石榴皮提取物及其生產方法和應用的製作方法

2023-12-05 19:20:51

專利名稱：：石榴皮提取物及其生產方法和應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及從植物石榴的果皮中提取的提取物及其生產方法和應用的
技術領域：
，是一種石榴皮提取物及其生產方法和應用即一種石榴皮提取物及其生產方法和弱極性大孔樹脂在石榴皮提取物的生產方法中的應用。
背景技術：
：流感是由甲、乙、丙三型流感病毒所引起的急性呼吸道傳染病。三型流感病毒均為正黏科病毒，是有包膜的單股負鏈RNA病毒，其中，甲型流感病毒對人類的危害最大，可造成世界性的流感大流行；乙型多造成局部爆發；丙型則主要侵犯嬰幼兒。流感病毒傳入人群後，造成流感流行的顯著特點為突然爆發，迅速蔓延，影響面廣，發病率高並伴有一定的死亡率。傳染源主要是患者，主要傳播途徑是帶有流感病毒的空氣飛沫。死亡通常是繼發細菌感染所造成，合併症常發生於嬰幼兒、老年人和慢性病患者。流感的危害眾所周知，人類迄今尚無力阻止每10至50年一次的世界性流感大流行，近年來禽流感、甲型流感的流行不僅損害了人們的身體健康，而且由此造成巨大的經濟損失和沉重的社會負擔，因此，防治流感已成為世界各國傳染病控制的核心問題。但由於流感病毒的變異性極高，抗流感病毒藥物的研究發展緩慢。為了更積極地應對流感的大流行，國際醫藥界一直在努力尋找防治流感的有效藥物。在我國，從傳統中藥材中發掘抗流感有效物質更受到廣泛關注。B肝病毒是嗜肝DNA病毒中的一個成員，B肝病毒感染機體後進入血液循環，在白細胞中繁殖，最後定位於肝實質細胞，導致B型肝炎。B型肝炎的傳播途徑為腸道外傳播。患急性B型肝炎後，90%的患者可以臨床治癒，獲得病後免疫；10%的患者轉為慢性B型肝炎，其中一部分人將發展為肝硬化及肝癌。B型肝炎是世界性傳染病，東南亞、非洲和我國屬於高發區，人群B肝病毒感染率高達60%。B型肝炎高發區的主要流行特徵是兒童期的感染率很高，他們作為穩定的傳染源在社會上長期存在，危害人群，同時又將是肝硬化及肝癌的受害者。雖然B肝病毒基因工程亞單位疫苗可控制病毒感染的流行，但由於B型肝炎高發區均為經濟不發達地區，全員計劃免疫還無法實現。由於目前臨床上可用的抗B肝藥物非常有限，而且療效都不盡理想，對社會上大量存在的B肝患者進行有效的治療，以提高其生存質量，延長生存期，是國際醫學界需要攻克的難題。開發研製安全有效的抗B肝病毒新藥，則是廣大藥學工作者努力的方向。愛滋病毒屬人類逆轉錄病毒，為有膜的RNA病毒。人體感染愛滋病毒後，大多數患者需7至10年才發展成愛滋病並導致死亡。緩慢的病程源於愛滋病毒漸進性地破壞人體免疫功能而最終繼發危及生命的各類併發症。然而，愛滋病的傳播速度驚人，在被發現後的短短20年時間裡，這種疾病已擴散到了全球各個角落，中國雖屬於低發區，但感染者也已遠遠超過ioo萬，愛滋病的傳播給人類健康帶來了巨大威脅。在愛滋病的防治方面，雖然用疫苗預防感染一直是國際上研究的熱點，但由於愛滋病毒極易產生基因突變而逃逸免疫保護等種種原因，疫苗研製至今沒有取得突破性的進展。抗愛滋病毒化療藥物的開發取得了一定的成績，已上市的多個化藥對預防母嬰傳播和意外感染顯示了一定效果。然而，化療藥物不能完全抑制病毒複製，依賴藥物劑量的毒性、耐藥性及價格昂貴等缺陷極大地限制了其療效和廣泛的臨床應用。科學家們正在努力爭取抗愛滋病毒藥物研發的實質性進展。病毒性疾病的防治已成為國際醫學界迫切需要解決的重大難題之一，特別是流感、B型肝炎和愛滋病等世界性瘟疫，對人們的生存質量乃至社會的經濟發展影響深遠，因此，抗病毒藥物的研究是醫藥領域迫切需要取得突破的科研課題。在我國，利用傳統中藥防治病毒性疾病一向備受重視，由於中藥多組分、多靶點、多種作用機制的優勢，從中藥材中提取分離到的一些抗病毒有效成分顯示出良好的開發應用前景。石榴皮為石榴科植物石榴(P皿icagranatumL)的乾燥果皮，性酸，味澀，具有澀腸、殺蟲、止血之功效。石榴是我國重點發展的水果之一，其種植面積正向規模化發展，但佔石榴果實近三分之一的石榴皮還沒有充分利用起來，大部被廢棄，造成嚴重的資源浪費。據報導，石榴皮中含有多種化學成分，主要有黃酮類、鞣質類、石榴皮鹼以及樹脂類成分等。目前，從石榴皮中製備提取物，並用於開發抗病毒藥物的研究在國內外未見報導，採用大孔樹脂吸附技術從石榴皮中分離純化黃酮類成分的研究亦未見正式報導，且未查到有相關的專利申請或授權。本發明提供一種應用於製備廣譜抗病毒藥物的石榴皮提取物及其生產方法和弱極性大孔樹脂在石榴皮提取物的生產方法中的應用，克服了現有技術之不足，該石榴皮提取物含有30%至70%(重量百分比)的黃酮類成分和10%至30%(重量百分比)的鞣質類成分；該石榴皮提取物的生產方法首次應用弱極性大孔樹脂吸附分離技術從石榴皮粗提物中分離純化石榴皮中的黃酮類成分；該石榴皮提取物特別能用於製備治療流感和/或B型肝炎和/或愛滋病等疾病的廣譜抗病毒藥物。本發明的技術方案之一是通過以下方式得到的一種用於製備廣譜抗病毒藥物的石榴皮提取物，其按重量百分比含有30%至70%的黃酮類成分和10%至30%的鞣質類成分。下面是對上述技術方案之一的進一步優化和/或選擇該石榴皮提取物按下述步驟得到第一步，石榴皮粗粉用水和/或乙醇粗提，其中，水粗提為將石榴皮粗粉加8倍至10倍量水，在8(TC至10(TC下提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液；乙醇粗提為將石榴皮粗粉加8倍至10倍量30%至70%的乙醇，在6(TC至8(TC提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液；第二步，將上述濾液濃縮至原體積的三分之一，加相當於濃縮液體積2倍量的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱得到乙醇溶液；第三步，將上述乙醇溶液濃縮後調節ra值為3至7，上大孔樹脂層析柱吸附；其中，大孔樹脂採用HPD400、HPD600、D-101、D-201、AB-8型弱極性大孔樹脂中的一種；
發明內容第四步，以相當於3至8個層析柱體積的去離子水衝洗上述層析柱，再以30%至70%的乙醇為洗脫劑進行洗脫，洗脫劑的用量相當於3至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液並合併；第五步，將上述合併後的乙醇洗脫液在6(TC至9(TC下濃縮，回收乙醇，再在50°C至8(TC下減壓乾燥，即得所需的石榴皮提取物。本發明的技術方案之二是通過以下方式得到的一種石榴皮提取物的生產方法按下述步驟進行第一步，石榴皮粗粉以水和/或乙醇粗提；第二步，加乙醇沉澱粗提物中的雜質；第三步，乙醇溶液濃縮後調節ra值，以大孔樹脂吸附粗提物中的總黃酮；第四步，用乙醇從大孔樹脂上洗脫總黃酮得到洗脫液；第五步，將洗脫液濃縮並回收乙醇，減壓乾燥，即得石榴皮提取物。其中，大孔樹脂採用HPD400、HPD600、D_101、D_201、AB-8型弱極性大孔樹脂中的一種。下面是對上述技術方案之二的進一步優化和/或選擇在上述第一步中將石榴皮粗粉加8倍量至10倍量的水，在6(TC至8(TC提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液。在上述第一步中將石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在6(TC至8(TC提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液。