;Seq ID No 258 的 50-76 ;Seq ID No 269 的 785-819 和 44-128 ;SeqID No 274 的 90-128 ;Seq ID No 289 的 314-384 ;Seq ID No 293 的
327-349;Seq ID No 304 的 242-314,405-478 和 23-100 ;Seq ID No305 的 129-210 ;Seq ID No 307 的 162-188 ;Seq ID No 310 的 750-772 ;Seq ID No 335 的 1-56 ;Seq ID No 337 的322-337 ;SeqID No 339 的 72-90 ;Seq ID No 345 的 374-395 ;Seq ID No 348 的 136-159 ; Seq ID No 358 的 141-164 ;Seq ID No 361 的 96-157 ;Seq ID No 363 的 1-82 ;Seq ID No 364的489-556 ;Seq ID No 371的159-183和49-133 ;包含表5的「推定的免疫原性氨基 酸」和「鑑別的免疫原性區域(aa)的位置」縱欄的胺基酸序列的肽,尤其是包含如下胺基酸 的肽Seq ID No 475 的 4-26,35-41,53-61,73-84,103-108,114-120,140-146,156-162, 192-208,214-219,227-233,239-252,260-268,284-297,1-48 和 113-133 ;Seq ID No 476 的 4-27,38-44,50-56,59-64,72-79,83-89,92-97,108-116,123-148,152-167,183-196, 200-220,232-244,255-261,265-274,282-302,309-317,1-79 和 231-302 ;Seq ID No 477 的 6-28,66-72,85-105,115-121,144-151,160-170,176-185,223-230,252-288,296-310, 319-333,367-374,458-464,471-480,483-488,520-528,530-549,559-564,593-601, 606-616,636-643,655-662,676-682,684-699,719-726,735-750,757-764,777-785, 799-810,812-843,846-853,868-873,880-889,891-899,909-929,934-940,963-969, 998-1004,1007-1014,1016-1022,1030-1046,1-80 和 808-821 ;Seq ID No 478 的 7-24, 35-41,75-81,91-114,122-132,137-144,148-156,183-192,194-200,212-228,233-238, 251-258,275-295,326-332,337-346,1-79 和 305-321 ;Seq ID No 479 的 31-38,42-52, 66-72,86-92,98-104,115-122,127-146,154-164,169-187,198-212,225-237,255-269, 13-92 和 135-142 ;Seq ID No 480 的 4-36,39-49,63-69,71-77,81-88,123-131,133-139, 160-169,174-180,188-194,210-217,273-278,289-300,317-334,336-341,383-401, 425-438,1-68,212-270 和 402-446 ;Seq ID No 481 的 21-29,31-42,49-63,72-79,81-93, 112-132,159-165,188-195,197-232,262-267,279-286,294-301,318-326,348-366, 381-405,409-426,436-465,471-480,484-492,497-505,521-544,554-561,567-577, 581-589,601-609,611-622,636-651,653-667,669-685,700-708,716-722,729-744, 749-766,780-786,789-811,814-864,1-57 和 84-106 ;Seq ID No482 的 6-24,35-48,57-63, 72-78,87-92,113-119,123-137,147-153,173-181,212-233 和 1-124 ;Seq ID No 483 的 13-34,62-69,78-83,86-91,98-104,107-115,146-159,179-188,195-205,209-221, 226-233,239-253,276-282,284-294,297-308,331-354,375-382, 388-399, 421-433, 449-458,464-469,472-491,508-513,525-531,534-550,575-593,601-618,629-635, 654-661,666-680,706-721,723-740,771-805,810-830,845-851 和 1-84 ;Seq ID No484 的 4-32,45-64,73-83,86-92,100-111,125-147,157-163,170-175, 177-188,226-232, 245-252,258-274,320-335,348-359 和 1-71 ;Seq ID No 485 的 13-40,43-71,76-83, 87-101,109-119,125-156,162-175,182-219,226-232,240-262,270-287,306-318, 326-342,344-408,414-444,449-456 和 1-51 ;Seq ID No 486 的 4-16,18-34,45-54, 99-108,134-140,203-212,241-257,266-274,279-291,308-315,330-336,355-370, 374-382,402-410,428-455,466-472,474-480,531-554,560-566,572-580,597-618, 632-660,664-674,676-685,691-705,708-735,750-768,1-87 和 342-480 ;表 6 的「胺基酸 從」到「胺基酸至」的縱欄中指定的血清反應性表位,尤其是包含如下胺基酸的肽No 475 的 115-132 和 1-26 ;Seq ID No 476 的 33-55 ;Seq ID No 478 的 1-25 ;Seq ID No 479 的 37-61 ;SeqID No 480 的 1-24 ;Seq ID No 481 的 1-23 ;Seq ID No 482 的 46-60 ;Seq ID No 483 的 1-28,23-50 和 45-71 ;Seq ID No 484 的 1-22 和 17—38 ;Seq ID No 485 的 1-22 和17-38 ;Seq ID No 486的1-27,22-47和422-447 ;表7的「胺基酸從」到「胺基酸至」縱欄 中指定的免疫原性表位,尤其是包含如下胺基酸的肽Seq ID No 475的115-132和1_47 ; Seq ID No 476 的 1-55 ;Seq ID No 477 的 22-85 ;Seq ID No478 的 307-320 和 1-44 ;Seq ID No 479 的 15-76 和 40-92 ;SeqID No 480 的 1-59,213-269 和 403-445 ;Seq ID No 481 的 1-56 和 85-105 ;Seq ID No 482 的 37-121 ;Seq ID No 483 的 1-71 ;Seq IDNo 484 的 1-38 ;Seq ID No 485 的 1-38 ;Seq ID No 486 的 1-47。本發明也提供了生產根據本發明的無乳鏈球菌超免疫血清反應性抗原或其片段 的方法,包括在合適的表達系統中表達根據本發明的一個或多個核酸分子。此外,本發明提供了生產表達根據本發明的無乳鏈球菌超免疫血清反應性抗原或 其片段的細胞的方法,包括用根據本發明的載體轉化或轉染合適的宿主細胞。根據本發明提供了尤其是疫苗的藥物組合物,其包含如本發明定義的超免疫血清 反應性抗原或其片段或如本發明定義的核酸分子。優選實施方案中,藥物組合物進一步包含了免疫刺激物質,優選地選自尤其是聚 陽離子肽的聚陽離子聚合物、免疫刺激脫氧核苷酸(0DN)、含有尤其是KLKL5KLK的至少兩 個LysLeuLys基團的肽、尤其是人生長激素的神經活性化合物、明礬(alumn)、弗氏完全或 不完全佐劑或它們的組合。更加優選的實施方案中,免疫刺激物質是聚陽離子聚合物和免疫刺激脫氧核苷酸 或含有至少兩個LysLeuLys基團的肽和免疫刺激脫氧核苷酸的組合。還更優選的實施方案中,聚陽離子聚合物是聚陽離子肽,尤其是聚精氨酸。根據本發明,提供了根據本發明的核酸或根據本發明的超免疫血清反應性抗原或 其片段用於藥物製備物的生產的用途,尤其是用於抗無乳鏈球菌感染的疫苗的生產。同此,也提供了至少結合於根據本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段的選擇 性部分的抗體或其至少有效部分。優選的實施方案中抗體是單克隆抗體。另一優選的實施方案中抗體的有效部分包含Fab片段。進一步優選的實施方案中抗體是嵌合抗體。還優選的實施方案中抗體是人源化抗體。本發明也提供了產生根據本發明的抗體的雜交瘤細胞系。此外,本發明提供了產生根據本發明的抗體的方法,特徵在於如下的步驟 通過給予非人的動物如本發明中定義的超免疫血清反應性抗原或其片段啟動 所述動物的免疫反應, 從所述動物移出含抗體的體液,以及 通過進一步純化步驟處理含所述抗體的體液產生抗體。相應地,本發明也提供了一種產生根據本發明的抗體的方法,特徵在於如下的步 驟 通過給予非人的動物如本發明中定義的超免疫血清反應性抗原或其片段啟動 所述動物的免疫反應, 從所述動物移出脾或脾細胞, 生產所述脾或脾細胞的雜交瘤細胞
挑選和克隆特異於所述超免疫血清反應性抗原或其片段的雜交瘤細胞, 通過所述克隆的雜交瘤細胞的培養和可選的進一步純化步驟產生抗體。根據上面方法提供或生產的抗體可以用於治療或預防無乳鏈球菌感染的藥劑的 製備。根據另一方面,本發明提供了結合根據本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段 的拮抗劑。所述能夠結合根據本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段的拮抗劑可以通過 包含如下步驟的方法鑑別a)將分離的或固定化的根據本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段在允許候 選拮抗劑和所述超免疫血清反應性抗原或其片段結合的條件下,在能夠提供應答於候選拮 抗劑和所述超免疫血清反應性抗原或其片段結合的可檢測信號的組分的存在下,與所述候 選拮抗劑接觸;以及b)檢測應答於拮抗劑與超免疫血清反應性抗原或其片段結合的信號的存在或不 存在。能夠降低或抑制根據本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段與其相互反應伴 侶的相互反應活性的拮抗劑可以通過包含如下步驟的方法鑑別a)提供了根據本發明的超免疫血清反應性抗原或其高免疫片段,b)向所述超免疫血清反應性抗原或其片段,提供相互反應伴侶,尤其是根據本發 明的抗體,c)允許所述超免疫血清反應性抗原或其片段與所述相互反應伴侶的相互反應以 形成相互反應複合物,d)提供候選拮抗劑,e)允許候選拮抗劑和相互反應複合物之間發生競爭反應,f)測定候選拮抗劑是否抑制或降低超免疫血清反應性抗原或其片段與相互反應 伴侶的相互反應活性。根據本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段可用於所述超免疫血清反應性抗 原或其片段的相互反應伴侶的分離和/或純化和/或鑑別。本發明也提供了體外診斷與根據本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段的表 達相關的疾病的方法,包括測定根據本發明編碼所述超免疫血清反應性抗原或其片段的核 酸序列的存在,或根據本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段的存在。本發明也提供了尤其是無乳鏈球菌感染的細菌感染體外診斷的方法,包括分析根 據本發明編碼所述超免疫血清反應性抗原或其片段的核酸序列的存在或根據本發明的超 免疫血清反應性抗原或其片段的存在。此外,本發明提供了根據本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段的用途其 用以產生結合於所述超免疫血清反應性抗原或其片段的肽,其中所述肽是抗促成素 (anticaline)0本發明也提供了根據本發明的超免疫血清反應性抗原或其片段的用途,其用以生 產功能性核酸,其中所述功能性核酸選自適體(aptamer)和鏡面體(spiegelmers)。根據本發明的核酸分子也可用於功能性核糖核酸的生產,其中所述功能性核糖核酸選自核酶、反義核酸和siRNA。本發明有利地提供了使用來自多個人血漿合併物的抗體製備物和來源於無乳鏈 球菌基因組的表面表達文庫,從無乳鏈球菌鑑別出來的一套有效的、相關的和全面的分離 的核酸分子和它們編碼的超免疫血清反應性抗原或其片段。因而,本發明滿足了在製備抗 體和鑑別有效對抗無乳鏈球菌感染的化合物的過程中有用的無乳鏈球菌抗原、疫苗、診斷 和產品的廣泛需要。有效疫苗應當由所有株表達的並能誘導抗無乳鏈球菌細胞表面組分的高親和力、 豐富抗體的蛋白質或多肽組成。對於調理作用,抗體應當是IgGl和/或IgG3,對於粘附和毒 素作用的中和,是任何IgG亞型和IgA。化學限定的疫苗必須是明確地比全細胞疫苗優良, 因為與人類組織交叉反應或抑制調理作用的無乳鏈球菌的組分能被去除,並且誘導保護抗 體和/或保護免疫反應的個體蛋白質能被挑選出來。本發明採用的方法是基於GBS蛋白質或肽與人血清中存在的抗體的相互作用。人 免疫系統產生的並且在人血清中存在的抗無乳鏈球菌抗體是抗原蛋白質的體內表達和它 們的免疫原性的指徵。另外,在用個體選擇或產生的血清進行的第二和第三輪篩選中處理 抗原蛋白質,所述抗原蛋白質是使用預選血清的合併物通過細菌表面展示表達文庫鑑別 的。因而,本發明提供了作為藥物組合物尤其是預防無乳鏈球菌感染的疫苗的一套有效、相 關、全面的GBS抗原。在鑑別根據本發明的一全套抗原的抗原鑑別程序中,用一些血清合併物或血漿級 分或其它合併的含有抗體的體液(抗體合併物)篩選了至少兩個不同的細菌表面表達文 庫。抗體合併物來源於已經測試了抗無乳鏈球菌抗原化合物的血清收集物,例如全部細胞 提取物和培養上清蛋白質。優選地,使用三個截然不同的血清收集物,得自ad 1.健康懷孕 婦女,子宮頸和肛門直腸GBS攜帶測試陰性,ad 2.健康懷孕婦女,子宮頸和/或肛門直腸 GBS攜帶測試陽性,其新生兒仍然無GBS(儘管用了抗生物預防),ad 3.低於45歲沒有臨 床疾病的成人。為了考慮是超免疫的並因而在本發明採用的篩選方法中是相關的,血清必 須與多個GBS特異性抗原反應。如本發明中使用的表達文庫應當允許所有可能抗原的表達,例如源自無乳鏈球 菌所有分泌的和表面蛋白質。細菌表面展示文庫由在細菌宿主膜的兩個挑選的外膜蛋白 質(LamB和FhuA)的呈示無乳鏈球菌一(總)套表達肽序列的細菌宿主的重組文庫表示 {Georgiou, G. , 1997} ; {Etz, H.等人,2001}。使用重組表達文庫一個優點是鑑別的超免疫 血清反應性抗原可以立即由篩選的和挑選的表達超免疫血清反應性抗原的克隆的編碼序 列的表達產生,沒有進一步的重組DNA技術或必要的克隆步驟。進一步用一或多個額外輪的篩選,分析通過根據本發明描述的程序鑑別的全套抗 原。所以,使用了被鑑別有免疫原性的個體抗體製備物或產生的抗所選肽的抗體。根據優 選實施方案,用於第二輪篩選的個體抗體製備物來源於顯示抗體滴度高於某個最低水平的 懷孕婦女和非孕成人,例如抗體滴度高於80百分數的測試人(患者或健康個體)血清,優 選地高於90百分數,尤其高於95百分數。在第二輪篩選使用這樣高滴度的個體抗體製備 物允許超免疫血清反應性抗原和其片段從無乳鏈球菌的非常有選擇性的鑑別。全面篩選過程之後,通過一系列ELISA和Western斑點試驗在第二輪篩選中測試 了挑選的抗原蛋白質以評價它們對大量的人血清收集物(最少 150健康和患者血清)的
38免疫原性,所述抗原蛋白質在原核表達系統中不能表達的情況下表達為重組蛋白質或體外 翻譯產物,或者鑑別的抗原性肽(合成產生)。個體抗體製備物(其也可是挑選的血清)允許所有超免疫血清反應性抗原最有希 望的候選物從第一輪的所有有希望的候選物中的選擇性鑑別是重要的。所以,優選地至少 10個個體抗體製備物(即來自至少10個已經遭受所選病原體感染的不同個體的抗體製備 物(例如血清))應當用於在第二輪篩選中鑑別這些抗原。當然,也可使用少於10個個體 製備物,然而,步驟的選擇性與低數量的個體抗體製備物可能不是最佳的。另一方面,如果 給定的超免疫血清反應性抗原(或其抗原片段)被至少10個個體抗體製備物,優選地至少 30個,尤其是至少50個個體抗體製備物識別,那麼超免疫血清反應性抗原的鑑別對正確鑑 別也有足夠的選擇性。當然也可以與儘可能多的個體製備物(例如與多於100或甚至與多 於1,000個)測試超免疫血清反應。所以,根據本發明的方法之超免疫血清反應抗體製備物的相關部分應當優選地至 少10個,更加優選地至少30個,尤其是至少50個個體抗體製備物。或者(或聯合地)超 免疫血清反應性抗原優選地也可用第二輪篩選中使用的至少20%,優選地至少30%,尤其 是至少40%的所有個體抗體製備物進行鑑別。根據本發明的優選實施方案,用於第二輪篩選個體抗體製備物從其製備的血清通 過它們抗無乳鏈球菌的滴度(例如抗這個病原體的製備物,例如裂解物,細胞壁組分和重 組蛋白質)進行挑選。優選地,當ELISA中全生物體(總裂解物或總細胞)用作抗原時, 挑選有總IgA滴度高於300U尤其是高於500U的和/或IgG滴度高於5,000U尤其是高於 10,000U(U =單位,從在給定稀釋度的0D4(l5nm讀數計算)的一些血清。人免疫系統產生的抗鏈球菌、並存在於人血清中的抗體是抗原蛋白質的體內表達 和它們的免疫原性的指徵。血清抗體識別的線性表位之識別能基於如4-5個胺基酸短的序 列。當然,它不是一定意味著這些短肽能夠體內誘導給定的抗體。為了那個原因,定義的表 位、多肽和蛋白質進一步地在動物(主要是小鼠)中測試它們誘導抗體內挑選蛋白質的抗 體的能力。優選的抗原位於細胞表面或被分泌,並且因而可胞外接近。期望抗細胞壁蛋白質 的抗體起多個作用抑制粘附、幹擾營養的獲得、抑制免疫逃避和促進噬菌作用{Hornef, M.等人,2002}。抗分泌蛋白質抗體對它們作為毒素或毒力組分的功能的中和是有益的。細 菌通過分泌蛋白質相互聯繫也是已知的。抗這些蛋白質之中和抗體將幹擾鏈球菌類之間或 鏈球菌內的促進生長的聯繫(cross talk)。生物信息分析(信號序列、細胞壁定位信號、跨 膜結構域)證明對於評價細胞表面定位或分泌是非常有用的。實驗室方法包括有相應表位 的抗體和蛋白質從人血清的分離,以及小鼠中抗細菌表面展示篩選挑選的(多)肽的免疫 血清的產生。這些血清然後作為下面試驗中的試劑用於第三輪篩選在不同條件下生長的 無乳鏈球菌的細胞表面染色(FACS或顯微鏡)、中和能力的測定(毒素、粘附)以及調理作 用和噬菌作用的促進(體外噬菌試驗)。為了所述目的,將細菌大腸桿菌菌落直接注射進小鼠,收集免疫血清並在相關體 外試驗中測試功能性調理或中和抗體。或者,可以使用肽或蛋白質作為底物從人或小鼠血 清純化特異性抗體。針對無乳鏈球菌的宿主防禦主要依賴調理噬菌性殺死機制。通過疫苗接種誘導高親和力的調理和中和類型的抗體幫助先天免疫系統清除細菌和毒素。這個使得根據本發明 的方法成為GBS抗原蛋白質鑑別的最佳工具。皮膚和黏膜的膜是強大的抗鏈球菌入侵的屏障。然而,一旦皮膚或粘附的膜被破 壞,第一道非適應性細胞防疫通過補體和噬菌細胞尤其是多形核白細胞(PMN)開始它的合 作作用。這些細胞能被當作清除入侵細菌的基石。因為無乳鏈球菌是主要的細胞外病原體, 主要的抗鏈球菌適應性反應來自免疫系統的體液途徑,並由三個主要機制介導調理作用 的促進、毒素的中和和粘附的抑制。相信調理作用因為它對有效噬菌作用的要求是尤其重 要的。對於有效的調理作用,為了 PMN通過IgG分子Fc片段或激活的C3b的受體的識別, 微生物表面必須用抗體和補體因子包被。調理作用之後,鏈球菌被吞噬和殺死。結合於細 菌細胞表面上的特異性抗原的抗體起附著於PMN的配體和促進噬菌作用的作用。期望結合 於粘附素和其它細胞表面蛋白質的非常一樣的抗體中和粘附以及阻止群集。本發明提供的 抗原的選擇因而非常適於鑑別將導致抗動物模型或人類中抗感染保護的那些抗原。根據此處使用的抗原鑑別方法,本發明驚人地提供了尤其如下描述的一套全面的 無乳鏈球菌新型核酸和新型超免疫血清反應性抗原和其片段。根據一個方面,本發明尤 其涉及編碼超免疫血清反應性抗原的核苷酸序列,所述序列列於序列列表中Seq ID No 1-217,435-448和463-474,以及代表超免疫血清反應性抗原的相應的編碼胺基酸序列列 於序列列表中 Seq ID No 218-434,449-462 和 475-486。本發明優選實施方案中,提供了其全長展示了與Seq ID No 14,90,157-216列 出的核苷酸序列70%相同性的核酸分子。最優選的是包含其全長與Seq ID No 14,90, 157-216列出的核酸分子至少80%或至少85%相同性的區域之核酸。在這點上,核酸分子 就其全長與Seq ID No 14,90,157-216列出的核酸分子至少90%、91 %、92%、93%、94%、 95 %或96 %相同是尤其優選的。此外,有至少97 %相同性的那些是優選的,有至少98 % 和至少99%的那些是尤其高度優選的,有至少99%或99. 5%是更加優選的,有100%相同 性是尤其優選的。另外,這點上優選實施方案是編碼基本上保留了與Seq ID No 14,90, 157-216列出的所述核酸編碼的成熟多肽相同生物功能或活性的超免疫血清反應性抗原或 其片段的核酸。如本領域已知並此處使用的相同性是通過比較序列測定的兩個或兩個以上多肽 序列或兩個或兩個以上多核苷酸序列之間的關係。本領域中,相同性也指多肽或聚核苷 酸序列之間序列相關的程度,就如在本情況下可以是這樣的序列串(strings)之間的匹配 測定的。能很容易地計算相同性。雖然有許多方法測量兩個聚核苷酸或兩個多肽序列之 間的相同性,所述術語對於技術人員是眾所周知的(例如分子生物學中的序列分析,von Heinje, G.,Academic Press,1987)。設計測定相同性的優選方法以給予測試的序列之間 最大的匹配。在電腦程式中編碼測定相同性的方法。測定兩個序列之間相同性的優選 電腦程式方法包括但不限於GCG程序包{Devereux,J.等人,1984}、BLASTP、BLASTN和 FASTA {Altschul, S.等人,1990}。根據本發明的另一方面,提供了展現與Seq ID No 1,3,5-13,15,18-25,27-31, 33-36,39-68,70-85,92-100,103-126,128-145,147,149-156,217,435-448 和 463-474 列 出的核酸序列有96%或高於96%,尤其是100%序列相同性的核酸分子。根據本發明的另一方面,提供了與核酸分子具有98 %或高於98 %,尤其是100 %序列相同性的核酸分子,所述核酸分子與Seq ID No 32,86,91,101,127列出的核酸序列相同。根據本發明的核酸分子作為第二備擇方案也可是至少基本上互補於上述第一備 擇方案的核酸的核酸分子。如此處使用地,互補是指核酸鏈經由Watson-Crick鹼基配對與 第二個核酸鏈是鹼基配對的。如此處使用地基本上互補的是指鹼基配對不發生在各個鏈所 有的鹼基而留有一定數量或百分比的未配對或錯配的鹼基。正確配對鹼基的百分比優選地 是至少70%,更加優選地80%,甚至更加優選地90%以及最優選地高於90%的任何百分 比。要注意70%配對鹼基的百分比被認為有同源性,具有這個程度配對鹼基對的雜交被認 為是嚴格的。這種嚴格雜交的雜交條件可以從分子生物學現代試驗方案(John Wiley and Sons, Inc. ,1987)獲得。更加特別地,雜交條件如下 例如在 5xSSPE,5xDenhardt' s 試劑,0. 1% SDS,100g/mL 剪切的 DNA 中在 68°C 進行的雜交 0. 2xSSC,0. 1% SDS中在42°C的中等嚴格清洗 0. lxSSC,0. 1% SDS 中在 68°C 的高嚴格清洗有50%GC含量的基因組DNA具有大約96°C的Tm。對於1 %的錯配,Tm降低大約 1°C。另外,此處描述的任何進一步的雜交條件原則上也可應用。當然,編碼與如本發明鑑別的那些相同的多肽分子之所有核酸序列分子包括任何 公開的給定編碼序列,因為遺傳密碼的簡併性可直接應用以清楚地測定編碼給定多肽分子 的所有可能的核酸分子,即使這樣簡併的核酸分子的數量可以很高。這個也可應用於給定 多肽的片段,只要在免疫接種這點上所述片段編碼適合用作例如作為主動或被動疫苗的多 肽。根據本發明的核酸分子作為第三備擇方案也能是包含了根據上面總結的根據本 發明的核酸分子第一和第二備擇方案的核酸分子至少15個鹼基的延伸的核酸。優選地,鹼 基形成了鹼基連續的延伸。然而,所述延伸由許多鹼基分開的兩個或兩個以上的基團組成, 也在本發明的範圍內。本核酸優選地由此處公開的序列至少20個,甚至更加優選地至少30個,尤其是至 少50個連續鹼基組成。由於用途的計劃區域(例如作為(PCR)引物、探針、(例如在(DNA) 晶片上的)捕獲分子等等),很容易地優化合適的長度。優選的核酸分子含有一個或多個表 1和2中列出的推定的免疫原性胺基酸序列的至少連續15個鹼基部分,尤其是表2的有高 於10分,優選地高於20分,尤其是有高於25分的序列。尤其優選的是含有本應用的序列方 案中任何序列的DNA序列連續部分的核酸,所述核酸與公開的無乳鏈球菌株NEM316 (ATCC 12403)基因組({Glaser,P.等人,2002} ;GenBank登陸號AL732656)和/或任何其它公開 的無乳鏈球菌基因組序列或其部分,尤其是血清型V的2603 V/R(A909)株{Tettelin,H.等 人,2002}) ;GenBank登陸號AE009948),顯示了一或多個,優選地多於2個,尤其是多於5個 不相同的核酸殘基。尤其優選的不相同的核酸殘基是導致不同胺基酸殘基的殘基。優選地, 核酸序列編碼與上面提到的公開的無乳鏈球菌對應物具有至少1個,優選地至少2個,優選 地至少3個不同胺基酸殘基的多肽。這樣分離的多肽也是優選的,所述多肽是此處例如序 列列表中提到的蛋白質(或全蛋白質)的片段,具有至少6、7或8個胺基酸殘基並由這些核酸編碼。根據本發明的核酸分子作為第四備擇方案也可是在嚴格雜交條件下退火於根據 上面總結的第一、第二和第三備擇方案的本發明任何核酸的核酸分子。嚴格雜交條件一般 是此處描述的那些。最後,根據本發明的核酸分子作為第五備擇方案也可是由於遺傳密碼的簡併性否 則能雜交根據上面總結的第一、第二、第三和第四備擇方案的根據本發明任何核酸分子的 任何核酸分子之核酸分子。這種核酸分子指的是優選地根據本發明的核酸編碼根據本發明 的超免疫血清反應性抗原或其片段的事實。這種核酸對於根據本發明的核酸分子的檢測, 並因而對例如無乳鏈球菌的各個微生物的診斷以及與這種微生物有關的任何疾病或疾病 狀態尤其有用。優選地,雜交將在如上面描述的第四備擇方案描述的嚴格條件下發生或進 行。如此處使用的核酸分子一般指的是任何核酸分子或脫氧核糖核酸分子,可以是非 修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。因而,例如,如此處使用的核酸分子在其它之中指 的是單和雙鏈DNA,單和雙鏈RNA的混合物的DNA,單和雙鏈區域的混合物的RNA,包含可以 是單鏈、或更加一般地雙鏈、或三鏈、或單和雙鏈區域混合物的DNA和RNA的雜交分子。另 外,如此處使用的核酸分子指的是包含RNA、或者DNA、或者RNA和DNA的三鏈區域。這樣區 域的鏈可以來自相同的分子或來自不同分子。這些區域可以包括所有的一個或多個分子, 但更一般地只涉及一些分子的區域。一個三螺旋區域的分子通常是寡核苷酸。如此處使用 地,術語核酸分子包括如上面描述的含有一個或多個修飾鹼基的DNA或RNA。因而,有為了 穩定性或為了其它原因而修飾的骨架的DNA或RNA是此處術語所指的「核酸分子」。另外, 包含例如次黃嘌呤核苷的異常鹼基或例如三苯甲基化鹼基的修飾鹼基的DNA或RNA(只提 及兩個例子)是如此處使用的術語的核酸分子。將理解已經對有本領域技術人員已知的很 多有用目的之DNA和RNA進行非常多種的修飾。如此處採用的術語核酸分子包含這樣化學、 酶或代謝修飾形式的核酸分子,以及病毒和其中包括簡單和複雜細胞的細胞特徵的化學形 式的DNA和RNA。術語核酸分子也包含通常指的是寡核苷酸的短核酸分子。「多核苷酸」和 「核酸」或「核酸分子」通常此處交替使用。本發明提供的核酸分子也包括眾多的獨特的片段,比無乳鏈球菌編碼區域的序列 列表中列出的核酸分子序列更長和更短,能通過標準克隆方法產生。為了是獨特的,片段必 須有足夠的大小使其能從其它已知的核酸序列中區分出來,最容易通過將任何挑選的無乳 鏈球菌片段與例如GenBank的計算機資料庫中的核苷酸序列比較而測定。另外,能對本發明包含的核酸分子和多肽進行修飾。例如,能進行不影響核酸編碼 的多肽的核苷酸替代,因而編碼超免疫血清反應性抗原或其片段編碼的任何核酸分子也包 含在本發明內。此外,使用例如標準克隆技術的標準技術能將編碼本發明提供的超免疫血清反應 性抗原或其片段的任何核酸分子功能性地聯接於任何期望的調節序列,不管是無乳鏈球菌 調節序列或異源性調節序列、異源性先導序列、異源性標記序列或產生融合蛋白的異源性 編碼序列。本發明的核酸分子可以是例如mRNA或cRNA的RNA形式,或者包括例如通過克隆 得到的或化學合成技術產生的cDNA和基因組DNA或其組合的DNA形式。DNA可以是三鏈、雙鏈或單鏈。單鏈DNA可以是編碼鏈,也已知為正義鏈,或者它可以是非編碼鏈,也指的是 反義鏈。本發明還涉及此處上面描述的核酸分子的變異體,所述變異體編碼具有序列列表 中列出的推算的無乳鏈球菌胺基酸序列的超免疫血清反應性抗原和其片段的片段、類似物 和衍生物。核酸分子的變異體可以是天然發生的變異體,例如天然發生的等位基因變異體, 或者它可以是不知道是天然發生的變異體。可以通過誘變技術製造核酸分子這樣非天然發 生的變異體,包括應用於核酸分子、細胞或生物體的那些。在這點的變異體之中,變異體是不同於前面提到的核酸分子,差別在於有核苷酸 替代、刪除或增加的核酸。替代、刪除或增加可包括一個或多個核苷酸。可在編碼或非編碼 區或者這兩個區域改變變異體。編碼區的改變可產生保守或非保守胺基酸替代、刪除或增 加。優選的是編碼變異體、類似物、衍生物或片段或者片段的變異體、類似物或衍生物的核 酸分子,所述核酸分子具有如序列列表中列出的無乳鏈球菌序列,其中以任何的聯合形式 少數、5至10個、1至5個、1至3個、2個、1個或沒有胺基酸被替代、刪除或增加。這些之中 尤其優選的是沉默替代、增加或刪除,它們不改變序列列表中列出的無乳鏈球菌多肽的特 性和活性。在這點也尤其優選的是保守替代。根據本發明的肽和片段也包括修飾的表位,其中優選地根據例如{Tourdot,S.等 人,2000}中公開的法則修飾或替代給定的表位的一個或兩個胺基酸,以及編碼這樣修飾的 表位的核酸序列。很清楚根據本發明的表位涵蓋了通過改進、保存或至少不顯著阻礙表位的T細胞 激活能力的胺基酸交換而衍生於本表位的表位。所以,本表位也涵蓋了不含有源於無乳鏈 球菌的原始序列但是激發相同或優選地改進的T細胞反應的表位。這些表位指的是「不規 則變化的」;它們需要具有對MHC/HLA分子相似的或優選地對更大的親和力,並且它們需要 以相似或優選地更強的方式刺激指向原始表位的T細胞受體(TCR)的能力。能通過合理設計獲得不規則變化的表位,即考慮如例如{Rammensee,H.等人, 1999}描述的單個殘基對結合於MHC/HLA的作用,聯合可能與TCR相互作用的殘基的系統交 換以及用指向原始表位的T細胞測試得到的序列。這樣的設計對於的本領域技術人員是可 能而無需過度的試驗。另一個可能性包括用指向原始表位的T細胞對肽庫的篩選。優選的方式是合成肽 庫的位點掃描。這樣的方法已經在例如{Hemmer,B.等人,1999}有詳細描述並且此處給予參考。作為本衍生胺基酸序列代表的表位或不規則變化的表位的備擇方案,也能採用模 仿這些表位的物質,例如「肽模仿物」或「回復-反_肽」(retro-inverso-p印tides)。改進的表位設計的另一方面,是帶有增加其刺激T細胞的能力的物質之製劑或修 飾。這些包括T輔助細胞表位、脂質或脂質體或如W001/78767中描述的優選的修飾。增加表位T細胞刺激能力的另一方法是帶有免疫刺激物質的製劑,例如象白細 胞介素-2、-7、-12、-18、I和II型幹擾素(IFN)的細胞因子或化學因子,尤其是IFN-Y、 GM-CSF、TNF- a、flt3 配體等。另外如此處討論地,關於本發明的核酸分子試驗,例如如上面討論的本發明的核 酸分子可以用作RNA、cDNA和基因組DNA的雜交探針以分離編碼本發明多肽的全長cDNA和基因組克隆,以及分離與本發明核酸分子具有很高的序列相似性的其它基因的cDNA和基 因組克隆。這樣的探針一般包含至少15個鹼基。優選地,這樣的探針將具有至少20個、至 少25個或至少30個鹼基,可以具有至少50個鹼基。特別優選的探針將具有至少30個鹼 基,將具有50個或更少的鹼基,例如30、35、40、45或50個鹼基。例如,使用已知的DNA序列通過篩選相關文庫分離本發明的核酸分子的編碼區域 以合成寡核苷酸探針。具有互補於本發明基因序列的序列的標記寡核苷酸然後用於篩選 cDNA、基因組DNA或mRNA文庫以測定探針雜交於文庫的哪些成員。如此處進一步討論地,關於核酸分子試驗,本發明的核酸分子和多肽可以用作開 發尤其是人類疾病的疾病的治療和診斷的試劑和物質。作為寡核苷酸的本發明的核酸分子能用於此處描述的方法中,但是優選地是PCR, 以測定此處鑑別的無乳鏈球菌基因是否全部或部分存在於例如血液的感染組織和/或在 其中轉錄。已經認識到這樣的序列也將在病原體已經達到的感染階段和感染類型的診斷有 用途。為了這個和其它的目的,可以使用如此處描述的包含至少一個根據本發明的核酸的 陣列。根據本發明的核酸分子可以用於核酸分子和含有這些核酸的生物體或樣品的檢 測。優選地這樣的檢測是為了診斷,更加優選地是為了與無乳鏈球菌的存在或豐度相關的 或相聯的疾病的診斷。感染了無乳鏈球菌的特別是哺乳動物尤其是人的真核細胞(此處也是「個體」)是 可以鑑別的,方法是通過各種技術在DNA水平檢測的根據本發明的任何核酸分子的檢測。 能夠獲得為了從其它生物體區分無乳鏈球菌的優選的候選核酸分子。本發明提供了診斷源自無乳鏈球菌感染的疾病的方法,包含從個體分離的或來源 於個體的樣品測定具有序列列表中列出的核酸分子序列的核酸分子表達水平的增加。能使 用本領域中眾所周知的核酸分子定量的方法測量核酸分子的表達,例如PCR、RT-PCR、RNaSe 保護、Northern斑點、其它的雜交方法和此處描述的陣列。如此處使用的分離的是指「通過人工」從其天然狀態分離;即,如果它天然發生,它 將被改變或從其原始環境去除,或兩個都有可能。例如,天然存在於活的生物體的天然發生 的核酸分子或肽在其天然狀態是不「分離的」,但是從其天然狀態的共存物質中分離的相同 的核酸分子或多肽是「分離的」,如此處採用的術語。作為分離的部分或下面的分離,例如為 了誘變形成融合蛋白質以及為了宿主中的增殖或表達,這樣的核酸分子能連接於例如DNA 的其它的核酸分子。分離的核酸分子單獨或連於例如載體的其它核酸分子能被引入培養的 或全生物體的宿主細胞。引入培養的或全部生物體的宿主細胞,這樣的DNA仍然將是分離 的,如此處使用的術語,因為它們將不是它們天然發生的形式或不在它們天然發生的環境 中。相似地,核酸分子和多肽可以發生在組合物中,例如介質製劑、核酸分子或多肽引入例 如細胞內的溶液、化學或酶反應的組合物或溶液,例如,它們不是天然發生的組合物,在此 處採用的那個術語的意義之內,在那裡仍然是分離的核酸分子或多肽。根據本發明的核酸可以是化學合成的。或者,核酸能通過本領域的技術人員已知 的方法從無乳鏈球菌中分離。根據本發明的另一方面,通過使用此處描述的抗原鑑別方法提供了一套全面的新 型超免疫血清反應性抗原和其片段。本發明優選的實施方案中,提供了包含此處描述的任何一個核酸分子編碼的胺基酸序列的超免疫血清反應性抗原及其片段。本發明的另一優 選實施方案中,提供了包含選自如Seq ID No 231,307,374-433中表示的多肽序列之氨 基酸序列的一套新型超免疫血清反應性抗原及其片段。本發明另一優選的實施方案中, 提供了包含選自 Seq ID No 218,220,222-230,232,235-242,244-248,250-253,256-285, 287-302,309-317,320-343,345-362,364,366-373,434,449-462 和 475-486 中表示的多肽 序列之胺基酸序列的一套新型超免疫血清反應性抗原及其片段。本發明另一優選實施方案 中,提供了包含選自Seq ID No 249,303,308,318,344中表示的多肽序列之胺基酸序列的 一套新型超免疫血清反應性抗原及其片段。
如本發明提供的超免疫血清反應性抗原及其片段包括序列列表中列出的任何多 肽,以及如下的多肽具有與序列列表中列出的多肽至少70%相同性,優選地與序列列表 中列出的多肽至少80 %或85 %相同性,更加優選地與序列列表中列出的多肽至少90 %相 似性(更加優選地至少90%相同性)以及仍然更加優選地與序列列表中列出的多肽至 少95%、96%、97%、98%、99%或99. 5%相似性(仍然更加優選地至少95%、96%、97%、 98%、99%或99. 5%相同性),也包括這樣的多肽的部分,所述多肽一般有含有4個胺基酸, 更加優選地至少8個,仍然更加優選地至少30個,仍然更加優選地至少50個胺基酸,例如 4,8,10,20,30,35,40,45或50個胺基酸的這樣的多肽部分。本發明還涉及這些超免疫血清反應性抗原及其片段的片段、類似物和衍生物。術 語「片段」、「衍生物」和「類似物」當指的是其胺基酸序列列於序列列表中的抗原時,是指基 本上保留了與這樣的超免疫血清反應性抗原及其片段相同的或相似的生物功能或活性的 多肽。超免疫血清反應性抗原及其片段的片段、衍生物或類似物可以是1)其中一個或 多個胺基酸殘基被保守或非保守胺基酸殘基(優選地保守的胺基酸殘基)替代的一種,並 且這樣替代的胺基酸殘基可以是或可以不是遺傳密碼編碼的一個,或者2)其中一個或多 個胺基酸殘基包括取代基團的一種,或者3)其中成熟的超免疫血清反應性抗原及其片段 與例如增加超免疫血清反應性抗原及其片段半衰期的化合物(例如,聚乙二醇)的另一種 化合物融合的一種,或者4)其中額外的胺基酸融合於成熟的超免疫血清反應性抗原及其 片段的一種,例如先導或分泌序列或用於成熟超免疫血清反應性抗原及其片段的純化的序 列或前蛋白質序列。這樣的片段、衍生物和類似物認為在本領域技術人員此處教義的範圍 內。本發明也涉及不同的無乳鏈球菌分離物的抗原。基於此處公開的核酸和胺基酸 序列可以很容易地分離這樣的同源物。至今有9個截然不同的血清型,分型基於血清型特 異性抗血清。對於每一個血清型能相應地測定任何抗原的存在。另外,測定如膿性鏈球菌 (S. pyogenes) sic基因{Hoe,N.等人,2001}描述的各種血清型中特定抗原的變異性是可能 的。各種血清型對不同GBS感染的作用在不同年齡組和地理區域是不同的。期望最有價值 的保護抗原在各種臨床株之中是保守的是一個很重要的方面。在這點序列列表中列出的超免疫血清反應性抗原及其變異體、類似物、衍生物和 片段,以及片段的變異體、類似物和衍生物在本發明尤其優選的實施方案中。額外地,包含 這樣的超免疫血清反應性抗原及其變異體、類似物、衍生物和片段以及片段的變異體、類似 物和衍生物的融合多肽也包含在本發明中。使用標準技術能很容易地製造這樣的融合多肽和蛋白質以及編碼它們的核酸分子,包括生產和表達編碼融合蛋白質的重組聚核酸的標準 重組技術。由於保守胺基酸替代而與參比不同的那些在優選變異體之中。這樣的替代是多肽 中給定胺基酸被另一個同樣特性的胺基酸替代的那些。一般視為保守替代是脂肪性胺基酸 Ala, Val, Leu和lie中互相的取代;羥基殘基Ser和Thr的交換,酸性殘基Asp和Glu的 交換,醯胺殘基Asn和Gin之間的替代,鹼性殘基Lys和Arg的交換以及芳香基殘基Phe和 Tyr之間的取代。在這點上進一步尤其優選的是具有序列列表中列出的任何多肽之胺基酸序列的 變異體、類似物、衍生物和片段,以及片段的變異體、類似物、衍生物,其中幾個、少數、5至 10個、1至5個、1至3個、2個、1個或沒有胺基酸殘基以任何聯合形式被替代、刪除或增加。 這些之中尤其優選的是不改變本發明多肽的特性和活性的沉默替代、增加和刪除。在這點 上也尤其優選的是保守替代。最高度優選的是具有序列列表中列出的沒有替代的胺基酸序 列的多肽。優選地以分離的形式提供本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段,優選地是純 化為同質的。包含具有序列列表中列出的胺基酸序列的多肽的片段以及序列列表中列出的多 肽的變異體和衍生物的片段也在本發明優選實施方案中。在這點上,片段是具有與前面提到的超免疫血清反應性抗原及其片段的部分但不 是所有胺基酸序列完全相同的胺基酸序列的多肽及其變異體或衍生物、類似物、片段。這樣 的片段可以是「游離的」,即不是其它胺基酸或多肽的部分或者與其融合,或者它們也包含 在它們形成的一部分或區域的更大的多肽內。本發明這個方面也優選的是特徵在於本發明 多肽的結構或功能屬性的片段,即包含本發明多肽的a-螺旋和a _螺旋形成區域、折 疊和摺疊形成區域、折轉和折轉形成區域、捲曲和捲曲形成區域、親水區域、疏水區域、 a兩性區域、0兩性區域、可曲(flexible)區域、表面形成區域、底物結合區域和高抗原指 示區域的片段以及這樣的片段的聯合。優選的區域是介導本發明超免疫血清反應性抗原及 其片段的活性的那些。在這點上最高度優選的是具有本發明超免疫血清反應性抗原及其片 段的化學、生物或其它活性的片段,包括有相似活性或改進活性或有降低的非期望活性的 那些。尤其優選的是包含酶受體或結構域的片段,所述酶受體或結構域賦予無乳鏈球菌存 活或造成人類疾病的能力所必須的功能。進一步優選的多肽片段是包含或含有尤其是人的 動物中抗原或免疫原性決定簇的那些。抗原片段定義為鑑別的抗原的片段,對於其本身它是抗原的或者當提供為半抗原 時可以製成抗原的。所以,本發明實現了顯示一個或(對於更長的片段)只有少數胺基酸 交換的抗原或抗原片段,假設在交換時沒有嚴重地破壞有胺基酸交換的這樣的片段的抗原 能力,即適於引發接受這個抗原免疫接種的個體的合適免疫反應以及用來自個體血清的個 體抗體製備物鑑別。高免疫反應抗原這樣的片段的優選實例選自包含表1A的「推定的免疫原性氨基 酸」欄和「鑑別的免疫原性區域的位置」的胺基酸序列的多肽,尤其是包含如下胺基酸的多 月太Seq ID No 218 的 4-20,35-44,65-70,73-87,92-98,112-137,152-161,177-186, 193-200,206-213,229-255,282-294,308—313,320—326,349—355,373—384,388—406,
