密碼子優化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因的製作方法

2023-11-12 02:59:12 1

專利名稱：密碼子優化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種按大腸桿菌密碼子偏愛性優化的的7α-羥基類固醇脫氫酶(7a-HSDH)基因。
背景技術：
熊膽是名貴的中藥材，用於治療膽結石疾病以及各種急性、慢性肝病，具有良好的治療效果。熊去氧膽酸(3 α -7 β - 二羥基-5 β -膽烷酸，以下簡稱UDCA)以及牛磺/甘氨熊去氧膽酸(T/GUDCA)是中藥材熊膽的主要有效成份。然而，由於中藥熊膽粉主要的獲取方式為「活熊引流取膽」，這有違野生動物保護法。並且被認為是非常不人道的獲取方式。另外，化學合成法過程複雜、得率較低。然而動物膽汁中存在眾多膽酸類物質，如牛、羊膽酸、鵝去氧膽酸、熊膽酸、豬膽酸、豬去氧膽酸等，這些物質可以通過適當的生物培育轉化成UDCA及其衍生物，其中在雞膽汁中鵝去氧膽酸(CDCA)以及牛磺/甘氨鵝去氧膽酸(Τ/ G⑶CA)含量豐富。⑶CA與UDCA的差別僅在於7位羥基的差向異構，利用7 α、7 β -羥基類固醇脫氫酶(7 α、7 β -HSDH)可以將CDCA、T/GCDCA轉化為UDCA、T/GUDCA。來自撒丁島梭菌(Clostridium sardiniense，DSM599/ATCC27555)的 7 α、7 β-HSDH 酶可以實現上述轉化過程。因此，為了快速獲取大量的和高純度的7 a -HSDH酶，本發明提出通過密碼子優化的7a-HSDH酶基因在大腸桿菌中進行原核表達。原核表達在短時間內可以得到大量產物，而為了得到有活性、結構完整的目的蛋白，分析基因中使用頻率較低的密碼子並進行替換從而得到優化的基因序列是十分必要的。另外，原核表達時採用原核表達載體pGEX-6p-l與目的基因進行GST融合表達，得到的融合表達蛋白往往具有正確的空間結構和相應的酶活，並且GST融合蛋白純化方法簡單快速，從而能夠快速得到有活性的目的蛋白。

發明內容
鑑於此，本發明的目的之一是提供密碼子經過改造且mRNA 二級結構穩定的密碼子優化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO. I所示。該優化基因在不改變蛋白質胺基酸序列的前提下，綜合考慮密碼子使用頻率，按照大腸桿菌的偏愛性進行優化，使其在宿主細胞中的表達量和純度顯著提高；本發明的目的之二是提供含密碼子優化的7 α -羥基類固醇脫氫酶基因的重組表達載體 pGEX-6p-l-7 a -HSDH ；本發明的目的之三是提供含密碼子優化的7 α -羥基類固醇脫氫酶基因的重組表達載體的大腸桿菌。本發明採用密碼子優化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因與原核表達載體pGEX-6p-l在大腸桿菌中GST融合表達，在短時間內可以生成大量有活性、結構完整的目的蛋白，而且GST融合蛋白純化方法簡單快速，從而能夠快速得到有活性的目的蛋白。


圖I為本發明優化前後7 a -HSDH基因序列比較圖2Α為本發明7 a -HSDH基因優化前表達的7 α -羥基類固醇脫氫酶的聚丙烯醯胺凝膠電泳2Β為本發明7 a -HSDH基因優化後表達的7 α -羥基類固醇脫氫酶的聚丙烯醯胺凝膠電泳3為本發明不同pH條件下優化的7 a -HSDH催化⑶CA氧化的酶活比較
具體實施例方式下面將結合實施例和附圖來詳細說明本發明，這些實施例和附圖僅起說明性作用，並不局限於本發明的應用範圍。本發明不限於下述實施方式或實施例，凡不違背本發明精神所做出的修改及變形，均應包括在本發明範圍之內。 實施例1:7α-羥基類固醇脫氫酶基因的優化設計和合成稀有密碼子的分析稀有密碼子主要通過軟體Ε. coli Codon Usage Analysis2. O(Morris Maduro,參考Analysis and Predictions from Escherichia coli sequencesin:Escherichia coli and Salmonella, Vol. 2，Ch. 114:2047-2066，1996，Neidhardt FCed.，ASM press, Washington, D. C.)分析得到在大腸桿菌中的使用相對頻率低於閾值(10%。)的密碼子。優化稀有密碼子根據不同密碼子在大腸桿菌中的使用頻率將使用頻率低於閾值的密碼子進行優化。優化結果如下本發明所用的優化密碼子
優化前I優化後I胺基酸I優化前I優化後I胺基酸 AAGAAACTACTG
ACAACCThrCTCCTG