在上述第二步中將濾液濃縮後加相當於濃縮液體積2倍量的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱得到乙醇溶液；在第三步中將乙醇溶液濃縮後調節ra值為3至7，上大孔樹脂層析柱吸附；其中，所用大孔樹脂選用HPD400、HPD600、D_101、D_201、AB-8型弱極性大孔樹脂中的一種；在第四步中以相當於3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以30%至70%的乙醇為洗脫劑進行洗脫，洗脫劑的用量相當於3至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液並合併；在第五步中將乙醇洗脫液在60°C至9(TC下濃縮，回收乙醇，再在5(TC至8(TC下真空乾燥，即得到所需的石榴皮提取物。本發明的技術方案之三是通過以下方式得到的弱極性大孔樹脂在上述石榴皮提取物的生產方法中的應用，其所用大孔樹脂為HPD400、HPD600、D-101、D-201、AB-8型弱極性大孔樹脂的一種。本發明的技術方案之四是通過以下方式得到的上述石榴皮提取物應用於製備針對流感病毒和/或B肝病毒和/或愛滋病毒的廣譜抗病毒藥物。本發明石榴皮提取物具有明顯的抗流感病毒、B肝病毒及愛滋病毒作用，可用於製備廣譜抗病毒藥物；本發明首次提出石榴皮提取物在抗流感病毒、B肝病毒及愛滋病毒方面的作用；並在該石榴皮提取物的生產方法中首次應用大孔樹脂吸附分離技術，從石榴皮粗提物中富集石榴皮中的黃酮類成分，並得到總黃酮含量達30%至70%(重量百分比)，同時含10%至30%(重量百分比)鞣質類成份的提取物。該方法簡單易行，工藝可靠，適合工業化生產。具體實施例方式本發明不受下述實施例的限制，可根據上述本發明的技術方案和實際情況來確定具體的實施方式。6下面結合實施例對本發明作進一步論述。通過下述實施例對本發明石榴皮提取物進行詳細說明實施例1:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水於8(TC至IO(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濾液濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上AB-8型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速為每小時2至5個層析柱體積，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例2:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水於8(TC至IO(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濾液濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上AB-8型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速為每小時2至5個層析柱體積，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例3:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水IO(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱12小時，濾除沉澱，濾液濃縮後以稀鹽酸調節ra值為7，上AB-8型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行梯度洗脫，每濃度乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速為2個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。其中，所用大孔吸附樹脂選用D-201、D-301、HPD400、HPD600、AB-8等型號的大孔樹脂中的一種。實施例4:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30^的乙醇於6(TC至8(rC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上AB-8型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例5:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上AB-8型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例6:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為7，上AB-8型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例7:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上AB-8型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例8:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上AB-8型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例9:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為7，上AB-8型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為5至10個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例10:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上AB-8型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例11:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上AB-8型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例12:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為7，上AB-8型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例13:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水於8(TC至IO(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濾液濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上HPD400型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速為每小時2至5個層析柱體積，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例14:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水於8(TC至IO(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濾液濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上HPD400型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速為每小時2至5個層析柱體積，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例15:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水IO(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱12小時，濾除沉澱，濾液濃縮後以稀鹽酸調節ra值為7，上HPD400型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行梯度洗脫，每濃度乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速為2個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。