46420-425 和 115-199 ;Seq ID No 219 的 5-24,35-41,44-70,73-89,103-109,127-143, 155-161,185-190,192-207,212-219,246-262,304-336,372-382,384-393,398-407, 412-418,438-444,1-75,76-161 和 164-239 ;Seq ID No 220 的 4-10,16-58,60-71,77-92, 100-126,132-146,149-164,166-172,190-209,214-220,223-229,241-256,297-312, 314-319,337-343,351-359,378-387,398-418,421-428,430-437,440-448,462-471, 510-519,525-536,552-559,561-568,573-582,596-602,608-630,637-649,651-665, 681-702,714-732,739-745,757-778,790-805,807-815,821-829,836-842,846-873, 880-903,908-914,916-923,931-940,943-948,956-970,975-986,996-1015,1031-1040, 1051-1069,1072-1095,1114-1119,1130-1148,1150-1157,1169-1176,1229-1238 和 802-812 ;Seq ID No221 的 5-12,14-26,35-47,52-67,72-78,83-98,121-141,152-159, 163-183,186-207,209-257,264-277,282-299,301-309,312-318,324-339,358-368, 372-378,387-397,425-431 和 46-291 ;Seq ID No 222 的 29-38,44-64,70-76,78-87, 94-100,102-112,119-134,140-149,163-173,178-186,188-194,207-234,247-262, 269-290 和 73-92 ;SeqID No 223 的 10-28,36-63,77-87,103-119,127-136,141-169, 171-183,195-200,207-232,236-246,251-265,268-283,287-297,314-322,335-343, 354-363,384-390,405-411,419-436,443-455,467-473,480-513,518-529,550-557, 565-585,602-608,616-625,632-660,665-677,685-701,726-736,738-747,752-761, 785-796,801-813,838-853,866-871 和 757-774 ;Seq ID No 224 的 31-38,61-66,74-81, 90-115,123-145,154-167,169-179,182-193,200-206,238-244,267-272 和 235-251 ;Seq IDNo 225 的 19-25,38-54,56-64,66-72,74-92,94-100,116-129,143-149,156-183, 204-232,253-266,269-275,294-307 和 241-313 ;Seq ID No 226 的 5-34,50-56,60-65, 74-85,89-97,108-119,159-165,181-199,209-225,230-240,245-251,257-262,274-282, 300-305 和 64-75 ;Seq ID No 227 的 5-13,16-21,27-42,45-52,58-66,74-87,108-114, 119-131 和 39-51 ;Seq ID No 228 的 6-23,46-54,59-65,78-84,100-120,128-133, 140-146,159-165,171-183,190-204,224-232,240-248,250-259,274-280,288-296, 306-315 和 267-274 ;Seq ID No 229 的 5-12,15-24,26-36,42-65,68-80,82-104,111-116, 125-144,159-167,184-189,209-218,235-243,254-265,269-283,287-300,306-316, 318-336,338-352,374-392 和 162-174 ;Seq ID No 230 的 30-42,45-54 和 25-37 ;Seq ID No 231 的 10-30,53-59,86-95,116-130,132-147,169-189,195-201,212-221,247-256, 258-265,278-283,291-298,310-316,329-339,341-352,360-367,388-396,398-411, 416-432,443-452,460-466,506-512,515-521,542-548 和 419-431 ;Seq ID No 232 的 4-27,30-53,60-67,70-90,92-151,159-185,189-195,198-210,215-239和 173-189 ;Seq ID No 233 的 4-26,41-54,71-78,116-127,140-149,151-158,161-175,190-196,201-208, 220-226,240-252,266-281,298-305,308-318,321-329,344-353, 372-378, 384-405, 418-426,429-442,457-463,494-505,514-522 和 174-188 ;Seq ID No 234 的 17-25,27-39, 61-67,81-89,99-110,120-131,133-139,147-161,167-172,179-185,192-198,203-213, 226-238,243-258,261-267,284-290,296-307,311-328,340-352,356-371 和 239-256 ;Seq ID No 235 的 8-30,40-49,67-80,114-123,126-142,152-162,188-194 和 57-70 ;Seq ID No 236 的 4-23,28-34,36-47,50-61,76-81,89-94,96-104,112-119,126-146,155-181,195-200,208-214,220-229,244-260,263-276,282-288,292-300,317-323,336-351, 353-359,363-375,382-399,415-432,444-455,458-471,476-481,484-492,499-517, 522-529,535-541,543-568,572-584,586-600,607-617,626-637,656-675 和 282-297 ;Seq ID No 237 的 6-24,30-35,38-45,63-91,134-140,146-160,167-188,214-220,226-234, 244-250,260-270,286-301,316-329,340-371,429-446,448-459,474-481,485-491, 512-526,537444,550-565,573-583,596-613,621-630,652-658 和 87-97 ;Seq ID No 238 的 8-20,26-48,56-67,76-8 6,94-109,115-121,123-129,143-160,178-186,191-198, 201-208,221-236,238-244,260-268 和 237-247 ;Seq ID No 239 的 4-40,42-57,73-87, 98-117, 126-135, 150-156, 166-174, 196-217, 231-236,248-258, 276-284,293-301,
307-313,339-347, 359-365,375-387,395-402,428-440,445-456,485-490,497-505, 535-541,547-555,610-625,648-656,665-671 和 448-528 ;Seq ID No 240 的 10-18,39-45, 51-61,80-96,98-106,110-115,158-172,174-183,191-200,220-237,249-255,274-289,
308-324,331-341,372-381,384-397,405-414和 322-338 ;Seq ID No 241 的 30-36,38-56, 85-108,134-147,149-160,163-183,188-201,206-211,219-238,247-254 和 5-13 ;Seq ID No242 的 11-40,98-103,110-115,133-145,151-159,172-179,192-201,204-212,222-228, 235-245,258-268,283-296,298-309,322-329,342-351,354-362,372-378,385-393, 407-418,495-516 和 1-148 ;Seq ID No 243 的 5-19,21-36,73-94,112-119,122-137, 139-145,152-167,184-190,198-204,208-224,249-265,267-281,299-304,309-317, 326-333,356-364,368-374,381-389,391-414,419-425,430-435 和 113-140 ;Seq ID No 244 的 45-54,59-67,78-91 和 15-23 ;Seq ID No 245 的 11-22,33-47,52-80,88-112, 124-129 和 6-25 ;Seq ID No 246 的 26-41,51-63,80-89,93-115,150-163,187-193, 220-237,240-249,286-294,296-306,316-329,345-353,361-370,407-425,428-437, 474-482,484-494,504-517,533-541,549-558,595-613,616-625,660-668,673-685, 711-726,736-744,749-761,787-802,812-820,825-837,863-878,888-896,901-913, 939-954,964-972,977-989,1003-1008,1016-1022,1028-1034,1041-1053,1059-1074, 1101-1122,420-511 和 581-704 ;Seq ID No247 的 18-25,27-55,71-83,89-95,102-113, 120-146,150-156,174-185 和 159-175 ;Seq ID No 248 的 24-30,38-56,63-68,87-93, 136-142,153-164,183-199,213-219,226-234,244-261,269-278,283-289,291-297, 320-328, 330-336, 340-346,348-356,358-366,382-387,401-408,414-419,449-455, 468-491,504-512,531-537,554-560,597-608,621-627,632-643,650-662,667-692, 703-716,724-737,743-758,783-794,800-818,846-856 和 806-884 ;Seq IDNo 249 的 4-14, 21-39,86-92,99-107,121-131,136-144,147-154,158-166,176-185,193-199,207-222, 224-230 和 117-136 ;Seq IDNo 250 的 65-76,85-97,103-109,115-121,125-146,163-169,
196-205,212-219,228-237,241-247,254-262,269-288,294-303,305-313,328-367, 395-401,405-412,418-429,437-447,481-488,506-513,519-524,530-541,546-557 和 266-284 ;Seq ID No 251 的 5-14,37-42,49-71,78-92,97-112,127-136,147-154, 156-163,186-198,216-225,233-243,248-253,295-307,323-332,359-366,368-374, 380-398 和 194-223 ;Seq ID No 252 的 4-11,33-39,45-72,100-113,119-129,136-144, 169-175,177-185,200-208,210-219,262-276,278-297,320-326,336-344,347-362,381-394,443-453 和 438-454 ;Seq ID No 253 的 4-29,31-52,55-61,95-110,138-158, 162-171,179-187,202-229,239-248,251-256,262-267,269-285,304-310,351-360, 362-368,381-388,415-428,435-440,448-458 和 161-178 ;Seq ID No 254 的 4-17,19-28, 32-43,47-59,89-110,112-126,128-134,140-148,152-161,169-184,191-204,230-235, 255-264,328-338,341-347,401-409,413-419,433-441,449-458,463-468,476-482, 486-492,500-506,529-545 和 305-381 ;Seq IDNo 255 的 10-29,38-45,53-61,134-145, 152-160,163-170,202-208,219-229,248-258,266-275,282-288,315-320,328-334, 377-385,392-402,418-424,447-453,460-471,479-487,491-497,500-507,531-537, 581-594,615-623,629-635,644-652,659-666,668-678,710-717,719-728,736-741, 747-760,766-773,784-789,794-800,805-817,855-861,866-887 和 698-715 ;Seq ID No 256 的 16-26,29-37,44-58,62-68,74-80,88-95,97-120,125-144,165-196 和 58-72 ;Seq ID No 257 的 14-21,23-46,49-60,63-74,78-92,96-103,117-129,134-161,169-211, 217-231,239-248,252-281,292-299,313-343 和 243-257 ;Seq ID No 258 的 11-27,46-52, 67-72,76-84,91-112,116-153,160-175,187-196,202-211,213-220 和 43-76 ;Seq ID No 259 的 5-29,37-56,78-86,108-118,152-161 和 120-130 ;Seq ID No 260 的 8-14,19-41, 52-66,75-82,87-92,106-121,127-133,136-143,158-175,180-187,196-204,221-228, 239-245, 259-265, 291-306, 318-323,328-340,352-358,361-368,375-381,391-399, 411-418,431-442,446-455,484-496,498-510,527-533,541-549,558-565,575-585, 587-594,644-655,661-668,671-677 和 184-196 ;Seq ID No 261 的 4-22,29-38,55-62, 75-81,102-107,110-134,143-150,161-167,172-179,191-215,223-233,241-247, 251-264,266-272,288-309,340-352,354-366,394-402,414-438 和 198-218 ;Seq ID No 262 的 24-44,49-70,80-91,105-118,128-136,140-154 和 77-92 ;Seq ID No 263 的 5-22, 31-36,41-47,67-74,83-90,105-122,135-143,160-167 和 118-129 ;Seq ID No 264 的 4-25,33-73,81-93,96-106,114-120,122-128,130-172,179-208,210-241,251-283, 296-301 和 92-100 ;Seq ID No 265 的 14-24,29-38,43-50,52-72,86-97,101-107, 110-125,127-141,145-157,168-175,177-184,186-195,205-226,238-250,255-261, 284-290,293-304,307-314,316-323,325-356,363-371,383-390,405-415,423-432, 442-454,466-485,502-511,519-527,535-556,558-565,569-574,612-634,641-655, 672-686,698-709,715-722,724-732,743-753,760-769,783-792,818-825,830-839, 842-849, 884-896, 905-918,926-940,957-969,979-1007,1015-1021,1049-1057 禾P 336-349 ;Seq ID No 266 的 6-16,26-31,33-39,62-73,75-85,87-100,113-123,127-152, 157-164,168-181,191-198,208-214,219-226,233-254,259-266,286-329 和 181-195 ;Seq ID No 267 的 4-13,32-39,53-76,99-108,110-116,124-135,137-146,149-157,162-174, 182-190,207-231,242-253,255-264,274-283,291-323,334-345,351-360,375-388, 418-425,456-474,486-492,508-517,520-536,547-560,562-577,31-45 和 419-443 ;Seq ID No 268 的 15-26,30-37,42-49,58-90,93-99,128-134,1 47-154,174-179,190-197, 199-205,221-230,262-274,277-287,300-314,327-333,343-351,359-377, 388-396, 408-413,416-425,431-446 和 246-256 ;Seq ID No 269 的 5-26,34-42,47-54,61-67, 71-104,107-115,131-138,144-153,157-189,196-202,204-210,228-245,288-309,316-329,332-341,379-386,393-399,404-412,414-421,457-468,483-489,500-506,508-517,523-534,543-557,565-580,587-605,609-617,619-627,631-636,640-646, 662-668,675-682,705-710,716-723,727-732,750-758,784-789,795-809,869-874, 14-138,166-286,372-503,674-696 和 754-859 ;Seq ID No 270 的 5-17,32-38,40-47, 80-89,113-119,125-137,140-154,157-163,170-177,185-199,213-225,228-236, 242-248,277-290,292-305,323-333,347-353,364-370,385-394,399-406,423-433, 441-451,462-474,477-487 和 116-124 ;Seq ID No 271 的 7-16,18-30,32-49,53-61, 63-85,95-101,105-115,119-134,143-150,159-178,185-202,212-229,236-250,254-265, 268-294 和 63-72 ;Seq ID No 272 的 4-12,19-47,73-81,97-103,153-169,188-198, 207-213,217-223,236-242,255-265,270-278,298-305,309-317,335-347,354-363,
373-394,419-424,442-465,486-492,500-507,542-549,551-558,560-572,580-589, 607-614,617-623,647-653,666-676,694-704,706-714,748-754,765-772,786-792, 795-806 和 358-370 ;Seq IDNo 273 的 18-28,30-38,40-46,49-55,69-78,82-98,104-134, 147-153, 180-190,196-202,218-236,244-261,266-273,275-286,290-295,301-314, 378-387,390-395,427-434 和 290-305 ;Seq IDNo 274 的 4-13,20-31,39-51,54-61,69-84, 87-105,117-124 和 108-125 ;Seq ID No 275 的 24-34,43-54,56-66,68-79 和 50-69 ;Seq ID No 276 的 5-43,71-77,102-131,141-148,150-156,159-186,191-207,209-234, 255-268, 280-286, 293-299,317-323,350-357,363-372,391-397,406-418,428-435,
455-465,484-497,499-505,525-531,575-582,593-607,621-633,638-649,655-673, 684-698,711-725,736-741,743-752,759-769,781-793,813-831,843-853,894-905, 908-916,929-946,953-963,970-978,1001-1007,1011-1033,165-178 和 818-974 ;Seq ID No 277 的 16-44,63-86,98-108,185-191,222-237,261-274,282-294,335-345,349-362,
374-384,409-420,424-430,440-447,453-460,465-473,475-504,522-534,538-551, 554-560,567-582,598-607,611-619,627-640,643-653,655-661,669-680,684-690, 701-707,715-731,744-750,756-763,768-804,829-837,845-853,855-879,884-890, 910-928,77-90,144-212,279-355,434-536,782-810 和 875-902 ;Seq ID No 278 的 4-22, 29-41,45-51,53-66,70-77,86-95,98-104,106-124,129-135,142-151,153-161,169-176, 228-251,284-299,331-337,339-370,380-387,393-398,406-411,423-433,440-452, 461-469, 488-498,501-516,523-530,532-559,562-567,570-602,612-628,630-645, 649-659,666-672,677-696,714-723,727-747 和 212-227 ;Seq IDNo 279 的 4-9,17-31, 35-41,56-61,66-75,81-87,90-124,133-138,149-163,173-192,213-219,221-262, 265-275,277-282,292-298,301-307,333-346,353-363,371-378,419-430,435-448,
456-469,551-570,583-599,603-612和 275-291 ;Seq ID No 280 的 28-34,53-58,72-81, 100-128,145-154,159-168,172-189,217-225,227-249,256-263,299-309,322-330, 361-379,381-388,392-401,404-417,425-436,440-446,451-464,469-487,502-511, 543-551,559-564,595-601,606-612,615-626,633-642,644-650,664-670,674-684, 692-701,715-723,726-734,749-756,763-771,781-787,810-843,860-869,882-889, 907-917,931-936,941-948,951-958,964-971,976-993,1039-1049,1051-1065, 1092-1121,1126-1132,1145-1151,1158-1173,1181-1192,1194-1208,1218-1223,1229-1243,1249-1254,1265-1279,1287-1297,1303-1320,1334-1341,1343-1358, 1372-1382,1406-1417,1419-1425,1428-1434,1441-1448,1460-1473,1494-1504, 1509-1514,1529-1550,654-669 和 1400-1483 ;Seq IDNo 281 的 10-16,20-25,58-65, 97-109,118-132,134-146,148-155,186-195,226-233,244-262,275-284,295-310, 317-322,330-339,345-351,366-375,392-403,408-415,423-430,435-444,446-457, 467-479,486-499,503-510,525-537,540-585,602-612,614-623,625-634,639-645, 650-669,700-707,717-724,727-739,205-230 和 733-754 ;Seq ID No 282 的 5-22,37-43, 72-81,105-113,128-133,148-160,188-194,204-230,238-245,251-257 和 194-213 ;Seq IDNo 283 的 16-21,35-41,56-72,74-92,103-109 和 62-68 ;Seq IDNo 284 的 4-15,17-82, 90-104,107-159,163-170,188-221,234-245,252-265 和 220-235 ;Seq ID No 285 的 16-22,36-46,61-75,92-107,113-121,139-145,148-160 和 30-42 ;Seq ID No 286 的 4-12, 20-26,43-49,55-62,66-78,121-127,135-141,146-161,164-170,178-189,196-205, 233-238,269-279,288-318,325-332,381-386,400-407 和 328-346 ;Seq ID No 287 的 5-12,31-49,57-63,69-79,89-97,99-114,116-127,134-142,147-154,160-173,185-193, 199-204,211-222,229-236,243-249,256-274 和 58-68 ;Seq ID No 288 的 10-20,28-34, 39-53,68-79,84-90,99-106 和 73-79 ;Seq ID No 289 的 14-37,45-50,61-66,77-82, 93-98,109-114,125-130,141-146,157-162,173-178,189-194,205-210,221-226, 237-242,253-258,269-274,285-290,301-306,316-332,349-359,371-378,385-406, 34-307 和 312-385 ;Seq ID No 290 的 4-10,17-38,50-85,93-99,109-116,128-185, 189-197,199-210,223-256,263-287,289-312,327-337,371-386,389-394,406-419, 424-432,438-450,458-463,475-502,507-513,519-526,535-542,550-567 和 361-376 ;Seq IDNo 291 的 10-39,42-93,100-144,155-176,178-224,230-244,246-255,273-282, 292-301,308-325,332-351,356-361,368-379,386-393,400-421 和 138-155 ;Seq ID No 292 的 5-11,17-34,40-45,50-55,72-80,101-123,145-151,164-172,182-187,189-195, 208-218,220-241,243-252,255-270,325-331,365-371,391-398,402-418,422-428, 430-435,443-452,463-469,476-484,486-494,503-509,529-553,560-565,570-590, 608-614,619-627,654-661,744-750,772-780,784-790,806-816,836-853,876-885, 912-918,926-933,961-975,980-987,996-1006,1016-1028,1043-1053,1057-1062, 994-1003 和 1033-1056 ;Seq ID No 293 的 17-45,64-71,73-81,99-109,186-192,223-238, 262-275,283-295,336-346,350-363,375-385,410-421,425-431,441-448,454-463,
468-474,476-512,523-537,539-552,568-583,599-608,612-620,628-641,644-654, 656-662,670-681,685-695,702-708,716-723,725-735,757-764,769-798,800-806, 808-816,826-840,846-854,856-862,874-881,885-902,907-928,274-350 和 443-513 ;Seq ID No 294 的4-22,29-41,45-51,53-61,70-76,85-92,99-104,111-122,134-140,142-154, 163-174,224-232,255-265,273-279,283-297,330-335,337-348,356-367,373-385, 391-396,421-431,442-455,475-485,493-505,526-538,544-561,587-599,605-620, 622-651,662-670,675-681,687-692,697-712,714-735 和 252-262 ;Seq ID No 295 的 4-12,15-35,40-46,50-59,67-94,110-128,143-169,182-188,207-215,218-228,238-250 禾口 74-90 ;Seq ID No 296 的 9—18,42—58,78—85,88—95,97—106,115—122,128—134,140-145,154-181,186-202,204-223,261-267,269-278,284-293,300-336,358-368 和 12-29 ;Seq ID No 297 的 7_34,46-53,62-72,82_88,100-105,111-117,132-137,144-160, 166-180,183-189,209-221,231-236,246-253,268-282,286-293,323-336,364-372, 378-392,422-433 和 388-405 ;Seq ID No 298 的 21-27,34-50,72-77,80-95,164-177, 192-198,202-220,226-236,239-247,270-279,285-292,315-320,327-334,348-355, 364-371,388-397,453-476,488-497,534-545,556-576,582-588,601-607,609-616, 642-662,674-681,687-697,709-715,721-727,741-755 和 621-739 ;Seq ID No 299 的 4-14,16-77,79-109 和 25-99 ;Seq ID No 300 的 4-9,17-23,30-37,44-55,65-72,77-93, 102-121,123-132,146-153 和 17-29 ;Seq ID No 301 的 4-18,25-41,52-60,83-92, 104-112,117-123,149-155,159-167,170-192,201-210,220-227,245-250 和 124-137 ;Seq ID No 302 的 8-25,50-55,89-95,138-143,148-153,159-169,173-179,223-238,262-268, 288-295,297-308,325-335,403-409,411-417,432-446,463-475,492-501,524-530, 542-548,561-574,576-593,604-609,612-622,637-654,665-672,678-685,720-725, 731-739,762-767,777-783,820-838,851-865,901-908,913-920,958-970,1000-1006, 1009-1015,1020-1026,1043-1052,1055-1061,1-128,252-341,771-793 和 1043-1058 ;Seq ID No 303 的 16-26,33-46 和 64-76 ;Seq ID No 304 的 4-27,69-77,79-101,117-1 23, 126-142,155-161,171-186,200-206,213-231,233-244,267-273,313-329,335-344, 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21-27,35-45,70-76,92-105,129-143,145-155,161-166, 170-191,204-211,214-231,234-246,249-255,259-275 和 1-18 ;Seq ID No 309 的 21-35, 45-53,56-64,69-97 和 1-16 ;SeqID No 310 的 25-33,41-47,61-68,86-101,106-114, 116-129,134-142,144-156,163-176,181-190,228-251,255-261,276-292,295-305, 334-357, 368-380, 395-410,424-429,454-460,469-482,510-516,518-527,531-546, 558-570,579-606,628-636,638-645,651-656,668-674,691-698,717-734,742-754, 765-770,792-797,827-835,847-859,874-881,903-909,926-933,942-961,964-977, 989-1004,1010-1028,1031-1047,1057-1075,1081-1095, 1108-1117, 1138-1144, 1182-1189,1193-1206,1220-1229,1239-1246,1257-1267,1271-1279,1284-1301,1312-1320,1329-1335,1341-1347,1358-1371,1399-1404,1417-1426,1458-1463, 1468-1476,1478-1485,1493-1506,1535-1541,1559-1574,1583-1590,1595-1601, 1603-1611,1622-1628,1634-1644,1671-1685,1689-1696,1715-1720, 1734-1746, 1766-1775,1801-1806,1838-1844,1858-1871,1910-1917,1948-1955,1960-1974, 2000-2015,2019-2036,2041-2063,748-847 和 1381-1391 ;Seq IDNo 311 的 5-12,18-24, 27-53,56-63,96-113,119-124,131-136,157-163,203-209,215-223,233-246,264-273, 311-316,380-389,393-399,425-433,445-450,457-462,464-470,475-482,507-513, 527-535,542-548,550-565,591-602,607-613,627-642,644-664,673-712,714-732, 739-764,769-782,812-818,826-838,848-854,860-871,892-906,930-938,940-954, 957-973,990-998,1002-1021,1024-1033,1037-1042,1050-1060,1077-1083,1085-1092, 1100-1129,1144-1161,1169-1175,1178-1189,1192-1198,1201-1207,1211-1221, 1229-1239,1250-1270,1278-1292,1294-1300,1314-1335,1344-1352,1360-1374, 1394-1405,1407-1414,1416-1424,1432-1452,1456-1462,1474-1497, 1500-1510, 1516-1522,1534-1542,1550-1559,1584-1603,1608-1627,187-273 和 306-441 ;Seq ID No 312 的 70-80,90-97,118-125,128-140,142-148,154-162,189-202,214-222,224-232, 