雷公藤內酯醇衍生物及其應用的製作方法

2023-12-05 15:56:16 2

專利名稱：雷公藤內酯醇衍生物及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種雷公藤內酯醇衍生物，其生產方法，在生產治療癌症的藥物中的應用，以及含有這種化合物的藥物組合。
雷公藤具有抗癌作用已為國內外學者所證實。1972年Kuphchan(1)就從雷公藤中分離獲得含環氧的二萜化合物，即雷公藤內酯醇(triptolide)，用於抗腫瘤研究。雷公藤內酯醇在0.2及0.25mg/kg ip時，能延長L615白血病小鼠的存活時間，且存活小鼠經數次攻擊不致白血病。在1ng/ml劑量時可抑制人鼻咽癌KB細胞的體外增殖(張覃沐，陳正玉，林晨，雷公藤內酯醇抗腫瘤作用及對小鼠免疫功能的影響，中國藥理學報，1981；2(2)128)，在抑制乳腺癌和胃癌細胞集落形成時，其強度與抑制人白血病HL-60細胞相近，IC50為0.504-1.22μg/L。對人宮頸癌Hela細胞動力學影響的實驗發現，雷公藤內酯醇對時相同步化細胞均有殺傷作用，並對S期細胞敏感。實驗還證明，雷公藤內酯醇在抗腫瘤的同時，能抑制RNA及蛋白質的合成，並選擇性地使磷酸果糖激酶上的巰基失活，抑制肝糖元合成，使RNA聚合酶失活，幹擾DNA的複製(許建華，李長春，黃自強，雷公藤內酯醇對Hela細胞的細胞動力學影響，中國藥理學報，1989；10(6)550)。由於雷公藤環氧二萜內酯化合物具有較強的生物活性和應用前景，引起研究者們的廣泛興趣，對它們的化學合成、結構修飾以及生物活性研究至今持續不斷(Berchtold GA et al，J Am Chem Soc，1980，1021200；Tamelen EEet al.J Am Chem Soc，1982，1041785)。早在80年代初期，就已成功地化學合成了雷公藤內酯醇，但由於反應路線長，步驟多且反應苛刻，最終獲得的目標產物僅有理論研究價值。於德泉等(於德泉，張東明，王淮濱，梁曉天，雷公藤內酯醇的結構修飾，藥學學報，1992，27(11)830)對雷公藤內酯醇作了大量的化學結構修飾，曾獲得許多有價值的產物。雷公藤內酯醇是雷公藤中的主要有效成分之一，儘管用量小，但其生物活性有效劑量接近其LD50臨床仍表現出相當毒性，故妨礙了進一步開發和臨床應用。另外從目前的文獻報導來看，國內外對雷公藤環氧二萜類化合物的生物活性研究仍是大部分集中在免疫抑制上，而對它們的抗腫瘤作用的研究不是很多，其原因是與其它具有免疫抑制作用的天然產物相比，雷公藤環氧二萜類化合物更具特色。但近期的研究表明，自身免疫系統性疾病如風溼性關節炎、糖尿病視網膜病變、紅斑性狼瘡等與腫瘤的生長一樣，都涉及到病變的新生血管生成，這些病都可稱之為「血管生成性疾病」。因此，作為治療風溼性關節炎和其它新生血管生成疾病的化合物也可能表現出對腫瘤的抑制作用(Folkman J，Nature Med，1995，127)。
分子腫瘤學研究所取得的進展為治療腫瘤提供了許多如癌基因、抑癌基因以及其它可供利用的抗癌藥物作用的靶點，如能找到藥物攻擊癌細胞的靶點尤其拮抗癌基因及其異常表達產物的藥物，對抗腫瘤藥物的研究和發展將具有重要的價值。凋亡及與凋亡有關的癌基因是抗腫瘤藥物篩選的重要靶點。雷公藤內酯醇可誘導淋巴細胞凋亡的研究(Yang YL，et al，Immunopharmacology 1998；40139)表明在誘導凋亡的早期雷公藤內酯醇激活凋亡相關蛋白酶。T12對多種腫瘤細胞有很強的殺傷作用，毒性也遠遠低於雷公藤內酯醇；從分子水平研究T12的作用機制也發現，該化合物誘導腫瘤細胞凋亡，並引發凋亡相關蛋白酶的激活，改變凋亡程序或凋亡程序的基因產物即降解Bcl-2癌蛋白，T12引發的這種活性明顯強於雷公藤內酯醇，使它有希望成為一種新型、低毒的抗腫瘤藥物。
