真菌漆酶的發酵生產方法及漆酶的應用的製作方法

2023-04-24 03:16:51 1

真菌漆酶的發酵生產方法及漆酶的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種真菌漆酶的發酵生產方法及漆酶的應用，該方法包括以下步驟：先製備好白腐菌Panus?conchatus菌種懸浮液；然後將菌種懸浮液接種於含3～5L發酵培養基的發酵罐中培養10～15天，得到發酵液；最後將發酵液過濾或離心，獲得漆酶製劑。本發明不僅發酵液後續處理簡便、生產成本低廉，而且發酵獲得的白腐菌漆酶活力在200IU/mL以上，與國內外其他發酵罐規模的漆酶生產方法相比，漆酶總產量和酶活力都達到了較高的水平，製得的漆酶製劑具有良好的紙漿漂白效果。
【專利說明】真菌漆酶的發酵生產方法及漆酶的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及真菌發酵【技術領域】，特別是涉及一種工業用漆酶的製備方法，確切地說是一種白腐真菌在5L規模發酵罐中培養發酵生產漆酶的方法及所述方法製備的漆酶製劑在紙漿漂白中的應用。
【背景技術】
[0002]漆酶(Laccase，EC.1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，與植物中的抗壞血酸氧化酶、哺乳動物血漿中的銅藍蛋白同屬於銅藍氧化酶家族。近十幾年來，真菌漆酶，尤其是白腐菌漆酶的功能和應用已經引起了越來越多的研究者的關注，由於它具有較高的氧化還原電勢，作用底物範圍非常廣泛，能催化氧化多種酚和芳胺類化合物，在某些小分子氧化還原介體存在的條件下，還能夠氧化木質素中的非酚型結構，因此白腐菌漆酶在製漿造紙工業中的紙漿漂白和廢水處理等領域中具有巨大的研究價值和工業化應用潛力。但是白腐菌漆酶在上述領域中的成功應用，目前需要解決的一個關鍵性問題是如何在控制成本的前提下提高漆酶的產量。優化發酵條件以提高白腐菌產酶能力並降低生產和應用成本是一種最基本也是最常用的研究思路。Borras等學者研究了白腐菌Trametes versicolor在麥芽汁半合成培養基中，對酸性染料蘭納灑脫灰脫色過程中的成本控制問題，發現培養基原料的費用佔脫色總成本的比例高達95%，而通過優化培養條件，選用低價的無麥芽汁合成培養基，能夠將脫色成本降低96%,並且脫色效果不變(Borras E, Blanquez P, SarraM, et al.Trametes versicolor pellets production:low-cost medium and scale-up.Biochemical Engineering Journal, 2008,42:61-66)。白腐菌漆酶高效生產的另一種思路是尋找合適的載體進行漆酶基因的異源表達，但是由於白腐菌漆酶中糖基的存在能夠促使漆酶蛋白的水解，因此相對於其它一些已實現工業化生產的氧化還原酶來說，如通過絲狀真菌的基因重組生產的葡萄糖氧化酶，白腐菌漆酶在活性宿主上的異源高效表達還較為困難，總體上還處於探索階段，難以滿足漆酶工業化生產和應用的要求。因此目前關於漆酶生產的研究主要還是集中於優化白腐菌的發酵條件上。