254-260,275-313,317-332,355-360,392-398,425-432,448-456,464-470,476-482, 491-505,521-528,533-546,560-567,592-597,605-614,618-626,637-644,646-653, 660-666,677-691 和 207-227 ;Seq ID No 313 的 5-19,26-34,37-55,57-66,69-83,86-102, 115-134,138-143,154-172,178-195,209-246,251-257,290-302,306-311 和 256-266 ;Seq ID No 314 的 10-20,22-28,35-57,72-79,87-103,108-128,130-144,158-171,190-198, 225-242,274-291,301-315,317-324,374-385 和 353-365 ;Seq ID No 315 的 4-9,17-30, 34-54,59-66,73-94,118-130,135-150,158-171,189-198,219-239,269-275,283-301, 89-106 和 176-193 ;Seq ID No 316 的 14-20,22-74,77-86,89-99,104-109,126-135, 154-165,181-195,197-212,216-224,264-275 和 107-118 ;Seq ID No 317 的 4-18,21-38, 63-72,101-109,156-162,165-179,183-192,195-210,212-218,230-239,241-256, 278-290, 299-311, 313-322,332-341,348-366,386-401,420-426,435-450,455-460, 468-479,491-498,510-518,532-538,545-552,557-563,567-573,586-595,599-609, 620-626,628-636,652-657,665-681 和 1-198 ;Seq ID No 318 的 4-10,16-38,51-68, 73-79,94-115,120-125,132-178,201-208,216-223,238-266,269-295,297-304,337-342, 347-356,374-401,403-422,440-447,478-504,510-516,519-530,537-544 和 191-206 ;Seq ID No 319 的 12-40,42-48,66-71,77-86,95-102,113-120,129-137,141-148,155-174, 208-214,218-225,234-240,256-267,275-283,300-306,313-321,343-350,359-367, 370-383,398-405,432-439,443-461,492-508,516-526,528-535 和 370-478 ;Seq ID No 320 的 6-14,20-37,56-62,90-95,97-113,118-125,140-145,161-170,183-202,237-244, 275-284,286-305,309-316,333-359,373-401,405-412 和 176-187 ;Seq ID No 321 的 33-44,50-55,59-80,86-101,129-139,147-153,157-163,171-176,189-201,203-224, 239-245,257-262,281-287,290-297,304-320,322-331,334-350,372-390,396-401,71-88 和 353-372 ;Seq ID No 322 的 5-11,15-24,26-33,40-47,75-88,95-103,105-112 和 17-30 ;Seq ID No 323 的 5-11,16-39,46-54,62-82,100-107,111-124,126-150,154-165,167-183,204-238,245-295,301-313,316-335和 8-16 ;Seq ID No 324 的 4-19,34-48, 69-74,79-107,115-127,129-135,143-153,160-169,171-182 和 142-153 ;Seq ID No 325 的 4-30,65-74,82-106,110-120,124-132,135-140,146-175,179-184,190-196,217-223, 228-233,250-267,275-292,303-315,322-332 和 174-186 ;Seq IDNo 326 的 9-16,29-41, 47-57,68-84,87-109,113-119,162-180,186-193,195-201,203-208,218-230,234-243, 265-271,28卜292,305-312,323-332,341-347,349-363,368-374,383-390,396-410, 434-440,446-452,455-464,466-473,515-522,529-542,565-570,589-600,602-613, 618-623,637-644,1019-1027,1238-1244,1258-1264,1268-1276,1281-1292,1296-1302 和 883-936 ;Seq IDNo 327 的 10-17,23-32,39-44,54-72,75-81,88-111,138-154,160-167, 178-185,201-210,236-252,327-334,336-342,366-376,388-400,410-430,472-482, 493-526,552-558,586-592,598-603,612-621,630-635,641-660 和 384-393 ;Seq ID No 328 的 4-22,24-39,50-59,73-84,100-105,111-117,130-138,155-161,173-178,182-189, 205-215, 266-284,308-313,321-328,330-337,346-363,368-374,388-395,397-405, 426-434,453-459,482-492,501-507,509-515,518-523,527-544,559-590,598-612, 614-629,646-659,663-684,686-694,698-721 和 445-461 ;Seq ID No 329 的 14-22,27-33 和 3-17 ;Seq ID No 330 的 29-41,66-73,81-87,90-108,140-146,150-159,165-184, 186-196,216-226,230-238,247-253,261-269 和 126-140 ;Seq ID No 331 的 5-12,16-25, 27-33,36-45,60-68,83-88,103-126 和 86-101 ;Seq ID No 332 的 14-23,36-47,56-66, 84-89,94-105,111-127,140-153,160-174,176-183,189-203,219-225,231-237,250-257 和 194-227 ;Seq ID No 333 的 4-25,54-60,64-71,73-82,89-106,117-124,157-169, 183-188,199-210,221-232,236-244,255-264 和 58-98 ;Seq ID No 334 的 13-19,26-36,
41-53,55-71,77-84,86-108,114-135,157-172,177-183,187-194,208-213,218-226, 110-125 和 156-170 ;Seq ID No 335 的 5-24,63-69,77-85,94-112,120-137,140-146, 152-159,166-172,179-187,193-199,206-212,222-228,234-240,244-252,257-264, 270-289,298-309,316-328,337-348,363-375,1-56 和 340-352 ;Seq ID No 336 的 18-39,
42-71,78-120,124-144,152-173,179-189,199-209,213-222,228-258,269-304,329-361, 364-372,374-389,396-441 和 313-327 ;Seq ID No 337 的 19-25,91-98,108-120,156-162,
168-174,191-204,211-216,232-266,272-278,286-308,316-321,327-333,344-355, 358-364,384-391,395-428,464-476,487-495,497-511,544-561,563-573,575-582, 588-594,10-25 和 322-338 ;Seq ID No 338 的 14-26,32-49,51-57,59-72,80-91,102-112, 119-125,147-161,164-173,175-183,188-213,217-222,246-254,260-276,282-303, 308-318, 321-328,333-350,352-359,371-378,392-401,407-414,416-443,448-463, 471-484, 490-497,501-514,519-527,539-551,557-570,578-590, 592-598,600-610, 618-629,633-647,654-667,676-689,702-709,718-726,728-737,741-760,764-780, 786-795, 808-826,836-842,845-852,865-874,881-887,931-945,949-957,968-974, 979-986,1003-1009,1023-1029 和 90-103 ;Seq ID No 339 的 11-16,37-56,60-66,69-77, 80-88,93-106,117-139,166-171 和 72-90 ;Seq ID No 340 的 59-84,123-133,145-150, 161-167,178-189 和 115-128 ;Seq ID No 341 的 15-33,39-46,52-64,74-87,108-124, 127-144,150-156,173-179,184-194,201-208,219-236,243-269,272-295,302-309,343-349,356-361,370-379,405-411,414-423,430-451,457-464,466-475,477-483, 496-502,507-522,541-548,557-563,571-577,579-585,590-605,626-642,650-662, 671-691,704-710,751-769,775-781,786-791,794-829,851-858,868-878,884-904, 913-919,931-939 和 132-142 ;Seq ID No 342 的 33-58,64-71,74-80,83-88,96-120, 122-139,146-157,167-177,207-213,220-225,236-242,264-279,300-305,326-336, 340-347,350-360,97-115 和 199-211 ;Seq ID No343 的 4-26,43-57,70-99,102-117, 121-133,142-148,151-168,170-183,192-220,235-249,258-279 和 30-41 ;Seq ID No 344 的 34-42,48-58,70-94,110-130,154-160,164-172,178-183,195-203,211-222,229-250, 256-261,274-284,286-292,312-323 和 222-233 ;Seq ID No 345 的 4-9,15-36,38-45,
49-74,78-88,100-112,136-191,211-220,226-233,239-246,254-274,287-307,316-322, 342-353,356-366,373-378,384-393,405-431,449-457,459-468,487-511,515-524, 529-541,544-552,562-568,571-576 和 208-280 ;Seq IDNo 346 的 10-27,31-37,39-54, 71-108,124-143和 2-107 ;Seq IDNo 347 的 16-27,38-57,64-70,90-102,104-113, 116-137,160-166 和 1-80 ;Seq ID No 348 的 13-21,31-36,56-67,127-136,153-171, 173-180,184-200,214-222,225-231,239-263,267-273 和 135-159 ;Seq ID No 349 的 12-27,31-51,68-74,77-87,94-101,108-114,117-123,127-134,138-168,173-196, 201-207,212-217,227-237,247-257,264-280 和 205-223 ;Seq ID No 350 的 17-22,25-54, 70-76,92-100 和 98-110 ;Seq ID No 351 的 7-29,40-50,60-67,87-96,105-111,119-164, 172-199,206-212,220-227,237-259,272-279,282-293,295-309,313-319,321-328, 345-363,376-386 和 159-176 ;Seq ID No 352 的 4-19,24-30,36-43,50-68,71-89,93-106, 141-152,154-172,179-197,199-215,229-239,246-252,255-263,281-298,319-325, 329-356, 358-368,374-390,397-409,420-429,432-444,450-456,459-475,483-494, 496-502,520-528,532-556 和 362-377 ;Seq ID No 353 的 18-25,40-62,77-85,91-97, 105-116,123-133,139-184,189-197 和 122-140 ;Seq ID No 354 的 4-49,52-58,62-70, 79-105,109-133,142-150,163-168,206-214,220-228,233-240,243-254,274-281, 303-311,327-338,357-373,378-396,403-413,420-436,441-453,461-467,475-481, 484-498, 506-512, 514-521,523-529,562-579,589-595,598-603,615-648,714-722, 728-742,749-758,777-792,795-807 和 643-658 ;Seq IDNo 355 的 8-27,37-48,51-56,
72-79,87-106,120-138,140-147,167-176,187-197,205-216,222-229,234-239,243-249, 277-288,292-315,334-343,347-353,363-391,398-404,430-447,461-467,478-492, 498-507 和 456-470 ;Seq ID No 356 的 5-12,18-24,59-69,80-93,95-109,119-125, 130-137,139-147,158-163,168-176,182-202,206-215,222-239,241-249,267-277, 291-298,311-318,321-327,338-344,348-355,373-386,393-406,411-417,434-443, 446-465,473-484,514-521,532-553,584-594 和 221-237 ;Seq IDNo 357 的 4-14,27-34,
50-58,63-72,79-106,109-114,121-142,146-154,161-167,169-175,178-201,223-238, 249-254,259-264,278-292,294-312,319-330 和 167-191 ;Seq ID No 358 的 7-28,36-42, 50-61,63-80,122-152,161-174,176-191 和 140-190 ;SeqID No 359 的 20-57,59-65, 70-78,86-102,119-133,142-161,163-173,177-188,192-202,204-220,222-236,240-253, 279-319,326-331,337-383,390-399,406-412,420-427,431-438 和 381-395 ;Seq ID No360 的 13-18,28-34,37-43,50-59,75-81,83-97,105-121,139-147,200-206,209-227, 231-247,260-271,318-327,366-381,388-394,399-406 和 182-201 ;Seq ID No 361 的 6-29,37-43,51-56,70-77,82-102,110-119,127-143,178-190,201-209,216-243, 261-269,281-292,305-313,327-339,341-354,356-373,391-397,423-429,438-445, 450-478 和 21-314 ;Seq ID No 362 的 4-12,15-21,32-41,59-76,80-89,96-104 和 90-103 ; Seq ID No 363 的 9-28,30-41,44-54,69-74,77-82,90-97,104-123,125-135,149-155, 164-173,177-184,217-226,230-235,238-244,258-272,282-297,300-305,309-315, 317-322,327-336,348-362,368-374,380-387,400-411,414-424,451-458,460-466, 483-494,497-503,506-511,521-528,540-553,569-587,598-606,628-642,661-681, 688-700,718-733,740-749,752-764,769-783,823-834,848-854,862-872,878-884, 886-898,915-920,938-951,954-961,963-972,982-989,996-1003,1010-1016,1021-1032, 1038-1044,1047-1057,1060-1070,1079-1088,1094-1102,1117-1127,1129-1135, 1142-1153,1158-1204,1212-1229,1234-1263,1269-1277,1308-1313, 1327-1338, 1344-1376,1400-1415,1436-1443,1448-1458,1497-1504,1511-1522,1544-1566,3-82 和 509-576 ;Seq ID No 364 的 8-36,40-64,71-79,88-94,102-109,118-127,138-148,
151-159,163-174,192-198,200-206,220-233,268-273,290-301,304-309,316-323, 331-349,378-391,414-420,427-437,455-475,494-510,541-547,549-555,616-640,1-60, 55-139,212-308,386-458 和 458-624 ;Seq ID No 365 的 16-31,35-42,70-77,91-101, 120-130,132-140,143-153,185-190,195-202,215-222,228-238,241-251,257-264, 268-277,288-302,312-324,326-333,341-348,364-382,415-429,438-454,458-466, 491-499,501-521 和 273-281 ;Seq ID No 366 的 8-14,32-57,74-149,155-177,179-212, 221-266,271-296,304-324,329-346,349-359,368-401,413-419,426-454,465-478, 493-510 和 466-490 ;Seq ID No 367 的 22-28,33-51,64-89,96-119,126-132,138-146,
152-159,161-169,172-179,193-198,205-211,221-231,235-254,273-280,297-303, 312-320,328-346,351-373,378-384,391-398,448-454,460-468,470-481,516-558, 574-593,597-602,613-623,626-646,649-656,668-673,675-683,696-708,715-722, 724-739,745-751,759-777,780-804,816-822 和 102-113 ;Seq ID No 368 的 12-28,41-91, 98-107,112-120,125-131,151-193,215-221,240-250,263-280 和 128-138 ;Seq ID No 369 的 16-24,32-38,46-62,68-81,90-105,127-133,144-150,160-166,178-184,186-202, 210-219,232-240,252-258,264-273,293-324,337-344,349-357,360-369,385-398, 410-416,419-427,441-449,458-476,508-515,523-539,544-549,562-569,571-579, 96-109 和 127-139 ;Seq ID No 370 的 19-25,28-34,56-61,85-97,110-116 和 39-53 ;Seq ID No 371 的 4-37,41-50,62-72,91-97,99-109,114-125,136-141,149-158,160-166, 201-215 和 27-225 ;Seq ID No 372 的 15-31,44-51,96-105,122-130,149-157,162-168, 178-183,185-192,198-204,206-213,221-234,239-245,248-255,257-266,289-335, 349-357,415-422,425-441,448-454,462-468 和 463-481 ;Seq ID No 373 的 5-31,39-55, 63-72,76-99,106-155,160-177,179-199,207-217,223-240,245-255,261-267,294-316, 321-343,354-378,382-452,477-488,529-536,555-569,584-591,593-612,620-627, 632-640,647-654,671-680,698-704,723-730,732-750,769-775,781-788,822-852 和505-525 ;Seq ID No 374 的 3-18 ;Seq ID No 375 的 4-14 和 12-24 ;Seq ID No 376 的 4-11,22-30 和 12-25 ;Seq ID No377 的 5-12 和 4-18 ;Seq ID No 378 的 4-28 和 7-14 ;Seq ID No379 的 6-16 和 8-16 ;Seq ID No 380 的 4-15,18-33 和 24-36 ;Seq ID No 381 的 4-10, 16-21 和 20-31 ;Seq ID No 382 的 6-19 ;Seq ID No 383 的 11-18 和 3-10 ;Seq ID No 384 的 13-24 和 3-15 ;Seq ID No 385 的 15-27 和 7-16 ;Seq ID No 386 的 11-16 和 1-15 ;Seq ID No 387 的 4-16 和 9-21 ;Seq ID No 388 的 4-24,40-48,54-67 和 22-39 ;Seq ID No 389 的 6-30,34-55,62-68,78-106 和 68-74 ;Seq ID No 390 的 3-14 ;Seq ID No 391 的 9-19 和 6-21 ;Seq ID No 392 的 4-17 和 1-9 ;Seq ID No 393 的 5-30 和 1-8 ;SeqID No 394 的 4-16, 23-46,51-56 和 45-55 ;Seq ID No 395 的 7_16;Seq ID No 396 的 2-14 ;Seq ID No 397 的 4-36,43-65 和 50-62 ;Seq ID No 398 的 10-30 和 14-21 ;Seq ID No 399 的 9-17 和 1-10 ; Seq ID No 400 的 4-12 和 3-16 ;Seq ID No 401 的 4-15 和 5-23 ;Seq ID No 402 的 10-21 ; Seq ID No 403 的 6-16 ;Seq ID No 404 的 4-29,31-38 和 2-14 ;Seq ID No 405 的 4-35 和 33-42 ;Seq ID No406 的 2-17 ;Seq ID No 407 的 9-18,30-35 和 15-33 ;Seq ID No408 的 4-9 和 6-12 ;Seq ID No 409 的 3-17 ;Seq ID No 410 的 12-21,37-44,52-61,72-80 和 38-48 ;Seq ID No 411 的 4-10,29-44,54-61,69-78 和 13-27 ;Seq ID No 412 的 13-23, 36-53和 2-15 ;Seq ID No 413 的 4-25,28-46,56-72,81-99,120-132,134-142,154-160和 129-141 ;Seq ID No 414 的 4-15,24-33,35-41,64-86 和 21-33 ;Seq ID No 415 的 9-15 禾口 4-13 ;Seq ID No 416 的 4-11,13-19,34-4 8 和 15-32 ;Seq ID No 417 的 4-21 和 11-31 ;Seq ID No 418 的 23-57 和 38-50 ;Seq ID No 419 的 4-32 和 3-13 ;Seq ID No 420 的 4-10, 13-25,32-42,56-68,72-84 和 26-38 ;SeqID No 421 的 4-20,31-48,52-58,65-71,80-93, 99-108,114-123和 37-49 ;Seq ID No 422 的 6-12,14-20和 3-25 ;Seq ID No 423 的 14-25, 27-38 和 5-14 ;Seq ID No 424 的 4-41,57-105,109-118,123-136,144-152 和 86-99 ;Seq ID No 425 的 6-19 ;Seq ID No 426 的 2-19 ;Seq ID No 427 的 14-47 和 1-14 ;Seq ID No 428 的 4-21,29-44 和 2-18 ;Seq ID No 429 的 23-29 和 10-28 ;Seq ID No 430 的 6-16, 22-36 和 11-22 ;Seq ID No 431 的 4-19,30-44 和 18-27 ;Seq ID No 432 的 5-15,37-45, 58-65 和 38-47 ;Seq ID No 433 的 4-15,23-34 和 4-15 ;Seq ID No 434 的 30-36,44-54, 79-85,101-114,138-152,154-164,170-175,179-200,213-220,223-240,243-255, 258-264,268-284和10-28 ;包含表IB的「相同區域」縱欄的胺基酸序列的肽,尤其是包含 如下胺基酸的肽Seq ID No 449 的 210-226 和 738-753 ;Seq ID No 450 的 326-344, 326-348,338-354,371-392,801-809和 877-901 ;Seq ID No 451 的 893-906 ;Seq ID No452 的 51-69 ;Seq ID No 453 的 110-125 ;Seq ID No 454 的 291-305 ;Seq ID No 455 的 210-226 和 738-753 ;Seq ID No 456 的 326-344,326-348,338-354,371-392,801-809 和 877-901 ;Seq ID No 457 的 893-906 ;Seq ID No 458 的 51-69 ;Seq ID No 459 的 110-125 ; SeqID No 460 的 291-305 ;Seq ID No 461 的 32-44 ;Seq ID No 462 的 399-410 ;表 2 的「氨 基酸從」到「胺基酸至」縱欄中指定的血清反應性表位,尤其是包含如下胺基酸的肽Sep ID No 218 的 120-143,138-161 和 156-179 ;Seq ID No 219 的 110-129 和 168-184 ;Seq ID No 222 的 74-90 ;Seq ID No 223 的 759-773 ;Seq ID No 224 的 237-260 ;SeqID No 225 的 265-284 ;Seq ID No 226 的 65-74 ;Seq ID No 227 的 41-50 ;Seq ID No 229 的 163-174 ; Seq ID No 230 的 26-37 ;SeqID No 232 的 174-189 ;Seq ID No 234 的 240-256 ;Seq ID No236 的 285-297 ;Seq ID No 238 的 238-247 ;Seq ID No 239 的 491-519 ;Seq ID No 243 的 114-140 ;Seq ID No 250 的 267-284 ;Seq ID No252 的 439-453 ;Seq ID No 253 的 162-178 ;Seq ID No 254 的 347-364 ;Seq ID No 255 的 699-715 ;Seq ID No 256 的 60-71 ; SeqID No 257 的 244-257 ;Seq ID No 258 的 44-63 和 57-76 ;Seq IDNo 260 的 185-196 ; Seq ID No 263 的 119-129 ;Seq ID No 266 的 182-195 ;Seq ID No 267 的 32-44 和 424-442 ;Seq ID No 268 的 247-256 ;Seq ID No 269 的 678-694,785-805,55-77 和 72-94 ; Seq ID No 281 的 210-226 ;Seq ID No 289 的 37-59 ;Seq ID No 296 的 13-29 ;Seq ID No 348 的 136-159 ;Seq ID No 349 的 205-222 ;Seq ID No 350 的 99-110 ;Seq ID No 351 的 160-176 ;Seq ID No 355 的 457-470 ;Seq ID No 356 的 221-237 ;Seq ID No 357 的 167-1 90 ;Seq ID No 361 的 96-120 ;Seq ID No 364 的 399-417,503-519 和 544-563 ;Seq ID No 371 的 46-68,159-183 和 184-198 ;Seq ID No372 的 463-481 ;表 4 的「胺基酸從,,到 「胺基酸至」縱欄中指定的免疫原性表位;尤其是包含如下胺基酸的肽Seq ID No 219的 110-129 和 168-184 ;Seq ID No 277 的 877-901,333-354,326-344 和 801-809 ;Seq ID No 347 的 l-54;Seq ID No 364 的 544-563,31-51,107-119,399-417 和 503-519 ;Seq ID No 218 的 120-198 ;Seq ID No 219 的 20-35 ;Seq ID No 221 的 118-201 ;Seq ID No 242 的 48-132 ;SeqID No 249 的 118-136 ;Seq ID No 253 的 162-178 ;Seq ID No 254 的 347-364 ; Seq ID No 255 的 699-715 ;Seq ID No 258 的 50-76 ;Seq ID No 269 的 785-819 和 44-128 ; Seq ID No 274 的 90-128 ;Seq ID No 289 的 314-384 ;Seq ID No 293 的 327-349 ;Seq ID No304 的 242-314,405-478 和 23-100 ;Seq ID No 305 的 129-210 ;Seq ID No 307 的 162-188 ;Seq ID No 310 的 750-772 ;Seq ID No335 的 1-56 ;Seq ID No 337 的 322-337 ; Seq ID No 339 的 72-90 ;Seq ID No 345 的 374-395 ;Seq ID No 348 的 136-159 ;Seq ID No358 的 141-164 ;Seq ID No 361 的 96-157 ;Seq ID No 363 的 1-82 ;Seq ID No 364 的 489-556 ;Seq ID No 371的159-183和49-133 ;包含表5的「推定的免疫原性胺基酸」和 「鑑別的免疫原性區域(aa)的位置」縱欄的胺基酸序列的肽,尤其是包含如下胺基酸的肽 Seq ID No475 的4-26,35-41,53-61,73-84,103-108,114-120,140-146,156-162,192-208, 214-219,227-233,239-252,260-268,284-297,1-48 和 113-133 ;Seq ID No 476 的 4-27, 38-44,50-56,59-64,72-79,83-89,92-97,108-116,123-148,152-167,183-196,200-220, 232-244,255-261,265-274,282-302,309-317,1-79 和 231-302 ;Seq ID No 477 的 6-28, 66-72,85-105,115-121,144-151,160-170,176-185,223-230,252-288,296-310,319-333, 367-374,458-464,471-480,483-488,520-528,530-549,559-564,593-601,606-616, 636-643,655-662,676-682,684-699,719-726,735-750,757-764,777-785,799-810, 812-843,846-853,868-873,880-889,891-899,909-929,934-940,963-969,998-1004, 1007-1014,1016-1022,1030-1046,1-80 和 808-821 ;Seq ID No 478 的 7-24,35-41,75-81, 91-114,122-132,137-144,148-156,183-192,194-200,212-228,233-238,251-258, 275-295,326-332,337-346,1-79 和 305-321 ;Seq ID No 479 的 31-38,42-52,66-72, 86-92,98-104,115-122,127-146,154-164,169-187,198-212,225-237,255-269,13-92 和 135-142 ;Seq ID No 480 的 4-36,39-49,63-69,71-77,81-88,123-131,133-139,160-169, 174-180,188-194,210-217,273-278,289-300,317-334,336-341,383-401,425-438,1-68, 212-270 和 402-446 ;Seq ID No 481 的 21-29,31-42,49-63,72-79,81-93,112-132,159-165,188-195,197-232,262-267,279-286,294-301,318-326,348-366,381-405, 409-426,436-465,471-480,484-492,497-505,521-544,554-561,567-577,581-589, 601-609,611-622,636-651,653-667,669-685,700-708,716-722,729-744,749-766, 780-786,789-811,814-864,1-57 和 84-106 ;Seq ID No 482 的 6-24,35-48,57-63,72-78, 87-92,113-119,123-137,147-153,173-181,212-233 和 1-124 ;Seq ID No 483 的 13-34, 62-69,78-83,86-91,98-104,107-115,146-159,179-188,195-205,209-221,226-233, 239-253,276-282,284-294,297-308,331-354,375-382,388-399,421-433,449-458, 464-469,472-491,508-513,525-531,534-550,575-593,601-618,629-635,654-661, 666-680,706-721,723-740,771-805,810-830,845-851 和 1-84 ;Seq ID No 484 的 4-32, 45-64,73-83,86-92,100-111,125-147,157-163,170-175,177-188,226-232,245-252, 258-274,320-335,348-359 和 1-71 ;Seq ID No485 的 13-40,43-71,76-83,87-101, 109-119,125-156,162-175,182-219,226-232,240-262,270-287,306-318,326-342, 344-408,414-444,449-456 和 1-51 ;Seq ID No 486 的 4-16,18-34,45-54,99-108, 134-140,203-212,241-257,266-274,279-291,308-315,330-336,355-370,374-382, 402-410,428-455,466-472,474-480,531-554,560-566,572-580,597-618,632-660, 664-674,676-685,691-705,708-735,750-768,1-87 和 342-480 ;表 6 的「胺基酸從」到「氨 基酸至」的 縱欄中指定的血清反應性表位,尤其是包含如下胺基酸的肽No 475的115-132 和 1-26 ;Seq ID No 476 的 33-55 ;Seq IDNo 478 的 1-25 ;Seq ID No 479 的 37-61 ;Seq ID No 480 的 l_24;Seq ID No 481 的 1-23 ;Seq ID No 482 的 46-60 ;Seq ID No 483 的 1-28, 23-50 和 45-71 ;Seq ID No 484 的 1-22 和 17-38 ;Seq ID No485 的 1-22 和 17-38 ;Seq ID No 486的1-27,22-47和422-447 ;表7的「胺基酸從」到「胺基酸至」縱欄中指定的免疫原 性表位,尤其是包含如下胺基酸的肽Seq ID No 475的115-132和1-47 ;Seq ID No476的 1-55 ;Seq ID No 477 的 22-85 ;Seq ID No 478 的 307-320 和 1-44 ;Seq ID No 479 的 15-76 和 40-92 ;Seq ID No 480 的 1-59,213-269 和 403-445 ;Seq ID No 481 的 1-56 和 85-105 ;Seq ID No482 的 37-121 ;Seq ID No 483 的 1-71 ;Seq ID No 484 的 1-38 ;Seq ID No 485的1-38 ;Seq ID No 486的1_47以及包含所述序列至少6個優選地多於8個尤其 多於10個胺基酸並且優選地不多於70、50、40、20、15或11個胺基酸的片段。所有這些片 段單獨地並且每一個獨立地形成了本發明優選的挑選的方面。通過一套長度至少10個胺基酸有1個胺基酸重疊的肽分析蛋白質抗原的全部序 列可以鑑別特定抗原的所有線性超免疫血清反應片段。隨後,通過使用表達的全長蛋白質 或其結構域多肽的用超免疫血清分析蛋白質抗原可以鑑別非線性表位。假設蛋白質獨特的 結構域足夠形成不依賴於天然蛋白質的3D結構,各個重組或合成產生的結構域多肽用超 免疫血清的分析將允許在多結構域蛋白質各個結構域內的構象抗原結構域的鑑別。對於結 構域擁有線性以及構象性表位的那些抗原,用相應於線性表位的肽的競爭試驗可用於證實 構象性表位的存在。將理解本發明尤其也涉及編碼前面提到的片段的核酸分子,雜交編碼片段的核酸 分子的核酸分子,特別是在嚴格條件下雜交的那些,以及用於擴增編碼片段的核酸分子的 例如PCR引物的核酸分子。在這些點上,優選的核酸分子是如上面討論的相應於優選片段 的那些。