本發明的一個目的是提供一種毒性低，臨床應用價值高的雷公藤內酯醇衍生物。
本發明的又一個目的是提供一種本發明的雷公藤內酯醇衍生物的用途。
本發明的另一個目的是提供一種生產本發明的雷公藤內酯醇衍生物的方法。
本發明的再一個目的是提供一種含有本發明的雷公藤內酯醇衍生物的藥物組合物。
本發明提供了一種雷公藤內酯醇衍生物，其結構式為 其中，R1是H，含有1-4個碳原子的烷基，-Ac-C(＝O)(CH2)nCO2H，或者是胺基酸基，其中，n為1-4的整數；R2是-SCN，-NCS。由於分子內重排，-SCN和-NCS之間可能會發生轉換。
在本發明的化合物中，優選R2是-SCN；R1是H。
於德泉等用不同試劑打開雷公藤內酯醇的12，13-環氧而得到包括12-位滷素(Cl，Br)的一系列雷公藤內酯醇衍生物。12-位為滷素的雷公藤內酯醇衍生物進入體內後，在酶促作用下，C12，13-可能重新關環，回復為前體化合物雷公藤內酯醇，從而再度表現前體化合物雷公藤內酯醇的毒性。本發明用雷公藤內酯醇為原料，在溫和反應條件下，用硫氰酸銨進行C-12，13的開環反應，獲得新型高抗腫瘤活性，低毒的12-β-硫氰酸基-13-α-羥基雷公藤內酯醇(以下簡稱T12)，其結構式如下 其中，R1是H，含有1-4個碳原子的烷基，-Ac-C(＝O)(CH2)nCO2H，或者是胺基酸基，其中，n為1-4的整數。R1基團可通過公知的方法加入。
本發明還提供了一種生產上述化合物的方法，包括將如下式所示的結構在加熱條件下與硫氰酸反應， 其中，R1是H，含有1-4個碳原子的烷基，-Ac-(＝O)(CH2)nCO2H，或者是胺基酸基，其中，n為1-4的整數。
本發明的上述方法中，所述反應最好是在有機溶劑中在65-87℃的條件下進行的。所述的有機溶劑最好是叔丁醇。
本發明還提供了一種上述化合物在製備治療癌症的藥物中的應用。
在上述應用中，所述的癌症可以是乳腺癌，肺癌，腎癌，惡性黑色素瘤，結腸癌和卵巢癌。而對腎癌，卵巢癌，乳腺癌，結腸癌和惡性黑色素瘤具有更好的效果。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有抑制癌細胞生長有效量的本發明的化合物以及藥物上可接受的載體。
在上述的藥物組合物中，所述的癌細胞可以是乳腺癌，肺癌，腎癌，惡性黑色素瘤，結腸癌和卵巢癌。最好是腎癌，卵巢癌，乳腺癌，結腸癌和惡性黑色素瘤細胞。
本發明還提供了另外一種藥物組合物，它含有抑制癌細胞生長協同有效量的本發明的化合物和bcl-2反義核苷酸，以及藥物上可接受的載體。
附圖簡要說明

圖1表示T12誘導細胞凋亡的DNA降解狀態。圖2表示T12誘導HL-60細胞和Bre-01細胞Bcl-2發生降解。圖3表示T12誘導bcl-2發生降解的強度並與其它三種化合物的比較。圖4表示本發明的化合物與反義核酸協同作用Col-06細胞的結果。
實施例112-β-硫氰酸基-13-α-羥基雷公藤內酯醇的製備方法；取3.6g(0.01mol)雷公藤內酯醇溶於400ml叔丁醇中，於50℃下攪拌加熱溶解，待完全溶解後，加入11.4g(0.15mol)硫氰酸銨。升溫至80℃，反應24hrs，反應畢。反應液加入400ml乙酸乙酯，有機層用飽和氯化鈉水溶液洗3次，MgSO4乾燥，過濾，於60℃下蒸除溶劑，剩餘物加入丙酮溶解。TLC檢測，氯仿∶甲醇(95∶5)展開，T12為主要點，含少量T和其它副產物。丙酮液加入10g 100-200目矽膠拌樣，除盡丙酮，200-300目矽膠柱層析分離，先用氯仿洗脫除盡T，再換用氯仿∶甲醇(95∶5)洗脫，TLC跟蹤檢測，收集T12餾分，合併T12。減壓蒸除溶劑後加入少量丙酮溶解，放置，析出T12粒狀結晶3.77g，收率90％。