[0003]白腐菌Panus conchatus是一株分泌漆酶的擔子真菌,其木質纖維素降解酶系具有較高的脫木素選擇性，其中漆酶是其最主要的木質素降解酶，在搖瓶液體發酵中表現出較高的漆酶產量，具有較高的研究和應用潛力。該白腐菌漆酶在紙漿漂白和廢水處理等領域中的成功應用，不僅要提高漆酶的產量，降低其生產成本，還要依賴於成熟的工業化發酵技術，而其中發酵罐規模生產是該白腐菌漆酶從實驗室研究向工業化生產過渡的關鍵環節和必經之路。酵罐規模的微生物液體培養通常稱為深層發酵(Submerged fermentation,SmF),機械攪拌式發酵罐(Stirred tank reactor, STR)是目前最常用的深層發酵設備，已經形成標準化的通用設備，適合於大多數微生物的培養發酵過程。它結構簡單，不需要特殊設備，利用機械攪拌器的作用，使菌體、發酵液、空氣和熱量等充分混合，促進物料的均勻分布和氧氣的溶解，以保證供給微生物生長繁殖和代謝所需的營養、溫度和溶解氧等。但是這種發酵罐用於白腐菌的培養發酵時，還存在一些不利因素，主要表現在罐體中白腐菌菌體的生長不易控制，菌絲的無序擴張會提高發酵液的粘稠度，並且纏繞在攪拌葉輪上，堵塞管路，嚴重影響物料、熱量和氧氣的均勻傳遞。雖然可以通過提高攪拌轉速改善上述問題，但是過高的轉速會導致菌絲受到的剪切力增大，抑制細胞繁殖代謝和漆酶的分泌，甚至導致細胞破裂，進而導致漆酶產量低、酶活低。
[0004]目前，關於白腐菌漆酶成熟的大規模發酵工藝的報導還很少，並且始終沒有解決生產的成本問題，這主要是因為發酵罐中存在著與搖瓶發酵完全不同的動力、熱量、物料以及氧氣等的傳遞特性，白腐菌的生產不易控制。因此，開發適應漆酶大規模生產的白腐菌菌種，改良已有發酵罐生產工藝和開發新型發酵設備，簡化發酵工藝，降低生產成本，以擴大化白腐菌漆酶的生產，已經成為漆酶生產領域活躍的研究熱點。

【發明內容】

[0005]本發明主要解決的技術問題是提供一種真菌漆酶的發酵生方法及漆酶的應用，不僅發酵液後續處理簡便、生產成本低廉，而且發酵獲得的白腐菌漆酶活力在200IU/mL以上,與國內外其他發酵罐規模的漆酶生產方法相比,漆酶總產量和酶活力都達到了較高的水平，製得的漆酶製劑具有良好的紙漿漂白效果。
[0006]為解決上述技術問題，本發明採用的一個技術方案是:提供一種真菌漆酶的發酵生產方法，所述方法包括以下步驟:
[0007]I)將真菌接種於種子培養基上培養2~4天，培養液經無菌紗布過濾後得到的菌絲體用無菌水洗淨，再將菌絲體高速打散約10秒後收集於無菌水中製成菌種懸浮液，所述真菌為白腐菌Panus conchatus ；
[0008]2)將所述菌種懸浮液接種於含3~5L發酵培養基的發酵罐中培養10~15天後，得到發酵液；
[0009]3)將所述發酵液過濾或離心後獲得漆酶製劑。
[0010]其中，所述種子培養基每升含20%~30%馬鈴薯浸出液、10~50g葡萄糖、I~IOg 蛋白腖、3gKH2P04、3gMgS04.7H20。
[0011]其中，所述發酵培養基為每升種子培養基中加入5~20g天然底物和I~5mmol誘導劑。
[0012]其中，所述天然底物為茶葉、稻草、麥草、花生殼、麥麩、豆柏、蔗渣、桔皮、玉米杆粉中的一種或兩種以上。
[0013]優選地，所述天然底物為麥麩。
[0014]其中，所述誘導劑為黎蘆醇、愈創木酚、二甲苯胺、阿魏酸、丁香醛、單寧酸、香草酸、香豆酸、硫酸銅中的一種或兩種以上。
[0015]優選地，所述誘導劑為硫酸銅。
[0016]其中，所述步驟I)中的培養溫度為28°C、轉速為120~180rpm。
[0017]其中，所述步驟2)中的培養溫度為28V~40°C，攪拌速度為150~300rpm。
[0018]本發明中，漆酶活力的測定以2，2-連氮-二(3-乙基苯並噻唑-6-磺酸(ABTS)為底物(ε 42(| = 3.6X IO4IT1 ^cnT1)，用等體積的0.5mmol/LABTS溶液和粗酶液反應，測定反應前3min內420nm處吸光值的增加量，定義每分鐘使I μ mo I ABTS轉化所需要的酶量為I個漆酶活力單位(IU)。[0019]本發明還涉及通過所述方法獲得的漆酶製劑在紙漿漂白中的應用。