AGACGCAriGGAGGCGl^
AGGCGCAriGTAGTGV^l
AGTAGCS^rTCAAGCS^r
ATAATT Τ^TCCAGCS^r
CAACAGGinTGTTGC
CCACCGProTTACTGΠ
CCTCCGPro優化前後的7 a -HSDH基因序列如圖I所示，紅色部分為優化前後變化的核苷酸序列，點「......」表示優化前後未改變的核苷酸序列。優化後的7 a -HSDH的序列與優化前
的序列的同源性為81%。優化後的7 a -HSDH基因序列如SEQ ID NO. I所示。密碼子優化後7 a-HSDH基因進行全基因合成，且在基因前後兩端分別添加了BamHI和Not I酶切位點。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。實施例2 :優化的7 α -羥基類固醇脫氫酶基因的重組表達載體pGEX-6p-l-7 a -HSDH的構建和含該重組表達載體的大腸桿菌的獲得⑴菌株和質粒大腸桿菌BL21菌株，購自天津博美科生物技術有限公司。表達載體pGEX_6p_l :購自 GE 公司(GE Healthcare)。
⑵重組表達載體的構建和含該重組表達載體的大腸桿菌的獲得利用限制性內切酶BamH I /Not I雙酶切優化後的基因並回收目的基因片段；用限制性內切酶BamH I /Not I雙酶切原核表達載體pGEX_6p-l並回收目的載體片段；連接，利用熱擊法轉化大腸桿菌；PCR篩選陽性克隆，再進行測序驗證，得到序列完全正確的重組表達載體pGEX-6p-l-7 a -HSDH及含該重組表達載體的大腸桿菌。實施例3 :優化的7 α -羥基類固醇脫氫酶基因在大腸桿菌中的表達將轉入成功的大腸桿菌重組菌株按5%的添加量加入LB液體培養基中，220rpm、37°C培養。待0D600為O. 5時，16°C IPTG誘導12小時，使大腸桿菌產生GST融合蛋白。將誘導完成的大腸桿菌IOOOOrpm離心3min收集菌體，300W超聲破壁菌液5min至澄清；4°C 14000rpm離心15min收集上清液；上清液與穀胱甘肽瓊脂糖凝膠4B(Glutathione Sepharose 4B medium,購自 GE healthcare 公司)4°C 結合 2h 使 GST 融合蛋白結合於穀胱甘肽瓊脂糖凝膠中，再利用預冷的五倍體積O. 25%吐溫20的PBS (IOOmM)溶液衝洗三次，利用預冷的五倍體積PBS (IOOmM)衝洗三次。再利用PreScission Protease酶4°C直接酶切含GST融合蛋白的穀胱甘肽瓊脂糖凝膠12h，離心得到目的蛋白。10%聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE )鑑定。優化前後表達的7α-羥基類固醇脫氫酶的聚丙烯醯胺凝膠電泳鑑定結果如圖2Α和圖2Β所示，圖2Α為優化前的電泳圖，圖2Β為優化後的電泳圖，圖中「酶切前」的電泳條帶為直接將含有GST融合蛋白的穀胱甘肽瓊脂糖凝膠切取小部分電泳獲得，圖中「酶切後」的電泳條帶為用PreScission Protease酶酶切GST融合蛋白且離心得到的目的蛋白進行電泳而獲得，圖中箭頭所指為7 α -羥基類固醇脫氫酶的蛋白條帶，大小約26kDa，與理論值一致。通過BandScan軟體分析凝膠圖中箭頭所指的目的蛋白條帶的灰度，計算目的蛋白7 α -羥基類固醇脫氫酶的含量，結果顯示優化後7 a -HSDH的純度由89. 4%提高到了95. 6%。實施例4 :不同pH條件下優化的7 a -HSDH催化⑶CA氧化酶活的測定將PreScission Protease酶酶切後離心得到的優化的目的蛋白通過二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid, BCA)(Thermo Scientific 公司)法測定蛋白濃度為 2mg/mL。按 1:1加入無菌甘油，混勻並分裝。-80°C保存。酶活測定原理7 a -HSDH可以催化⑶CA氧化生成7_酮石膽酸(7-KLCA)，同時將氧化型輔酶II (NADP+)轉化成為還原型輔酶II (NADPH)，後者在340nm處有特異的光吸收，所以通過測定反應體系在340nm處光吸收在單位時間內的增加量可以計算出7-KLCA在單位時間內的生成量，進而得到7 a -HSDH催化⑶CA的酶活力。NADPH標準曲線的測定:取O. IM NADPH母液稀釋得到濃度為O. 005,0. 01,0. I、