Mp265-266℃.Rf值為0.15(CHCl3/MeOH，95∶5)，顯色劑為Kedd’s試劑，呈紫紅色。元素分析C21H25NSO6，計算值％C，60.14. H，6.01. N，3.34.實測值％C，59.85. H，5.93. N，3.26.[α]D25-114.06℃(acetone，4.17mg/ml).IR(KBr)cm-13450，3000，2152，1739，1674，1441，1032，980。MS m/z(％)419(M+，13)，404(-CH3，14.5)，361(- ，13)，343(-H2O，13)，271(14)，241(23)，151(48)，137(89)，72(91)，61(100)。1HNMR，δppm0.8(3H，d，J＝6.77Hz，16-CH3)，0.95(3H，s，20-CH3)，0.99(3H，d，J＝6.88Hz，17-CH3)，1.28(1H，m，1-αH)，1.45(1H，m，1-βH)，1.85(1H，t，J＝14.17Hz，6-βH)，2.0(1H，m，2-H)，2.18(1H，m，2-H)，2.20(1H，m，6-αH)，2.25(1H，m，15-H)，2.67(1H，m，5-H)，3.0(1H，d，J＝4.4Hz，14-H)，3.35(1H，m，7-H)，3.75(1H，d，J＝5.61Hz，11-H)，3.90(1H，d，J＝5.87Hz，12-H)，4.85(2H，m，19-H)，5.0(1H，s，13-OH)，5.45(1H，d，J＝4.2Hz，14-OH)；13CNMR，δppm14(16-C)，15.5(20-C)，16(17-C)，17(2-C)，22.5(6-C)，29(15-C)，30(1-C)，35(10-C)，39(5-C)，51(11-C)，57.5(12-C)，60.5(8-C)，61.5(7-C)，67(9-C)，70.5(19-C)，74(14-C)，76.5(13-C)，115(SCN)，123(3-C)，162(4-C)，173(18-C)。
實施例2SRB法測定T12對20種不同腫瘤細胞的抑制作用體外培養腫瘤細胞已成為篩選抗癌藥物和進行研究的重要手段。過去常用的手段是利用動物如小鼠白血病/淋巴瘤細胞系，但人與小鼠的細胞對藥物的反應有明顯的差別，因此近年來大多已改用人體腫瘤細胞系進行體外抗腫瘤試驗。本發明的抗腫瘤試驗應用了六種細胞系，分別為肺癌(Lu-06)、乳腺癌(Bre-o1)、卵巢癌(Ov-01)、腎癌(Re-01)、結腸癌(Col-06)、惡性黑色素瘤(Mel-08)。
採用美國國立癌症研究所建立的SRB抗癌藥物篩選方法(Skehan P，Storeng R，Scudiero D et al，New colorimentric cytotoxicity assay foranticancer-drug screening.J Nalt Cancer Inst 1990；821107)對本發明進行體外抗腫瘤測試，並與其先導化合物雷公藤內酯醇(T)和另一雷公藤內酯醇衍生物8-OH雷公藤內酯醇(高活性免疫抑制劑，以下簡稱T8，見Jung，1/1999 PCT/US98/08562，WO98/52933)以及抗腫瘤植物合成藥紫杉醇進行了比較。測試方法如下將腫瘤細胞培養在含5％小牛血清的RPMI1640培養基中，內含適量青、鏈黴素和穀氨醯胺，在5％CO2，37℃條件下培養。分別將受試細胞按一定密度接種於96孔板內，24小時後給藥組換成新的含被試藥物的培養液(藥品先經DMSO溶解後，加入PBS稀釋成1mg/ml濃度，使用時按所需濃度再稀釋並加入細胞中)繼續培養48小時。每孔加入預冷的50％三氯乙酸(TCA，最終濃度為10％)50μl，靜置5分鐘後移放置4℃1小時，在自動洗板機上洗滌5次，空氣乾燥。加入100μl SRB液(用1％醋酸配製成0.4％溶液)染色10分鐘，再置洗板機上用1％醋酸溶液洗滌4次，以除去未結合染料，空氣乾燥。最後用150μl 10mmol/L非緩衝Tris溶液溶解結合的SRB，充分混勻後，用微孔板讀數儀，在波長490nm處進行自動快速比色測定，同時對數據進行處理。