[0020]本發明的有益效果是:區別於現有酵罐發酵生產的白腐菌漆酶產量低、酶活力低、生產成本高的情況，本發明將白腐菌漆酶的生產由搖瓶擴大到5L發酵罐，生產規模擴大約100倍，不僅發酵液後續處理簡便、生產成本低廉，而且發酵獲得的白腐菌漆酶活力在200IU/mL以上，與國內外其他發酵罐規模的漆酶生產方法相比，漆酶總產量和酶活力都達到了較高的水平。此外，製得的漆酶製劑用於紙漿漂白時具有良好的漂白效果。
【具體實施方式】
[0021]下面結合實施例對本發明進行詳細說明。
[0022]本發明中，白腐菌Panus conchatus由華南理工大學制眾造紙工程國家重點實驗
室提供。
[0023]實施例1
[0024]馬鈴薯浸出液的製備:稱取300g新鮮馬鈴薯，去皮切片後於1000mL去離子水中煮沸30min,冷卻後用紗布過濾,濾液用去離子水定容至1000mL。
[0025]PDA培養基:每升馬鈴薯浸出液中加入無水葡萄糖20g，瓊脂20g。
[0026]種子培養基:每升馬鈴薯浸出液中加入無水葡萄糖20g，蛋白腖lg，KH2PO4 3g，MgSO4.7H20 3g。
[0027]發酵培養基:每升種子培養基中加入經粉碎的麥麩10g，發酵專用消泡劑0.2mL,硫酸銅3mmol。
[0028]1、菌種懸浮液的製備`
[0029]將白腐菌Panus conchatus由PDA斜面培養基轉接入裝有50mL種子培養基的300mL三角瓶中，在搖床中150rpm、28 °C震蕩培養3d後，培養液經無菌紗布過濾，菌絲體用無菌水洗淨並在高速打碎杯中打散約IOs,收集於無菌水中製成菌種懸浮液備用。
[0030]2、發酵罐產酶
[0031]將製備好的菌種懸浮液於無菌條件下接種入裝有發酵培養基的發酵罐中，發酵罐裝液量3L，接種量500mL。本發明採用的發酵罐為5L全自動機械攪拌式發酵罐，其各項運行參數可以通過與之相聯的數字式控制器調節。接種後控制機械攪拌轉速為150rpm，發酵一段時間後，由於菌絲體大量繁殖，發酵液粘稠度顯著增大，因此將攪拌轉速提高至300rpm以促進物料的均勻分布。培養液溫度通過循環冷凝水維持在28°C，同時向發酵罐中通入空氣以維持發酵液的溶氧度，通氣量為l.0Lpm，總發酵時間為15天。發酵培養基中加入的生物發酵專用消泡劑可以避免菌體代謝和機械攪拌產生的泡沫對管路的堵塞。
[0032]發酵後測定酶活,漆酶活力高達200IU/mL以上。
[0033]3、漆酶製劑的獲得
[0034]發酵液經紗布過濾除去菌絲體和麥麩殘渣後，4°C下5000r/min冷凍離心15min，分離除去細小顆粒物質，收集上清液即得工業用漆酶製劑。
[0035]漆酶製劑用於紙漿漂白
[0036]1、漂白工藝條件:
[0037]漆酶處理(L):紙漿(漿濃10 % )在0.5MPa氧壓下，在50°C和ρΗ5.0的緩衝溶液中，加入2.0IU/g本實施例獲得的漆酶(對絕幹楽；)及I %的硝基腐殖酸(nitrohumicacid, NHA)(介體)，在帶電動攪拌的高壓釜中處理2h，洗淨。
[0038]氧脫木素(O):氧脫木素是在帶電動攪拌的高壓釜中進行。條件為:漿濃10%，MgSO4 用量 0.5%，NaOH 用量 2.0%，氧壓為 0.7MPa，時間 60min。
[0039]螯合處理(Q):漿濃10%,1.0% EDTA, ρΗ3.0，溫度 70。。，時間 60min。
[0040]過氧化氫漂白(P):漿濃10 %，H2O2 2.0%, Na0H2.0 %，MgSO40.05 %。，溫度 90 °C，時間4h。
[0041]2、漂白效果:獲葦漿經過用量1.0IU/g(對絕幹漿)的漆酶處理(L)，Kappa值降低17.8%，白度下降3.4% IS0，粘度變化較小，再經QP漂白後，白度達72.5% IS0，較QP漿白度增加3.3% IS0，粘度1250ml/g，比荻葦QP漿粘度高113mL/g。荻葦OLQP漿，白度達83.2% IS0，比OQP漿白度升高8.2% ISO。Kappa值顯著下降，而粘度下降不多。