本發明也涉及包含本發明的一個或多個核酸分子的載體、用本發明的載體進行基 因工程的宿主細胞以及通過重組技術的超免疫血清反應性抗原及其片段的產生。大量的表達載體能用於表達根據本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段。一 般,適於維持、繁殖或表達核酸以在宿主中表達多肽的任何載體可以用於在這方面的表達。 與本發明的這個方面一致,載體可以例如是質粒載體、單或雙鏈噬菌體載體、單或雙鏈RNA 或DNA病毒載體。此處公開的起始質粒或者是市售可獲得的、公開可獲得的,或者通過眾所 周知的公開的程序的常規應用能從可獲得的質粒構建。在某些方面,載體之中優選的是為 了本發明的核酸分子和超免疫血清反應性抗原或其片段的表達的那些。宿主細胞中的核酸 構建體能以傳統方式用於產生重組序列編碼的基因產物。或者,本發明的超免疫血清反應 性抗原及其片段能通過傳統肽合成器合成產生。成熟的蛋白質能表達於哺乳細胞、酵母、細 菌或其它在合適的啟動子控制下的細胞。使用來源於本發明的DNA構建體的RNA,也能採用 無細胞的翻譯系統以產生這樣的蛋白質。能對宿主細胞進行基因工程化以整合核酸分子和表達本發明的核酸分子。合適宿 主的代表性實例包括例如鏈球菌、葡萄球菌、大腸桿菌、鏈黴菌和枯草芽孢桿菌細菌細胞; 例如酵母細胞和麴黴屬細胞的真菌細胞;例如果蠅S2和夜蛾Sf9細胞的昆蟲細胞;例如 CHO,COS, Hela,C127,3T3,BHK, 293和Bowes黑素瘤細胞的動物細胞;以及植物細胞。本發明也提供了產生無乳鏈球菌超免疫血清反應性抗原及其片段的方法,包括從 宿主細胞表達本發明提供的核酸分子編碼的超免疫血清反應性抗原或其片段。本發明還提 供了產生表達無乳鏈球菌超免疫血清反應性抗原或其片段的細胞的方法,包括用根據本發 明的載體轉化或轉染合適的宿主細胞使得轉化的或轉染的細胞表達載體中含有的核酸編 碼的多肽。可以以例如融合蛋白質的修飾形式表達多肽,並且多肽可以不僅包括分泌信號還 有額外的異源性功能區域。因而,例如,尤其是帶電荷胺基酸的額外胺基酸區域可以加到多 肽的N或C末端以改進在純化過程中或隨後的操作和儲存過程中在宿主細胞中的穩定性和 持續性。區域也可加到多肽以促進純化。這樣的區域可以在多肽的最後製備之前去除。多 肽基團加到多肽以引起分泌或排洩、以改進穩定性或促進純化在其它之中是本領域熟悉的 和常規的技術。優選的融合蛋白質包含對於溶解或純化多肽是有用的來自免疫球蛋白的異 源性區域。例如,EP-A-0 464 533 (加拿大副本2045869)公開了包含免疫球蛋白分子的恆 定區不同部分和另一個蛋白質或其部分的融合蛋白質。在藥物發現中,例如,為了鑑別拮抗 劑的高通量篩選試驗的目的蛋白質已經與抗體Fc部分融合。見例如{Bennett,D.等人, 1995}和{Johanson, K.等人,1995}。通過眾所周知的方法能從重組細胞培養物中重新獲得和純化無乳鏈球菌超免疫 血清反應性抗原或其片段,包括硫酸銨或乙醇沉澱、酸提取、陰離子或陽離子交換色譜、磷 酸纖維素色譜、疏水相互作用色譜、羥基磷灰石色譜和凝集素色譜。通過化學合成以及通過生物工程手段能生產根據本發明的超免疫血清反應性抗 原及其片段。後者包含了用含有根據本發明的核酸的載體轉染或轉化宿主細胞,以及在本 領域技術人員已知的條件下培養轉染或轉化的宿主細胞。為了純化或分離要生產的多肽的 生產方法也可以包含純化步驟。優選的實施方案中載體是根據本發明的載體。根據本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段可用於含有這些生物體或其衍生
60的多肽的樣品中一個或多個生物體的檢測。優選的這樣的檢測是為了診斷,更加優選地 為了疾病的診斷,最優選地為了與革蘭氏陽性細菌的存在或豐度相關或相聯的疾病的診 斷,尤其是選自鏈球菌、葡萄糖球菌和乳球菌的細菌。更加優選地,微生物選自肺炎鏈球 菌(Streptococcus pneumoniae)、化月農鏈球菌(Streptococcus pyogenes)禾口變形鏈球菌 (Streptococcus mutans),尤其微生物是化膿鏈球菌。本發明也涉及診斷試驗,例如用於檢測細胞和組織中本發明的超免疫血清反應性 抗原及其片段的水平的定量和診斷試驗,包括正常和異常水平的測定。所以,例如,根據本 發明,為了檢測與正常組織樣品相比多肽的過度表達的診斷試驗可以用於檢測感染的存 在,以及鑑別感染生物體。能用於測定源自宿主的樣品中多肽水平的試驗技術對於本領域 技術人員是眾所周知的。這樣的試驗方法包括放射免疫試驗、競爭結合試驗、Western斑點 分析和ELISA試驗。這些之中,ELISA常常是優選的。ELISA試驗最初包含製備特異於多肽 的抗體,尤其是單克隆抗體。另外,一般地製備了結合於單克隆抗體的報告抗體。報告抗體 附著於檢測試劑,例如放射活性的、螢光的或酶試劑,例如辣根過氧化物酶。根據本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段可用於陣列的目的或與其相連。更 加特別的,至少一個根據本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段可以固定於支持物上。 所述支持物一般包含各種超免疫血清反應性抗原及其片段,由此可以使用一種或一些根據 本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段和/或不同的超免疫血清反應性抗原及其片段 產生多樣性。這樣的陣列以及任何陣列的特徵性特性一般是獨特的多肽固定於所述支持物 或其表面上獨特的或預先定義的區域或位置上。因為這個,陣列獨特位置或區域上的任何 活性與特異性多肽相關。不同超免疫血清反應性抗原及其片段固定於支持物的數量可以在 從10個那麼少到幾千個不同超免疫血清反應性抗原及其片段的範圍內。優選實施方案中 每cm2超免疫血清反應性抗原及其片段的密度是從每cm2 10個肽/多肽那麼少到每cm2至 少400個不同肽/多肽,更加特別的每cm2至少1000個不同超免疫血清反應性抗原及其片 段。這種陣列的生產對於本領域的技術人員是已知的,例如,在美國專利5,744,309 中有描述。陣列優選地包含具有至少第一個表面的平坦的、多孔或非多孔的固相支持物。如 此出公開的超免疫血清反應性抗原及其片段固定於所述表面。其它之中優選的支持物材料 是玻璃或纖維素。為了此處描述的任何診斷應用使用矩陣也在本發明內。除了根據本發明 的超免疫血清反應性抗原及其片段外,為了如上面描述的陣列的產生也可以使用根據本發 明的核酸。這個也應用於抗體製成的陣列,優選地其它之中如此處描述的單克隆抗體。另一方面本發明涉及指向任何根據本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段、其 衍生物或片段的抗體。本發明包括例如單克隆和多克隆抗體、嵌合、單鏈和人源化抗體,以 及Fab片段或Fab表達文庫的產物。抗體可以是嵌合的也在本發明之內,即它們的不同部 分源自不同種屬或者至少各自的序列取自不同的種屬。通過將超免疫血清反應性抗原及其片段直接注射到動物或者通過給予優選非人 類的動物超免疫血清反應性抗原及其片段,能夠獲得產生的抗相應於本發明的序列的超免 疫血清反應性抗原及其片段的抗體。然後如此得到的抗體將結合超免疫血清反應性抗原及 其片段本身。以這個方式,甚至僅僅編碼超免疫血清反應性抗原及其片段的一個片段的序 列能用於產生結合整個天然超免疫血清反應性抗原及其片段的抗體。然後這樣的抗體能用於從表達那些超免疫血清反應性抗原及其片段的組織中分離超免疫血清反應性抗原及其 片段。為了單克隆抗體的製備,能夠使用本領域已知的提供連續細胞系培養物產生的抗 體的任何技術(如原先{Kohler, G.等人,1975}中描述地)。能使為了單鏈抗體的產生描述的技術適應於產生抗根據本發明的免疫原性的超 免疫血清反應性抗原及其片段的單鏈抗體。轉基因小鼠或例如其它哺乳動物的其它生物體 可以用於表達抗根據本發明的免疫原性超免疫血清反應性抗原及其片段的人源化抗體。或者,噬菌體展示技術或核糖體展示能用於從篩選擁有各自靶抗原的人類淋巴細 胞的PCR擴增v-基因文庫或從幼稚文庫挑選對超免疫血清反應性抗原及其片段有結合 活性的抗體基因{McCafferty, J.等人,1990} ; {Marks, J.等人,1992}。也能通過鏈改組 (chain shuffling) {Clackson, T.等人,1991}改進這些抗體的親和力。如果存在兩個抗原結合結構域,每個結構域可以指向不同的表位-稱為「雙特異 性」抗體。上面描述的抗體可以應用於分離或鑑別表達超免疫血清反應性抗原及其片段的 克隆或為了用親和色譜的分離和/或純化通過將抗體附著於固相支持物而純化本發明的 超免疫血清反應性抗原及其片段。因而,抗本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段的抗體尤其可以應用於抑制和 /或治療感染,特別是細菌感染,特別是來自無乳鏈球菌的感染。超免疫血清反應性抗原及其片段包括抗原性、表位或免疫原性等同的衍生物,它 形成了本發明的特定方面。如此處使用的術語「抗原性等同衍生物」包含某些抗體特異性識 別的超免疫血清反應性抗原及其片段或其等同物,所述抗體當針對根據本發明的蛋白質或 超免疫血清反應性抗原及其片段培養時,幹擾病原體和哺乳動物宿主之間的相互作用。如 此處使用的術語「免疫原性等同衍生物」包含肽或其等同物,當其用於合適的製劑以在脊柱 動物中培養抗體時,抗體起幹擾病原體和哺乳動物宿主之間相互作用的作用。超免疫血清反應性抗原及其片段,例如抗原性或免疫原性等同衍生物或其融合蛋 白能夠用作抗原以免疫小鼠或例如大鼠或小雞的其它動物。融合蛋白質可以給超免疫血清 反應性抗原及其片段提供穩定性。抗原可以例如通過結合連接於例如牛血清白蛋白(BSA) 或匙孔血藍蛋白(KLH)的免疫原性載體蛋白質。或者,包含蛋白質或超免疫血清反應性抗 原及其片段多個拷貝的抗原肽或抗原性、免疫原性等同的超免疫血清反應性抗原及其片段 可以有足夠的抗原性以改進免疫原性而避免載體的使用。優選地,修飾抗體或其衍生物使其在個體有更少的免疫原性。例如,如果個體是 人,抗體最優選地可以是「人源化的」,其中雜交瘤衍生的抗體的互補決定區域被接種到人 單克隆抗體,例如如{Jones, P.等人,1986}或{Tempest, P.等人,1991}中描述地。本發明的多核苷酸在基因免疫中的使用將優選地採用合適的遞送方法,例如質粒 DNA直接注射入肌肉,與特異性蛋白質載體複合的DNA的遞送,用磷酸鈣的DNA共沉澱,DNA 包裝在各種形式的脂質體中,粒子轟擊{Tang,D.等人,1992},{Eisenbraun,M.等人,1993} 以及使用克隆的逆轉路病毒載體的體內感染{Seeger,C.等人,1984}。另一方面本發明涉及結合於根據本發明的任何超免疫血清反應性抗原及其片段 的肽,以及這樣肽的生產方法,由此所述方法特徵在於根據本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段的使用,並且基礎步驟對於本領域的技術人員是已知的。可以通過使用根據本領域技術的方法產生這樣的肽,例如噬菌體展示或核糖體展 示。在噬菌體展示的情況下,基本上產生了噬菌體形式的肽的文庫,這種文庫與靶分子接 觸,在這個情況下是根據本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段。隨後從各自的反應中 去除那些結合於靶分子的肽,優選地是與靶分子的複合物。結合的特性至少在某個程度依 賴於例如鹽濃度等等特定實行的實驗設置是本領域技術人員已知的。結合於有更高的親和 力或更大力量的靶分子的那些肽從文庫的非結合成員分離之後,並且可選地也在靶分子從 靶分子與肽的複合物去除後,隨後可以特徵分析各自的肽。特徵分析之前,可選地實行擴增 步驟,例如通過增殖編碼肽的噬菌體。特徵分析優選地包含靶結合肽的測序。基本上,肽不 限制它們的長度,然而優選地在各自的方法中優選地得到具有從大約8至20個胺基酸的長 度的肽。文庫的大小可以是大約102至1018,優選地108至1015個不同的肽,然而並不限於 這些。特定形式的靶點結合超免疫血清反應性抗原及其片段是所謂的「抗促成素」,在其 它之中它們在德國專利申請DE 197 42 706中有描述。在另一方面本發明涉及與任何的根據本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段 相互作用的功能性核酸,以及這樣功能性核酸的生產方法,由此所述方法特徵在於根據本 發明的超免疫血清反應性抗原及其片段的用途,並且基礎步驟對於本領域的技術人員是已 知的。功能性核酸優選地是適體和鏡面體。適體是單鏈或雙鏈的、並且特異性與靶分子相互作用的D-核酸。適體的生產或挑 選在例如歐洲專利EP 0 533 838中有描述。基本上實行了下面的步驟。首先,提供了核酸 的混合物,即潛在的適體,由此每個核酸一般包含一些優選地至少8個隨後隨機的核苷酸 的片段。這個混合物隨後與靶分子接觸,由此例如基於與候選混合物對靶點增加的親和力 或對靶點更大的力量核酸與靶分子結合。隨後從剩餘的混合物中分離結合核酸。可選地, 使用例如多聚酶鏈式反應擴增這樣得到的核酸。這些步驟可以重複數次,只要最後混合物 具有增加的特異性結合於靶點的核酸的比例,然後可選地從中挑選最終結合核酸。這些特 異性結合的核酸指的是適體。很明顯在適體的生產或鑑別方法的任何階段,為了使用標準 技術測定它的序列可以採集個體核酸混合物的樣品。例如通過引入對產生適體的技術領域 技術人員已知的定義的化學基團可以穩定適體在本發明之內。這樣的修飾例如可以存在於 氨基基團在核苷酸糖基團2』位置的引入。適體目前用作治療劑。然而,這樣挑選的或產生 的適體可以用於靶點確認和/或用作優選基於小分子藥劑的藥劑開發的先導物質也在本 發明之內。這個實際上通過競爭試驗完成,由此候選藥物抑制靶分子和適體之間特異性相 互作用,由此在適體從靶點和適體的複合物取代時,可以假設各自的候選藥物允許靶點和 適體之間相互作用的特異性抑制,如果相互作用是特異性的,所述候選藥物將至少在原則 上適於阻斷靶點並因而降低其在包含這樣靶點的各自的系統中的生物利用度或活性。這樣 得到的小分子可以進行進一步的衍生化和修飾以優化其物理、化學、生物和/或醫學特徵, 例如毒性、特異性、生物降解度和生物利用度。鏡面體和它們的產生或製造基於一個簡單的原則。鏡面體的製造在國際專利申請 W0 98/08856中有描述。鏡面體是L-核酸,這是指它們由L-核苷酸而不是象適體的D-核 苷酸組成。鏡面體特徵在於它們在生物系統具有非常高的穩定性並且與適體相比特異性地與它們指向的靶分子相互作用這個事實。產生鏡面體的方法中,產生了 D-核酸的異源群, 這個群與靶分子的光學對映體接觸,在這個情況下例如與根據本發明超免疫血清反應性抗 原及其片段的天然發生的L-對映體的D-對映體接觸。隨後,分離不與靶分子的光學對映 體相互作用的那些D-核酸。但是分離、可選地鑑別和/或測序與靶分子的光學對映體相互 作用的那些D-核酸,隨後基於從D-核酸獲得的核酸序列信息合成相應的L-核酸。就與靶 分子的光學對映體相互作用的前面提到的D-核酸的序列而言相同的這些L-核酸將特異性 地與天然發生的靶分子而不是它的光學對映體相互作用。與適體產生的方法相似,重複各 種步驟幾次並因而濃集特異性與靶分子的光學對映體相互作用的那些核酸是可能的。
在另一方面,本發明涉及與根據本發明的任何核酸分子相互作用的功能性核酸, 以及這樣功能性核酸的製造方法,由此所述方法特徵在於根據本發明的核酸分子和它們各 自序列的用途並且基礎步驟對於本領域技術人員是已知的。功能性核酸優選地是核酶、反 義寡核苷酸和siRNA。核酶是催化活性的核酸,優選地由基本上包含兩個基團的RNA組成。第一個基團 顯示了催化活性而第二基團負責與靶核酸的特異性相互作用,在這個情況下是編碼根據本 發明的超免疫血清反應性抗原及其片段的核酸。靶核酸和核酶第二基團相互作用時,一般 通過兩個雜交鏈上基本上互補的鹼基的延伸雜交和Watson-Crick鹼基配對,催化活性基 團可以變成有活性的,就是指它或者分子內或者分子間催化核酸分子,倘若核酶的催化活 性是磷酸二酯酶活性。隨後,可以有靶核酸進一步的降解,最後導致了靶核酸以及源自所述 靶核酸的蛋白質的降解。核酶、它們的使用和設計原則對於本領域技術人員是已知的,例如 {Doherty, E.等人,2001}和{Lewin,A.等人,2001}中有描述。用於藥劑的製造以及作為診斷試劑的反義寡核苷酸的活性和設計分別基於作用 的相同模式。基本上,反義寡核苷酸基於鹼基互補與靶RNA優選地與mRNA雜交,因而激活 RNase H。RNase H被磷酸二酯和硫代磷酸酯偶聯的DNA激活。然而除了硫代磷酸酯偶聯 的DNA以外,磷酸二酯偶聯的DNA很快地被細胞內核酶降解。這些抗性的非天然發生DNA 衍生物在與RNA雜交時不抑制RNase H。換而言之,反義聚核苷酸僅僅作為DNA RNA雜交 複合物是有效的。這種反義寡核苷酸的實例在其它之中的美國專利US 5,849,902和US 5,989,912。換而言之,基於靶分子的核酸序列,在這個情況下靶分子是根據本發明的超免 疫血清反應性抗原及其片段的核酸分子,可以基於鹼基互補的原則,從原則上可從其推測 的各自的核酸序列的靶蛋白質或者通過了解尤其是mRNA這樣的核酸序列設計合適的反義 寡核苷酸。特別優選的是具有硫代磷酸酯DNA(3至9個鹼基)的短的延伸的反義寡核苷酸。 最少3個DNA鹼基對於細菌RNase H的激活是必需的,最少5個鹼基是哺乳動物RNase H激 活必需的。在這些嵌合寡核苷酸中有形成RNase H底物的中心區域,它與由不形成RNase H 底物的修飾的核苷酸組成的雜交「臂」側面相接。可以例如通過2』 -氧-甲基或2』 -氟修 飾嵌合寡核苷酸的雜交臂。替代的方法使用了所述臂中的甲基膦酸酯或氨基磷酸酯連接。 本發明的實踐中有用的反義寡核苷酸進一步實施方案是P-甲氧基寡核苷酸,部分P-甲氧 基寡脫氧核糖核酸或P-甲氧基寡核苷酸。本發明尤其相關和有用的是如上面提到的兩個美國專利更加特別描述的那些反 義寡核苷酸。這些寡核苷酸不含有天然發生的5' —3'-連接的核苷酸。更合適的寡核苷酸具有兩個類型的核苷酸激活RNase H的2』-脫氧硫代磷酸酯和不激活RNase H的2』 修飾的核苷酸。2』-修飾的核苷酸之間的連接是磷酸二酯、硫代磷酸酯或P-乙氧基磷酸二 酯。通過連續的RNase H激活區域完成RNase H的激活,所述激活區域含有3和5個之間 的2』脫氧硫代磷酸酯核苷酸以激活細菌RNase H以及5和10個之間的2』脫氧硫代磷酸 酯核苷酸以激活真核特別是哺乳動物RNase H。通過使5』和3』末端鹼基高度核酶抗性以 及可選地通過取代3』末端阻斷基團完成對於降解的保護。更加特別地,反義寡核酸包含5』末端和3』末端;從位置11至595' -3'-連接 的核苷酸獨立地選自2』修飾的磷酸二酯核苷酸和2』修飾的P-烷氧基磷酸三酯核苷酸;其 中5』末端核苷酸附著於三和十個連續的硫代磷酸酯連接的脫氧核糖核酸之間的RNase H 激活區域,其中所述核苷酸3』末端選自反轉的脫氧核糖核酸、一至三個硫代磷酸酯2』修飾 的核糖核酸的連續延伸、生物素基團和P-烷氧基磷酸三酯核苷酸。也可以使用反義寡核苷酸,其中不是5』末端核苷酸而是上面詳述的3』末端核苷 酸附著於RNase H激活區域。5』末端也選自特定的基團,而不是所述寡核苷酸的3』末端。根據本發明的核酸以及超免疫血清反應性抗原及其片段可以用作或用於尤其是 疫苗的藥物組合物的製造。優選是疫苗的這樣的藥物組合物優選地是為了無乳鏈球菌造成 的、相關的或相聯的疾病的預防和治療。在這個範圍內本發明的另一方面涉及誘導尤其是 哺乳動物的個體的免疫反應的方法,包含用本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段或其 片段或變異體接種個體,足夠生產抗體以保護所述個體免受感染,特別是鏈球菌感染並且 最特別的鏈球菌的感染。仍然本發明的另一方面,涉及誘導個體免疫反應的方法,包含通過基因治療或其 它,遞送核酸功能性編碼超免疫血清反應性抗原及其片段或其片段或變異體以體內表達超 免疫血清反應性抗原及其片段或其片段或變異體,目的是為了誘導產生抗體或細胞介導的 T細胞反應的免疫反應以保護所述個體免受疾病,不管那個疾病是否已經在個體內確定,T 細胞可以是產細胞因子的T細胞或細胞毒性T細胞。給予基因的一個方法是通過加速作為 顆粒上的塗層或其它的基因進入期望的細胞內。本發明的另一方面涉及免疫組合物,當被引入能夠誘導宿主內免疫反應的宿主內 時,它能誘導這樣的宿主內的免疫反應,其中所述組合物包含編碼和表達本發明的超免疫 血清反應性抗原及其片段的抗原的重組DNA。可以治療性或預防性地使用免疫反應,可以採 用抗體免疫或細胞免疫的形式,例如源自CTL或CD4+T細胞的細胞免疫。本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段或其片段可以與本身可能不產生抗體 但是能夠穩定第一個蛋白質並產生將具有免疫性和保護特性的融合蛋白質的輔蛋白質 (co-protein)融合。這個融合的重組蛋白質優選地進一步含有抗原性輔蛋白質,例如穀胱 甘肽S轉移酶(GST)或半乳糖苷酶,溶解蛋白質並促進其產生和純化的相對大的輔蛋 白質。另外,輔蛋白質在提供免疫系統全面刺激的意義上起佐劑的作用。輔蛋白質可以附 著於第一個蛋白質的氨基端或羧基端。本發明也提供的是在無乳鏈球菌感染的動物模型中在這樣的基因免疫實驗中使 用所述核酸分子或者其特定片段的方法。這樣的片段對於鑑別能引發預防性或治療性免疫 反應的蛋白質表位尤其有用。這個方法能允許隨後從成功抵抗或清除感染的動物的必備器 官製備有特別價值的單克隆抗體以開發尤其是人類的哺乳動物中無乳鏈球菌感染的預防試劑或治療處理。超免疫血清反應性抗原及其片段可以用作宿主免疫接種的抗原以產生抗細菌入 侵的保護的特異性抗體,例如通過阻斷細胞對損傷組織的粘附。組織損傷的實例包括例如 病毒感染(尤其是呼吸系統的,例如流感病毒)、機械、化學或熱損傷或者通過留置裝置的 植入造成的皮膚或結締組織以及黏膜組織的傷口,或者例如口腔、乳腺、尿道或陰道的黏膜 的傷口。本發明也包括包含免疫原性重組蛋白質和合適載體的疫苗製劑。因為蛋白質可以 在胃內降解,優選地它通過非胃腸道給予,包括例如皮下、肌肉內、靜脈、皮內、鼻內或經皮 的給予。適於非胃腸道給予的製劑包括水性和非水性無菌注射溶液,它可以含有賦予製劑 與個體的優選是血液的體液等滲的抗氧化劑、緩衝劑、細菌抑制劑和溶質;水性和非水性的 無菌懸浮液,它可以包括懸浮劑或增稠劑。製劑可以呈現在單位劑量或多個劑量的容器內, 例如密封的安瓿和藥瓶,可以儲存於冷凍乾燥條件下,只需要使用前立即加入無菌液體載 體。疫苗製劑也可以包括增強制劑免疫原性的佐劑系統,例如水包油系統和本領域已知的 其它系統。劑量將依賴於疫苗的特異性活性並能很容易地通過常規試驗測定。根據另一方面,本發明涉及包含如本發明為了無乳鏈球菌提供的這樣的超免疫血 清反應性抗原及其片段的藥物組合物。這樣的藥物組合物可包含一個優選地至少兩個或兩 個以上的抗無乳鏈球菌的超免疫血清反應性抗原及其片段。可選的,這樣的無乳鏈球菌超 免疫血清反應性抗原及其片段在聯合藥物組合物中也可與抗其它病原體的抗原聯合。優選 地,所述藥物組合物是為了預防或治療無乳鏈球菌和/或其它病原體造成的感染的疫苗, 疫苗中包括了抗所述病原體的抗原。根據另一方面,本發明涉及包含編碼上面鑑別的對於無乳鏈球菌的超免疫血清反 應性抗原或其片段的核酸分子的藥物組合物。這樣的藥物組合物可以包含一個或多個編碼 抗無乳鏈球菌的超免疫血清反應性抗原或其片段的核酸分子。可選地,編碼超免疫血清反 應性抗原或其片段的這樣的無乳鏈球菌核酸分子在聯合藥物組合物中也可以與編碼抗其 它病原體的抗原的核酸分子聯合。優選地,所述藥物組合物是為了預防或治療無乳鏈球菌 和/或其它病原體造成的感染的疫苗,疫苗中包括了抗上述病原體的抗原。藥物組合物可含有任何適合的輔助物質,例如緩衝物質、穩定劑或另外的活性成 分,尤其是已知與藥物組合物和/或疫苗生產有關的成分。根據本發明的超免疫血清反應性抗原、片段或其編碼核酸分子的優選的載體和/ 或賦形劑是為了進一步刺激對給定的超免疫血清反應性抗原、其片段或其編碼核酸分子的 免疫反應的免疫刺激化合物。優選地根據本發明的藥物製備物中的免疫刺激化合物選自尤 其是聚陽離子肽的聚陽離子物質、優選是免疫刺激脫氧核苷酸的免疫刺激核酸分子、明礬、 弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、尤其是人生長激素的神經活性化合物或其組合。尤其是疫苗的藥物組合物除根據本發明的超免疫血清反應性抗原、其片段和/或 其編碼核酸分子外還包含有生物或藥物活性的其它化合物也在本發明的範圍內。優選地, 疫苗組合物包含至少一個聚陽離子肽。根據本發明使用的聚陽離子化合物可以是顯示了根 據TO 97/30721的特徵作用的任何聚陽離子化合物。優選的聚陽離子化合物選自鹼性多 肽、有機聚陽離子、鹼性聚胺基酸或它們的混合物。這些聚胺基酸應當具有至少4個胺基酸 殘基的鏈長度(W0 97/30721)。尤其優選的是象聚賴氨酸、聚精氨酸和在多於8個尤其是多於20個胺基酸殘基的範圍內含有多於20%尤其多於50%的鹼性胺基酸的多肽的物質或 者它們的聯合。其它優選的聚陽離子和它們的藥物組合物在W0 97/30721 (例如聚乙烯亞 胺)和W099/38528中有描述。優選地這些多肽含有20和500個之間的胺基酸殘基,尤其 是30和200個之間的殘基。這些聚陽離子化合物可以化學或重組產生或可以來源於天然的來源。陽離子(多)肽也可以是抗微生物的,有如{GanZ,T.,1999}中綜述的特性。這些 (多)肽可以是原核的或動物或植物來源的或者可以化學或重組產生(W0 02/13857)。肽 也可以屬於防衛素類(W0 02/13857)。這樣的肽的序列例如能在下面網址的抗微生物序列 資料庫中找到http://www. bbcm. univ. trieste. it/ tossi/pag2. html這樣的宿主防禦肽或防禦物質也是根據本發明的聚陽離子多聚體的優選形式。一 般地,允許作為優選地由APC(包括樹突細胞)介導的適應性免疫系統的終末產物激活(或 下調)的化合物用作聚陽離子多聚體。尤其優選用作本發明的聚陽離子物質是cathelicidin衍生的抗微生物肽或 其衍生物(國際專利申請W0 02/13857,此處引用作為參考),尤其是源於哺乳動物 cathelicidin的抗微生物肽,優選地來自人、牛或小鼠。源於天然來源的聚陽離子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(衍生的陽離子肽、觸 角足肽、殼聚糖或甲殼素其它的衍生物)或源於生化或重組產生的這些肽或蛋白質的其它 肽。其它優選的聚陽離子化合物是cathelin或來自cathelin的相關或衍生的物質。例 如,小鼠 cathelin 是具有胺基酸序列 NH2-RLAGLLRKGGEKIGEKLKKIGOKIKNFFQKLVPQPE_COOH 的肽。相關的或衍生的cathelin物質含有有至少15_20個胺基酸殘基的cathelin序列的 全部或部分。衍生化可以包括天然胺基酸被不在20個標準胺基酸中的胺基酸替代或修飾。 另外,更多的陽離子殘基可以引入這樣的cathelin分子中。這些cathelin分子優選地與抗 原聯合。結果這些cathelin分子作為沒有更多的佐劑加入的抗原的佐劑驚人地有效。所 以這樣的cathelin分子用作有或沒有更多的免疫激活物質的疫苗製劑的有效佐劑是可能 的。根據本發明使用的另一個優選的聚陽離子物質是含有被3至7個疏水胺基酸的連 接子分開的至少2個KLK基團的合成肽(國際專利申請W002/32451,此處引入作為參考)。本發明的藥物組合物可進一步包含免疫刺激核酸。免疫刺激核酸是例如含有中性 或人工CpG的核酸,源自非脊柱動物或在某些鹼基內容含有非甲基化的胞核嘧啶_鳥嘌呤 二核苷酸(CpG)的短寡核苷酸形式(0DN)(例如W0 96/02555中描述的)的核酸的短延伸。 或者,基於如例如W001/93903中描述的次黃嘌呤核苷和胞啶的核酸或含有脫氧次黃嘌呤 核苷和/或脫氧尿苷殘基的脫氧核酸(W0 01/93905和PCT/EP 02/05448中描述的,此處引 用作為參考)可優選地用作本發明的免疫刺激核酸。優選地,根據本發明也可以使用不同 免疫刺激核酸的混合物。任何上面提到的聚陽離子化合物與如前面提到的任何免疫刺激核酸聯合也在 本發明之內。優選地,這樣的聯合是根據W0 01/93905, W002/32451, W0 01/54720, W0 01/93903,W0 02/13857 和 PCT/EP 02/05448 和奧地利專利申請 A 1924/2001 中描述的那 些,此處引用作為參考。
另外或可替代地,這樣的疫苗組合物除了根據本發明的超免疫血清反應性抗原及 其片段和其編碼核酸外還可以包含神經活性化合物。優選地,神經活性化合物是如例如W0 01/24822中描述的人生長因子。也優選地,神經活性化合物聯合於如前面提到的任何聚陽 離子化合物和/或免疫刺激核酸。在另一方面,本發明涉及藥物組合物。例如這樣的藥物組合物是此處描述的疫苗。 藥物組合物也是包含任何下面的化合物或其聯合的藥物組合物根據本發明的核酸分子, 根據本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段,根據本發明的載體,根據本發明的細胞,根 據本發明的抗體,根據本發明的功能性核酸和根據本發明的例如抗促成素的結合肽,如此 處描述的任何激動劑和拮抗劑。與此有關任何這些化合物可聯合於非無菌或無菌載體或與 細胞、組織或生物體一起使用的載體而應用,例如適於給予研究對象的藥物載體。這樣的組 合物包含例如介質添加劑或治療有效量的本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段以及 藥物可接受載體或賦形劑。這樣的載體可以包括但不限於生理鹽水、緩衝鹽、葡萄糖、水、甘 油、乙醇和它們的聯合。製劑應當適合給藥的模式。藥物組合物可以以任何有效的、方便的方式給予,包括例如通過其它之中局部、口 腔、肛門、陰道、靜脈內、腹腔內、肌肉內、皮下、鼻內、氣管內或皮內途徑的給予。在治療中或作為預防劑,活性試劑可以作為例如無菌水性分散物優選等滲的可注 射組合物給予個體。或者組合物可製成適於局部應用的例如軟膏、乳膏、洗液、眼藥膏、滴眼液、滴耳 液、漱口水、浸透敷料和縫線和煙霧劑的形式,並且可以含有合適的傳統添加劑,包括例如 防腐劑、輔助藥物穿透的溶劑以及藥膏和乳膏中的軟化劑。這樣的局部製劑可以含有相容 性傳統載體,例如乳膏或軟膏基質以及洗劑的乙醇或油醇。這樣的載體可以構成大從約 至大約98%的製劑重量;更加通常地它們將構成一共大約80%的製劑重量。除了上面描述的治療外,本發明的組合物一般可用作傷口治療劑以阻止細菌粘附 到受傷組織中暴露的基質蛋白質以及為了牙科治療的預防用途用作抗生物預防的代替或 與抗生物預防結合。疫苗組合物很方便地是可注射的形式。可採用傳統佐劑以增強免疫反應。疫苗接 種合適的單位劑量是0. 05-5 y g抗原/每公斤體重,優選地給予這樣的劑量1-3次,間歇 1-3 周。在所示劑量範圍,本發明的化合物應當沒有觀察到妨礙它們給予合適的個體副毒 性作用。進一步的實施方案中,本發明涉及診斷的和藥物的包裝和試劑盒,包含一個或多 個充填了一個或多個本發明前面提到的成分的容器。成分能以有用的量、劑量、製劑或聯合 存在。與這樣的容器有關的是管理藥物或生物產品的製造、使用或銷售的政府機構規定的 形式的通知,反映了人類給予的產品的製造、使用或銷售的機構的批准。與本發明相關,如此處公開的例如藥物組合物或疫苗的用途相關的任何疾病尤其 是鏈球菌更加優選地化膿性和肺炎鏈球菌相連或相聯的疾病或疾病狀態。與此相關,要注 意無乳鏈球菌包含了包括此處公開的那些的一些菌株。與根據本發明要預防和/或治療的 細菌感染相關的、造成的或相聯的疾病在人類包括除了其它的細菌性咽炎、中耳炎、肺炎、 菌血症、腦膜炎、腹膜炎、傷口感染和敗血症。
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仍然進一步的實施方案中,本發明涉及使用任何根據本發明的超免疫血清反應性 抗原及其片段的篩選方法。這樣的篩選方法對本領域的技術人員是已知的,能設計所述方 法以篩選激動劑或拮抗劑。優選地篩選了在本情況下抑制或阻止根據本發明的超免疫血清 反應性抗原及其片段與相互作用伴侶結合的拮抗劑。這樣的相互作用伴侶可以是天然發生 的相互作用伴侶或非天然發生的相互作用伴侶。本發明也提供了篩選化合物的方法以鑑別增強(激動劑)或阻斷(拮抗劑)本發 明的超免疫血清反應性抗原及其片段或核酸分子的功能的那些化合物,例如其與結合分子 的相互作用。篩選的方法可以包括高通量。例如,為了篩選激動劑或拮抗劑,可以從表達結合於本發明的超免疫血清反應性 抗原及其片段的分子的細胞分別製備根據本發明的核酸分子的相互作用伴侶和核酸,可以 是合成反應混合物、細胞腔室,例如膜、細胞被膜或細胞壁或者任何的它們的製備物。製備 物在有或無可以是激動劑或拮抗劑的候選分子的存在下與標記的超免疫血清反應性抗原 及其片段一起孵育。候選分子與結合分子結合的能力反映在標記配體結合的降低。無償結 合,即不引起超免疫血清反應性抗原及其片段功能性作用的分子最可能是好的拮抗劑。很 好結合的並引起與超免疫血清反應性抗原及其片段相同的或密切相關的功能性作用的分 子是好的激動劑。 可以例如通過在候選分子與細胞或合適的細胞製備物相互作用後測定報告系統 的活性,以及與本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段或引發與超免疫血清反應性抗原 及其片段相同作用的分子的作用比較測量可能的激動劑和拮抗劑的功能性作用。在這點上 有用的報告系統包括但不限於比色標記底物轉化為產物,對超免疫血清反應性抗原及其片 段的功能性活性的改變有響應的報告基因,以及本領域已知的結合試驗。拮抗劑試驗的另一個實例是競爭試驗,在競爭抑制試驗合適的條件下聯合本發明 的超免疫血清反應性抗原及其片段和有膜結合的結合分子、重組結合分子、天然底物或配 體、底物或配體模仿物的可能的拮抗劑。能例如用放射活性或比色化合物標記超免疫血清 反應性抗原及其片段,如此能精確地測定結合於結合分子或轉化為產物的超免疫血清反應 性抗原及其片段以評價可能的拮抗劑的有效性。可能的拮抗劑包括結合於本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段並因而抑制 或取消其活性的的小有機分子、肽、多肽和抗體。可能的拮抗劑也可以是小有機分子、肽、多 肽,例如結合於結合分子上相同位點但不引起本發明超免疫血清反應性抗原及其片段的功 能活性的密切相關的蛋白質或抗體。可能的拮抗劑包括小分子,它結合於並佔據了超免疫血清反應性抗原及其片段的 結合位點,由此阻止與細胞結合分子的結合,使得正常的生物活性被阻止。小分子的實例包 括但不限於小有機分子、肽或肽樣分子。其它可能的拮抗劑包括反義分子(對於這些分子的描述,見{Okano,H.等人, 1991};寡核苷酸作為基因表達的反義抑制劑;CRC Press,BocaRation,FL(1988))。優選的可能的拮抗劑包括本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段的衍生物。如此處使用的根據本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段的活性是其結合於 任何其相互作用伴侶的能力或結合於其或任何相互作用伴侶這樣的能力的程度。在特定的方面,本發明提供了本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段、核酸分子或的抑制劑幹擾病原體和負責感染後遺症的哺乳動物宿主之間最初的物理相互作用的用途。尤其是可以在如下方面使用本發明的分子i)阻止無乳鏈球菌粘附於黏膜表面的和 植入裝置上的哺乳動物細胞外基質蛋白質或傷口的細胞外基質蛋白質;ii)阻斷哺乳動物 細胞外基質蛋白質和介導組織損傷或入侵的細菌蛋白質之間的細菌性粘附;iii)導致免 疫防禦的逃避;iv)阻斷除了裝置的植入或其它手術技術以外例如通過抑制營養的獲得啟 動的感染中致病的正常進程。此處提供的每個DNA編碼序列可以用於抗菌化合物的發現和開發。編碼蛋白質在 表達時能用作抗菌藥篩選的靶點。另外,編碼編碼的蛋白質胺基酸區域或Shine-Delgarno 或各自mRNA的其它翻譯促進序列的DNA序列能用於構建反義序列以控制目的編碼序列的 表達。可以採用拮抗劑和激動劑以例如抑制源自鏈球菌尤其是無乳鏈球菌感染的疾病, 例如敗血症。在仍然另一方面,本發明涉及親和裝置,這樣的親和裝置包含至少一種支持材料 和附著於支持材料的任何根據本發明的超免疫血清反應性抗原及其片段。由於根據本發明 的超免疫血清反應性抗原及其片段對它們的靶細胞或靶分子或它們的相互作用伴侶的特 異性,只要滿足結合的條件,超免疫血清反應性抗原及其片段允許它們的相互作用伴侶從 應用於支持材料的任何種類的樣品中選擇性去除。樣品可以是生物或醫學樣品,包括但不 限於發酵肉湯、細胞碎片、細胞製備物、組織製備物、器官製備物、血液、尿液、淋巴液、液體寸寸。超免疫血清反應性抗原及其片段可以以共價或非共價方式附著於基質。合適的支 持材料對於本領域技術人員是已知的,並選自纖維素、氧化矽、玻璃、鋁、順磁珠、澱粉和右 旋糖苷。本發明進一步通過下面的圖示、實例和序列列表舉例說明,從中可以取得進一步 的特性、實施方案和優點。要理解只經由例證不經由公開的限制給予本實例。與本發明相關

圖1顯示了針對無乳鏈球菌的人抗體來源的特徵。圖2顯示了來自無乳鏈球菌ATCC 12403的小片段基因組文庫LSAg-70的特徵。圖3顯示了使用生物素化人IgG通過MACS對細菌細胞的挑選。圖4顯示了所用菌株的血清型和採用鑑別抗原之一的基因分布分析的實例。圖5顯示了通過用大腸桿菌裂解物免疫誘導小鼠中表位特異性抗體的實例。圖6顯示了通過流式細胞儀用表位特異性抗血清染色細胞表面的實例。圖7顯示了體外試驗中挑選的表位誘導的抗體殺菌活性的測定。表IA顯示了用基因組無乳鏈球菌文庫和人血清進行的所有篩選的總結。表IB顯 示了通過表IA中列出的蛋白質抗原區域內序列標示鑑別的抗原蛋白質。表2顯示了用人血清的表位血清學分析的總結。表3顯示了 46個無乳鏈球菌株中鑑別的抗原的基因分布分析的總結。表4顯示了小鼠免疫原性實驗的總結。表5顯示了用基因組無乳鏈球菌文庫和人血清進行的所有篩選的總結。表6顯示了用人血清的表位血清學的總結。