其中，所用大孔吸附樹脂選用D-201、D-301、HPD400、HPD600、AB-8等型號的大孔樹脂中的一種。實施例16:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇於6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上HPD400型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例17:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上HPD400型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例18:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為7，上HPD400型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例19:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上HPD400型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例20:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上HPD400型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例21:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為7，上HPD400型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為5至10個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例22:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上HPD400型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例23:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上HPD400型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例24:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為7，上HPD400型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例25:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水於8(TC至IO(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濾液濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上HPD600型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速為每小時2至5個層析柱體積，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。10實施例26:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水於8(TC至IO(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濾液濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上HPD600型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速為每小時2至5個層析柱體積，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例27:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水IO(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱12小時，濾除沉澱，濾液濃縮後以稀鹽酸調節ra值為7，上HPD600型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行梯度洗脫，每濃度乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速為2個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。其中，所用大孔吸附樹脂選用D-201、D-301、HPD400、HPD600、AB-8等型號的大孔樹脂中的一種。實施例28:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇於6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上HPD600型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例29:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上HPD600型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例30:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為7，上HPD600型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例31:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上HPD600型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例32:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上HPD600型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例33:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為7，上HPD600型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為5至10個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例34:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上HPD600型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例35:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上HPD600型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例36:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為7，上HPD600型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例37:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水於8(TC至IO(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濾液濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上D-101型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速為每小時2至5個層析柱體積，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例38:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水於8(TC至IO(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濾液濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上D-101型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速為每小時2至5個層析柱體積，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例39:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水IO(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱12小時，濾除沉澱，濾液濃縮後以稀鹽酸調節ra值為7，上D-101型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行梯度洗脫，每濃度乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速為2個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。其中，所用大孔吸附樹脂選用D-201、D-301、HPD400、HPD600、AB-8等型號的大孔樹脂中的一種。實施例40:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇於6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上D-101型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例41:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上D-101型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例42:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為7，上P-101型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例43:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上D-101型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例44:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上D-101型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例45:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為7，上D-101型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為5至10個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例46:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上D-101型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例47:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上D-101型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例48:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為7，上D-101型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例49:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水於8(TC至IO(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濾液濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上D-201型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速為每小時2至5個層析柱體積，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例50:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水於8(TC至IO(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濾液濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上D-201型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速為每小時2至5個層析柱體積，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例51:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量水IO(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱12小時，濾除沉澱，濾液濃縮後以稀鹽酸調節Wl值為7，上D-201型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行梯度洗脫，每濃度乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速為2個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。