[0042]實施例2
[0043]馬鈴薯浸出液的製備:稱取300g新鮮馬鈴薯，去皮切片後於1000mL去離子水中煮沸30min,冷卻後用紗布過濾,濾液用去離子水定容至1000mL。
[0044]PDA培養基:每升馬鈴薯浸出液中加入無水葡萄糖20g，瓊脂20g。
[0045]種子培養基:每升馬 鈴薯浸出液中加入無水葡萄糖10g，蛋白腖10g，KH2PO4 3g，MgSO4.7H203g。
[0046]發酵培養基:每升種子培養基中加入經粉碎的花生殼20g，發酵專用消泡劑0.2mL,黎蘆醇 5mmol。
[0047]1、菌種懸浮液的製備
[0048]將白腐菌Panus conchatus由PDA斜面培養基轉接入裝有50mL種子培養基的300mL三角瓶中，在搖床中150rpm、28 °C震蕩培養3d後，培養液經無菌紗布過濾，菌絲體用無菌水洗淨並在高速打碎杯中打散約IOs,收集於無菌水中製成菌種懸浮液備用。
[0049]2、發酵罐產酶
[0050]將製備好的菌種懸浮液於無菌條件下接種入裝有發酵培養基的發酵罐中，發酵罐裝液量3L，接種量500mL。本發明採用的發酵罐為5L全自動機械攪拌式發酵罐，其各項運行參數可以通過與之相聯的數字式控制器調節。接種後控制機械攪拌轉速為150rpm，發酵一段時間後，由於菌絲體大量繁殖，發酵液粘稠度顯著增大，因此將攪拌轉速提高至300rpm以促進物料的均勻分布。培養液溫度通過循環冷凝水維持在28°C，同時向發酵罐中通入空氣以維持發酵液的溶氧度，通氣量為l.0Lpm，總發酵時間為10天。發酵培養基中加入的生物發酵專用消泡劑可以避免菌體代謝和機械攪拌產生的泡沫對管路的堵塞。
[0051]發酵後測定酶活,漆酶活力高達200IU/mL以上。
[0052]3、漆酶製劑的獲得
[0053]發酵液經紗布過濾除去菌絲體和花生殼殘渣後，4 °C下5000r/min冷凍離心15min,分離除去細小顆粒物質，收集上清液即得工業用漆酶製劑。
[0054]漆酶製劑用於紙漿漂白
[0055]1、漂白工藝條件:
[0056]漆酶處理(L):紙漿(漿濃10 % )在0.5MPa氧壓下，在50°C和ρΗ5.0的緩衝溶液中，加入2.0IU/g本實施例獲得的漆酶(對絕幹楽；)及I %的硝基腐殖酸(nitrohumicacid, NHA)(介體)，在帶電動攪拌的高壓釜中處理2h，洗淨。[0057]氧脫木素(O):氧脫木素是在帶電動攪拌的高壓釜中進行。條件為:漿濃10%，MgSO4 用量 0.5%，NaOH 用量 2.0%，氧壓為 0.7MPa，時間 60min。
[0058]螯合處理(Q):漿濃10%,1.0% EDTA, ρΗ3.0，溫度 70。。，時間 60min。
[0059]過氧化氫漂白(P):漿濃10%，H2O2 2.0%,NaOH 2.0%,MgSO40.05%。，溫度 90°C，時間4h。
[0060]2、漂白效果:麥草漿經過用量2.0IU/g的漆酶處理(L) ,Kappa值降低8.7%，白度下降1% IS0，粘度變化較小，再經QP漂白後，白度74.6% IS0，較QP漿白度增加1.9% ISO,粘度比QP漿下降一點。氧脫木素麥草漿經過用量2.0IU/g的漆酶處理，Kappa值、粘度下降。OLQP漿，白度達81.8% ISO,比OQP漿白度升高2.0% ISO。
[0061]實施例3
[0062]馬鈴著浸出液的製備:稱取200g新鮮馬鈴薯，去皮切片後於1000mL去離子水中煮沸30min,冷卻後用紗布過濾,濾液用去離子水定容至1000mL。
[0063]PDA培養基:每升馬鈴薯浸出液中加入無水葡萄糖20g，瓊脂20g。
[0064]種子培養基:每升馬鈴薯浸出液中加入無水葡萄糖50g，蛋白腖lg，KH2P043g,MgSO4.7H203g。