表1T12和taxol作用六個腫瘤細胞系的GI50均值(μg/ml)比較細胞系 T T8 T12 TaxolLu-06(肺癌) 0.090.50.6 0.075Bre-01(乳腺癌)0.040.30.055 0.06OV-01(卵巢癌) 0.006 0.06 0.02 0.05Mel-08(黑色素瘤) 0.020.25 0.09 0.07Re-01(腎癌) 0.030.25 0.06 1Col-6(結腸癌) 0.020.10.03 0.007本發明對六個腫瘤細胞系的作用結果以及與T、T8和紫杉醇的比較如表1。本發明對六個腫瘤細胞均具有明顯的抑制作用，其作用略低於T，但明顯高於T8，抗腎癌作用顯著高於紫杉醇；對結腸癌，卵巢癌、乳腺癌以及黑色素瘤細胞也顯示很強的抑制作用。
實施例3貼壁生長細胞集落形成法測定T12對腫瘤克隆原細胞的抑制作用克隆原細胞是指具有持續分裂能力的細胞。腫瘤的生長、轉移和復發均以克隆原細胞的增殖為基礎。當單個細胞連續分裂6代或以上時，可形成彼此不接觸的集落群體，通過計數集落可定量分析克隆原細胞，是一種較靈敏的檢測方法。集落形成測試方法如下所述取指數生長期貼壁Re-01細胞，經Trypsin-EDTA消化後製成單個分散細胞懸液，進行活細胞計數，用RPMI1640培養基稀釋細胞密度為500個/ml。取35ml培養皿，每三個一組，加入稀釋後的細胞懸液，本發明以10倍稀釋成五種不同濃度(0.001～10μg/ml)加入，同時設藥物空白組。細胞與藥物混勻後置含5％CO2的37℃溫箱中培養14天。棄去培養液，常規Giemsa染色細胞並計數含50個細胞以上的集落。集落抑制率(％)＝(1-給藥組集落數/對照組集落數)×100以腎癌Re-01細胞係為材料，測定了T12對其集落形成的抑制作用，結果為T12作用濃度為0.1ug/ml時，可完全抑制Re-01克隆原細胞的生長；作用濃度為0.01ug/m和10.001ug/ml，抑制率分別為85％和28％。
實施例4人癌裸鼠異種移植物的實驗治療以往通過多種小鼠模型發現的抗腫瘤藥主要對惡性淋巴瘤和白血病有效，而且小鼠腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性高於人體腫瘤細胞。裸鼠具有胸腺依賴性功能缺乏，異種移植時無排斥反應。異種移植後的人體腫瘤在裸鼠體內仍保持其原有的組織形態及免疫學特徵以及染色體組型和對抗腫瘤藥物的原有敏感性。將人體惡性黑色素瘤細胞Mel-08接種裸鼠體內，異種移植方法如下所述藥物配製取相應量樣品，加適量的吐溫80助懸，以0.5％CMC-Na溶液配製成所需濃度的混懸液(每個劑量0.5ml/鼠)。
免疫功能缺陷裸鼠，體重17-19克，6-8周齡，均為雌性。試驗組和陽性對照組均為6隻，陰性對照組為12隻。陽性對照藥物為氮烯咪胺(DTIC)，以生理鹽水配製；陰性對照給以相應的溶劑。
試驗的主要步驟取生長旺盛的荷瘤動物，無菌條件下以勻漿法製備人體惡性黑色素瘤成細胞懸液，以相應宿主每鼠腋皮下接種0.2ml/只，次日按實驗設計方案腹腔給藥，連續十四天，4mg/kg/日。實驗結束後解剖各組動物，剖取腫瘤稱重，按下列公式計算腫瘤抑制率腫瘤抑制率＝[(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重]×100。