表7顯示了小鼠免疫原性實驗的總結。在詳述中提到的圖示在下面有更詳細地描述。 圖1顯示了如免疫試驗測量的抗無乳鏈球菌抗體的人血清和子宮頸分泌物的特 徵分析。使用從無乳鏈球菌血清型III株ATCC 12403製備的總細菌裂解物或培養上清組 分,通過標準ELISA測量總抗無乳鏈球菌IgG和IgA抗體水平。㈧顯示了由總細菌裂解蛋 白質的健康成人血清的代表性實驗結果。數據表示為從線性檢測範圍內的血清稀釋度(對 於IgA2.000X,對於IgG 10, 000)在405nm處的吸光度計算來的ELISA單位。大寫數字指出 了包括在健康成人非孕血清合併物中的(從52個中)挑選的血清。(B)為了確保對蛋白質 抗原的多重免疫反應性,對通過ELISA挑選的高滴度血清進行免疫斑點分析。顯示了使用 從無乳鏈球菌血清型III ATCC 12403株製備的總細菌裂解物和在5. 000X稀釋度的挑選的 病人血清的代表性實驗結果。(C)顯示了通過免疫斑點分析來自沒有群集的懷孕婦女的子 宮頸分泌物的挑選。定量分析子宮頸紗布條提取的抗體的IgA含量。使用總細菌裂解物在 多孔斑點設備中測試了來自每個製備物2yg IgA的免疫反應性。用抗人IgA第二抗體顯 像斑點。挑選並合併顯示了與GBS蛋白質有反應性(通過箭頭指出)的IgA製備物。圖2(A)顯示了無乳鏈球菌ATCC 12403小片段基因文庫LSAg-70的片段大小的 分布。在測序576個隨機挑選的克隆後,修齊序列(464個)以消除載體殘基,對有各種基 因組片段大小的克隆數量作圖。(B)顯示了無乳鏈球菌ATCC 12403染色體之上的相同的 LSAg-70 —套隨機測序的克隆分布圖例。長方形指出了與有註解的ORF配對的序列,菱形代 表了與+/+或+/_方向的非編碼染色體序列完全配對的克隆。環形決定了有嵌合序列的所 有克隆的位置。鹼基對中的數字距離指出了環形基因組上的方向。圖底下的數字和百分比 給出了文庫內各種克隆集合的劃分。圖3㈧顯示了用生物素化的人IgG的MACS挑選。用15_20 μ g生物素化的 IgG(PSagll-IgG,從人血清中純化)篩選了 pMAL9. 1中的LSAg-70文庫。作為陰性對照,沒 有血清加入到篩選的文庫細胞。對於每輪挑選顯示了第一次、第二次和第三次洗脫之後挑 選的細胞數(分別上、中和下圖)。(B)顯示了細菌表面展示挑選的特異性克隆(1-26個)的 反應性,通過用MACS的挑選使用的在1 3,000稀釋度的人血清IgG合併物(PSagl 1-IgG, 4yg/yl)的免疫斑點分析進行分析。作為負載對照,相同的斑點用指向平臺蛋白質LamB 的抗體在高免疫兔血清1 5,000稀釋度也進行分析。Μ,分子重量標記物;L,來自表達 LamB而沒有外源肽插入的克隆的提取物。圖4㈧顯示了用於基因分布研究分析的無乳鏈球菌臨床分離物不同血清型的圖 示。許多菌株是不可分型的,可以代表額外的血清型。(B)顯示了用各自的寡核苷酸和46個 無乳鏈球菌株的gbs0061基因分布的PCR分析。PCR片段預言的大小是814bp。1_46,無乳 鏈球菌株,如在A下顯示的臨床分離物;_,沒有加入基因組DNA ;+,無乳鏈球菌ATCC 12403 的基因組DNA,作為文庫構建的模板。圖5顯示了用有無乳鏈球菌衍生的表位並表達Lamb或FhuA的大腸桿菌克隆的總 細菌裂解物誘導表位特異性小鼠血清IgG抗體水平的測量。(A)顯示了分別用gbs0428、 gbs0628、gbs632表位產生的三套小鼠血清(每組5個小鼠,1_5)代表性肽ELISA實驗。在 兩個不同的稀釋度測試血清黑柱100X ;灰柱1000X。在肽ELISA中使用了相應於各自表 位的生物素標記的合成肽。用沒有無乳鏈球菌衍生的表位的大腸桿菌裂解物誘導的血清指的是FhuA或LamB。(B)顯示了使用從為了小鼠注射挑選的個體大腸桿菌克隆製備的裂解 物的典型免疫斑點實驗。血清被不攜帶表位的大腸桿菌裂解物耗盡以去除抗大腸桿菌蛋白 質的抗體。顯示了 gbs0918、gbs0428、gbs0628和gbs632表位的實例。陰性對照(-)是有 空的平臺蛋白質的大腸桿菌克隆。箭頭指出了平臺蛋白質LamB和FhuA的位置。 圖6顯示了通過流式細胞儀對無乳鏈球菌細胞表面上特異性抗體結合的檢測。圖 6A中培養的抗無乳鏈球菌血清型III裂解物的免疫前小鼠血清和多克隆血清與無乳鏈球 菌株血清型III孵育並用流式細胞儀進行分析。對照顯示了二抗與無乳鏈球菌細胞表面的 非特異性結合的水平。圖6B中的柱狀圖指出了與產生的抗只含有「空的」平臺蛋白質FhuA 的大腸桿菌裂解物的對照血清相比由於抗gbs0031、抗gbsl925和抗gbs0012抗體的特異性 結合螢光的增加。圖7顯示了如體內殺死試驗中測定的表位特異性抗體的殺菌活性。免疫血清的殺 死活性與合適的對照血清平行進行測量並相對於對照血清進行計算。數據表示為殺死的百 分比,就是作為特異性抗體存在的後果細菌cfu的降低。用無乳鏈球菌裂解物產生的高免 疫多克隆小鼠血清和來自非免疫小鼠的血清分別作為試驗的陽性和陰性對照。測試用(A) gbs0012, gbs0016, gbs0031, gbs0428, gbsl306 和 gbs2018 表位和用(B) gbs0233, gbs0419, gbs0942, gbs0975, gbsl038, gbsll44和gbs2093表位產生的免疫血清的殺菌活性,相對 於合適的對照來表示數據,對照可以是例如用沒有無乳鏈球菌衍生的表位並表達Lamb或 FhuA的大腸桿菌克隆誘導的血清。無乳鏈球菌血清型III細胞與小鼠吞噬細胞孵育60分 鍾,存活的細菌通過接種於血瓊脂之後計數cfu進行定量。表1 細菌表面展示鑑別的免疫原性蛋白質。(A)縱欄 A,無乳鏈球菌 ATCC 12403 在 fhuA 中的 300bp 文庫,NSag8_IgA (826),B, 在 fhuA 中的 300bp 文庫,PSaglO-IgA(768),C,在 fhuA 中的 300bp 文庫,PSaglO-IgG(711), D,在 fhuA 中的 300bp 文庫,PSaglI-IgG (640),E,在 LamB 中的 70bp 文庫,NSag8_IgA (1057), F,在 LamB 中的 70bp 文庫,NSag8_IgG (869),G,在 LamB 中的 70bp 文庫,PSaglO-IgA (904), H,在LamB中的70bp文庫,PSaglO-IgA-吸附的(493),I,在LamB中的70bp文庫, PSaglO-IgG (910),J,在 LamB 中的 70bp 文庫,PSaglI-IgA (631),K,在 LamB 中的 70bp 文庫, PSaglI-IgG (926),L,在 LamB 中的 70bp 文庫,PSagl8_IgA (691),M,在 LamB 中的 70bp 文庫, PSag-sIgA(628);*,用程序ANTIGENIC (KoIaskar和Tongaonkar,1990)進行長於5個胺基酸的抗原 序列的預報。表IB列出了胺基酸序列標示鑑別的免疫原性蛋白質和細菌表面展示鑑別的 肽。已經由細菌表面展示鑑別的抗原肽擁有列出的來自無乳鏈球菌的蛋白質中相同的副 本。顯示了肽與多個人血清反應(見表2)。所以靶向這些肽的血清能識別多個蛋白質。表2 用人血清的表位的血液學。顯示了代表挑選的表位的個體合成肽與人血清的免疫反應性。反應性的程度表示 為+,++或+++,並加和肽與個體血清(13個患者和9個健康成人,總共22個)的個體反應 性。在ELISA單位作為所有反應性的加和的基礎上計算每個肽的總分。對於+分數為2-8, ++為9-16以及+++為17-26。校正背景後從OD4tl5nm的讀數和血清稀釋度計算ELISA單位。 縱欄中分別指出了第一個和最後一個胺基酸殘基的胺基酸從和胺基酸至給出了合成肽在 根據ATCC 12403菌株基因組注釋的抗原ORF內的位置。肽名稱gbs0012. 1存在於注釋的ORF :gbs0012o表3 無乳鏈球菌株的基因分布用特異於編碼相關抗原的基因的寡核苷酸通過PCR測試了如圖4A中顯示的四十六個無乳鏈球菌株。為了證實正確的DNA片段的擴增對一個挑選的PCR反應的PCR片 段進行測序。*,源自與無乳鏈球菌ATCC 12403相比的測序的血清型IA株中胺基酸替代的 數目。#,用於測序的代替菌株,因為基因在血清型IA株中不存在。表4:抗原表位的免疫原性用包含編碼融合於無乳鏈球菌肽的平臺蛋白質LamB或FhuA的質粒的大腸桿菌克 隆免疫測試了無乳鏈球菌抗原的免疫原性。使用相應的大腸桿菌克隆裂解物通過肽ELISA 和/或免疫斑點檢測和測量表位特異性抗體的存在。結果表示為+至+++++,對於肽ELISA 計算為基於ELISA單位的各體小鼠血清的反應性的總和(如圖5A上指出的),對於免疫斑 點(IB)計算為合併的(5個個體)小鼠血清與含有平臺蛋白質的表位反應性的強度(如圖 5B上指出的)。縱欄中分別指出第一個和最後一個胺基酸殘基的胺基酸從和胺基酸至給出 了合成肽在根據ATCC 12403的基因注釋的抗原ORF內的位置。表5 細菌表面展示鑑別的免疫原性蛋白質。(A)fhuA 中無乳鏈球菌 ATCC12403 的 300bp 文庫,IC8_IgA(826),B, fhuA 中的 300bp 文庫,PlO-IgA(768),C, fhuA 中的 300bp 文庫,PlO-IgG(711),D, fhuA 中的 300bp 文庫,Pll-IgG(640),E, IamB 中的 70bp 文庫,IC8_IgA(1057),F, IamB 中的 70bp 文庫, IC8-IgG (869), G, IamB 中的 70bp 文庫,PlO-IgA (904),H,IamB 中的 70bp 文庫,PlO-IgA-吸 附(493),I,IamB 中的 70bp 文庫,PlO-IgG(910),J, IamB 中的 70bp 文庫,PlI-IgA(631), K, IamB 中的 70bp 文庫與 PlI-IgG (926),*,用程序 ANTIGENIC (Kolaskar 和 Tongaonkar, 1990)進行長於5個胺基酸的抗原序列的預言。表6 用人血清的表位的血清學。顯示了代表挑選的表位的個體合成肽與人血清的免疫反應性。反應性的程度表示 為+、++或+++,加和肽與個體血清(13個患者和9個健康成人,共22個)的個體反應性。在 ELISA單位作為每個肽的總分的基礎上計算每個肽的總分。對於+分數為2-8,++為9-16, +++為17-30。背景校正後從OD4tl5nm的讀數和血清稀釋度計算ELISA單位。縱欄中分別指出 第一個和最後一個胺基酸殘基的胺基酸從和胺基酸至給出了根據合成肽在ATCC12403的 基因注釋的抗原ORF內的位置。肽名稱gbs0233. 1存在於注釋的ORF :gbs0233。表7 小鼠中抗原表位的免疫原性。用包含編碼融合於無乳鏈球菌肽的平臺蛋白質LamB或FhuA的質粒的大腸桿菌克 隆免疫測試了無乳鏈球菌抗原的免疫原性。通過肽ELISA檢測和測量表位特異性抗體的存 在。結果表示為+至+++++,對於肽ELISA計算為基於ELISA單位的各體小鼠血清的反應性 的總和(如圖5上指出的)。縱欄中分別指出第一個和最後一個胺基酸殘基的胺基酸從和 胺基酸至給出了合成肽在根據ATCC12403的基因注釋的抗原ORF內的位置。
實施例實施例1 基於抗無乳鏈球菌抗體的人血清來源的表徵和挑選、抗體篩選試劑的 製備
試驗過程酶聯免疫試驗(ELISA)。用包被緩衝液(0. IM碳酸鈉pH 9. 2)稀釋的5_10 μ g/ml總蛋白質包被ELISA平 板(Maxisorb,Millipore)。PBS-BSA中製成三個稀釋度的血清。根據生產廠商的推薦(稀 釋度1,000χ)使用高特異性 馬辣根過氧化物酶(HRP)-連接的抗人IgG或抗人IgA 二抗 (Southern Biotech)。通過基於自動ELISA閱讀儀(TECAN SUNRISE) OD4tl5nm的讀數測量底 物轉化為顏色產物,定量抗原抗體複合物。細菌抗原提取物的製備總細菌裂解物細菌在THB (Todd-Hewitt肉湯)中生長過夜,重複冷凍-解凍循環 裂解細菌在乾冰/乙醇混合物上孵育直到凍結(1分鐘),然後在37°C解凍(5分鐘)重 復3次。這之後是超聲和離心收集上清(3,500rpm, 15分鐘,4°C )。培養上清液離心去除細菌後,通過混合1份上清和3份無水乙醇,用冰冷的乙醇 沉澱過夜生長的細菌培養物的上清,在_20°C孵育過夜。離心收集沉澱物(2,600g,15分 鍾)。乾燥的粒狀沉澱物為了 ELISA溶於PBS,或為了 SDS-PAGE和免疫斑點溶於尿素和SDS 樣品緩衝液。Bradford試驗測定樣品的蛋白質濃度。免疫斑點從體外生長的無乳鏈球菌血清型III株製備總細菌裂解物和培養上清樣品。使用 BioRad Mini-Protean細胞電泳系統通過SDS-PAGE分離10至25 μ g總蛋白質/泳道,蛋白 質轉移到硝酸纖維素膜(ECI^AmershamPharmacia)。在5%的奶中封閉過夜後,加入2,OOOx 稀釋的人血清,HRPO標記的抗人IgG用於檢測。抗體從子宮頸紗布條的提取用內窺鏡檢查過程中引入子宮頸管的吸收圓柱紗布條(Polyfiltronics)收集子 宮頸分泌物,其後冷凍保存直到提取。根據Hordnes等人,1998 (樣品的提供者)進行提取。 簡要地,紗布條與含有蛋白酶抑制劑的PBS混合,震蕩,從含有紗布條的試管中排出液體。 測定提取物中總IgA和IgG抗體的濃度。用於基因組篩選的抗體的純化基於篩選程序中使用的血清或子宮頸分泌物合併物的總抗GBS滴度挑選來自患 者和健康組的五份血清。通過將熱滅活血清與全細胞大腸桿菌細胞(DH5ci,用pHIEll 轉化,在與細菌表面展示使用的相同的條件下生長)孵育去除抗大腸桿菌蛋白質的抗 體。根據廠商說明書(超連接固定蛋白質G,Pierce)用蛋白質G親和色譜從合併的貧瘠 (depleted)血清生產IgG高度富集的製備物。也通過親和色譜使用固定在鏈親和素_瓊 脂糖(GIBC0 BRL)上的生物素標記的抗人IgA(S0uthern Biotech)純化IgA抗體。用 SDS-PAGE、Western斑點、ELISA和蛋白質濃度測量檢查損耗(d印letion)和純化的效率。結果人免疫系統產生的並存在於人血清的抗無乳鏈球菌抗體是抗原蛋白質的體內表 達和它們的免疫原性的指徵。這些分子對於如本發明描述的方法中各體抗原的鑑別是必須 的,所述方法基於特異性抗GBS抗體和相應的無乳鏈球菌肽或蛋白質的相互作用。為了獲 得相關抗體所有組分(r印ertoires),從如下來源收集人血清I.子宮頸和肛門直腸GBS攜帶測試陰性的健康懷孕婦女
II.子宮頸和/或肛門直腸GBS攜帶測試陰性其新生兒仍然無GBS(雖然用抗生素 預防)的健康懷孕婦女III.沒有臨床疾病< 45歲的成人 IV.幼稚個體,5和10個月之間的小孩,在他們已經喪失母體抗體,由於GSB疾病 的缺乏沒有獲得的GSB特異性抗體另外也從前兩個組的供體收集子宮頸分泌物。這些抗體來源的主要價值主要是分 泌IgA組分,它作為黏膜表面上的保護性效應分子而有直接有關。用來自懷孕婦女和未孕成人至少兩個不同人群的抗體進行篩選很重要,因為GBS 疾病也影響老人和免疫受損成人。懷孕研究組內,仍有兩個不同的患者類別包括在抗原篩 選中,有GBS群集的婦女和無群集的那些婦女。暴露於病原體的個體中誘導的血清和例如黏膜分泌物的其它體液中的抗體對於 抗原鑑別是至關緊要的。暴露於GBS導致了無症狀的群集、當前或過去的急性或慢性感 染。無乳鏈球菌的群集和感染是普遍的,作為來自以前的遭遇的天然免疫的後果抗體是存 在的。很可能高滴度沒有群集的個體的血清含有功能性抗體,能消除攜帶。在相同的時間 只有抗體持續存在才有可能誘導抗GBS組分的某些抗體。為了那個原因,也包括來自有群 集的個體的血清。已經顯示群集與莢膜多糖(CPS)-特異性抗體反應相關聯。然而,不清楚 是否足夠水平的對CPS的抗體能阻止GBS的群集,因為有群集的婦女有高和低水平的抗CPS 抗體,對於沒有群集的懷孕婦女這也是真的。然而,有報告指出懷孕期間產生的抗體的效應功能和親合力可能改變。認識到最 健康的成人受到保護免受入侵GSB疾病並且敏感性比新生兒和老人要低很重要。來自這些 個體的抗體似乎對於相應抗原的鑑別尤其有價值。已知抗GBS抗體水平隨著年齡增加。GBS是黏膜病原體,應當誘導IgA反應;為了那個原因進行基於IgA的篩選以及基 於IgG的篩選很重要。一些無乳鏈球菌株表達高親和力IgA結合受體的事實也指出宿主反 應中IgA的重要性。最近有報告指出不僅IgG而且IgA血清抗體能被PMN的FcRlII受體識 別並促進調理作用{PhiIlips-Quagllata, J.等人,2000} ; {Shibuya, Α.等人,2000}。IgA 抗體的主要作用是主要在黏膜表面的中和。血清IgA水平反映了二聚型分泌IgA的質量、數 量和特異性。為了那個原因對血清收集物不僅分析抗鏈球菌IgG,也分析IgA水平。ELISA 試驗中高度特異性第二試劑用於檢測例如IgG和IgA的來自高親和力類型的抗體,但不避 免IgM。IgM抗體的產生在初級適應體液反應過程中發生,得到了低親和力抗體,而IgG和 IgA抗體已經經歷了親和力的成熟,並且在抵抗或預防疾病中價值更高。通過一系列免疫試驗對來自懷孕婦女的127個血清樣品和97份子宮頸分泌物和 來自健康成人的50份血清進行抗無乳鏈球菌抗體的特徵分析。使用例如總細菌提取物和 從無乳鏈球菌血清型III ATCC 12403株製備的培養上清蛋白質的兩個不同的抗原製備物 通過ELISA完成主要的特徵分析。圖IA中顯示了使用來自健康成人群的血清的典型實驗。 在反應是線性的給定的稀釋度比較抗體滴度。基於IgG和IgA抗兩個複合抗原混合物(包 括血清型特異性III型莢膜)的反應性對血清進行分級,挑選最高的血清進行進一步的免 疫斑點測試。這個分析證實預先挑選的血清抗多個GBS蛋白質的高抗體反應性,尤其與未 挑選的低滴度血清比較時(圖1B)。然而,血清的ELISA分級不總是與免疫斑點信號相關, 提示抗莢膜抗體是多量的,控制了抗總細菌提取物的ELISA反應性。因而,包括在抗體合併物中的血清的最終挑選主要基於免疫斑點試驗中的多個免疫原性條帶。這個廣泛的抗體特 徵分析方法導致了抗GBS超免疫血清的明確的鑑別。測定了 97份子宮頸分泌物的IgA含量,通過免疫斑點測試了相同量(2iig)的抗 GBS反應性。陽性挑選的血清分成有群集和沒有群集的IgA合併物並分開地用於細菌表面 展示實驗。為了細菌表面展示對抗原的鑑別,挑選並合併來自兩個供體組的5份血清。挑 選的血清包括在四個懷孕婦女的合併物(PSAglO-IgG,-IgA, PSAgll-IgG,PSAgl8-IgG和 PSAg-sIgA)和一個(非孕)健康成人的合併物(NSAg8-IgG,-IgA)中。通過親和色譜從合 並的血清純化IgG和IgA抗體,並耗盡大腸桿菌反應性抗體以避免細菌表面展示篩選中的
曲旦 冃足°實施例2 無乳鏈球菌的高度隨機的、挑選框架的、小片段的基因組DNA文庫的產 生實驗過程鏈球菌基因組DNA的製備。來自冷凍穿刺培養物的無乳鏈球菌ATCC12403細菌 接種於50ml Todd-Hewitt肉湯培養基並且在通風和37°C搖晃18h而生長。然後收集培養 物,1,600xg離心15分鐘,去除上清。用PBS清洗細菌小球3次,小心懸浮於0. 5ml的溶解 酶溶液(100mg/ml)。加入0. lml的10mg/ml熱處理的RNase A和20U的RNase T1,小心混 合,溶液在37°C孵育lh。0.2ml的20% SDS溶液和0. lml蛋白酶K(10mg/ml)的加入之後, 試管在55°C孵育過夜。然後加入1/3體積的飽和NaCl,溶液在4°C孵育20分鐘。微離心 機中沉澱提取物(13,000rpm),上清轉入新的試管。用Ph0H/CHCl3/IAA(25 24 1)和用 CHC13/IAA(24 1)萃取溶液。加入0.6x體積的異丙醇在室溫下沉澱DNA,用無菌Pasteur 移液管從溶液纏繞DNA並轉入含有80%冰冷乙醇的試管中。10-12,000xg離心沉澱物重新 獲得DNA,然後空氣中乾燥並溶於ddH20中。小基因組DNA片段的製備。使用杯狀管(cup-horn)超聲儀(BandelinSonoplus UV 2200超聲儀,裝有BB5杯狀管,在100%動力輸出10秒脈衝)將基因組DNA片段機械剪 切成大小範圍150和300bp之間的片段或通過溫和的DNase I處理(Novagen)剪切成大小 50至70bp之間的片段。觀察到當將DNA打碎成150-300bp大小範圍的片段時,超聲得到了 緊湊很多的片段大小分布。然而,雖然DNA大量暴露於超聲波誘導的流體力學剪切力,還是 不能有效率並可重複的獲得隨後片段大小的降低。所以,使用Novagen的鳥槍(shotgun)剪 切試劑盒通過溫和的DNase I處理獲得大小50至70bp的片段。製備試劑盒提供的1 20 稀釋度的DNase I,在MnCl2存在下在60 u 1體積中在20°C進行消化5分鐘以確保酶的雙 鏈剪切。用0.5M EDTA中止反應,在2%TAE-瓊脂糖凝膠上評價片段化的效率。這個 處理導致了基因組DNA片段化為近50-70bp片段。然後使用T4DNA聚合酶在100 y M每個 dNTP的存在下平端處理(blunt-ended)片段兩次以確保末端的有效淨化(flushing)。片 段在連接反應中立即使用或為了隨後的使用冷凍於-20°C。載體的描述。在有與卡那黴素抗性基因交換的內醯胺酶(bla)基因的 pASK-IBA骨架上{Skerra,A.,1994}構建載體pMAL4. 31。另外,將bla基因克隆進多個克 隆位點。編碼成熟的內醯胺酶的序列先於ompA的先導肽序列以允許有效的跨細胞質 膜的分泌。此外,編碼成熟的0 -內醯胺酶最初12個胺基酸(間隔子序列)的序列跟在ompA先導肽序列後面以避免緊接在先導肽酶切割位點之後的序列的融合,因為例如這個區 域的正性電荷胺基酸群將降低或取消跨細胞質膜的轉位{KajaVa,A.等人,2000}。Smal限 制性位點供給文庫的插入。用於挑選片段的重新獲得的上遊Fsel位點和下遊NotI位點在 Smal位點的兩側。以bla基因轉錄在_1閱讀框在NotI位點後得到一個中止密碼子15bp 的方式在編碼12個胺基酸間隔子序列的序列之後插入三個限制性位點。+lbp插入重建了 bla 0RF以至於得到內醯胺酶伴隨著氨苄西林抗性的獲得。通過將lamB基因克隆進pEHl的多個克隆位點構建載體 pMAL9. 1 {Hashemzadeh-Bonehi, L.等人,1998}。隨後,序列在胺基酸154後插入lamB,含有 限制性位點FSeI、SmaI和NotI。以挑選了框架的DNA片段的轉移得到fhuA的連續閱讀框 和各自插入的這個方式構建這個插入的閱讀框,所述DNA片段通過用來自質粒pMAL4. 31的 Fsel和NotI的消化進行剪切。通過將fhuA基因克隆進pEHl的多個克隆位點構建了載體pHIEll。之後,序列在 胺基酸405後插入fhuA,含有限制性位點FseI、XbaI和NotI。以挑選了框架的DNA片段的 轉移得到lamB的連續閱讀框和各自插入的這個方式選擇這個插入的閱讀框,所述DNA片段 通過用來自質粒PMAL4. 31的Fsel和NotI的消化進行剪切。用於框架挑選的文庫的克隆和評價。基因組無乳鏈球菌DNA片段連接到載體 PMAL4. 31的Smal位點。將重組DNA電穿孔進DH10B電穿孔勝任的大腸桿菌細胞(GIBC0 BRL),轉化株接種於補充了卡那黴素(50i!g/ml)和氨苄西林(50 y g/ml)的LB瓊脂平板 上。平板在37°C孵育過夜,為了大規模的DNA提取收集克隆。儲存和保留代表性的平板以 收集克隆用於菌落的PCR分析和大規模的測序。簡單的菌落PCR試驗用於最初測定大致的 片段大小分布以及插入效率。從測序的數據評價精確的片段大小、在插入位點的接合的完 整性以及框架選擇的精確性(3n+l規則)。用於細菌表面展示的文庫的克隆和評價。從pMAL4.31載體切割基因組DNA片 段,含有有限制性酶Fsel和NotI的無乳鏈球菌文庫。然後完整的片段群轉移到質粒 PMAL9. 1 (LamB)或pHIEll (FhuA)中,所述質粒已經用Fsel和NotI消化。使用識別8bp富 含GC序列的這兩個限制性酶,在每個平臺載體中維持PMAL4. 31載體中挑選的閱讀框。然 後通過電穿孔將質粒文庫轉化進大腸桿菌DH5 a細胞。細胞接種於補充了 50i!g/ml卡那 黴素的大的LB瓊脂平板上,在可以得到清晰可見的單個菌落的密度在37°C生長過夜。然後 從這些平板的表面刮下細胞,用新鮮LB培養基清洗,分裝在-80°C儲存用於文庫篩選。結果用於框架挑選的文庫。在PMAL4. 31載體中產生分別有大約70和300bp大小的 兩個文庫(LSAg-70和LSAg-300)。對於每一個文庫,大約1 P g的pMAL4. 31質粒DNA和 50ng的片段化的基因組無乳鏈球菌DNA的連接和其後的轉化在框架挑選後得到了 4X105 至2X106個克隆。為了評價文庫的隨機性,測序了大約576個隨機選擇的克隆。生物信息 分析顯示這些克隆中只有很少的克隆多於一次存在。此外,顯示大約80%的克隆的大小在 範圍25和100bp之間,有平均大小大約40bp (圖2)。幾乎所有序列遵循3n+l規則,顯示了 所有克隆恰當地選擇框架。細菌表面展示文庫。大腸桿菌表面上肽的展示要求來自LSAg-70和LSAg-300文 庫的插入體從框架挑選載體PMAL4. 31轉移到展示質粒pMAL9. 1 (LamB)或pHIEll (FhuA)。Fsel和NotI限制性剪切基因組DNA片段,5ng插入體與0. 1 y g質粒DNA連接,其後轉化進 DH5a細胞得到了 2-5xl06個克隆。從LB平板刮下克隆並冷凍而沒有進一步的擴增。實施例3 使用細菌表面展示的基因組文庫和人血清的高度免疫原性肽序列從無 乳鏈球菌的鑑別試驗過程MACS篩選。來自給定文庫的大約2. 5X108個細胞在37°C在5ml補充了 50iig/ml 卡那黴素的LB培養基中生長2小時。ImM IPTG加入30分鐘誘導表達。用新鮮LB培養基 清洗細胞兩次,大約2 X 107個細胞重新懸浮在100 u 1LB培養基中並轉移到Eppendorf管 中。10至20 ii g生物素化的從血清純化的人IgG加入到細胞,懸浮液在4°C輕微震搖 孵育過夜。加入900 u 1 LB培養基,混合懸浮液,隨後在6,OOOrpm 4°C離心10分鐘(對於 IgA篩選,使用lOyg純化的IgA,這些用生物素化的抗人IgG 二抗捕獲)。用lml LB清 洗細胞一次,然後重新懸浮於100 u 1LB培養基。加入10 u 1偶聯於鏈親和素的MACS微珠 (Miltenyi Biotech,德國),繼續在4°C孵育20分鐘。之後加入900 yl LB培養基,將MACS 微珠細胞懸浮液上樣到已經平衡的固定於磁鐵的MS柱(Miltenyi Biotech,德國)。(MS柱 通過用lml 70% EtOH清洗一次並用2ml LB培養基清洗兩次平衡)。然後用3ml LB培養基清洗柱三次。磁鐵去除之後,通過用2ml LB培養基清洗洗 脫細胞。用3ml LB培養基清洗柱後,2ml洗脫物第二次上樣到相同的柱上,重複清洗和洗脫 步驟。進行第三次上樣、清洗和洗脫步驟,得到2ml的終洗脫物。第二和第三輪篩選進行如下。離心收集終洗脫物的細胞,重新懸浮在lml補充了 50 u g/ml卡那黴素的LB培養基。培養物在37°C孵育90分鐘,然後在ImM IPTG誘導30分 鍾。隨後收集細胞,用lml LB培養基清洗一次,懸浮於10 iU LB培養基。再次加入10至 20 yg人生物素化的IgG,懸浮液在4°C輕微震搖孵育過夜。所有進一步的步驟與第一輪挑 選完全一樣。兩輪挑選之後挑選的細胞接種於補充了 50 y g/ml卡那黴素的LB瓊脂平板上, 37 °C孵育過夜。通過測序和Western斑點分析對挑選克隆的評價。挑選的克隆在補充了 50 u g/ml 卡那黴素的3ml LB培養基中37°C生長過夜以使用標準程序製備質粒DNA。在MWG(德國) 或與TIGR(美國)合作進行測序。對於Western斑點分析,用10% SDS-PAGE分離大約10至20 ii g總細胞蛋白質,轉 印到HybondC膜(Amersham Pharmacia Biotech,英格蘭)上。使用人血清作為第一抗體 在大約1 3,000至1 5,000的稀釋度以及偶聯於HRP抗人IgG或IgA抗體作為第二抗 體在1 5,000的稀釋度檢測LamB或FhuA融合蛋白質。使用ECL檢測試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech,英國)進行檢測。或者,兔抗FhuA或兔抗LamB多克隆免疫血清用作 第一抗體,聯合各自的偶聯於HRP的第二抗體以檢測融合蛋白質。結果使用生物素化IgG通過磁鐵激活的細胞分揀(MACS)對細菌表面展示文庫的篩 選。用從健康成人(NSagS-IgG,-IgA)或P10,ll,18(見實施例1 抗體從人血清的製備) 的血清製備的生物素化的人IgG和IgA的合併物篩選pMAL9. 1中的LSag-70和pHIEll中 的Lsag-70文庫。如實驗過程下描述地進行挑選過程。圖3A顯示了用LSag-70文庫和PSagll-IgG的篩選的代表性實例。如從菌落計數可以看到地,在從MACS篩選的第一挑選循 環之後,最後重新獲得的細胞總數戲劇性地從2 X 107個細胞降到大約2X104個細胞,但是 沒有抗體加入的挑選顯示了相似的細胞數的降低(圖3A)。所以進行第二和第三輪挑選。 在第三輪的最後,用PSagll-IgG重新獲得大約104個細胞,然而當沒有加入來自人血清的 IgG時,只重新獲得了 2X103個細胞,清楚地顯示了挑選依賴於無乳鏈球菌特異性抗體。為 了評價篩選的表現,隨機選擇26個挑選的克隆,並用篩選性IgG合併物進行免疫斑點分析 (圖3B)。這個分析揭示了多於80%挑選的克隆顯示了與相關血清中存在的抗體的反應性, 而表達沒有無乳鏈球菌特異性插入物的LamB的對照株與相同的血清不反應。一般,觀察到 反應的速率在35%至90%的範圍內。菌落PCR分析顯示了所有挑選的克隆含有期待大小 範圍的插入物。隨後大量隨機選擇的克隆(每輪篩選600至1200個)的測序導致了基因和被用於 篩選的人血清抗體特異性識別的相應的肽或蛋白質序列的鑑別。挑選特異性克隆的頻率至 少部分反映了在用於挑選的血清中並且識別這個克隆呈現的表位的特異性抗體的豐度和/ 或親和力。在這點,很驚人地源自一些0RF的克隆被選擇了多於100次,指出它們高度免疫 原的特性。表1和表5總結了所有13個進行的篩選所得到的數據。使用單個克隆的全細 胞提取物通過免疫斑點分析驗證了表1和表5中呈現的所有克隆以顯示與用於各自篩選中 的人血清合併物的表明的反應性。如從表1和表5能看到地,鑑別的0RF的獨特區域鑑別 為免疫原性的,因為蛋白質不同大小片段被平臺蛋白質展示在表面。更加值得注意多數細菌表面展示篩選鑑別的基因編碼附著於無乳鏈球菌的表面 的和/或分泌的蛋白質。這個與表面附著的或分泌的蛋白質在無乳鏈球菌毒力中期望的作 用是一致的。實施例4 高度免疫原性肽序列與個體人血清反應性的評價實驗過程肽合成使用Syroll 合成器(Multisyntech,Witten,德國)在 Rink醯胺樹脂上(P印Chem, Tilbingen,德國)使用標準F-moc化學小規模(4mg樹脂;平行共288個)合成肽。序列組 合後,用Fmoc-e-氨基己酸(作為連接劑)和生物素(Sigma,St. Louis,M0 ;象正常的氨基 酸被激活的)延長肽。用93% TFA、5%三乙基矽烷和2%水1小時將肽從樹脂上切下來。 真空下乾燥肽,從乙腈/水(1 1)冷凍乾燥3次。正確質量的存在通過質譜在Reflex酶聯免疫實驗(ELISA)根據生產廠商的說明書在鏈親和素ELISA平板(EXIC0N)上在10 u g/ml濃度包被 生物素標記的肽(在N-末端)。根據生產廠商的推薦使用高度特異性馬辣根過氧化物酶 (HRP)連接的抗人 IgG 二抗(SouthernBiotech)(稀釋度:l,000x)。在 200X 和 1,000X 兩個 血清稀釋度測試血清。手工包被之後,通過有內置ELISA閱讀儀(GENI0S,TECAN)的Gemini 160 ELISA機器人(TECAN)處理和分析肽平板。結果對挑選克隆的生物信息分析之後,設計併合成相應的肽。在有多於26個胺基酸殘 基的表位的情況下,製造重疊肽。所有的肽用N-末端生物素標記進行合成並用作鏈親和素 包被的ELISA平板上的包被試劑。
對基於它們與個體血清的反應性而挑選的肽進行分析,所述肽包括在用於製備為 了細菌表面展示的IgG和IgA篩選試劑的血清合併物中。表2和表6中顯示了 74個肽的 血清反應性的總結,所述肽代表了 55個用22份用於抗原鑑別的人血清(來自13個病人和 9個健康暴露於高滴度個體)分析的來自基因組篩選的不同的無乳鏈球菌抗原蛋白質。通 過基於陽性血清數和反應的程度計算的每個肽的分數對肽進行。肽在對弱陽性血清有很高 的反應性到有廣泛的反應性的範圍內。實施例5 用從無乳鏈球菌鑑別的高免疫原性蛋白質的基因分布研究實驗過程PCR測定的GBS抗原的基因分布理想的疫苗抗原會是存在於所有或絕大部分疫苗指向的靶生物體株的抗原。為了 確立編碼鑑別的無乳鏈球菌抗原的基因是否在無乳鏈球菌株中普遍存在,在一系列獨立的 無乳鏈球菌分離物上用特異於目的基因的引物進行PCR。獲得無乳鏈球菌的分離物,包括如 圖4A中顯示的在患者中最頻繁存在的血清型。對於所有鑑別的0RF設計了作為引物的寡 核苷酸序列,產生大約1,OOObp的產物,如果可能包括所有鑑別的免疫原性表位。如實施例 2下描述地製備所有無乳鏈球菌株的基因組DNA。根據生產廠商的說明書(Invitrogen,荷 蘭)使用Taq聚合酶(lU)、200nM dNTPsUOpMol每個寡核苷酸和試劑盒在25 yl的反應體 積進中行 PCR。作為標準,進行 30 個循環(lx :5min. 95°C,30x :30sec. 95°C,30sec. 56°C, 30sec. 72°C,lX4min. 72°C ),除非各個條件必須適於個體引物對。結果通過PCR測試了鑑別的編碼免疫原性蛋白質的基因在46個不同無乳鏈球菌株中 它們的存在(圖4A)。作為實例,圖4B顯示了用所有指出的46個菌株的GBS0061的PCR反 應。清楚可見地,基因存在於所有分析的菌株中。對來自IA型菌株的PCR片段進行測序, 顯示與無乳鏈球菌ATCC12403株比較所有的657bp是相同的,指出兩個分離物之間高水平 的保守性。從總共117個分析的基因中,100個以上存在於所有或幾乎所有的測試的菌株中, 而只有5個基因在多於10%測試的46個菌株中不存在(表3)。另外,只有少數基因(例 如GBS0016,GBS1087,GBS1528和GBS2018)顯示了大小的不同,但是存在於所有或大多數菌 株分離物中。從一個菌株產生的PCR片段的測序和隨後的與III型株ATCC 12403的比較 證實了正確DNA片段的擴增,揭示了如表3中指出的序列差異的程度。重要地,很多鑑別的 抗原在所有的菌株中在序列和大小是高度保守的,所以是預防GBS感染的新型疫苗候選。實施例6 得自用來自大腸桿菌表面上展示的無乳鏈球菌的高度免疫原性蛋白質 /肽免疫小鼠的免疫血清的特徵分析實驗過程小鼠免疫血清的產生包含編碼了融合於無乳鏈球菌肽的平臺蛋白質的質粒的大腸桿菌克隆在37°C在 補充了 50i!g/ml卡那黴素的LB培養基中生長。過夜的培養物1 10稀釋,生長直到0.5 的0D■,與0. 2mM IPTG孵育2小時。沉澱成粒的細菌細胞懸浮在PBS緩衝液中,冰上用超聲 打破,產生粗細胞提取物。根據0D_測量,相應於5 X 107個細胞的分裝量靜脈注射到NMRI 小鼠,之後是2周後的追加。第二次注射1周後採血漿。肽ELISA測量表位特異性抗體的
80水平。抗原的體外表達通過免疫斑點測試體外生長的無乳鏈球菌III血清型的抗原的表達。測試不同生 長培養基和培養條件以檢測總裂解物和細菌培養上清中抗原的存在。當檢測到相應於預言 的分子重量的特異性條帶點和電泳遷移率時,認為表達被證實了。細胞表面染色如下進行細胞流式儀分析。細菌在培養條件下生長,得到如免疫斑點分析顯示的 抗原的表達。細胞在Hanks平衡鹽溶液(HBSS)中清洗兩次,細胞密度調整為100 yl HBSS, 0. 5% BSA中大約IX 106個CFU。在4°C與稀釋50至100倍的小鼠抗血清孵育30至60分 鍾之後,通過在過量的HBSS,0.5%BSA中的離心洗掉未結合的抗體。螢光素(FITC)標記的 第二羊抗小鼠抗體(F(ab』)2片段特異性的)與細胞在4°C孵育30至60分鐘。清洗後,細 胞用2%多聚甲醛固定。使用Becton DickinsonFACScan流式細胞儀檢測結合的抗體,用計 算機程序CELLQuest進一步分析數據。陰性對照血清包括小鼠免疫前血清和用沒有無乳鏈 球菌基因組插入物的質粒編碼基因lamB或fhuA轉化的IPTG誘導的大腸桿菌細胞製備的 裂解物所產生的小鼠多克隆血清。殺菌(殺死)試驗鼠巨噬細胞(RAW246. 7或P388. D1)和細菌孵育,通過菌落計數測定60分鐘後活 細菌的丟失。簡而言之,細菌用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)清洗兩次,細胞密度調整為50 yl HBSS中大約IX 105個CFU。細菌與小鼠血清(最多可達25% )和豚鼠補體(最多可達5% ) 在總體積100 ill中4°C孵育60分鐘。預調理的細菌與巨噬細胞(鼠細胞系RAW264. 7或 P388.D1 ;每lOOiil 2X 106個細胞)以1 20的比例混合,旋轉震搖器上在500rpm 37 °C 孵育。每個樣品的分裝物用無菌水稀釋,室溫孵育5分鐘以裂解巨噬細胞。然後將系列稀 釋物接種到Todd-Hewitt肉湯瓊脂平板上。平板在37°C孵育過夜,用Countermat閃光菌落 計數儀(IUL儀器)計數菌落。對照血清包括小鼠免疫前血清和用包含沒有無乳鏈球菌基 因組插入物的基因lamB或fhuA的質粒轉化的IPTG誘導的大腸桿菌製備的裂解物所產生 的小鼠多克隆血清。結果小鼠的免疫原性使用如圖5A和B中分別舉例以及表4和表7中總結的表達埋於LamB或FhuA平 臺蛋白質中給定表位的大腸桿菌通過肽ELISA和/或免疫斑點測定特異性抗體的存在。61 個不同表位區域呈現的43個新型GBS抗原在小鼠中顯示是有免疫原性的。然後使用無乳 鏈球菌血清型III株製備的總細菌裂解物和培養上清通過免疫斑點分析陽性血清(數據未 顯示)。這個分析作為測定抗原蛋白質是否表達以及如果為了用FACS分析評價多肽的表面 表達在什麼生長條件下的第一步。基於文獻的數據不期待所有的蛋白質會在體外條件下表 達。無乳鏈球菌的細胞表面染色。隨後過基於流式細胞儀的試驗證明一些抗原蛋白質 易接近細胞表面通。GBS細胞與免疫前血清以及產生的抗無乳鏈球菌裂解物或包含了編碼 融合於無乳鏈球菌肽的平臺蛋白質的質粒的大腸桿菌克隆的多克隆小鼠血清孵育,之後用 螢光標記的二抗檢測。如圖6A中顯示地,通過無乳鏈球菌III血清型細胞群螢光的顯著遷移證明,生產的抗無乳鏈球菌裂解物的抗血清含有抗表面組分的抗體。對於生產的抗許多 鑑別的GBS抗原的肽的多克隆血清觀察到無乳鏈球菌III血清型細胞的相似的細胞表面染 色(圖6B)。一些實例中,如柱狀圖中檢測到的兩個峰指出地一小部分細菌沒有染色(圖 6B)。這個現象可以是細菌生長過程中基因產物差異表達、不足的抗體水平或其它表面分子 或血漿蛋白質造成的抗體結合部分抑制的結果。重要地,眾所周知的保護性GBS抗原Sip/ gbs0031在這個試驗中被證明也是陽性的。體外殺菌活性。調理噬菌死亡是抗細胞外細菌例如無乳鏈球菌的宿主防禦的裡程 碑。如果特定抗原誘導的抗體能結合激活的補體組分(C3bi),抗體對細菌抗原的細胞表面 結合是受調理素作用的並誘導噬菌細胞(巨噬細胞和中性粒細胞)的殺死(殺菌)。圖7 中數據呈現了通過用相應抗原在小鼠中產生的抗原特異性抗體測量的殺菌活性。根據這些 數據,一些新型 GBS 抗原,例如 gbs0012, gbs0016, gbs0428, gbsl306 和 gbs2018,誘導功能 性抗體。重要地,眾所周知的保護性GBS抗原Sip/gbs0031在完全相同的試驗中被證明是 強陽性的。這些實驗證實了生物信息的預言,很多蛋白質由於它們的信號肽序列而被運出, 另外顯示了它們存在於無乳鏈球菌III血清型的細胞表面上。它們也證實這些蛋白質可用 於有功能特性的人抗體的識別,使得它們成為開發抗GBS疾病的疫苗很有價值的候選。表1A 細菌表面展示鑑別的免疫原性蛋白質。
表IB 胺基酸序列識別鑑別的免疫原性蛋白質和細菌表面展示鑑別的肽 表2.用人血清的表位血清學表3 無乳鏈球菌株中的基因分布 表4.小鼠表位的免疫原性表6.鑑別的抗原內表位與人血清的免疫反應性 Doherty, Ε.,等人(2001) · Annu Rev Biophys Biomol Struct 30 :457_475·Eisenbraun, Μ.,等人(1993). DNA Cell Biol 12 :791_7.Etz, H.,等人(2001). T Bacteriol 183 :6924_35·Farley, Μ. (2001). Clin Infect Dis 33 :556_61·Ganz, Τ. (1999). Science 286 :420_421·Georgiou, G. (1997). Nature Biotechnology 15:29-34.Glaser, P.,等人(2002) · Mol Microbiol 45 1499-513.Hashemzadeh-Bonehi,L.,等人(1998). Mol Microbiol 30 :676_678·
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agaactcgaa atgcaattag atatcctaaa gcaagcagcg gtgattatgg cacaaaaagg 60 gaaataatca ctgctaataa ggataaatac agcatttcaa agatgtgtcg ctggctgaat 120 atgccacgct caagttatta ctatcaagcc gtggagtcag tatctaaaac ggagtttgaa 180 gaaactatta aaagaatttt tctcgatagc gagtctagat acggatccag aaaaatcaaa 240 atatgcttga ataacgaagg tatcacactt tcacgtcgtc ggattcgacg cattatgaag 300 cgactcaatt tggtttctgt ttatcagaaa gccaccttca aaccacattc tagaggcaag 360 aatgaagccc ctattcccaa ccacttagac aggcaattta agcaagaaag accactacaa 420 gccttagtca ctgacttaac ctatgttcgt gtaggcaatc gttgggctta tgtttgcctc 480 atcattgacc tatacaaccg tgaaatcatc ggcctgtctc ttggttggca caagaccgct 540 gaactcgtta agcaagccat acaaagcatc ccttacgccc tgaccaaagt caagatgttc 600 cattcagatc gtggcaaaga gtttgataat cagttaattg atgaaatatt ggaagccttt 660 ggaatcacac gttcgcttag tcaggctggt tgtccttatg acaatgccgt agctgaaagt 720 acgtatcgtg ctttcaaaat tgaatttgtt tatcaagaaa cctttcaatc gctggaagaa 780 ctagctctta agactgAaaa ggcaacactt ttctgtacaa catttataaa gtgttgcctt 840 ttcaggtttt taccaatgct a861
SeqID 218
MKKVLTFLLCSLYFVSIPAISTEEPLTLSQNRRYALTQTVVDKEMYFDAIPERPTTKIEISSFQDEALTITGETLVP
NTLLSIVSLTINSNGIPVFTLSNGQFIKASREAIFNDLVSKQQSVSLDYWLKPSFVTYEAPYTNGVSEVKNNLKPYS
RmVEQAETEHGIYYKTDSGFWISVEDLSVADNKMAKVQEVLLEKYNKDKYGIYIKaNTgrVAGINIDRSMYSAS
IAKLATLYASQEQVKLGKLSLDSKFEYKDNVNQFPNSYDPSGSGKLEKKADHKLYTVKELLEATAKESDNVATMLG
YYVNNQYDSMFQTQVDTISGMHIDMKKRQISPQAAGKMMEAIYYQNGDIVNYLSKTDFDNTRIPKNIPVKVAHKIGD
AYDYKHDAAIVYAEQPFIMIIFTDKSSYDDITKIADDVYQVLK
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EAVSQQLGQEIQTLSNKIVARNESLKKQVRSAQKGNLTNYINTILNSKSVSDAVNRWAIREWSANEKfflJVQQEAD
KAALEAKQIENQNAINTVMNKQAIENNKAALATQRAQLEMQLELSAQLTTVQNEKASLIQAKAQAEEMRKMEA