[0065]發酵培養基:每升種子培養基中加入經粉碎的豆柏5g，發酵專用消泡劑0.2mL，愈創木酌.Immol ο
[0066]1、菌種懸浮液的製備
[0067]將白腐菌Panus conchatus由PDA斜面培養基轉接入裝有50mL種子培養基的300mL三角瓶中，在搖床中180rpm、28°C震蕩培養2d後，培養液經無菌紗布過濾，菌絲體用無菌水洗淨並在高速打碎杯中打散約IOs,收集於無菌水中製成菌種懸浮液備用。
[0068]2、發酵罐產酶
[0069]將製備好的菌種懸浮液於無菌條件下接種入裝有發酵培養基的發酵罐中，發酵罐裝液量4L，接種量500mL。本發明採用的發酵罐為5L全自動機械攪拌式發酵罐，其各項運行參數可以通過與之相聯的數字式控制器調節。接種後控制機械攪拌轉速為150rpm，發酵一段時間後，由於菌絲體大量繁殖，發酵液粘稠度顯著增大，因此將攪拌轉速提高至250rpm以促進物料的均勻分布。培養液溫度通過循環冷凝水維持在30°C，同時向發酵罐中通入空氣以維持發酵液的溶氧度，通氣量為l.0Lpm，總發酵時間為11天。發酵培養基中加入的生物發酵專用消泡劑可以避免菌體代謝和機械攪拌產生的泡沫對管路的堵塞。
[0070]發酵後測定酶活,漆酶活力高達200IU/mL以上。
[0071]3、漆酶製劑的獲得
[0072]發酵液經紗布過濾除去菌絲體和豆柏殘渣後，4°C下5000r/min冷凍離心15min，分離除去細小顆粒物質，收集上清液即得工業用漆酶製劑。
[0073]漆酶製劑用於紙漿漂白
[0074]1、漂白工藝條件:
[0075]漆酶處理(L):紙漿(漿濃10 % )在0.5MPa氧壓下，在50°C和ρΗ5.0的緩衝溶液中，加入2.0IU/g本實施例獲得的漆酶(對絕幹楽；)及I %的硝基腐殖酸(nitrohumicacid, NHA)(介體)，在帶電動攪拌的高壓釜中處理2h，洗淨。
[0076]氧脫木素(0):氧脫木素是在帶電動攪拌的高壓釜中進行。條件為:漿濃10%，MgSO4 用量 0.5%，NaOH 用量 2.0%，氧壓為 0.7MPa，時間 60min。
[0077]螯合處理(Q):漿濃10%,1.0% EDTA, ρΗ3.0，溫度 70。。，時間 60min。
[0078]過氧化氫漂白(P):漿濃10 %，H2O2 2.0%, Na0H2.0 %，MgSO40.05 %。，溫度 90 °C，時間4h。
[0079]2、漂白效果:蘆葦漿經過用量1.0IU/g的漆酶處理，Kappa值降低17.8%，白度下降2.2% IS0，粘度變化不大，再經QP漂白後，白度達74.7% IS0，較QP漿白度增加3.4%ISO,粘度1250ml/g，比QP漿高。氧脫木素蘆葦漿經過用量2.0IU/g的漆酶處理，Kappa值、粘度下降。OLQP漿，白度達84.1 % IS0，比OQP漂白漿的白度高6.8% IS0，而粘度僅下降65mL/g。
[0080]實施例4
[0081]馬鈴薯浸出液的製備:稱取280g新鮮馬鈴薯，去皮切片後於1000mL去離子水中煮沸30min,冷卻後用紗布過濾,濾液用去離子水定容至1000mL。
[0082]PDA培養基:每升馬鈴薯浸出液中加入無水葡萄糖20g，瓊脂20g。
[0083]種子培養基:每升馬鈴薯浸出液中加入無水葡萄糖20g，蛋白腖8g，KH2PO4 3g，MgSO4.7H203g。
[0084]發酵培養基:每升種子培養基中加入經粉碎的稻草15g，發酵專用消泡劑0.2mL,阿魏酸2mmol。
[0085]1、菌種懸浮液的製備
·[0086]將白腐菌Panus conchatus由PDA斜面培養基轉接入裝有50mL種子培養基的300mL三角瓶中，在搖床中120rpm、28 °C震蕩培養4d後，培養液經無菌紗布過濾，菌絲體用無菌水洗淨並在高速打碎杯中打散約IOs,收集於無菌水中製成菌種懸浮液備用。