其中，所用大孔吸附樹脂選用D-201、D-301、HPD400、HPD600、AB-8等型號的大孔樹脂中的一種。實施例52:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇於6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上D-201型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例53:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加濃縮液體積2倍量的無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上D-201型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例54:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為7，上D-201型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例55:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上D-201型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例56:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上D-201型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例57:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量50%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱1524小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為7，上D-201型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為5至10個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例58:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為3，上D-201型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以30%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例59:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為5，上D-201型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以50%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例60:石榴皮粗粉加8倍量至10倍量70%的乙醇6(TC至8(TC煮提兩次，每次3小時，過濾，合併濾液，濃縮至原體積的三分之一，加2倍量無水乙醇放置沉澱24小時，濾除沉澱，濃縮後以稀鹽酸調節ra值為7，上D-201型大孔樹脂層析柱，待上樣液全部吸附後，以3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以70%的乙醇進行洗脫，乙醇用量為3至8個層析柱體積，流速2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液，合併後於6(TC至9(TC濃縮，濃縮液再於5(TC至8(TC減壓乾燥，即得石榴皮提取物。實施例61:對上述實施例1至60所得石榴皮提取物按下述方法進行總黃酮含量的測定對照品溶液的配製精密稱取乾燥至恆重的蘆丁對照品50毫克，置25毫升容量瓶中，加甲醇適量，置水浴上微熱使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取10毫升，置100毫升容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得每毫升含0.2毫克無水蘆丁的對照品溶液。標準曲線的製備精密量取對照品溶液1、2、3、4、5、6毫升，分別置25毫升的容量瓶中，各加水至6毫升，加5%亞硝酸鈉溶液1毫升，混勻，放置6分鐘，再加入10%硝酸鋁溶液1毫升，搖勻，放置6分鐘，再加入氫氧化鈉試液10毫升，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15分鐘，以相應試劑為空白，於500納米處測定吸收度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪製標準曲線。樣品測定分別精密稱取上述實施例1至60所得石榴皮提取物樣品1.Og，置100毫升的容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取10毫升，置100毫升的容量瓶中，加水至刻度，搖勻，精密量取3毫升，置25毫升容量瓶中，加水至6毫升，加5%亞硝酸鈉溶液1毫升，混勻，放置6分鐘，再加入10%硝酸鋁溶液1毫升，搖勻，放置6分鐘，再加入氫氧化鈉試液10毫升，加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15分鐘，以相應試劑為空白，於500納米處測定吸收度，從上述標準曲線上讀出樣品溶液中含無水蘆丁的量，計算石榴皮提取物樣品中總黃酮(以無水蘆丁計)的含量，應在30%至70%的範圍內。實施例62:對上述實施例1至60所得石榴皮提取物按下述方法進行鞣質含量的磷鉬鎢酸試液的配製取鎢酸鈉100g、鉬酸鈉25g，加水700ml使溶解，加鹽酸100ml、磷酸50ml，加熱回流10小時，放冷，再加硫酸鋰150g、水50ml和溴0.2ml，煮沸除去殘留的溴(約15分鐘)，冷卻，加水稀釋至1000ml，濾過，即得。試液應呈黃色，如放置後變為綠色，可加溴O.2ml，煮沸除去多餘的溴即可。對照品溶液的製備精密稱取沒食子酸對照品50mg，置100ml棕色量瓶中，加水溶解並稀釋至刻度，精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得(每lml中含沒食子酸0.05mg)。標準曲線的製備精密量取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.Oml，分別置25ml棕色量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液lml，再分別加水11.5、ll、10、9、8、7ml，用29X碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻。放置30分鐘，以相應的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(《中國藥典》2005版一部附錄VA)，在760nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪製標準曲線。