O.2,0. 3,0. 4mM NADPH標準溶液，檢測340nm處的光吸收值。以NADPH濃度為X軸、340nm處的光吸收值為Y軸繪製NADPH的標準曲線。酶活測定具體步驟室溫條件下，向比色皿中加入196 μ L 10mg/mL⑶CA甲醇溶液，將甲醇揮發完全；加入2mL磷酸鹽緩衝液(PBS)，充分吹打混勻(⑶CA終濃度為2. 5mM)；加入4 μ L O. IM NADP+溶液(NADP+終濃度為O. 2mM);加入10 μ L上述保存的7 a -HSDH0混勻後立即置於分光光度計中調零。開始計時，每分鐘讀取一次340nm處光吸收的變化值。光吸收的變化值通過NADPH的標準曲線方程換算成底物在單位時間內的增加量。進而計算出酶的活力。酶活力單位(U)定義在上述反應條件下，催化每分鐘生成I μ mol7-酮石膽酸(7-KLCA)所需的酶量定義為一個酶活單位。 不同pH (6. 5-9)環境下，優化的7 a -HSDH的相對活性比較如圖3所示，橫坐標為PH值，縱坐標為7 a -HSDH催化⑶CA氧化的相對活性，則PH為8. O時7 a -HSDH的活性最高，PH為7. 5時次之。上述實施例說明通過密碼子優化的7 a -HSDH基因在大腸桿菌中經融合表達和酶切得到了純度更高的且有活性的目的蛋白，純度高相應地說明了有活性的目的蛋白的量的提聞。最後說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的宗旨和範圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求範圍當中。附本發明設計的DNA序列SEQ ID NO. I密碼子優化的7 α -羥基類固醇脫氫酶基因核苷酸序列
ATGAAACGCCTGGAAGGCAAAGTGGCAATTGTGACCAGCTCTACTCGTGGCATTGGCCGTGCATCTGCAGAAGCACTGGCAAAAGAAGGTGCTCTGGTGTATCTGGCAGCACGTAGCGAGGAACTGGCTAATGAAGTTATTGCAGATATTAAAAAACAGGGTGGCGTGGCTAAATTTGTTTACTTTAATGCTCGTGAAGAAGAAACTTACACTAGCATGGTGGAAAAAGTTGCTGAAGCTGAAGGCCGCATTGATATTCTGGTTAATAACTACGGTGGCACCAATGTTAATCTGGATAAAAACCTGACTGCTGGCGATACCGATGAATTCTTTCGCATTCTGAAAGATAACGTTCAGAGCGTGTACCTGCCGGCAAAAGCTGCTATTCCGCATATGGAAAAAGTGGGCGGTGGCAGCATTGTTAATATCAGCACTATTGGCAGCGTTGTTCCGGATATTAGCCGCATTGCTTACTGCGTGAGCAAAAGCGCTATTAACTCTCTGACTC
AGAACATTGCACTGCAGTATGCACGCAAAAATATCCGCTGCAATGCAGTGCTGCCGGGTCTGATTGGCACTCGCGCAGCACTGGAAAATATGACTGATGAATTTCGCGACAGCTTCCTGGGCCATGTTCCGCTGAATCGCGTGGGCCGCCCGGAAGATATTGCAAATGCAGTTCTGTACTATGCCTCTGATGATAGCGGTTATGTGACCGGCATGATTCATGAAGTTGCAGGCGGTTTTGCACTGGGCACTCCGC
AGTATAGCGAATACTGCCCGCGCTAA
權利要求
1.密碼子優化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因，其特徵在於其核苷酸序列為SEQIDNO. I所示。
2.含權利要求I所述密碼子優化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因的重組表達載體pGEX-6p-l-7a -HSDH。
3.含權利要求2所述重組表達載體的大腸桿菌。
全文摘要
本發明公開了密碼子優化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因、含所述優化基因的重組表達載體pGEX-6p-1-7α-HSDH和含所述重組表達載體的大腸桿菌。本發明採用密碼子優化的7α-羥基類固醇脫氫酶基因與原核表達載體pGEX-6p-1在大腸桿菌中GST融合表達，在短時間內可以生成大量有活性、結構完整的目的蛋白，而且GST融合蛋白純化方法簡單快速，從而能夠快速得到有活性的目的蛋白。
文檔編號C12N15/53GK102827848SQ20121026049
公開日2012年12月19日 申請日期2012年7月25日 優先權日2012年7月25日
發明者王伯初, 婁德帥, 譚君, 祝連彩, 季慶治, 岑小惜, 劉紹勇 申請人:上海凱寶藥業股份有限公司