與藥物未處理組比較，腫瘤生長明顯受抑制，抑瘤率為50.17％，與已經用於臨床的陽性對照藥物氮希咪胺(20mg/kg)的結果(抑瘤率為54.92％)接近。
實施例5T12誘導細胞凋亡的凝膠電泳檢測細胞凋亡對個體發育過程中細胞衰亡與更新、保持細胞數目的相對恆定方面起著重要作用。凋亡發生變化或異常，將導致人類疾病的產生。腫瘤過去被認為是增殖、分化異常疾病，隨著對腫瘤細胞凋亡的研究，現認為腫瘤也是細胞凋亡異常的疾病。細胞凋亡異常打破了正常組織中細胞增殖與凋亡的平衡調節，導致細胞數目的不斷增加，表現出生長優勢，最終形成腫瘤。因此，可誘導腫瘤細胞凋亡的藥物是治療腫瘤的一條有效途徑。
細胞凋亡的後期由於核酸酶的活化作用，使核染色質DNA降解，並產生不同長度(180-200bp)的寡聚核小體片段，通過瓊脂糖電泳可觀察到此特徵。該特徵是目前判斷細胞凋亡發生的重要標誌。應用瓊脂糖電泳方法檢測了以1μg/ml濃度的T12作用人早幼粒白血病HL-60細胞後的DNA降解狀況。操作步驟如下所述。
經本發明處理後的HL-60細胞約3×106用含2mmol/L EDTA的PBS洗2次，加入0.3mlTBE緩衝液(Tris.HCl 50mmol/L，pH 8.0，含10mmol/LEDTA)，0.25％NP-40及Rnase A(終濃度為1％)，混勻後，37℃溫育30分鐘；再加入proteinase K(終濃度為1mg/ml)，37℃繼續溫育30分鐘。取上清液15μl加5μl上樣緩衝液，在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，紫外光下觀察結果並照相。
圖1顯示了T12處理與未處理的HL-60細胞的DNA降解狀態。T12分別處理細胞4、12、24小時後，在1.5％的瓊脂糖膠上出現清晰的DNA梯狀條帶(DNA降解標誌，孔3-5)，未經T12處理和經處理2小時的細胞未產生DNA梯狀條帶(孔1、2)，表明T12可誘導腫瘤細胞凋亡。
實施例6流式細胞儀檢測細胞凋亡和細胞周期分布細胞凋亡的某些特徵也能夠通過用流式細胞儀的檢測反應出來，以此判定凋亡的發生，同時也是進行藥物作用後細胞周期分布檢測的可靠工具。流式細胞儀分析方法如下所述。
經本發明分別處理和未處理的Re-01和HL-60細胞2×106，分別於不同時間收集細胞，1000rpm/分離心5分鐘，去上清，沉澱用PBS洗滌兩次，再以1∶9比例加入70％乙醇固定細胞，混勻後-20℃過夜。再次離心收集細胞，PBS洗滌兩次，加入1ml 20μg/ml PI染色液(用40mM Na2HPO4/檸檬酸緩衝液，pH7.8；0.25mg/ml Rnase A)，室溫染色30分鐘。在Epics Elite流式細胞儀上(COULTER公司，US)，以488nm雷射為光源，檢測紅色螢光信號，結果分析軟體為Elite 4.0和DNA Multicycle。
表2T12處理HL-60細胞不同時間的DNA含量分析(％)處理時間(h)0 2 4 8 24Sub-G1 9.1 28.9 74.8 79.879.8表3T12處理Re-01細胞不同時間的DNA含量分析(％)處理時間(h)0 12 24 48 72Sub-G1 5.1 10.3 27.4 54.090.0如表2、3所示，以T12(1μg/ml)分別HL-60細胞處理2小時，Re-01細胞12小時即可誘導細胞出現DNA含量小於2倍體的亞G1凋亡峰，並隨作用時間的延長亞G1凋亡峰含量增加。