QAAAEAMQAEAMQAESVAMQAMQVESATAPTETVQTQPRTEIKPSNLTATSSATTVATTTATATNEPKVTQPS
WTMVEAPMWSSTPMVSKPVWSYDSSNTYPMGQCWGMSMASWVGNYWGNANQWGASARAAGYSVGTTPRV
GAVAVWPYDGGGYGHVAWTSVANNSSIQVMESNYAGNMSIGNYRGSFNPSASGSVYYIYPN
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SIKVADAQDDMR_DVQNFISQ_AILINPVDSKAIVTAIKSANNANIPVILMDRGSEGGKVLTTVASDNVMG
KMAADYAVKKLGKKAKAFELSGVPGASATVDRGKGFHSVAKSKLDILSSQSANFDRAKALNTTQNMIQGHKDVQIIF
AQM)EMALGMQAVKSAGLQWLIVGIDGQPDAHDAIKKGDISATIAQQPAMGEIAIQAAIDHYKGKKVEKETISP
IYLVTKDNVEKYNW
SeqID 229
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HAMYEQKYPLVSALSRPIIAQKLVEMAHQTGATTIAHGCTGKGNDQVRFEVAIMLDPELKVIAPVREWKWHREEEI
TFAKANGVPIPADLDNPYSIDQNLWGRANEOGVKENPWNQAPEEAFGITKSPEEAPDCAEYIDITFQNGKPIAINNQ
EMTLADLILSLNEIAGKHGIGRIDHVENRLVGIKSREIYECPAAMVLLMHKEIEDLTLVREVSHFKPILENELSNL
IYNALWFSPATKAIIAYVKETQKWNGTTKVKLYKGSAKWARHSSNSLYDENLATYTAADNFDQDMVGFIKLWGL
PTQVNAQVNKG
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EKDLNKLGVKAEGDDKWITLSSPSPQFIYYLAFTNFMPQKQEWEKYGKDYATTSKNTVYSGPYTVEGWNGSNGTF
TLKKNKNYWDAKNVKTKEVRIQTVKKPDTAVQMYKRGELDAANISNTSAIYQANKNNKDVTDVLEATTAYMQYNTTG
SVKGLDNVKIRRALNLATNRKGWQAAVDTGSKPAIAFAPTGLAKTPDGTDLAKYVAPGYEYNKTEAAKLFKEGLAE
SGLTKLKLTITADADVPAAKNSVDYIKSTWEMLPGLTVEEKFVTFKQRLEDSRKQNFDIWSWGGDYPEGSTFYG
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GLSIDFTHAYKK
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ieyqninkvygenvavedinlkiypgdfvcfigtsgsgkttlmrmvmmjiptngtllfkgkdistinpielrrrigyviqniglmphmtiyenivlvpkllkwseeakrakareliklvelpeeyldrypselsggqqqrigviralAADQDIILMDEPFGALDPITREGIQDLVKSLQEEMGKTIILVTHDMDEALKLATKIIVMDNGKMVQEGTPNDLLHHPatsfveqmigeerllhaqaditpvkqiionpvsitaektlteaitlmrqkrvdsllvtdngkligfidleslsskykkdrlvsdilkhtdfyvmeddllrntaerilkrglkyapwdhennlkgivtraslvd1ydi iffgdtetedqSeqID 235mkidkkeflaliasiillifasvtfflfkdhgttqmdtvessvnhvsdsqlteaqdmdkfekkpsekllkdvelalnklsnsskkealqkrfkkakdkylkdeadkkatkdatdlveileqapseenvlkaemvnkltvkeskealqkridtVKTQYGLIGNQTPSSSVAETTEQGTANPASQDTSSYVNQNVAPTYEQPQTNNTPVTPGVNNTVPTPGTGTAPATNGTGVAQSeqID 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]SEMPKMQNMAKVEKTSDKPMMVATSVRKMMATPTPVAMTKTTSVDEVKKSTDTAFKQTVDVPAHYVNMKGNGPFLAGVNQTIPYEAFGGDG1TRLILKSSEGAKWSDNGVDKNSPLLPLKGLTKGKYFYQVSLNGNTTGKEGQALLDQIKANDKHSYQATIRVYGAKDGKVDLKNMISQKMVTINIPHITTDMEVKNSLKMAFKEKVDVPAKYVSMKAKGPFLAGVNETIPYEAFGGDG1TRLILKASEGAKWSDNGVDKNSPLLPLKDLTKGKYFYQVSLNGNTAGKKGQALLDQIKANGSHT[4905]YQATITIYGTKDGKVDMNTILGQKTVMIHINVAKKDMNSTSMMMKKDKMI1PMKKEMTSSKINTGMMMSNNKMSANMQMSSQAKSNDKAGKKMSMMSKNLPNTGETKQQNVGVLG1SLAFATGLTALGLKKSKQRSeqID 243MTHITFDYSKVLGQFVGE昍LDYLQPQVSAADAFLRQGTGPGSDFLGWMDLPENYDKEEFSRIQKMEKIKSDSEVLWIGIGGSYLGAKAAIDFLNNHFANLQTAEERKAPQILYAGNSISSTYLADLVEYVQDKEFSVNVISKSGTTTEPAIAFRVFKELLVKKYGQEEANKRIYATTDKVKGAVKVEADANNWETFWPDNVGGRFSVLTAVGLLPIMSGADITALMEGMMRKDLSSDKISENIAYQYMVRNVLmGYITEIUNYEPSLQYFGEWMQUGESEGKDQKGIYPTSANFSTDLHSLGQFIQEGYRNLFETWRVEKPRKNVTIPELTEDLDGLGYLQGKDVDFVNKKATDGVLLAHTDGGVPNMFVTLPTQDAYTLGYTIYFFELAIGLSGYLNSVNPFDQPGVEAYKRNMFALIjGKPGFEELSAELNARLSeqID 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238imRIMGDVYNTADLYWGYKVKSEAWTHTTEKSKPVEPQMTPKAPMGIPSTGEASMTPLTAIGAIILSALG
LAGFKKRQK
SeqID 278
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QKQKDQSQQNLVKATSTVTEAEKVMEATPEWKEAIKAVTEAKEAVTDAEANWDAQKTEQKANQEVQSQAKTVDE
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249[5607]EFESOTQIVWSATPGDYEMEQTDTVVEQIIRPTGLIi)PEVEVRPSMGQMDDLLGEINLRTEKGERTFITTLTKMAEDLTDYLKEMGVDVKYMHSDIKTLERTEIIRDLRLGVFDVLIGINLLREGIDVPEVSLVAILDADKEGFLRNERGLIQTIGRMRNSNGHVIMYADKITDSMQRAMDETARRRRL_YNEKHGIVPQTIKKEIRDLIAITKSNDSDKPEKWDYSSLSKKERQAEIKALQQQMQEAAELLDFELAAQIRDVILELKAIDSeqID 328MKHKLKAFTLALLSIFFVFGGKVSAETVNIVSDTAYAPFEFKDSDQTYKGIDVDIVNEVAKRAGWNVNMTYPGFDMVNAVQSGQADALMAGTTVTEARKKVFNFSDTYYDTSVILYTKNNNKVTNYKQLKGKWGVKNGTMQSFLEENKSKYGYKVKTFDTSDLMNNSLDSGSI YMMDDQPWQFAINQGKAYAINMEGEAVGSFAFAVKKGSGHDffiJKEFNTAFAQMKSDGTYNDIMDKWLGKDATKTSGKATGNANEKATPVKPSYKIVSDSSFAPFEYQNGKGKYTGFDMELIKKIAKQQGFKIi)ISNPGFDAALMVQSGQADGVIAGATITEARQKIFDFSDPYYTSSVIUVKKGSNVKSYQDLKGKTVGAKNGTASYTWLSDHADKYNYHVKAFDEASIMYDSMNSGSIDALMDDEAVLAYAINQGRKFETPIKGEKSGDIGFAVKKGANPELIKMFNNGLASLKKSGEYDKLVKKYLSTASTSSNDKMKPVDESTILGLISNNYKQLLSGIGTTLSLTLISFAIAMVIGIIFGMMSVSPSNTLRTISMIFVDIVRGIPLMIVAAFIFWGIPNLIESITGHQSPINDFVAATIALSLNGGAYIAEIVRGGIEAVPSGQMEASRSLGISYGKTMQKVILPQAVRmPNFINQFVISLKDTTIVSAIGLVELFQTGKIIIARNYQSFRMYAILAIMYLVIITLLTRLAKRLEKRLKSeqID 329MGDKPISFRDKDGNFVSAADVWNAEKI^ELFNTLNPNRKLRLEREKLAKEKGSeqID 330METYTLSNTLNIPKIGFGTWQLTEGEEAYKAVTHALKVGYTHIDTAQIYGNEHSVGRAIRDSGLARESIFLTTKIWNDKHDYmKASIDESLQKLGVDYIDLLLIHIPNPKALRENDAWKAGNAGTWKAMEEAYKEGKVKAIGVSNFMKIttEALFETAEIKPMVNQIILAPGCAQEDLVRFCKGNDILLEAYSPFGTGAIFENESIKAIAEKYGKSVAQVALRWSLDNGFLPLPKSATPKNIEANLDIFDFQLNEDDITTLIQLDSGIKPKDPDNVSFSeqID 331MVKGQGNWAQNKKAHHDmVETIEAGIVLTGTEIKSVRAARITLKDGYAQIKNGEAWLINVHITPYDQGNIWNQD [5631 ]PDRTRKLLLKKREIEKISNELKGTGMTLVPLKVYLKDGFAKVLLGLAKGKHDYDKRESIKRRE_IARQLKNYNSRSeqID 332MDHFTKLWQDFSKLPNWAIALGGSRSGDSFDQSSDYDLYVYCMTPDITSRKRILNKHCHYIELNNHYWELEDNGTLNDGTDIDILYRNIDNFLSDLEDWEHHNSRIGYTTCFWHNLINCQILYDPENQLQSLKERFEVSYPSQLQKQIIIQNRNLLTGKLPSYDKQI IKALKRQDFVSTHHRTTAFLDSYFDIIFAimTHPGEKMISYAKKNATLLPKHFEENI IKLOWSNEHTVKETLNDIIMHLDVMENFQHFIGSeqID 333MKKIIYLGLACVSILTLSGCESIERSLKGDRYVDQKLAENSSKEATEQLNKKTKQALKADKKAFPQLDKAVAKNEAQVLIKTSKGDINIKLFPKYAPLAVENFLTHAKEGYYNGLSFHRVIKDFMIQSGDPNGDGTGGKSIWNSKDKKKDSGNGFVNEISPYLYNIRGSLAMANAGADTNGSQFFINQSQQDHSKQLSDKKVPKVIIKAYSEGGNPSLDGGYTVFGQVISGMETVDKIASVEVTKSDQPKEKITITSIKVIKDYKFKSeqID 334MKIGIIAAMEEELKLLVENLEDKSQETVLSNVYYSGRYGEHELVLVQSGVGKVMSAMSVAILVESFKVDAIINTGSAGAVATGDWGDVWADTLVYHDVDLTAFGYDYGQMSMQPLYFHSDKTFVSTFEAVLSKEEMTSKVGLIATGDSFIAG
250[5646]QEKIVIKGHFPQVUVEMEGAAIAQAAQATGKPFVWRAMSDTAAHDANITFDEFIIEAGKRSAQVLMAFLKALSeqID 335MEKRLSLGALVLASTVLLMOGNVGGGASSTGTKIGKDIKVGYNWELSGNVSSYGNSMKNGADLAVKEINAAGGVGGKKLKVLSQDNKSENAEAATVATNLVTKGANVIIGPATSGAAASSTPKVNAAAVPMIAPAATQDNLVYGSDGKTLNQYFFRATFVDNYQGKLLSQYATDNLKAKKWLFYDNSSDYSKGVAKSFKESYSGKIVDSMTFSAGDTDFQASLTKLKGK [5651 ]EYDAIVMPGYYTETGLIVKQARKLGISKPVLGPDGFDSPKFVQSATPVGASNVYYLTGFTTQGSTKAKAFHDHYVKAYGEEPSMFSALSYDAVYMAAKSAKGAKTSIDLKKALAKLKDFKGVTGKMSIDKNHNWKSAYWKLDDGKTSSVNIISAKSeqID 336MENHNSIKQTYGLMTTIAMIVGWIGSGIYFKVDDILKFTGGDVFLGMVILVLGSFSIVFGSLSISELAIRTSESGGIFSYYEKYVSPALAATLGLFASFLYLPTLTAIVSWVAAFYTLGESSSLESQIILAAVYILALSLMNIFAKRIAGGFQSLTTFVKMIPLVLIALIGAFWSDKAPQLPQffiJAIQPSNVGWSWVSGLVPLYFAYDGWTIFVSIAPEVKNPKKNLPLAFVIGPALILLSYLAFFYGLTQILGASFIMTTGNDAINYMNIIFGPSVGRLLSFIVILSVLGVANGLLLGIMRLPQAFAERGWIKSERMANINLKYQMSLPASLTVTAVAIFWLFVHFMVTKFNLLPGSDISEIAWFNNTSLIILYVLVLSLYLKKDIKNKFTGLVSPILAILGGLILFIGSLLSNFFTVLIFQCFCLLFCLICHYIYQKNNPKTHESeqID 337LTEFNDDQHSNHDQKSFKEQILAELEEANRLRKLREEELYQKEQEAKEMRRTAQLMADYEAQRLKDEQEARAKALETKQRLEEQEKARIEAKLLAEMREEERRQAEQALASQEEQVINQGMEPSRELDSGSKSSEFRTTENVPDIDLKADKTDVATAVPNQETEEIFLVRATDIPTEGENVKLGETSELEPVAKEPIRVEDLSKEEEDIALSAKNKHNKRERRQKADNVAKRIARILISIIILVLLLTAFVGYRFVDSAIKPVDSNSNKFVQVEIPIGSGNKLIGQILEKAGVIKSATVFNYYSKFKNYSNFQSGYYNLKKSMTLDQIMELEKGGTAEPTKPALGKILITEGYTIKQIAKAIESNKIDTKTTSTPYKADDFLKLVQDETFIKKMVAKYPNLLGSLPDKSKAIYQLEGYLFPATYNYYKDTTLEGLVEDMISI1NTKMAPYYNTIKAKNMSVM)VLTLSSLVEKEGSTDEDmiASWYNRLSA(mQSNIAILYAMGKLGDKTSLAEDAQINTSIKSPYNIYTNTGIiTGPVDSPSISAIEATIKPASTDYLYFVADVKTGNVYYAKDFETHKANVEKYINSQINSeqID 338MSRMIPGRIRNQGIELYEQGLVSLISQEGNLLKAKVGDCQIEYSLVTEETKCSCDFFARKGYCQfflmEHFLKNDPEGMILSKVQVQQESQQETKKKTSFGSVFLDSLIINEDDTIKYQLSAQGEQNPYANDIWWTLKIRRLPDDRSYVIRDIKAFLNTVRKEAYYQIGKQYFETLSLIQFDETSQELIEFLWRLIPSHSSKIDLEFILPNQGRffl,SLTRGFFEEGVTLMNALENFSFESDFHQFMOFKELEGEDiYQFKVIVHRQSIELEIKEKDLKPLFANSYLFYRDTFmNLKQEKMVTAIRSLPIEGDLAKHIHFDLDDQDKLMMiDFKEIGLVDAPRSFSIHDFKVNFEFDINSQNEILLQMVFDYGNDLTVHMQEI£QLTFASHFKHEEKIFKLLERYGFAPHFSTSHPAYSAQELWYTYM,PQFKMGTVSLSAKLESYRLIERPQIDIEAKGSLLDISFDFSDLLENDVDQALVALFDNNPYFVNKSGQLVIFDEETKKVSATLQGLRARRAKNGHIELDNIAAFQLSELFANQDNVSFSQHFYQLIEDLRHPEKFKIPGLSVSASLRDYQLTGVRWLSfflDHYGFAGILADDMGLGKTLQTISFLSTKLTI SRVLILSPSSLIWQDEFHKFAPDVDVAVAYGSKIRRDEIIAERHQVIITSYSSFRQDFETYSEGNYDYLILDEAQVMKNAQTKIAHSLRSFEVKNGFALSGTPIENKLLEIWSIFQIILPGLLPGKKEFLKLNPK [5681 ]QVARYIKPFVMRRKEEVLLPELPDLIEMNYPNEMTDSQKVIYLAQLRQIQESIQHSSDADLNRRKIEILSGITRLRQICDTPRLFMDYDGESGKLESLHQLLTQIKENGHRALIFSQFRGMDIAEREMVAMGLTTYKITGSTPANERHEMTRAFNAGSKDAFLISLKAGGVGLNLTGADTWLIDLWWNPAVEMQAISRAHRLGQKENVEVYRLITRGTIEEKILEMQETKKm,VTTVLDGNETHASMSVDDIREILGVSKSeqID 339
VLLTEIKKSPEGLYFDKKIDIKESLMERHSEIMDISDIQVSGHWYEDGLYLLDYNMAYDITLPSSRSMKPWLSEK QTINEVFIEAENVSTKKELVDQDLVLILEEDDINLEESVIDNILLNIPLRVLMDEVGVEADLSGKNWSLMTEKQYE EKQAKEKEKSNPFAALEGMFDSD SeqID 340
MEVKTAIEWMHTFNQKIQSNKDYLSELDTPIGDGDHGGNMARGMTAVIENLDNNEFSSAADVFKTVSMQLLSKVGGA SGPLYGSAFMGITKAEQSESTISEALGAGLEMIQKRGKAELNEKTMVDVWHGVIEAIEKNELTEDRIDSLVDATKGM KATKGRASYVGERSLGHIDPGSFSSGLLFKALLEVGGV SeqID 341
MQDKLMIRGARAHNLKNISVDIPRDKLVWTGLSGSGKSSLAFDTIYAEGQRRYVESLSAYARQFLGNMEKPDVDSI
DGLSPAISIDQKTTSKNPRSTVGTVTEINDYLRLLYARVGTPYCINGHGAITASSVEQIVDKVLALPERTKMQILAP
IIRRKKGQHKSTFEKIQKDGYVRVRIDGDIHDVTEVPELSKSKMHNIDIWDRLINKEGIRSRLFDSVEMLRLSDG
YWIDTMDGNELLFSEHYSCPEOGFTVPELEPRLFSFNAPFGSCTTCDGLGIKLEVDIDLVIPDKSKTLREGALVPW
NPISSNYYPT1EQAMTQFDVDMDTPFEKLSKAEQDLALYGSGEREFHFHYINDFGGERNIDLPFEGWNNINRRYH
ETNSDYTRNVMREYMNELKCNTCHGYRLNDQALCVRVGGEEGLNIGQVSDLSIArttELLETLRLSSNEQLIARPII
KEIHDRLSFLNNVGLNYLNLSRSAGTLSGGESQRIRLATQIGSNLSGVLYVLDEPSIGLHQRDNDRLIDSLKKMRDL
GNTLIWEHDEDIMMMDWLIDVGPGAGAFGGEIVASGTPKQVAKNTKSITGQYLSGKKVIPVPSERRVGNGRFLEI
KGMENNLQNLDVKFPLGKFIAVTGVSGSGKSTLINSILKKAVAQKLNRNSDKPGKYVSLEGIEYVDRLIDIDQSPI
GRTPRSNPATYTGVFDDIRDLFAQTNEAKIRGYKKGRFSFNVKGGRCESCSGDGIIKIEMHFLPDVYVPCEVCHGTR
YNSETLEVHYKEKNIAQILDMTVNDAVTFFMIPKIARKLQTIKDVGLGYVTLGQPATTLSGGEAQRMKLASELHKR
STGKSLYILDEPTTGLHADDIARLLKVLDRFVDDGNTVLVIEHNLDVIKTADHIIDLGPEGGIGGGQIVAIGTPEEV
AENPKSYTGYYLKEKLAR
SeqID 342
MWPEDRIASFRRTLLGWYDQEKRDLPWRRTTNPYYIWVSEHQQTQVNTVIPYYKRFLEWFPQIKDLADAPEEQLL
KAWEGLGYYSRV_KAAQQVMVDFGGIFPHTYDDIASLKGIGPYTAGAIASISFNLPEPAVDGNVMRVMARLFEV
NYDIGDPKNRKIFQAIMEILIDPDRPGDFNQALMDLGTDIESAKTPRPDESPIRFFNMYLNGTYSKYPIKNPKKKP
KPMRIQAFVIRNQNGQYLLEKNTKGRLLGGFWSFPIIETSPLSQQLDLFDDNQSNPIIWQTQNETFQREYQLKPQWT
DNHFPNIKHTFSHQKWTIELIEGVVMTDLPNAPffi.KWMIEDFSLYPFATPQKKffl.ETYLKQKNA
SeqID 343
LIEITWTVKYITEFIATAFLIILGNGAVANVDLKGTKGNNSGWIIIAIGYGLGVMMPALMFGNVSGNHINPAFTLGL
AFSGLFPWAHVGQYILAQILGAMFGQLVWMVYQPYFVKTENPNHVLGSFSTISALDDGQKSSRKMYINGFLNEFV
GSFVLFFGALALTKNYFGVELVGKLVQAGYDQTTMTRISPYVTGSLAVAHLGIGFLVMTLVASLGGPTGPALNPAR
DLGPRIVHRLLPKQILGQAKEDSKWWYAWVPVLAPIVASILAVALFKLLYL
SeqID 344
MSSYWNNYPELKKNIDETNQLIQERIQVRNKDIEMLSQLTMGGKQLRPAFFYLFSQLGNKENQDTQQLKKIMSL EILHVATLIHDDVIDDSPLRRGNMTIQSKFGKDIAVYTGDLLFTVFFDLILESMADTPFMRINAKSMRKILMGELDQ MHLRYNQQQGIHHYLRAISGKTAELFKLASKEGAYFGGAEKEWRLAGHIGFNIGMTFQILDDILDYTADKKTFNKP VLEDLTQGVYSLPLLLAIEENPDIFKPILDKKTDMATEDMEKIAYLWSHRGVDKARHLARKFTEKAISDINKLPQN SAKKQLLQLTNYLLKRKI
252SeqID 345
MFKIPLFKELKTDQWVKPFFKQYKVSLVIALFLGFMTFFSASALMFNSGYLISKSASLPSNILLVYVPIVLTRAFGI
GRPVFRYIERLTSHNWVLRMTSQLRLKLYHSLESNAIFMKRDFRLGDVMGLLAEDINYLQNLYLRTIFPTIIAWLLY
SFIIIATGFFSLWFALMfflXYLA頂IFLFPLWSILANGARQTREKELKNMXTDLTDNVLGISDWIFSQRGQEYVAL
昍RSESELMAIQKKIRSFNNRRALIVELVFGFLAILVIIWASNQFIGHRGGEANWIAAFVLTVFPLSEAFAGLSMA
QETNKYSDSIHRLNELSETYFETTQNQLPNKPYDFSVKNLSFQYKPQEKWVLHffiDLDIKEGEKIAILGRSGSGKST
LASLLRGDLKASQGKITLGGADVSIVGDCISNYIGVIQQAPYLFNTTLLNNIRIGNQDASEEDVWKVLERVGLKEMV
TDLSDGLYIMVDEAGLRFSGGERHRIALARILLKDVPIVILDEPTVGLDPITEQALLRVFMKELEGKTLVWITHM
GIEHADRILFIENGQLELEGSPQELSQSSQRYRQLKAADDGDL
SeqID 346
MKKLITEKKVNNVSTVNYLKLGLVSAMFAGGAFVALGSTQGVSASTFTAPQATHPKAERaTDSEIYERAQKQVLPK YIQGSLSGILNQHSTLYKQQNAAVTPQVSSPKAERQLTDSEIYERAQKQVLPKYIQGSLSGILNQHSTLNA SeqID 347
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MKINQMKKDELFEGFYLIKKAEVRKTRAGKDFIAFTFRDDTGEISGNMWDAQTYNVEEFVAGKIVHMKGRREVYNGT
PQVNQITLRNIKDGEPNDPRDFKEKPPINVDNVREYME冒 KIENATWQRWRALYRKYNKEFFTYPAAKTNHHAF
ESGLAYHTATMVRLADSIGDIYPELNKSLMFAGIMJiDLAKVIELSGPDNTEYTIRGNLIGHISLIDEELTKILAEL
NIDDTKEEVTVLRHVILSHHGQLEYGSPVRPRIMEAEIIHMIDNIDANMMMMTTALNRVNEGEMTNRIFAMDNRSFY
KPNIK
SeqID 349
1VDKKWRFEDSASYFACPKCQNPLIKESNSLKCSDNHCFDLSKFGYVNLLGGKKIDEHYDKKSFENRQLVLENGYY
NHILEAESKVLENNSQFHSVLDIGOGEGFYSRQLVNKYEKTFLAFDISKDSIQLAAKSDQSRLVKWFVSDLANLPIQ
DSSIDIILDIFSPANYKEFRRVLSDDGILVKWPVAEHVQELREKASQYLKQKDYSNQKILDHFRKEFEIISEQKW
QSYNCSQQERQAFIDMTPLLFSVDKTTIDWASISEITVGALIVIGKKRSVSK
SeqID 350
MCLICQRIEMIERNENPYFVKEYETGYLVLGDHQYFQGYCLFLSKKHVTELHELPRD_YLSEMADASEIVAKAF RADKMNIESLGNGDAMiFfflPPRKTGDLRNYGHNGKGPVWWYPFEKMYADSVRATGAEIEKLKEKLLDVLG SeqID 351
MFSDLRKKFVFLIMSILIWVLFLFAVSNRYNQYWDEYDAYRIVKLVAKNDYLGIPGDEPIALVTIDNQKMVKIQSN
NTDLTNDVIEKSSLKLLEQGKKSRKWKSFIYSIKEYKDKTYTIAIMDLASYEVPYARRFLILVFTIFGFCLLAAVSL
YLSRFIVGPVETEMTREKQFVSDASHELKTPIMIRANVQVLEQQIPGNRYLDHWSETKRMEFLIEDLLNLSRLDE
KRSKWKKLNLSVLCQEVLLTYESLAYEEEKCLNDTIEDDVWIVGEESQIKQILIILLDNAIRHSLSKSEIQFSLK
QARRKAILTISNPSAIYSKEVMDNLFERFYQAKDDHADSLSFGLGLSIAKAIVERHKGRIRAYQEKDQLRLEVQLPI
DGFWTNIMIN
SeqID 352
LIILDKKSYDLLFYLLKLEEPETVMAIANALNQSRRKVYYMKINDALPSDVPQIVSYPRVGILLTEKQKMCRLLLDEVTDYSYVMKSSERLQLSLVSIWAKDRITIDRLMaNDVSRNTILNDLNELRSELAEKEYNLaQSTKCRGYFL
DGHPLSIIQYLYKLLDDIYHNGSSSFIDLFNHKLSQAFGASTYFSKEVLDYFHHYLFISQRSLGKKINSQDGQFMIQ
ILPFILMAYRKMRLSPEVQTSLNSDFSLWQRKEYEIAKELADELEENFQLSLDEIEVGLVAfflmSFRKDRDNM
SQDYDDMRATLTSFLKELEERYMJFVHKKDLLRQLLTHCKALLYRIRYGIFSVNPLTEHIKDKYEELFAITSSSVK
LLEKAWQIKLTDDDVAYLTIiGGELRNSQQSPNKLKLVIVSDEGIAIQKLLLKQCQRYLTNSDIEAVFTTEQYQSV
SDLMHVDMWSTSDALESRFP1WHPVLTDDDIIRLIRFSKKGNCANSNQFTNELEKTIAQYVKEDSERYVLKSKI
EKLIHQELLQDVLPLQSTVC
SeqID 353
MKYFLDTADVSEIRRLNRLGIVDGVTTNPTIISREGRDFKEVINEICQIVDGPVSAEVTGLTCDEMVTEAREIAKWS PNVmiPMTEEGUAVSQLSKEGIKTMTLIFTVAQGLSAMMGATFISPFVGRLEDIGTDAYALIRDLRHIIDFY GFQSEIIMSIRGLAHVEGVAKOGAHIATIPDKTFASLFTHPLTDKGIETFLKDWDSFKKK SeqID 354
MSHYSIKLQEVFRLAQFQMRYESHYLESWMiXAMVLVHDSVAGLTFAEYESEVAIEEYEMTILALGRAPKEEIT
NYQFLEQSPALKKILKLAENISIWGAEDVGTEHVLimVNKDLLATRILELVGFRGQDDGESVRMVDLRKALERH
AGFTKDDIKAIYELRNPKKAKSGASFSDMMKPPSTAGDLADFTRDLSQMAVDGEIEPVIGRDKEISRMVQVLSRKTK
NNPVLVGDAGVGKTAUYGLAQRIANGNIPYELRDMRVLELDMMSWAGTRFRGDFEERMNQIIADIEEDGHIILFI
DELHnMGSGSGIDSTLDMNILKPALARGTLRTVGATTQEEYQKHIEKDMLSRRFAKVLVEEPNLEDAYEILLGL
KPAYEAFHNVTISDEAVMTAVKVAHRYLTSKNLPDSAIDLLDEASATVQMMIKKNAPSLLTEVDQAILDDDMKSASK
ALKASYKGKKRKPIAVTEDHIMATLSRLSGIPVEKLT_SKKYLNLEKELHKRVIGQDDAVTAISRAI_SGIR
TGKRPIGSFMFLGPTGVGKTELAKALAEVLFDDESALIRFDMSEYMEKFMS腳 GAPPGYVGYDEGGELTEKVRNK
PYSVLLFDEVEKAHPDIFNVLLQVLDDGVLTDSRGRKVDFSNTIIIMTSNLGATALRDDKTVGFGAKDISHDYTAMQ
KRIMEELKKAYRPEFINRIDEKWFHSLSQDNMREWKIMVKPLILALKDKGMDLKFQPSAimAEDGYDIEMGAR
PLRRTIQTQVEDffi,SELLLANQVKEGQVIKIGVSKGKLKFDIAKS
SeqID 355
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SGLPMGHEFTSFILALLQVSGRAPKVDEDIIKRIKGIEKTINLETYVSLTCHNCPDWQAFNIMAVLNPNITfflMIE
GGMYQDEVKSKGIMSVPTVYKDQEEFTSGRATIEQLLEQLDGPLDAEAFADKGVYDVLVIGGGPAGNSMIYMRKG
LKTGILAETFGGQVIETVGIENMIGTLYTEGPKLMAQIEEHTKSYDIDIIKSQLATGIEKKELVEVTLANGAILQAK
TAILALGAKWRNINVPGEEEFRNKGVTYCPHCDGPLFEGKDVAVIGGGNSGMEMLDLAGVTKHVTVLEFLPELKAD
QVLQERMKTDNLTILKNVATKDIVGEDHVTGLNYTDRDTNEEKHIDLEGVFVQIGLVPSTSWLKDSGIELNERQEI
WDKFGSTNIPGIFAAGDCTDAAYKQIIISMGSGATAAIGAFDYLIRQ
SeqID 356
MIKYQDDFYQAVNGEWAKTAVIPDDKPRTGGFSDLADDIEAimSTTDKWLADENKPSDTILNHFIAFHKMTADYQK REEVGVSPVLPLIEEmLQSFSEFASKVAEYELEGKPNEFPFGVAPDFMNAQLNVLWAEAPGIILPDTTYYSEDNE KGKELLAFWRKSQEDLLPLFGLSEQEIKDILDKVLALDAKLAQYVLSREESSEYVKLYHPYNWEDFTKLAPELPLDA IFQKILGQKPDKVIWEERFWTEFASDYYSESNWELLKADLILSAmYMYLTDDIRIKSGVYSRALSGTPQAMDK KKMYYLASGPYNQALGLWYAGEKFSPEAKADVEHKIATMIDVYKSRLEKADWLAQSTREKAIMKLNVITPHIGYPE KLPETYTKKIIDPKLSLVENATNLDKISIAYGWSKWNKPVDRSEWHMPAHMVNAYYDPQQNQIVFPMILQEPFYAL EQSSSANYGGIGAVIAHEISHAFDTNGASFDEHGSLNNWWTDEDFEAFKKLTDKWEQFDGLESYGAKVNGKLTVSE[5802]NVADLGGVACALEMQRESDFSARDFFINFATIWRMKARDEYM_SVDVHAPAQWRTNITVTNFEEFHKEFDVKDGDNMWRPVEKRVIIffSeqID 357MSKILFFGEPLIRITPKENDYFADSISTKLFYGGSEVNTARALQGFGQDTKLLSALPNNPIGNSFLQFLKAQGIDTHSIQWVGERVGLYFLEDSFACRKGEWYDRDHSSLHDFRINQIDFDQLFEGVSLFHFSGITLSLDESIQEITLLLLKEAKKREITISLDLNFRSKLISPKNAKILFSQFATFADICFGIEPLMVDSQDTTFF_EATIEDVKERMISLINHFDFQVIFHTKRLQDEWGRNHYQAYIANRKQEFVTSKEITTAVNQRIGSGDAFVAGALYQLLQHSDSKTVIDFAVASASLKCALEGDNMFETVTAVNKVLNQSKDIIRSeqID 358MKSRKKDKLVLRLTTTLLVFGLGGVWFYNYKNDNVEPTVTSASDQTTTFIQTISPTAIEISKTYDLYASVLLAQAILESSSGQSDLSKAPNYNLFGIKGEYKGKSVQMPTLEDDGKGNMTQIQAPFRAYPNYSASLYDYAELVSSQKYASVWKSNTSSYKDATAALTGLYATDTAYASKLNQIIETYSLDAYDKSeqID 359MADVKWNNEDSRGQKQDLKAKLFHIKIGSVPLPVYVCLALLILLAGFLQKLPVM^GGFAVILTMGWFLGTIGASIPGFKNFGGPAILSLLVPSILVFFNLINKNVLESTMOKQANFLYFYIACLVSGSILGMNRKfflJQGLLRMIFPMXGMVCAMMVGTFVGVILGLEWRHTLFYIVTPVUGGIGEGILPLSLGYSSITGVASEQLVAQLIPATIIGNFFAILCTALLNRLGEKKmSGQGQLVRLNKGEDMSDIIADHSGPIDVKKMGGGVLTACSLFIFGfflXQQLTGFPGPVLMIVMAILKYINVIPRETQNGAKQLYKFISGNFTFPLMAGLGLLYIPLKDWATLSIQYFIWISWFTVISVGFFVSRFLNMNPVEAGIISACQSGMGGTGDVAILSTADRMNLMPFAQVATRLGGAITVITMTAILRffl,FSeqID 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SeqID 448atgtctagttttaatagaaaaaaacttaagtttttgggtatatctttggcgactctaaca60[6469]gccaccacagttaccctggttgcctgtggtaatgagtcaaagaactctggagataataaa120[6470]gttattaattggtatattcctactgaaatcagtacattggacatttcaaagaatacagat180[6471]gcttattcaaacttagctataggtaattcaggcagcaatttacttagaattgataaagag240[6472]ggcaaaccaaaacccgatttagctaaaaaagtatccgtttcttctgatggtcttacttat300[6473]actgctacacttcgtgataatttaaaatggtcagatggaagcaaactaagcgctgaagat360[6474]tttgtttacacatggcggagaatagttgatcctaaaactgcatctgaatatgcttacttg420[6475]gcgacagaatcgcaccttttaaatgctgataagattaattctggagatattaaagattta480[6476]aataaacttggtgtaacagctaaaggcaatcaagtgacctttaaattgacaagtccatgc540[6477]cctcaatttaaatattatttagccttctctaattttatgcctcaaaaacaatcgtatgtt600[6478]gaaaaagttggtaaagattatggtacaacatcaaaaaatcaaatttactcaggtccttac660[6479]cttgttaaggattggaatggttcaaatggtaaatttaaattagtcaaaaataaatattat720[6480]tgggattctaaacatgttaaaacaaatagtgtcatagttcaaaaccagat780[6481]actgcagttcaaatgtacaagcaaggtcagattgattttgctgaaatatcaggaacttct840[6482]gctatttata accaaactggttcggttaaagcattgacaaatcagaaaattaggcaagct900[6483]ttgaatttagcgactgatcgtaaaggtgttgttaaagcggcagttgatacaggttcaact960[6484]cctgctgaatctctggtccc1333333/t t agccaaattacctaatggtgaggatctttcc1020[6485]aagtatactgccccaggttatacgtataatacaagtaaagctcaaaaactttttaaagaa1080[6486]ggtcttgctgaggttggtcagtcatctctcaagttaacaatcacagctgattcggactct1140[6487]ccagcagctaaaaatgctgttgactatgtgaaatctacatgggagagtgctttgcctggt1200[6488]ctaactgttgaagaaaaatttgttactttcaagcaacgccttgaagatgc aaaaaatgaa1260[6489]aattttgatgtcgtgctcttctcatggggaggagattatccagaaggatcaactttctat1320[6490]gggttattcacgactaattctgcgtataattatggtaaattttcttctaaagagtatgac1380[6491]aatgcctatcaaaaggcaattactactgacgccttgaaaccaggagatgccgctaatgat1440[6492]tacaaaactgctgaaaaagctttatttgatcaatcatattataacccagtttattaccta1500[6493]gggaaaaaaggactccaaaattctaaattaaaggggttggtaagaaattcaactggtttg1560[6494]aatgttgattttacttatgcttataagacagaataa1596
SeqID 449
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273[6543]MTIFDERELKERFTHENRVSFYEFVAKYDAQMVPVMKAKGYRCIHSMERTWFTFGEFTIRRRRWQKGEHWWPVDEKLGLKKNVRYSLEFMYQIASLAI1MPYEKVIKWQMMYCIVITKPTWKAVKISRELLKEKEAYRFFDEDIPVDKEPVDMIYLEGDGVMVKAREEGLDNRNVDLSHFWHTGSQKVGSNRFVLQNKKEFVSLDNROTRQKILDYLYNHFYIAPNTLLITNSDGGHGYTPYVFKEIAKALKVKQHEHFWDRYHVNEKIKSFFKLYPVELMTGAFQSIKQHDKEKLRTVLDTTEALILMEEEMEGFNQFKRKLLNFQYTKSAELRGFSRAGIGVMESQHRKITYRMMKKRGMYWTIQGAEIMSQLIVLSYEGQLRDIPFGSWREDYQKYQELENLSAGKIKHEQNKINKRYDLQTLGRLRYGRHRNLSeqID 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權利要求