[0087]2、發酵罐產酶
[0088]將製備好的菌種懸浮液於無菌條件下接種入裝有發酵培養基的發酵罐中，發酵罐裝液量5L，接種量500mL。本發明採用的發酵罐為5L全自動機械攪拌式發酵罐，其各項運行參數可以通過與之相聯的數字式控制器調節。接種後控制機械攪拌轉速為150rpm，發酵一段時間後，由於菌絲體大量繁殖，發酵液粘稠度顯著增大，因此將攪拌轉速提高至200rpm以促進物料的均勻分布。培養液溫度通過循環冷凝水維持在35°C，同時向發酵罐中通入空氣以維持發酵液的溶氧度，通氣量為l.0Lpm，總發酵時間為12天。發酵培養基中加入的生物發酵專用消泡劑可以避免菌體代謝和機械攪拌產生的泡沫對管路的堵塞。
[0089]發酵後測定酶活,漆酶活力高達200IU/mL以上。
[0090]3、漆酶製劑的獲得
[0091]發酵液經紗布過濾除去菌絲體和稻草殘渣後，4°C下5000r/min冷凍離心15min，分離除去細小顆粒物質，收集上清液即得工業用漆酶製劑。
[0092]漆酶製劑用於紙漿漂白
[0093]1、漂白工藝條件:
[0094]漆酶處理(L):紙漿(漿濃10 % )在0.5MPa氧壓下，在50°C和ρΗ5.0的緩衝溶液中，加入2.0IU/g本實施例獲得的漆酶(對絕幹楽；)及I %的硝基腐殖酸(nitrohumicacid, NHA)(介體)，在帶電動攪拌的高壓釜中處理2h，洗淨。
[0095]氧脫木素(0):氧脫木素是在帶電動攪拌的高壓釜中進行。條件為:漿濃10%，MgSO4 用量 0.5%，NaOH 用量 2.0%，氧壓為 0.7MPa，時間 60min。
[0096]螯合處理(Q):漿濃10%,1.0% EDTA, ρΗ3.0，溫度 70。。，時間 60min。
[0097]過氧化氫漂白(P):漿濃10%，Η2022.0%，NaOH 2.0%，MgSO40.05%。，溫度 90°C，時間4h。
[0098]2、漂白效果:桉木硫酸鹽漿經過氧脫木素(O)，然後用量2.0IU/g(對絕幹漿)的漆酶處理(L)，再經QP漂白，紙漿白度可以達到85% IS0，紙漿的黏度下降很少。
[0099]實施例5
[0100]馬鈴薯浸出液的製備:稱取250g新鮮馬鈴薯，去皮切片後於1000mL去離子水中煮沸30min,冷卻後用紗布過濾,濾液用去離子水定容至1000mL。
[0101]PDA培養基:每升馬鈴薯浸出液中加入無水葡萄糖20g，瓊脂20g。
[0102]種子培養基:每升馬鈴薯浸出液中加入無水葡萄糖30g，蛋白腖6g，KH2PO4 3g，MgSO4.7H203g。
[0103]發酵培養基:每升種子培養基中加入經粉碎的蔗渣10g，發酵專用消泡劑0.2mL,丁香醒 3mmol0 [0104]1、菌種懸浮液的製備
[0105]將白腐菌Panus conchatus由PDA斜面培養基轉接入裝有50mL種子培養基的300mL三角瓶中，在搖床中140rpm、28°C震蕩培養3d後，培養液經無菌紗布過濾，菌絲體用無菌水洗淨並在高速打碎杯中打散約IOs,收集於無菌水中製成菌種懸浮液備用。
[0106]2、發酵罐產酶
[0107]將製備好的菌種懸浮液於無菌條件下接種入裝有發酵培養基的發酵罐中，發酵罐裝液量3L，接種量500mL。本發明採用的發酵罐為5L全自動機械攪拌式發酵罐，其各項運行參數可以通過與之相聯的數字式控制器調節。接種後控制機械攪拌轉速為150rpm，發酵一段時間後，由於菌絲體大量繁殖，發酵液粘稠度顯著增大，因此將攪拌轉速提高至300rpm以促進物料的均勻分布。培養液溫度通過循環冷凝水維持在40°C，同時向發酵罐中通入空氣以維持發酵液的溶氧度，通氣量為l.0Lpm，總發酵時間為13天。發酵培養基中加入的生物發酵專用消泡劑可以避免菌體代謝和機械攪拌產生的泡沫對管路的堵塞。