表4T12對HL-60細胞作用不同時間的細胞周期變化作用時間(h) G0/G1 S G2/Mcontrol 32.0 53.7 14.32 29.5 59.2 11.34 71.8 25.3 2.9表5T12對Re-01細胞作用不同時間的細胞周期變化處理時間(h) G0/G1 S G2/Mcontrol 28.4 60.6 11.02438.1 36.9 25.04840.7 43.3 16.0從表4、5可以看出，未經藥物處理的HL-60細胞和Re-01兩種細胞大部分都處於S期，經T12分別處理不同時間後，可見細胞G0/G1期百分比增高，表明在1μg/ml濃度作用下，T12可明顯減少S期的細胞群體，而增加G0/G1期的細胞群體，其作用呈時間依賴性。
實施例7本發明使凋亡相關蛋白酶活化並降解Bcl-2蛋白細胞凋亡是受多因素調控的程序性死亡過程，許多癌基因、抑癌基因參與了這一過程，如bcl-2。在T12對六個腫瘤細胞的生長抑制的分析中，我們發現，異常表達Bcl-2的癌細胞表現出對本發明的特異敏感性，GI50顯著低於Bcl-2表達陰性或低水平表達的癌細胞(如表6所示)。
表6部分過度表達和低水平表達Bcl-2細胞的GI50比較Bre-01*Bre-07 Col-06*Col-05 Mel-08*Mel-050.055 0.3 0.03 0.2 0.07 0.25「*」表示高表達Bcl-2的細胞系(Western blot檢測)因此推測T12誘導細胞凋亡的作用可能與bcl-2癌基因或其產物有關。為了證實這一推測，應用抗Bcl-2單抗並以異常表達Bcl-2的HL-60細胞為材料，進行蛋白免疫印跡反應，檢測本發明作用後Bcl-2蛋白表達狀態。方法所述如下。
經藥物處理後的HL-60細胞1×106，離心後直接懸於樣品處理液(20mmol/L Tris/HCl pH8.0，4％SDS，30％甘油，10％β-巰基乙醇和適量溴酚藍)，用微量注射器反覆抽吸，使細胞裂解，100℃煮沸3分鐘，直接上樣經12％SDS-PAGE分離，將凝膠轉移至PVDF膜上，5％脫脂奶粉封閉過夜，加入抗Bcl-2單抗，作用2小時，洗膜後用辣根過癢化物酶標記的羊抗鼠二抗孵育，化學發光法顯色處理圖2所示為T12作用HL-60細胞24，48小時(孔4，5)，與未處理細胞(孔6)比較，在蛋白印跡主帶位置(p26)的下方，增加一條可與特異單抗反應的降解條帶(相對分子量大約為20kDa)。同樣濃度的T12處理Bre-01乳腺癌細胞48小時(孔7)，也可獲得相同的印跡反應結果。但本發明不誘導淋巴瘤Ly-01細胞Bcl-2發生降解(孔1，2)。Bcl-2蛋白降解可使Bcl-2失活並加速腫瘤細胞凋亡(Yamamoto AM et al，Leukemia 1998；121467)。Bcl-2的降解提示本發明誘導細胞凋亡過程引發了可降解Bcl-2的凋亡蛋白酶的激活。進一步比較了本發明與其先導化合物triptolide、T8和雷公藤多甙粉引發HL-60細胞凋亡蛋白活性升高的差異，檢測了四種化合物在1μg/ml處理濃度下，介導凋亡蛋白酶降解Bcl-2的強度，結果如圖3本發明(孔5)介導蛋白酶降解Bcl-2的強度明顯高於其它三種化合物(孔1對照，孔2-4分別為雷公藤多甙粉、T和T8)。
實施例8本發明與反義核苷酸的協同作用反義核苷酸是90年代誕生的一種新型生物技術治療藥物，該藥物特異地、選擇性地攻擊引起疾病的基因及其特定的鹼基序列，從而阻斷其活性和蛋白質的合成，最終達到治療腫瘤的目的。癌基因bcl-2的高表達與多種人體腫瘤的發生和發展有關，其基因產物抑制腫瘤細胞的凋亡途徑。反義核苷酸作用靶基因並使之失活，具有非常高的序列特異性，但對於已經生成的癌蛋白卻束手無策。因此利用人工合成的bcl-2反義核苷酸(中國專利申請號98 1 11872.0)作用異常表達Bcl-2的癌細胞，封閉其癌基因的表達即封閉基因產物Bcl-2的生成；再利用本發明可誘導凋亡相關蛋白酶激活的作用，使已經生成的Bcl-2蛋白降解，這種新穎的聯合處理腫瘤細胞的方式，將為臨床治療腫瘤疾病提供新的思路。以結腸癌細胞Col-06為材料，先後用反義核苷酸和本發明處理。