一種編碼超免疫血清反應性抗原或其片段的分離的核酸分子,其包含選自如下的核酸序列a)與選自Seq ID No 14,90,157-216的核酸分子具有至少70%序列相同性的核酸分子,b)互補於a)的核酸分子的核酸分子,c)包含a)或b)的核酸分子至少15個連續鹼基的核酸分子,d)在嚴格雜交條件下退火於a)、b)或c)的核酸分子的核酸分子,e)雜交於a)、b)、c)或d)中定義的核酸分子之核酸分子的簡併性序列。
2.根據權利要求1的分離的核酸分子,其中序列相同性是至少80%,優選地至少95%, 尤其是100%。
3.一種編碼超免疫血清反應性抗原或其片段的分離的核酸分子,包含選自如下的核酸 序列a)與選自Seq ID No 1,3,5-13,15,18-25,27-31,33-36,39-68,70-85,92-100, 103-126,128-145,147,149-156,217,435-448 和 463-474 的核酸分子具有 96 % 或高於 96%,優選地至少98%,尤其是100%序列相同性的核酸分子,b)互補於a)的核酸分子的核酸分子,c)包含a)或b)的核酸分子至少15個連續鹼基的核酸分子,d)在嚴格雜交條件下退火於a)、b)或c)的核酸分子的核酸分子,e)雜交於a)、b)、c)或d)中定義的核酸分子之核酸分子的簡併性序列。
4.一種編碼超免疫血清反應性抗原或其片段的分離的核酸分子,包含選自如下的核酸序列a)與選自SeqID No 32,86,91,101,127的核酸分子有98%或高於98%,尤其是100% 序列相同性的核酸分子,b)互補於a)的核酸的核酸分子,c)雜交於a)、b)、c)或d)中定義的核酸分子之核酸分子的簡併性序列。
5.根據權利要求1、2、3或4中任何一個的核酸分子,其中所述核酸是DNA。
6.根據權利要求1、2、3、4或5中任何一個的核酸分子,其中所述核酸是RNA。
7.根據權利要求1至5中任何一個的分離的核酸分子,其中從基因組DNA尤其是無乳 鏈球菌(S. agalactiae)基因組DNA分離所述核酸分子。
8.一種包含根據權利要求1至7中任何一個的核酸分子的載體。
9.根據權利要求8的載體,其中所述載體經改造適於根據權利要求1至7中任何一個 的核酸分子編碼的超免疫血清反應性抗原或其片段的重組表達。
10.一種包含根據權利要求8或9的載體的宿主細胞。
11.包含根據權利要求1、2、5、6或7中任何一個的核酸分子編碼的胺基酸序列的超免 疫血清反應性抗原及其片段,優選地所述胺基酸序列選自Seq ID No 231,307,374-433。
12.包含根據權利要求3、5、6或7中任何一個的核酸分子編碼的胺基酸序列的超免疫 血清反應性抗原及其片段,優選地所述胺基酸序列選自Seq ID No 218,220,222-230,232, 235-242,244-248,250-253,256-285,287-302,309-317,320-343,345-362,364,366-373, 434,449-462 和 475-486。
13.包含根據權利要求4、5、6或7中任何一個的核酸分子編碼的胺基酸序列的超免疫 血清反應性抗原及其片段,優選地所述胺基酸序列選自Seq ID No 249,303,308,318,344。
14.超免疫血清反應性抗原的片段,其選自包含表IA「推定的免疫原性胺基酸」和「鑑 別的免疫原性區域的位置」縱欄的胺基酸序列的肽,尤其是包含如下胺基酸的肽Seq ID No 218 的 4-20,35-44,65-70,73-87,92-98,112-137,152-161,177-186,193-200, 206-213,229-255,282-294,308-313,320-326,349-355,373-384,388-406,420-425 和115-199;Seq ID No 219 的 5-24,35-41,44-70,73-89,103-109,12 7-143,155-161, 185-190,192-207,212-219,246-262,304-336,372-382,384-393, 398-407, 412-418, 438-444,1-75,76-161 和 164- 239 ;SeqID No 220 的 4-10,16-58,60-71,77-92,100-126, 132-146,149-164,166-172,190-209,214-220,223-229,241-256,297-312,314-319, 337-343,351-359,378-387,398-418,421-428,430-437,440-448,462-471,510-519, 525-536,552-559,561-568,573-582,596-602,608-630,637-649,651-665,681-702, 714-732,739-745,757-778,790-805,807-815,821-829,836-842,846-873,880-903, 908-914,916-923,931-940,943-948,956-970,975-986,996-1015,1031-1040,1051-1069, 1072-1095,1114-1119,1130-1148,1150-1157,1169-1176,1229-1238 和 802-812 ;Seq ID No 221 的 5-12,14-26,35-47,52-67,72-78,83-98,121-141,152-159,163-183,186-207, 209-257,264-277,282-299,301-309,312-318,324-339,358-368,372-378,387-397, 425-431 和 46-291 ;Seq ID No 222 的 29-38,44-64,70-76,78-87,94-100,102-112, 119-134,140-149,163-173,178-186,188-194,207-234,247-262,269-290 和 73-92 ;Seq ID No 223 的 10-28,36-63,77-87,103-119,127-136,141-169,171-183,195-200,207-232, 236-246,251-265,268-283,287-297,314-322,335-343,354-363,384-390,405-411, 419-436,443-455,467-473,480-513,518-529,550-557,565-585,602-608,616-625, 632-660, 665-677, 685-701, 726-736, 738-747, 752-761, 785-796, 80卜813,838-853, 866-871 和 757-774 ;Seq ID No 224 的 31-38,61-66,74-81,90-115,123-145,154-167, 169-179,182-193,200-206,238-244,267-272 和 235-251 ;Seq ID No225 的 19-25,38-54, 56-64,66-72,74-92,94-100,116-129,143-149,156-183,204-232,253-266,269-275, 294-307 和 241-313 ;Seq ID No226 的 5-34,50-56,60-65,74-85,89-97,108-119,159-165, 181-199,209-225,230-240,245-251,257-262,274-282,300-305 和 64-75 ;Seq ID No 227 的 5-13,16-21,27-42,45-52,58-66,74-87,108-114,119-131 和 39-51 ;Seq ID No 228 的 6-23,46-54,59-65,78-84,100-120,128-133,140-146,159-165,171-183, 190-204, 224-232,240-248,250-259,274-280,288-296,306-315 和 267-274 ;Seq ID No 229 的 5-12,15-24,26-36,42-65,68-80,82-104,111-116,125-144,159-167,184-189,209-218, 235-243,254-265,269-283,287-300,306-316,318-336,338-352,374-392 和 162-174 ;Seq ID No 230 的 30-42,45-54 和 25-37 ;Seq ID No 231 的 10-30,53-59,86-95,116-130, 132-147,169-189,195-201,212-221,247-256,258-265,278-283,291-298,310-316, 329-339,341-352,360-367,388-396,398-411,416-432,443-452, 460-466, 506-512, 515-521,542-548 和 419-431 ;Seq ID No 232 的 4-27,30-53,60-67,70-90,92-151, 159-185,189-195,198-210,215-239 和 173-189 ;Seq ID No 233 的 4-26,41-54,71-78,116-127,140-149,151-158,161-175,190-196,201-208,220-226,240-252,266-281,298-305,308-318,321-329,344-353,372-378,384-405,418-426,429-442,457-463, 494-505,514-522 和 174-188 ;Seq ID No 234 的 17-25,27-39,61-67,81-89,99-110, 120-131,133-139,147-161,167-172,179-185,192-198,203-213,226-238,243-258, 261-267,284-290,296-307,311-328,340-352,356-371 和 239-256 ;Seq ID No 235 的 8-30,40-49,67-80,114-123,126-142,152-162,188-194 和 57-70 ;Seq ID No 236 的 4-23, 28-34,36-47,50-61,76-81,89-94,96-104,112-119,126-146,155-181,195-200,208-214, 220-229,244-260,263-276,282-288,292-300,317-323,336-351,353-359,363-375, 382-399, 415-432,444-455,458-471,476-481,484-492,499-517,522-529,535-541, 543-568,572-584,586-600,607-617,626-637,656-675 和 282-297 ;Seq ID No 237 的 6-24,30-35,38-45,63-91,134-140,146-160,167-188,214-220,226-234,244-250, 260-270,286-301,316-329,340-371,429-446,448-459,474-481,485-491,512-526, 537-544,550-565,573-583,596-613,621-630,652-658 和 87-97 ;Seq ID No238 的 8-20, 26-48,56-67,76-86,94-109,115-121,123-129,143-160,178-186,191-198,201-208,221-236,238-244,260-268和 237-247 ;Seq ID No 239 的 4-40,42-57,73-87,98-117, 126-135,150-156,166-174,196-217,231-236,248-258,276-284,293-301,307-313, 339-347,359-365,375-387,395-402,428-440,445-456,485-490,497-505,535-541, 547-555,610-625,648-656,665-671 和 448-528 ;Seq ID No 240 的 10-18,39-45,51-61, 80-96,98-106,110-115,158-172,174-183,191-200,220-237,249-255,274-289,308-324, 331-341,372-381,384-397,405-414 和 322-338 ;Seq IDNo 241 的 30-36,38-56,85-108, 134-147,149-160,163-183,188-201,206-211,219-238,247-254 和 5-13 ;Seq ID No 242 的 11-40,98-103,110-115,133-145,151-159,172-179,192-201,204-212,222-228, 235-245,258-268,283-296,298-309,322-329,342-351,354-362,372-378,385-393, 407-418,495-516 和 1-148 ;Seq ID No243 的 5-19,21-36,73-94,112-119,122-137, 139-145,152-167,184-190,198-204,208-224,249-265,267-281,299-304,309-317, 326-333,356-364,368-374,381-389,391-414,419-425,430-435 和 113-140 ;Seq ID No 244 的 45-54,59-67,78-91 和 15-23 ;Seq IDNo 245 的 11-22,33-47,52-80,88-112, 124-129 和 6-25 ;Seq ID No246 的 26-41,51-63,80-89,93-115,150-163,187-193, 220-237, 240-249,286-294,296-306,316-329,345-353,361-370,407-425,428-437, 474-482,484-494,504-517,533-541,549-558,595-613,616-625,660-668,673-685, 711-726,736-744,749-761,787-802,812-820,825-837,863-878,888-896,901-913, 939-954,964-972,977-989,1003-1008,1016-1022,1028-1034,1041-1053,1059-1074, 1101-1122,420-511 和 581-704 ;Seq ID No 247 的 18-25,27-55,71-83,89-95,102-113, 120-146,150-156,174-185 和 159-175 ;SeqID No 248 的 24-30,38-56,63-68,87-93, 136-142,153-164,183-199,213-219,226-234,244-261,269-278,283-289,291-297, 320-328,330-336,340-346,348-356,358-366,382-387,401-408,414-419,449-455, 468-491,504-512,531-537,554-560,597-608,621-627,632-643,650-662,667-692, 703-716,724-737,743-758,783-794,800-818,846-856 和 806-884 ;Seq ID No 249 的 4-14,21-39,86-92,99-107,121-131,136-144,147-154,158-166,176-185,193-199, 207-222,224-230和117-136 ;Seq ID No 250 的65-76,85-97,103-109,115-121,125-146,163-169,196-205,212-219,228-237,241-247,254-262,269-288,294-303,305-313, 328-367, 395-401,405-412,418-429,437-447,481-488,506-513,519-524,530-541, 546-557 和 266-284 ;Seq ID No 251 的 5-14,37-42,49-71,78-92,97-112,127-136, 147-154,156-163,186-198,216-225,233-243,248-253,295-307,323-332,359-366, 368-374,380-398 和 194-223 ;Seq ID No 252 的 4-11,33-39,45-72,100-113,119-129, 136-144,169-175,177-185,200 - 2 0 8,210-219,262-276,278-297,320-326,336-344, 347-362,381-394,443-453 和 438-454 ;Seq ID No 253 的 4-29,31-52,55-61,95-110, 138-158,162-171,179-187,202-229,239-248,251-256,262-267,269-285,304-310, 351-360,362-368,381-388,415-428,435-440,448-458 和 161-178 ;Seq ID No 254 的 4-17,19-28, 32-43,47-59,89-110,112-126,128-134,140-148,152-161,169-184, 191-204,230-235,255-264,328-338,341-347,401-409,413-419,433-441,449-458, 463-468,476-482,486-492,500-506,529-545 和 305-381 ;Seq ID No 255 的 10-29,38-45, 53-61,134-145,152-160,163-170,202-208,219-229,248-258,266-275,282-288, 315-320,328-334,377-385,392-402,418-424,447-453,460-471,479-487,491-497, 500-507,531-537,581-594,615-623,629-635,644-652,659-666,668-678,710-717, 719-728,736-741,747-760,766-773,784-789,794-800,805-817,855-861,866-887 和 698-715 ;Seq ID No 256 的 16-26,29-37,44-58,62-68,74-80,88-95,97-120,125-144, 165-196 和 58-72 ;Seq ID No 257 的 14-21,23-46,49-60,63-74,78-92,96-103,117-129, 134-161,169-211,217-231,239-248,252-281,292-299,313-343 和 243-257 ;Seq ID No 258 的 11-27,46-52,67-72,76-84,91-112,116-153,160-175,187-196,202-211,213-220 ^P 43-76 ;Seq ID No 259 的 5-29,37-56,78-86,108-118,152-161 和 120-130 ;Seq ID No 260 的 8-14,19-41,52-66,75-82,87-92,106-121,127-133,136-143,158-175,180-187, 196-204,221-228,239-245,259-265,291-306,318-323,328-340,352-358,361-368, 375-381,391-399,411-418,431-442,446-455,484-496,498-510,527-533,541-549, 558-565,575-585,587-594,644-655,661-668,671-677 和 184-196 ;Seq IDNo 261 的 4-22, 29-38,55-62,75-81,102-107,110-134,143-150,161-167,172-179,191-215,223-233, 241-247,251-264,266-272,288-309,340-352,354-366,394-402,414-438 和 198-218 ;Seq IDNo 262 的 24-44,49-70,80-91,105-118,128-136,140-154 和 77-92 ;Seq ID No 263 的5-22,31-36,41-47,67-74,83-90,105-122,135-143,160-167和 118-129 ;Seq ID No 264 的 4-25,33-73,81-93,96-106,114-120,122-128,130-172,179-208,210-241,251-283, 296-301 和 92-100 ;Seq ID No 265 的 14-24,29-38,43-50,52-72,86-97,101-107, 110-125,127-141,145-157,168-175,177-184,186-195,205-226,238-250,255-261, 284-290,293-304,307-314,316-323,325-356,363-371,383-390,405-415,423-432, 442-454,466-485,502-511,519-527,535-556,558-565,569-574,612-634,641-655, 672-686, 698-709, 715-722,724-732,743-753,760-769,783-792,818-825,830-839, 842-849,884-896,905-918,926-940,957-969,979-1007,1015-1021,1049-1057 禾P 336-349 ;Seq ID No 266 的 6-16,26-31,33-39,62-73,75-85,87-100,113-123,127-152, 157-164,168-181,191-198,208-214,219-226,233-254,259-266,286-329 和 181-195 ;Seq ID No 267 的 4-13,32-39,53-76,99-108,110-116,124-135,137-146,149-157,162-174,182-190,207-231,242-253,255-264,274-283,291-323,334-345,351-360,375-388,418-425,456-474,486-492,508-517,520-536,547-560,562-577,31-45和 419-443 ;Seq ID No 268 的 15-26,30-37,42-49,58-90,93-99,128-134,147-154,174-179,190-197, 199-205,221-230,262-274,277-287,300-314,327-333,343-351,359-377, 388-396, 408-413,416-425,431-446 和 246-256 ;Seq ID No 269 的 5-26,34-42,47-54,61-67, 71-104,107-115,131-138,144-153,157-189,196-202,204-210,228-245,288-309, 316-329,332-341,379-386,393-399,404-412,414-421,457-468,483-489,500-506, 508-517,523-534,543-557,565-580,587-605,609-617,619-627,631-636,640-646, 662-668,675-682,705-710,716-723,727-732,750-758,784-789,795-809,869-874, 14-138,166-286,372-503,674-696 和 754-859 ;Seq ID No 270 的 5-17,32-38,40-47, 80-89,113-119,125-137,140-154,157-163,170-177,185-199,213-225,228-236, 242-248,277-290,292-305,323-333,347-353,364-370,385-394,399-406,423-433, 441-451,462-474,477-487 和 116-124 ;Seq ID No 271 的 7-16,18-30,32-49,53-61, 63-85,95-101,105-115,119-134,143-150,159-178,185-202,212-229,236-250,254-265, 268-294 和 63-72 ;Seq ID No 272 的 4-12,19-47,73-81,97-103,153-169,188-198, 207-213,217-223,236-242,255-265,270-278,298-305,309-317,335-347,354-363, 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16-22,36-46,61-75,92-107,113-121,139-145,148-160 和 30-42 ;Seq ID No 286 的 4-12, 20-26,43-49,55-62,66-78,121-127,135-141,146-161,164-170,178-189,196-205, 233-238,269-279,288-318,325-332,381-386,400-407 和 328-346 ;Seq ID No 287 的 5-12,31-49,57-63,69-79,89-97,99-114,116-127,134-142,147-154,160-173,185-193, 199-204,211-222,229-236,243-249,256-274 和 58-68 ;Seq ID No288 的 10-20,28-34, 39-53,68-79,84-90,99-106 和 73-79 ;SeqID No 289 的 14-37,45-50,61-66,77-82,93-98, 109-114,125-130,141-146,157-162,173-178,189-194,205-210,221-226,237-242, 253-258,269-274,285-290,301-306,316-332,349-359,371-378,385-406,34-307 和 312-385 ;Seq ID No 290 的 4-10,17-38,50-85,93-99,109-116,128-185,189-197, 199-210,223-256,263-287,289-312,327-337,371-386,389-394,406-419,424-432, 438-450,458-463,475-502,507-513,519-526,535-542,550-567 和 361-376 ;Seq ID No 291 的 10-39,42-93,100-144,155-176,178-224,230-244,246-255,273-282,292-301, 308-325,332-351,356-361,368-379,386-393,400-421 和 138-155 ;Seq ID No 292 的 5-11,17-34,40-45,50-55,72-80,101-123,145-151,164-172,182-187,189-195,208-218, 220-241,243-252,255-270,325-331,365-371,391-398,402-418,422-428,430-435, 443-452,463-469,476-484,486-494,503-509,529-553,560-565,570-590,608-614, 619-627,654-661,744-750,772-780,784-790,806-816,836-853,876-885,912-918, 926-933,961-975,980-987,996-1006,1016-1028,1043-1053,1057-1062,994-1003 和 1033-1056 ;Seq ID No 293 的 17-45,64-71,73-81,99-109,186-192,223-238,262-275, 283-295,336-346,350-363,375-385,410-421,425-43 1,441-448,454-463,468-474, 476-512,523-537,539-552,568-583,599-608,612-620,628-641,644-654,656-662, 670-681,685-695,702-708,716-723,725-735,757-764,769-798,800-806,808-816, 826-840,846-854,856-862,874-881,885-902,907-928,274-350 和 443-513 ;Seq ID No,294 的 4-22,29-41,45-51,53-61,70-76,85-92,99-104,111-122,134-140,142-154, 163-174,224-232,255-265,273-279,283-297,330-335,337-,,348,356-367,373-385, 391-396,421-431,442-455,475-485,493-505,526-538,544-561,587-599,605-620, 622-651,662-670,675-681,687-692,697-,,,,712,714-735 和 252-262 ;Seq ID No 295 的 4-12,15-35,40-46,50-59,67-94,110-128,143-169,182-188,207-215,218-228,238-250 和 74-90 ;Seq ID No 296 的 9-18,42-58,78-85,88-95,97-106,115-122,128-134, 140-145,154-181,186-202,204-223,261-267,269-278,284-293,300-,,,336,358-368 和 12-29 ;Seq ID No 297 的 7-34,46-53,62-72,82-88,100-105,111-117,132-137,144-160, 166-180,183-189,209-221,231-236,,246-253,268-282,286-,,293,323-336,364-372, 378-392,422-433 和 388-405 ;Seq ID No 298 的 21-27,34-50,72-77,80-95,164-177, 192-,198,202-220,226-236,239-247,,270-279,285-292,315-320,327-334,348-355, 364-371,388-397,453-476,488-497,534-545,556-576,582-588,601-,,607,609-616, 642-662,674-681,687-,697,709-715,721-727,741-755 和 621-739 ;Seq ID No 299 的 4 -14,16-77,79-109 和 25-99 ;Seq ID No 300 的 4-9,17-23,30-37,44-55,65-72,77-93, 102-121,123-132,146-153 和 17-29 ;Seq ID No 301 的 4-18,25-41,52-60,83-92, 104-112,117-,,,123,149-155,159-167,170-192,201-210,220-,227,245-250 和 124-137 ;Seq ID No 302 的 8-25,50-55,89-95,138-143,148-153,159-169,173-179,223-238,262-268, 288-295,297-308,325-,,335,403-409,411-417,432-446,463-475,492-501,524-530, 542-548,561-574,576-593,604-609,612-,,622,637-654,665-672,678-685,720-725, 731-739,762-,767,777-783,820-838,851-865,901-908,913-920,958-970,1000-1006, 1009-1015,1020-,,1026,1043-1052,1055-1061,1-128,252-341,771-793 和 1043-1058 ;Seq ID No 303 的 16-26,33-46 和 64-76 ;Seq ID No 304 的 4-27,69-77,79-101,117-123, 126-142,155-161,171-186,200-206,213-,,231,233-244,267-273,313-329,335-344, 347-370,374-379,399-408,422-443,445-453,461-468,476-482,518-534,544-553, 556-567,578-595,601-620,626-,636,646-658,666-681,715-721,762-768,778-785, 789-803,809-819,22-108,153-318,391-527 和 638-757 ;Seq ID No 305 的 6-21,32-43, 62-92,104-,123,135-141,145-152,199-216,218-226,237-247,260-269,274-283, 297-303,1-72 和 127-,,,211 ;Seq ID No 306 的 6-26,50-56,83-89,108-114,123-131, 172-,181,194-200,221-238,241-247,251-259,263-271,284-292,304-319,321-,,,335, 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1100-1129,1144-1161,1169-1175,1178-1189,1192-1198,1201-1207,1211-1221, 1229-1239,1250-1270,1278-1292,1294-1300,1314-1335,1344-1352,1360-1374, 1394-1405,1407-1414,1416-1424,1432-1452,1456-1462,1474-1497,1500-1510, 1516-1522,1534-1542,1550-1559,1584-1603,1608-1627,187-273 和 306-441 ;Seq ID No 312 的 70-80,90-97,118-125,128-140,142-148,154-162,189-202,214-222,224-232, 254-260,275-313,317-332,355-360,392-398,425-432,448-456,464-470,476-482, 49卜505,521-528,533-546,560-567,592-597,605-614,618-626, 637-644, 646-653, 660-666,677-691 和 207-227 ;Seq ID No 313 的 5-19,26-34,37-55,57-66,69-83,86-102, 115-134,138-143,154-172,178-195,209-246,251-257,290-302,306-311 和 256-266 ;Seq IDNo 314 的 10-20,22-28,35-57,72-79,87-103,108-128,130-144,158-171,190-198, 225-242,274-291,301-315,317-324,374-385 和 353-365 ;Seq ID No 315 的 4-9,17-30, 34-54,59-66,73-94,118-130,135-150,158-171,189-198,219-239,269-275,283-301, 89-106 和 176-193 ;Seq ID No 316 的 14-20,22-74,77-86,89-99,104-109,126-135, 154-165,181-195,197-212,216-224,264-275 和 107-118 ;Seq ID No 317 的 4-18,21-38, 63-72,101-109,156-162,165-179,183-192,195-210,212-218,230-239,241-256, 278-290,299-311,313-322,332-341,348-366,386-401,420-426,435-450,455-460, 468-479, 491-498,510-518,532-538,545-552,557-563,567-573,586-595,599-609, 620-626,628-636,652-657,665-681 和 1-198 ;Seq ID No 318 的 4-10,16-38,51-68, 73-79,94-115,120-125,132-178,201-208,216-223,238-266,269-295,297-304,337-342, 347-356,374-401,403-422,440-447,478-504,510-516,519-530,537-544 和 191-206 ;Seq ID No 319 的 12-40,42-48,66-71,77-86,95-102,113-120,129-137,141-148,155-174, 208-214,218-225,234-240,256-267,275-283,300-306,313-321,343-350,359-367, 370-383,398-405,432-439,443-461,492-508,516-526,528-535 和 370-478 ;Seq ID No,320 的 6-14,20-37,56-62,90-95,97-113,118-125,140-145,161-170,183-202,237-244, 275-284,286-305,309-316,333-359,373-401,405-412 和 176-187 ;Seq ID No 321 的 33-44,50-55,59-80,86-101,129-139,147-153,157-163,171-176,189-201,203-224, 239-245,257-262,281-287,290-297,304-,,320,322-331,334-350,372-390,396-401,71-88 和 353-372 ;Seq ID No322 的 5-11,15-24,26-33,40-47,75-88,95-103,105-112和 17-30 ; Seq ID No 323 的 5-11,16-39,46-54,62-82,100-107,111-124,126-150,154-165,167-183,204-238,245-295,301-313,316-335和 8-16 ;Seq ID No 324 的 4-19,34-48, 69-74,79-107,115-127,129-135,143-153,160-169,171-,182 和 142-153 ;Seq ID No 325 的 4-30,65-74,82-106,110-120,124-132,135-140,146-175,179-184,190-196,217-223, 228-233,250-267,275-,,,292,303-315,322-332 和 174-186 ;Seq ID No 326 的 9-16,29-41, 47-57,68-84,87-109,113-119,162-180,186-193,195-201,203-208,218-230,,234-243, 265-271,281-292,305-312,323-332,341-347,349-363,368-374,383-390,396-410, 434-440,446-452,455-464,466-473,515-522,529-542,565-570,589-600,602-613, 618-623,637-644,1019-1027,1238-1244,1258-1264,1268-1276,1281-1292,1296-1302 和 883-936 ;Seq ID No 327 的 10-,,17,23-32,39-44,54-72,75-81,88-111,138-154,160-167, 178-185,201-210,236-252,327-334,336-342,366-376,388-400,410-430,472-482, 