[0108]發酵後測定酶活,漆酶活力高達200IU/mL以上。
[0109]3、漆酶製劑的獲得
[0110]發酵液經紗布過濾除去菌絲體和蔗渣後，4°C下5000r/min冷凍離心15min，分離除去細小顆粒物質，收集上清液即得工業用漆酶製劑。
[0111]漆酶製劑用於紙漿漂白
[0112]1、漂白工藝條件:
[0113]漆酶處理(L):紙漿(漿濃10% )在0.5MPa氧壓下，在50°C和ρΗ5.0的緩衝溶液中，加入2.0IU/g本實施例獲得的漆酶(對絕幹楽；)及I %的硝基腐殖酸(nitrohumicacid, NHA)(介體)，在帶電動攪拌的高壓釜中處理2h，洗淨。
[0114]氧脫木素(0):氧脫木素是在帶電動攪拌的高壓釜中進行。條件為:漿濃10%，MgSO4 用量 0.5%，NaOH 用量 2.0%，氧壓為 0.7MPa，時間 60min。
[0115]螯合處理(Q):漿濃10%，l.0%EDTA，pH3.0，溫度7(rC，時間60min。
[0116]過氧化氫漂白(P):漿濃10 %，H2O2 2.0%, Na0H2.0 %，MgSO40.05 %。，溫度 90 °C，時間4h。
[0117]2、漂白效果:馬尾松漿經過氧脫木素(0)，然後用量2.0IU/g(對絕幹漿)的漆酶處理(L)，再經QP漂白，紙漿白度可以達到83% IS0，紙漿的黏度下降很少。
[0118]實施例6[0119]馬鈴薯浸出液的製備:稱取220g新鮮馬鈴薯，去皮切片後於1000mL去離子水中煮沸30min,冷卻後用紗布過濾,濾液用去離子水定容至1000mL。
[0120]PDA培養基:每升馬鈴薯浸出液中加入無水葡萄糖20g，瓊脂20g。
[0121]種子培養基:每升馬鈴薯浸出液中加入無水葡萄糖40g，蛋白腖4g，KH2PO4 3g，MgSO4.7H203g。
[0122]發酵培養基:每升種子培養基中加入經粉碎的玉米杆18g，發酵專用消泡劑
0.2mL,香草酸 4mmol。
[0123]1、菌種懸浮液的製備
[0124]將白腐菌Panus conchatus由PDA斜面培養基轉接入裝有50mL種子培養基的300mL三角瓶中，在搖床中160rpm、28°C震蕩培養3d後，培養液經無菌紗布過濾，菌絲體用無菌水洗淨並在高速打碎杯中打散約IOs,收集於無菌水中製成菌種懸浮液備用。
[0125]2、發酵罐產酶
[0126]將製備好的菌種懸浮液於無菌條件下接種入裝有發酵培養基的發酵罐中，發酵罐裝液量3L，接種量500mL。本發明採用的發酵罐為5L全自動機械攪拌式發酵罐，其各項運行參數可以通過與之相聯的數字式控制器調節。接種後控制機械攪拌轉速為150rpm，發酵一段時間後，由於菌絲體大量繁殖，發酵液粘稠度顯著增大，因此將攪拌轉速提高至280rpm以促進物料的均勻分布。培養液溫度通過循環冷凝水維持在37°C，同時向發酵罐中通入空氣以維持發酵液的溶氧度，通氣量為l.0Lpm，總發酵時間為14天。發酵培養基中加入的生物發酵專用消泡劑可以避免菌體代謝和機械攪拌產生的泡沫對管路的堵塞。
[0127]發酵後測定酶活,漆酶活力高達200IU/mL以上。
[0128]3、漆酶製劑的獲得
[0129]發酵液經紗布過濾除去菌絲體和玉米杆殘渣後，4 °C下5000r/min冷凍離心15min,分離除去細小顆粒物質，收集上清液即得工業用漆酶製劑。
[0130]漆酶製劑用於紙漿漂白
[0131]1、漂白工藝條件:
[0132]漆酶處理(L):紙漿(漿濃10% )在0.5MPa氧壓下，在50°C和ρΗ5.0的緩衝溶液中，加入2.0IU/g本實施例獲得的漆酶(對絕幹楽；)及I %的硝基腐殖酸(nitrohumicacid, NHA)(介體)，在帶電動攪拌的高壓釜中處理2h，洗淨。