並以單獨T12和單獨反義作為對照，方法如下所述反義核苷酸體外處理採用將反義核苷酸，脂質體混和液用無血清1640按所需濃度稀釋並處理細胞，37℃培養6小時，棄去舊培養液，用無血清1640洗滌一次後，加入含10％小牛血清的培養基，37℃5％CO2條件下繼續培養至72小時；本發明組處理直接用含血清培養基稀釋至所需濃度，作用細胞48小時；本發明聯用反義核苷酸組則先經反義處理，24小時之後加入本發明，繼續作用48小時。所有測試濃度包括藥物空白細胞對照以及加藥零時細胞對照均為三復孔。檢測採用同實施例3相同的方法進行。
結果如圖4所示。單獨用本發明作用Col-06細胞，其GI50大約為0.04μg/ml，與反義聯用處理細胞GI50小於0.001μg/ml，比T12單獨作用降低了50倍以上。
實施例9本發明的急性毒性實驗毒性實驗是抗癌新藥研究的重要環節，而小鼠是毒性研究中最常用的動物。本發明的毒性實驗，採用昆明種小鼠腹腔注射單次給藥，觀察給藥後動物產生的毒性反應，並測定其半數致死量。昆明種小鼠，體重20±1克，6周齡。室溫24±2℃、相對溼度65±10％條件餵養，飼以標準全價營養顆粒飼料，自由攝食和飲水。試驗設5個劑量組，劑量間距為0.8。動物隨機分組，每組20隻，雌雄各半。給藥後觀察即時反應，記錄兩周內小鼠的死亡分布，死亡小鼠及兩周後存活小鼠進行解剖肉眼屍檢，發現有病變組織時，對該組織進行鏡檢。試驗結果以Bliss方法計算。
以腹腔注射單次給藥對昆明種小鼠急性毒性試驗的LD50值為74.42mg/kg，性別之間無顯著性差異，P值＞0.05。先導化合物雷公藤內酯醇的LD50值為0.85mg/kg體重已有報導(Folkman J Nature Med 1995，127)。與此比較，本發明的毒性明顯低於先導化合物T。
權利要求
1.一種雷公藤內酯醇衍生物，其結構式為 其中，R1是H，含有1-4個碳原子的烷基，-Ac，-C(＝O)(CH2)nCO2H，或者是胺基酸基，其中，n為1-4的整數，R2是-SCN，或者-NCS。
2.按照權利要求1所述的化合物，其特徵在於，R2是-SCN；R1是H。
3.一種生產權利要求1所述的化合物的方法，包括將如下式所示的雷公藤內酯醇在加熱條件下與硫氰酸反應， 其中，R1是H，含有1-4個碳原子的烷基，-Ac，-C(＝O)(CH2)nCO2H，或者是胺基酸基，其中，n為1-4的整數。
4.按照權利要求3所述的方法，其特徵在於，該反應是在有機溶劑中在65-87℃的條件下進行的。
5.按照權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述的有機溶劑是叔丁醇。
6.權利要求1或2所述的化合物在製備治療癌症的藥物中的應用。
7.按照權利要求6所述的應用，其特徵在於，所述的癌症是腎癌，乳腺癌，肺癌，惡性黑色素瘤，結腸癌或卵巢癌。
8.一種藥物組合物，它含有抑制癌細胞生長有效量的權利要求1或2所述的化合物以及藥物上可接受的載體。
9.按照權利要求8所述的組合物，其特徵在於，所述的癌細胞來自乳腺癌，肺癌，腎癌，惡性黑色素瘤，結腸癌或卵巢癌。
10.一種藥物組合物，它含有抑制癌細胞生長協同有效量的權利要求1或2所述的化合物和bcl-2反義寡核苷酸，以及藥物上可接受的載體。
11.按照權利要求10所述的組合物，其特徵在於所述的癌細胞來自乳腺癌，肺癌，腎癌，惡性黑色素瘤，結腸癌或卵巢癌。
全文摘要
一種雷公藤內酯醇衍生物，其結構式為右式，其中，R
文檔編號C07D493/04GK1261602SQ99111660
公開日2000年8月2日 申請日期1999年8月20日 優先權日1999年4月16日
發明者王大元, 高小平, 李文武, 李伯剛 申請人:成都地奧製藥集團有限公司, W&K國際公司