493-,,,526,552-558,586-592,598-603,612-621,630-635,641-660 和 384-393 ;Seq ID No 328 的 4 -22,24-39,50-59,73-84,100-105,111-117,130-,,138,155-161,173-178,182-189, 205-215,266-284,308-313,321-328,330-337,346-363,368-374,388-395,397-405, 426-434, 453-459,482-492,501-,,,507,509-515,518-523,527-544,559-590,598-612, 614-629,646-659,663-684,686-694,698-721 和 445-461 ;Seq ID No 329 的 14-22,27-33 和 3-17 ;Seq ID No 330 的 29-41,66-73,81-87,90-108,140-146,150-159,165-184, 186-196,216-226,230-238,247-253,261-269 和 126-140 ;Seq ID No 331 的 5-12,16-25, 27-33,36-45,60-68,83-88,103-126 和 86-101 ;Seq ID No 332 的 14-23,36-47,56-66, 84-89,94-105,111-127,140-153,160-,,,174,176-183,189-203,219-225,231-237,250-257 和 194-227 ;Seq ID No 333 的 4-25,54-60,64-71,73-82,89-106,117-124,157-169, 183-,,,188,199-210,221-232,236-244,255-264 和 58-98 ;Seq ID No 334 的 13-19,26-36,41-53,55-71,77-84,86-108,114-135,157-172,177-183,187-194,208-213,218-226, 110-125 和 156-170 ;Seq ID No 335 的 5-24,63-69,77-85,94-,,,112,120-137,140-146, 152-159,166-172,179-187,193-199,206-212,222-228,234-240,244-252,257-264, 270-289,298-309,316-328,337-,,,348,363-375,1-56 和 340-352 ;Seq ID No 336 的 18-39,42-71,78-120,124-144,152-173,179-189,199-209,213-222,228-258,269-304,329-361, 364-372,374-389,396-441 和 313-327 ;Seq ID No 337 的 19-,25,91-98,108-120,156-162,168-174,191-204,211-216,232-266,272-278,286-308,316-321,327-333,344-355, 358-364,384-391,395-428,464-476,487-495,497-511,544-561,563-,,573,575-582, 588-594,10-25 和 322-338 ;Seq ID No 338 的 14-26,32-49,51-57,59-72,80-91,102-112, 119-125,147-161,164-173,175-183,188-,213,217-222,246-254,260-276,282-303, 308-318,321-328,333-350,352-359,371-378,392-401,407-414,416-443,448-463, 471-484,4 9 0 -,,,497,501-514,519-527,539-551,557-570,578-590,592-598,600-610,618-629,633-647,654-667,676-689,702-709,718-726,728-737,741-760,764-780, 786-795,808-826,836-842,845-852,865-874,881-887,931-945,949-957,968-974, 979-986,1003-1009,1023-1029 和 90-103 ;Seq ID No 339 的 11-16,37-56,60-66,69-77, 80-88,93-106,117-139,166-171 和 72-90 ;Seq ID No 340 的 59-84,123-133,145-150, 161-167,178-189 和 115-128 ;Seq ID No 341 的 15-33,39-46,52-64,74-87,108-124, 127-144,150-156,173-179,184-194,201-208,219-236,243-269,272-295,302-309, 343-349,356-361,370-379,405-411,414-423,430-451,457-464,466-475,477-483, 496-502,507-522,541-548,557-563,571-577,579-585,590-605,626-642,650-662, 671-691,704-710,751-769,775-781,786-791,794-829,851-858,868-878,884-904, 913-919,931-939 和 132-142 ;Seq ID No 342 的 33-58,64-71,74-80,83-88,96-120, 122-139,146-157,167-177,207-213,220-225,236-242,264-279,300-305,326-336, 340-347,350-360,97-115 和 199-211 ;Seq ID No343 的 4-26,43-57,70-99,102-117, 121-133,142-148,151-168,170-183,192-220,235-249,258-279 和 30-41 ;Seq ID No 344 的 34-42,48-58,70-94,110-130,154-160,164-172,178-183,195-203,211-222,229-250, 256-261,274-284,286-292,312-323 和 222-233 ;Seq ID No 345 的 4-9,15-36,38-45, 49-74,78-88,100-112,136-191,211-220,226-23 3,239-246,254-274,287-307,316-322, 342-353,356-366,373-378,384-393,405-431,449-457,459-468,487-511,515-524, 529-541,544-552,562-568,571-576 和 208-280 ;Seq IDNo 346 的 10-27,31-37,39-54,71-108,124-143和 2-107 ;Seq IDNo 347 的 16-27,38-57,64-70,90-102,104-113, 116-137,160-166 和 1-80 ;Seq ID No 348 的 13-21,31-36,56-67,127-136,153-171, 173-180,184-200,214-222,225-231,239-263,267-273 和 135-159 ;Seq ID No 349 的 12-27,31-51,68-74,77-87,94-101,108-114,117-123,127-134,138-168,173-196, 201-207,212-217,227-237,247-257,264-280 和 205-223 ;Seq ID No 350 的 17-22,25-54, 70-76,92-100 和 98-110 ;Seq ID No 351 的 7-29,40-50,60-67,87-96,105-111,119-164, 172-199,206-212,220-227,237-259,272-279,282-293,295-309,313-319,321-328, 345-363,376-386 和 159-176 ;Seq ID No 352 的 4-19,24-30,36-43,50-68,71-89,93-106, 141-152,154-172,179-197,199-215,229-239,246-252,255-263,281-298,319-325, 329-356,358-368,374-390,397-409,420-429,432-444,450-456,459-475,483-494, 496-502,520-528,532-556 和 362-377 ;Seq ID No 353 的 18-25,40-62,77-85,91-97, 105-116,123-133,139-184,189-197 和 122-140 ;Seq ID No 354 的 4-49,52-58,62-70, 79-105,109-133,142-150,163-168,206-214,220-228,233-240, 243-254, 274-281, 303-311,327-338,357-373,378-396,403-413,420-436,441-453,461-467,475-481, 484-498,506-512,514-521,523-529,562-579,589-595,598-603, 615-648, 714-722, 728-742,749-758,777-792,795-807 和 643-658 ;Seq IDNo 355 的 8-27,37-48,51-56,72-79,87-106,120-138,140-147,167-176,187-197,205-216,222-229,234-239,243-249, 277-288,292-315,334-343,347-353,363-391,398-404,430-447,461-467,478-492, 498-507 和 456-470 ;Seq ID No 356 的 5-12,18-24,59-69,80-93,95-109,119-125, 130-137,139-147,158—163,168-176,182—202,206—215,222—239,241—249,267—277, 29卜298,311-318,321-327,338-344,348-355,373-386,393-406,411-417,434-443,446-465,473-484,514-521,532-553,584-594 和 221-237 ;Seq IDNo 357 的4-14,27-34, 50-58,63-72,79-106,109-114,121-142,146-154,161-167,169-175,178-201,223-238, 249-254,259-264,278-292,294-312,319-330 和 167-191 ;Seq ID No 358 的 7-28,36-42, 50-61,63-80,122-152,161-174,176-191 和 140-190 ;SeqID No 359 的 20-57,59-65, 70-78,86-102,119-133,142-161,163-173,177-188,192-202,204-220,222-236,240-253, 279-319,326-331,337-383,390-399,406-412,420-427,431-438 和 381-395 ;Seq ID No 360 的 13-18,28-34,37-43,50-59,75-81,83-97,105-121,139-147,200-206,209-227, 231-247,260-271,318-327,366-381,388-394,399-406 和 182-201 ;Seq ID No 361 的 6-29,37-43,51-56,70-77,82-102,110-119,127-143,178-190,201-209,216-243, 261-269,281-292,305-313,327-339,341-354,356-373,391-397,423-429,438-445, 450-478 和 21-314 ;Seq ID No 362 的 4-12,15-21,32-41,59-76,80-89,96-104 和 90-103 ; Seq ID No 363 的 9-28,30-41,44-54,69-74,77-82,90-97,104-123,125-135,149-155, 164-173,177-184,217-226,230-235,238-244,258-272,282-297,300-305,309-315, 317-322,327-336,348-362,368-374,380-387,400-411,414-424,451-458,460-466, 483-494,497-503,506-511,521-528,540-553,569-587,598-606,628-642,661-681, 688-700,718-733,740-749,752-764,769-783,823-834,848-854,862-872,878-884, 886-898,915-920,938-951,954-961,963-972,982-989,996-1003,1010-1016,1021-1032, 1038-1044,1047-1057,1060-1070,1079-1088,1094-1102,1117-1127,1129-1135, 1142-1153,1158-1204,1212-1229,1234-1263,1269-1277,1308-1313,1327-1338, 1344-1376,1400-1415,1436-1443,1448-1458,1497-1504,1511-1522,1544-1566,3-82 和 509-576 ;Seq ID No 364 的 8-36,40-64,71-79,88-94,102-109,118-127,138-148,151-159,163-174,192-198,200-206,220-233,268-273,290-301,304-309,316-323, 331-349,378-391,414-420,427-437,455-475,494-510,541-547,549-555,616-640,1-60, 55-139,212-308,386-458 和 458-624 ;Seq ID No 365 的 16-31,35-42,70-77,91-101, 120-130,132-140,143-153,185-190,195-202,215-222,228-238,241-251,257-264, 268-277,288-302,312-324,326-333,341-348,364-382,415-429,438-454,458-466, 491-499,501-521 和 273-281 ;Seq ID No 366 的 8-14,32-57,74-149,155-177,179-212, 221-266,271-296,304-324,329-346,349-359,368-401,413-419,426-454,465-478, 493-510 和 466-490 ;Seq ID No 367 的 22-28,33-51,64-89,96-119,126-132,138-146,152-159,161-169,172-179,193-198,205-211,221-231,235-254,273-280,297-303, 312-320,328-346,351-373,378-384,391-398,448-454,460-468,470-481,516-558, 574-593,597-602,613-623,626-646,649-656,668-673,675-683,696-708,715-722, 724-739,745-751,759-777,780-804,816-822 和 102-113 ;Seq ID No 368 的 12-28,41-91, 98-107,112-120,125-131,151-193,215-221,240-250,263-280 和 128-138 ;Seq ID No 369 的 16-24,32-38,46-62,68-81,90-105,127-133,144-150,160-166,178-184,186-202, 210-219,232-240,252-258,264-273,293-324,337-344,349-357,360-369,385-398, 410-416,419-427,441-449,458-476,508-515,523-539,544-549,562-569,571-579, 96-109 和 127-139 ;Seq ID No 370 的 19-25,28-34,56-61,85-97,110-116 和 39-53 ;Seq ID No 371 的 4-37,41-50,62-72,91-97,99-109,114-125,136-141,149-158,160-166,201-215 和 27-225 ;Seq ID No 372 的 15-31,44-51,96-105,122-130,149-157,162-168, 178-183,185-192,198-204,206-213,221-234,239-245,248-255,257-266,289-335, 349-357,415-422,425-441,448-454,462-468 和 463-481 ;Seq ID No 373 的 5-31,39-55, 63-72,76-99,106-155,160-177,179-199,207-217,223-240,245-255,261-267,294-316, 321-343,354-378,382-452,477-488,529-536,555-569,584-591,593-612,620-627, 632-640,647-654,671-680,698-704,723-730,732-750,769-775,781-788,822-852 和 505-525 ;Seq ID No 374 的 3-18 ;Seq ID No 375 的 4-14 和 12-24 ;Seq ID No 376 的 4-11,22-30 和 12-25 ;Seq ID No377 的 5-12 和 4-18 ;Seq ID No 378 的 4-28 和 7-14 ;Seq ID No379 的 6-16 和 8-16 ;Seq ID No 380 的 4-15,18-33 和 24-36 ;Seq ID No 381 的 4-10, 16-21 和 20-31 ;Seq ID No 382 的 6-19 ;Seq ID No 383 的 11-18 和 3-10 ;Seq ID No 384 的 13-24 和 3-15 ;Seq ID No 385 的 15-27 和 7-16 ;Seq ID No 386 的 11-16 和 1-15 ;Seq ID No 387 的 4-16 和 9-21 ;Seq ID No 388 的 4-24,40-48,54-67 和 22-39 ;Seq ID No 389 的 6-30,34-55,62-68,78-106 和 68-74 ;Seq ID No 390 的 3-14 ;Seq ID No 391 的 9-19 和 6-21 ;Seq ID No 392 的 4-17 和 1-9 ;Seq ID No 393 的 5-30 和 1-8 ;SeqID No 394 的 4-16, 23-46,51-56 和 45-55 ;Seq ID No 395 的 7_16;Seq ID No 396 的 2-14 ;Seq ID No 397 的 4-36,43-65 和 50-62 ;Seq ID No 398 的 10-30 和 14-21 ;Seq ID No 399 的 9-17 和 1-10 ; Seq ID No 400 的 4-12 和 3-16 ;Seq ID No 401 的 4-15 和 5-23 ;Seq ID No 402 的 10-21 ; Seq ID No 403 的 6-16 ;Seq ID No 404 的 4-29,31-38 和 2-14 ;Seq ID No 405 的 4-35 和 33-42 ;Seq ID No406 的 2-17 ;Seq ID No 407 的 9-18,30-35 和 15-33 ;Seq ID No408 的 4-9 和 6-12 ;Seq ID No 409 的 3-17 ;Seq ID No 410 的 12-21,37-44,52-61 ,72-80 和 38-48 ;Seq ID No 411 的 4-10,29-44,54-61,69-78 和 13-27 ;Seq ID No 412 的 13-23, 36-53和 2-15 ;Seq ID No 413 的 4-25,28-46,56-72,81-99,120-132,134-142,154-160和 129-141 ;Seq ID No 414 的 4-15,24-33,35-41,64-86 和 21-33 ;Seq ID No 415 的 9-15 禾口 4-13 ;Seq ID No 416 的 4-11,13-19,34-48 和 15-32 ;Seq ID No 417 的 4-21 和 11-31 ;Seq IDNo 418 的 23-57 和 38-50 ;Seq ID No 419 的 4-32 和 3-13 ;Seq IDNo 420 的 4-10,13-25, 32-42,56-68,72-84 和 26-38 ;Seq ID No421 的 4-20,31-48,52-58,65-71,80-93,99-108, 114-123 和 37-49 ;Seq ID No 422 的 6-12,14-20 和 3-25 ;Seq ID No 423 的 14-25,27-38 ^P 5-14 ;Seq ID No 424 的 4-41,57-105,109-118,123-136,144-152 和 86-99 ;Seq ID No 425 的 6-19 ;Seq ID No 426 的 2-19 ;Seq ID No 427 的 14-47 禾口 1-14 ;Seq ID No 428 的 4-21,29-44 和 2-18 ;Seq ID No 429 的 23-29 和 10-28 ;Seq ID No 430 的 6-16,22-36 和 11-22 ;Seq ID No 431 的 4—19,30—44 禾口 18—27 ;Seq IDNo 432 的 5-15,37-45,58-65 和 38-47 ;Seq ID No 433 的 4-15,23-34 和 4-15 ;Seq ID No 434 的 30-36,44-54,79-85, 101-114,138-152,154-164,170-175,179-200,213-220,223-240,243-255,258-264, 268-284和10-28 ;包含表IB的「相同區域」縱欄的胺基酸序列的肽,尤其是包含如下氨基 酸的 Jft :Seq ID No 449 的 210-226 和 738-753 ;Seq ID No 450 的 326-344,326-348, 338-354,371-392,801-809 和 877-901 ;Seq ID No 451 的 893-906 ;Seq ID No 452 的 51-69 ;Seq ID No 453 的 110-125 ;Seq ID No 454 的 291-305 ;SeqID No 455 的 210-226 和 738-753 ;Seq ID No 456 的 326-344,326-348,338-354,371-392,801-809 和 877-901 ; Seq ID No 457 的 893-906 ;Seq ID No 458 的 51-69 ;Seq ID No 459 的 110-125 ;SeqID No`460 的 291-305 ;Seq ID No 461 的 32-44 ;Seq ID No 462 的 399-410 ;表 2 的「胺基酸從」 至丨J「胺基酸至」縱欄中指定的血清反應性表位,尤其是包含如下胺基酸的肽Sep ID No 218 的 120-143,138-161 和 156-179 ;Seq ID No 219 的 110-129 和 168-184 ;Seq ID No 222 的 74-90 ;Seq ID No 223 的 759-773 ;Seq ID No 224 的 237-260 ;SeqID No 225 的 265-284 ; Seq ID No 226 的 65-74 ;Seq ID No 227 的 41-50 ;Seq ID No 229 的 163-174 ;Seq ID No 230 的 26-37 ;SeqID No 232 的 174-189 ;Seq ID No 234 的 240-256 ;Seq ID No 236 的 285-297 ;Seq ID No 238 的 238-247 ;Seq ID No 239 的 491-519 ;Seq ID No 243 的 114-140 ;Seq ID No 250 的 267-284 ;Seq ID No252 的 439-453 ;Seq ID No 253 的 162-178 ;Seq ID No 254 的 347-364 ;Seq ID No 255 的 699-715 ;Seq ID No 256 的 60-71 ; SeqID No 257 的 244-257 ;Seq ID No 258 的 44-63 和 57-76 ;Seq IDNo 260 的 185-196 ; Seq ID No 263 的 119-129 ;Seq ID No 266 的 182-195 ;Seq ID No 267 的 32-44 和 424-442 ;Seq ID No 268 的 247-256 ;Seq ID No 269 的 678-694,785-805,55-77 和 72-94 ; SeqID No 281 的 210-226 ;Seq ID No 289 的 37-59 ;Seq ID No 296 的 13-29 ;Seq ID No 348 的 136-159 ;Seq ID No 349 的 205-222 ;SeqID No 350 的 99-110 ;Seq ID No 351 的 160-176 ;Seq ID No 355 的 457-470 ;Seq ID No 356 的 221-237 ;Seq ID No 357 的 167-190 ;Seq ID No 361 的 96-120 ;Seq ID No 364 的 399-417,503-519 和 544-563 ;Seq ID No 371 的 46-68,159-183 和 184-198 ;Seq ID No372 的 463-481 ;表 4 的「胺基酸從,,到 「胺基酸至」縱欄中指定的免疫原性表位;尤其是包含如下胺基酸的肽Seq ID No 219的 110-129 和 168-184 ;Seq ID No 277 的 877-901,333-354,326-344 和 801-809 ;Seq ID No 347 的 l-54;Seq ID No 364 的 544-563,31-51,107-119,399-417 和 503-519 ;Seq ID No 218 的 120-198 ;Seq ID No 219 的 20-35 ;Seq ID No 221 的 118-201 ;Seq ID No 242 的 48-132 ;SeqID No 249 的 118-136 ;Seq ID No 253 的 162-178 ;Seq ID No 254 的 347-364 ; Seq ID No 255 的 699-715 ;Seq ID No 258 的 50-76 ;Seq ID No 269 的 785-819 和 44-128 ; Seq ID No 274 的 90-128 ;Seq ID No 289 的 314-384 ;Seq ID No 293 的 327-349 ;Seq ID No304 的 242-314,405-478 和 23-100 ;Seq ID No 305 的 129-210 ;Seq ID No 307 的 162-188 ;Seq ID No 310 的 750-772 ;Seq ID No335 的 1-56 ;Seq ID No 337 的 322-337 ; Seq ID No 339 的 72-90 ;Seq ID No 345 的 374-395 ;Seq ID No 348 的 136-159 ;Seq ID No358 的 141-164 ;Seq ID No 361 的 96-157 ;Seq ID No 363 的 1-82 ;Seq ID No 364 的 489-556 ;Seq ID No 371的159-183和49-133 ;包含表5的「推定的免疫原性胺基酸」和 「鑑別的免疫原性區域(aa)的位置」縱欄的胺基酸序列的肽,尤其是包含如下胺基酸的肽 Seq ID No 475 的 4-26,35-41,53-61,73-84,103-108,114-120,140-146,156-162, 192-208,214-219,227-233,239-252,260-268,284-297,1-48 和 113-133 ;Seq ID No 476 的 4-27,38-44,50-56,59-64,72-79,83-89,92-97,108-116,123-148,152-167,183-196, 200-220,232-244,255-261,265-274,282-302,309-317,1-79和 231-302 ;Seq ID No477 的 6-28,66-72,85-105,115-121,144-151,160-170,176-185,223-230,252-288,296-310, 319-333,367-374,458-464,471-480,483-488,520-528,530-549,559-564,593-601, 606-616,636-643,655-662,676-682,684-699,719-726,735-750,757-764,777-785, 799-810,812-843,846-853,868-873,880-889,891-899,909-929,934-940,963-969, 998-1004,1007-1014,1016-1022,1030-1046,1-80 和 808-821 ;Seq ID No 478 的 7-24,35-41,75-81,91-114,122-132,137-144,148-156,183-192,194-200,212-228,233-238, 251-258,275-295,326-332,337-346,1-79 和 305-321 ;Seq ID No 479 的 31-38,42-52, 66-72,86-92,98-104,115-122,127-146,154-164,169-187,198-212,225-237,255-269, 13-92 和 135-142 ;Seq ID No480 的 4-36,39-49,63-69,71-77,81-88,123-131,133-139, 160-169,174-180,188-194,210-217,273-278,289-300,317-334,336-341,383-401, 425-438,1-68,212-270 和 402-446 ;Seq ID No 481 的 21-29,31-42,49-63,72-79,81-93, 112-132,159-165,188—195,197-232,262-267,279-286,294-301,318-326,348-366, 381-405,409-426,436-465,471-480,484-492,497-505,521-544,554-561,567-577, 581-589,601-609,611-622,636-651,653-667,669-685,700-708,716-722,729-744, 749-766,780-786,789-811,814-864,1-57 和 84-106 ;Seq ID No 482 的 6-24,35-48, 57-63,72-78,87-92,113-119,123-137,147-153,173-181,212-233 和 1-124 ;Seq ID No483 的 13-34, 62-69, 78-83, 86-91,98-104,107-115,146-159,179-188,195-205, 209-221,226-233,239-253,276-282,284-294,297-308,331-354,375-382,388-399, 421-433,449-458,464-469,472-491,508-513,525-531,534-550,575-593,601-618, 629-635,654-661,666-680,706-721,723-740,771-805,810-830,845-851 和 1-84 ;Seq ID No 484 的 4-32,45-64,73-83,86-92,100-111,125-147,157-163,170-175,177-188, 226-232,245-252,258-274,320-335,348-359 和 1-71 ;Seq ID No 485 的 13-40,43-71, 76-83,87-101,109-119,125-156,162-175,182-219,226-232,240-262,270-287,306-318, 326-342,344-408,414-444,449-456 和 1-51 ;Seq ID No 486 的 4-16,18-34,45-54, 99-108,134-140,203-212,241-257,266-274,279-291,308-315,330-336,355-370, 374-382,402-410,428-455,466-472,474-480,531-554,560-566,572-580,597-618, 632-660,664-674,676-685,691-705,708-735,750-768,1-87 和 342-480 ;表 6 的「胺基酸 從」到「胺基酸至」的縱欄中指定的血清反應性表位,尤其是包含如下胺基酸的肽No 475 的 115-132 和 1-26 ;Seq ID No 476 的 33-55 ;Seq ID No 478 的 1-25 ;Seq ID No479 的 37-61 ;Seq ID No 480 的 1-24 ;Seq ID No 481 的 1-23 ;Seq ID No 482 的 46-60 ;Seq ID No 483 的 1-28,23-50 和 45-71 ;Seq ID No 484 的 1-22 和 17-38 ;Seq ID No 485 的 1-22 和17-38 ;Seq ID No 486的1-27,22-47和422-447 ;表7的「胺基酸從」到「胺基酸至」縱 欄中指定的免疫原性表位,尤其是包含如下胺基酸的肽Seq IDNo 475的115-132和1_47 ; Seq ID No 476 的 1-55 ;Seq ID No 477 的 22-85 ;Seq ID No 478 的 307-320 和 1-44 ;Seq ID No 479 的 15-76 和 40-92 ;Seq ID No 480 的 1-59,213-269 和 403-445 ;SeqID No 481 的 1-56 和 85-105 ;Seq ID No 482 的 37-121 ;Seq ID No483 的 1-71 ;Seq ID No 484 的 1-38 ;Seq ID No 485 的 1-38 ;SeqID No 486 的 1-47。
15.一種生產根據權利要求11至14中任何一個的無乳鏈球菌超免疫血清反應性抗原 或其片段的方法,包括表達根據權利要求1至7中任何一個的核酸分子。
16.一種生產表達根據權利要求11至14中任何一個的無乳鏈球菌超免疫血清反應性 抗原或其片段的細胞的方法,包括用根據權利要求8或權利要求9的載體轉化或轉染合適 的宿主細胞。
17.一種藥用組合物,尤其是疫苗,包含如權利要求11至14中任何一個定義的超免疫 血清反應性抗原或其片段或根據權利要求1至7中任何一個的核酸分子。
18.根據權利要求17的藥物組合物,尤其是疫苗,特徵在於它進一步包含一種免疫刺 激物質,優選地選自尤其是聚陽離子肽的聚陽離子聚合物、免疫刺激脫氧核苷酸(0DN)、包 含至少兩個LysLeuLys基序的肽、尤其是人生長激素的神經活性化合物、明礬、弗氏完全或 不完全佐劑或其組合。
19.根據權利要求1至7中任何一個的核酸分子或根據權利要求11至14中任何一個 的超免疫血清反應性抗原或其片段用於製備藥物製品,尤其是用於製備抗無乳鏈球菌感染 的疫苗的用途。
20.一種抗體或至少其有效部分,所述抗體至少結合根據權利要求11至14中任何一個 的超免疫血清反應性抗原或其片段的選擇性部分。
21.根據權利要求20的抗體,其中所述抗體是單克隆抗體。
22.根據權利要求20或21的抗體,其中所述有效部分包含Fab片段。
23.根據權利要求20至22中任何一個的抗體,其中所述抗體是嵌合抗體。
24.根據權利要求20至23中任何一個的抗體,其中所述抗體是人源化抗體。
25.產生根據權利要求20至24中任何一個的抗體的雜交瘤細胞系。
26.—種產生根據權利要求20的抗體的方法,特徵在於下面的步驟 通過給予非人的動物權利要求11至14中任何一個定義的超免疫血清反應性抗原或 其片段而引發所述動物的免疫反應, 從所述動物移出含有抗體的體液,以及 通過對所述含有抗體的體液進行進一步的純化步驟而產生所述抗體。
27.產生根據權利要求21的抗體的方法,特徵在於下面步驟 通過給予非人的動物如權利要求12至15中任何一個定義的超免疫血清反應性抗原 或其片段而引發所述動物的免疫反應, 從所述動物移出脾或脾細胞, 產生所述脾或脾細胞的雜交瘤細胞, 挑選並克隆特異於所述超免疫血清反應性抗原或其片段的雜交瘤細胞, 通過所述克隆雜交瘤細胞的培養和可選的進一步的純化步驟產生所述抗體。
28.根據權利要求20至24中任何一個的抗體用於製備治療或預防無乳鏈球菌感染的 藥物的用途。
29.一種拮抗劑,其結合根據權利要求11至14中任何一個的超免疫血清反應性抗原或 其片段。
30.一種鑑別能夠結合根據權利要求11至14中任何一個的超免疫血清反應性抗原或 其片段的拮抗劑的方法,包括a)在允許候選拮抗劑與分離的或固定化的根據權利要求11至14中任何一個的超免疫 血清反應性抗原或其片段結合的條件下,在能提供響應於所述候選拮抗劑與所述超免疫血 清反應性抗原或其片段結合的可檢測信號的組分的存在下,將所述超免疫血清反應性抗原 或其片段與所述候選拮抗劑接觸;以及b)檢測響應於所述拮抗劑與超免疫血清反應性抗原或其片段的結合產生的信號的存 在與否。
31.鑑別能夠降低或抑制根據權利要求11至14中任何一個的超免疫血清反應性抗原或其片段與其相互作用伴侶之相互作用活性的拮抗劑的方法,包括a)提供根據權利要求11-14中任何一個的超免疫血清反應性抗原或其高免疫片段,b)向尤其是根據權利要求20至24中任何一個的抗體的所述超免疫血清反應性抗原或 其片段提供相互作用伴侶,c)允許所述超免疫血清反應性抗原或其片段與所述相互作用伴侶相互作用以形成相 互作用複合物,d)提供候選拮抗劑,e)允許候選拮抗劑和相互作用複合物之間發生競爭反應,f)測定候選拮抗劑是否抑制或降低超免疫血清反應性抗原或其片段與相互作用伴侶 的相互作用活性。
32.根據權利要求11至14中任何一個的超免疫血清反應性抗原或其片段的用途,用於 所述超免疫血清反應性抗原或其片段的相互作用伴侶的分離和/或純化和/或鑑別。
33.一種體外診斷與根據權利要求11至14中任何一個的超免疫血清反應性抗原或其 片段的表達相關的疾病的方法,包括測定編碼所述超免疫血清反應性抗原和片段的根據權 利要求1-7中任何一個的核酸序列的存在,或根據權利要求11-14中任何一個的超免疫血 清反應性抗原或其片段的存在。
34.一種細菌感染,尤其是無乳鏈球菌感染的體外診斷的方法,包括分析編碼所述超免 疫血清反應性抗原或其片段的根據權利要求1至7中任何一個的核酸序列的存在,或者根 據權利要求11至14中任何一個的超免疫血清反應性抗原或其片段的存在。
35.根據權利要求11至14中任何一個的超免疫血清反應性抗原或其片段的用途,用於 產生結合所述超免疫血清反應性抗原或其片段的肽,其中所述肽選自抗促成素。
36.根據權利要求11至14中任何一個的超免疫血清反應性抗原或其片段用於功能性 核酸製造的用途,其中所述功能性核酸選自適體和鏡面體。
37.根據權利要求11至14中任何一個的核酸分子用於製備功能性核糖核酸的用途,其 中功能性核糖核酸選自核酶、反義核酸和siRNA。
全文摘要
本發明公開了編碼超免疫血清反應性抗原或其片段和來自無乳鏈球菌的超免疫血清反應性抗原或其片段的分離的核酸分子、分離這樣的抗原的方法及其特定用途。
文檔編號C07K14/315GK101864431SQ20091022280
公開日2010年10月20日 申請日期2004年5月6日 優先權日2003年5月7日
發明者A·梅克, E·納吉, M·漢納, M·霍基, S·卡倫達, S·普拉斯託莫斯基 申請人:英特塞爾股份公司

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