[0133]氧脫木素(0):氧脫木素是在帶電動攪拌的高壓釜中進行。條件為:漿濃10%，MgSO4 用量 0.5%，NaOH 用量 2.0%，氧壓為 0.7MPa，時間 60min。
[0134]螯合處理(Q):漿濃10%,1.0% EDTA, ρΗ3.0，溫度 70。。，時間 60min。
[0135]過氧化氫漂白(P):漿濃10 %，H2O2 2.0%, Na0H2.0 %，MgSO40.05 %。，溫度 90 °C，時間4h。
[0136]2、漂白效果:竹漿經過氧脫木素(0)，然後用量2.0IU/g(對絕幹漿)的漆酶處理(L)，再經QP漂白，紙漿白度可以達到82 % ISO,紙漿的黏度下降。[0137]本領域技術人員不脫離本發明的實質和精神， 可以有多種變形方案實現本發明，以上所述僅為本發明較佳可行的實施例而已，並非因此局限本發明的權利範圍。此外，應當理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
【權利要求】
1.一種真菌漆酶的發酵生產方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟: 1)將真菌接種於種子培養基上培養2~4天，培養液經無菌紗布過濾後得到的菌絲體用無菌水洗淨，再將菌絲體高速打散約10秒後收集於無菌水中製成菌種懸浮液，所述真菌為白腐菌 Panus conchatus ； 2)將所述菌種懸浮液接種於含3~5L發酵培養基的發酵罐中培養10~15天,得到發酵液； 3)將所述發酵液過濾或離心後獲得漆酶製劑。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述種子培養基每升含20%~30%馬鈴薯浸出液、10~50g無水葡萄糖、I~IOg蛋白腖、3gKH2P04、3gMgS04.7H20。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述發酵培養基為每升種子培養基中加入5~20g天然底物和I~5mmol誘導劑。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述天然底物為茶葉、稻草、麥草、花生殼、麥麩、豆柏、蔗渣、桔皮、玉米杆粉中的一種或兩種以上。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述天然底物為麥麩。
6.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述誘導劑為黎蘆醇、愈創木酚、二甲苯胺、阿魏酸、丁香醛、單寧酸、香草酸、香豆酸、硫酸銅中的一種或兩種以上。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述誘導劑為硫酸銅。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟I)中的培養溫度為28°C，轉速為120 ~180rpm。·
9.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述步驟2)中的培養溫度為28°C~40°C，攪拌速度為150~300rpm。
10.如權利要求1所述的方法獲得的漆酶製劑在紙漿漂白中的應用。
【文檔編號】C12N9/02GK103571801SQ201210270321
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月1日 優先權日:2012年8月1日
【發明者】付時雨, 傅愷, 王劍英, 張清輝, 王宏 申請人:深圳市綠微康生物工程有限公司