樣品溶液的製備取供試品適量，精密稱定，置250ml棕色量瓶中，加水150ml，放置過夜，超聲處理10分鐘，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置(使固體物沉澱)。濾過，棄去初濾液50ml，精密量取續濾液20ml，置100ml棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。測定總酚精密量取樣品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，照標準曲線製備項下的方法，自"加入磷鉬鎢酸試液lml"起，加水10ml，依法測定吸光度，從標準曲線中讀出樣品溶液中沒食子酸的量(mg)，計算，即得。測定不被吸附的多酚精密量取樣品溶液25ml，加至已盛有乾酪素0.6g的100ml具塞錐形瓶中，密塞，置30°C水浴中保溫1小時，時時振搖，取出，放冷，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續濾液2ml，置25ml棕色量瓶中，照標準曲線製備項下的方法，自"加入磷鉬鎢酸試液lml"起，加水10ml，依法測定吸光度，從標準曲線中讀出樣品溶液中沒食子酸的量(mg)，計算，即得。樣品中鞣質含量的計算鞣質含量=總酚量_不被吸附的多酚量按上述方法計算石榴皮提取物樣品中鞣質的含量，應在10%至30%的範圍內。在本發明中首次提出弱極性大孔樹脂在石榴皮提取物生產方法中的應用。所用弱極性大孔樹脂選用D-101、D-201、HPD400、HPD600、AB-8型大孔樹脂中的一種。通過以下實驗例對本發明石榴皮提取物的廣譜抗病毒作用進行說明實驗例l本發明石榴皮提取物對流感病毒致細胞病變的抑制作用。1.材料和方法1.l病毒株流感甲型病毒(H具亞型粵防72243株)，流感乙型病毒(濟防97-13株)，購自中國預防醫學科學院病毒學研究所。1.2實驗樣品石榴皮提取物樣品SL1、SL2、SL3，為淡棕色至深棕色的浸膏粉，樣品中總黃酮含量(重量百分比)SL1為30%、SL2為50%、SL3為70%，鞣質含量(重量百分比)SL1為30%、SL2為20%、SL3為10%。實驗前均以高純水配製成10mg/ml的原藥液，過濾除菌後備用；陽性對照藥利巴韋林，規格100mg/片，臨床服用2片/次，3次/日，實驗前用高純水配製成10mg/ml的原藥液，過濾除菌後備用。2.方法與結果樣品對MDCK細胞毒性的測定樣品SL2、SL2、SL3和陽性對照原液均以培養液作2倍稀釋，取1:5至1:320共7個稀釋度，將各稀釋度的藥液分別加到已接種Hela細胞並長成單層的培養板中，100微升/孔，每濃度4個平行孔，同時設細胞對照。將培養板置37°C、5%C02條件培養四天，每日觀察細胞生長情況，以細胞不出現明顯退變的最小稀釋倍數為最大無毒濃度(TC。)。並按Reed-Muench法計算50%有毒濃度(TC5。)，結果見表1。樣品對病毒致細胞病變的影響取已長成單層的MDCK細胞，接種流感甲型病毒10—5(50%細胞培養感染量CCID5。的15倍)、流感乙型病毒10—2(CCID5。的30倍)，於37t:吸附2小時後傾去病毒液，以不含血清的維持液洗細胞表面2次。實驗設細胞對照組、病毒對照組和各樣品不同稀釋度的給藥組，每組4個平行孔，細胞對照組、病毒對照組加等體積的維持液，給藥組樣品取TC。以下的5個倍比稀釋度分別給藥。37°C、5%C02條件培養，每日觀察細胞病變情況，細胞病變程度按六級標準判斷(-:無病變；士細胞病約佔整個單層的10%以下；1:細胞病變約佔整個單層的10%至25%;2:細胞病變約佔整個單層的25%至50%;3:細胞病變約佔整個單層的50%至75%;4:細胞病變約佔整個單層的75%以上)。當病毒對照組細胞病變為4時記錄實驗結果。按Reed-Muench法計算半數有效濃度EC5。，並計算樣品的選擇指數TI(TC5。/EC5。)，結果見表2。根據選擇指數TI的計算結果，認為石榴皮提取物SL1、SL2、SL3在體外細胞培養中對甲型流感病毒和乙型流感病毒均有抑制作用。實驗結果說明石榴皮提取物樣品SL1、SL2、SL3有明顯的抗流感病毒作用。實驗例4:本發明石榴皮提取物對人B肝病毒的抑制作用1.實驗材料1.1樣品石榴皮提取物SL1、SL2、SL3，實驗前均以高純水配製成10mg/ml原藥液，過濾除菌後於4t:保存，臨用時以培養液稀釋成所需濃度給藥；陽性對照藥拉米夫定用高純水配製成lmg/ml的原液，實驗前以細胞培養液配成所需濃度給藥。1.2試劑MEM培養基，GiBco，InvitrogenCorporation;胰酶，北京三博遠志生物技術有限公司；小牛血清、HEPES，中國醫科院生物醫學工程研究所；B肝病毒核酸定量檢測試劑、cPCR-螢光探針，中山大學達安基因股份有限公司。1.3細胞株2.2.15細胞，B型肝炎病毒(HBV)DNA克隆轉染人肝癌細胞(H印G2)的2.2.15細胞系，購自北京大學人民醫院肝病中心，以含穀氨醯胺的MEM培養液於37°C，5%C02條件下培養，大約一周傳代一次。2.方法及結果細胞毒性的測定2.2.15細胞接種96孔培養板，待細胞長成單層時，吸棄上清，設細胞對照組和SL1、SL2、SL3各6個濃度的給藥組，每組4孔。各樣品原液分別以培養液作2倍稀釋，取1/5至1/320共7個稀釋度，分別加樣，細胞對照組加培養液，200y1/孔，於37°C、5%C02條件培養，第4天各組換相應濃度的藥液，第8天於顯微鏡下觀察，以細胞病變CPE為指標，程度分為五級，完全破壞為4;75%為3;50%為2;25%為1;無病變為0。計算每濃度藥液平均細胞病變程度和抑制百分率。觀察最大無毒濃度TC。，並按Reed&Muench法18計算半數有毒濃度TC5。，結果見表3。樣品對B肝病毒DNA複製的抑制作用2.2.15細胞接種96孔細胞培養板(約10萬個/毫升)，每孔200微升，371\5%C02條件培養，待細胞長成單層後，設細胞對照組、拉米夫定(1微克/毫升)組、Hl、H2、H3各四個濃度(均取TC。及其以下的3個2倍稀釋度)，每濃度4孔，加樣，200微升/孑L於37°C、5%C02條件培養，第4天換一次藥液，繼續培養，於第8天收集細胞培養上清液，以螢光定量PCR法測定B肝病毒DNA表達量(拷貝/毫升)，計算樣品的抑制率。按Reed&Muench法計算半數有效濃度IC5。，並計算選擇指數SI，結果見表4。抑制率(％)=(對照組表達量_給藥組表達量)/對照組表達量X100%選擇指數SI=TC50/IC50三個樣品抑制B肝病毒複製的選擇指數均大於2，表明石榴皮提取物具有明顯的抗B肝病毒作用。試驗例4:本發明石榴皮提取物在人類嗜T淋巴細胞病毒I型感染的T細胞系MT-4細胞中對愛滋病毒HIV-1P24抗原的抑制作用MT-4細胞懸液計數，用100CCID5。的HIV-1IIIB感染細胞，在37°C，5%C02培養箱中吸附1.5小時。用無血清的1640培養液洗去未吸附病毒，用培養液將感染病毒的細胞配成2X105個細胞/毫升，接種於96孔細胞培養板內，每孔100微升；再分別加入3倍稀釋的樣品溶液和5倍稀釋的陽性對照藥齊多夫定(AZT)溶液100微升。每個稀釋度重複3個孔，同時設細胞對照組和病毒對照組。培養板置於371\5%0)2飽和溼度培養箱內培養。4天後吸出上清，-20°〇凍存，待測HIV-1P24抗原滴度，細胞加MTT染色測定樣品對細胞的毒性。MTT染色測定細胞毒性上述培養板每孔加5毫克/毫升的MTT溶液10微升染色，37°C、5%0)2飽和溼度培養箱內培養4小時後，每孔加入100微升50%DMF-17%TritonX-100脫色液，置37t:下過夜，在酶標儀上測定波長為570納米處的吸收度值，計算樣品的半數有毒濃度(CC5。)。測定樣品在細胞培養內抑制HIV-1P24抗原的EC5。將上述凍存的感染病毒的MT-4上清液融化後進行稀釋，按預實驗結果調整稀釋比例。按照HIV-1P24抗原檢測試劑盒說明測定HIV-1P24抗原滴度，加樣組與病毒對照組比較，計算樣品的EC5。及選擇指數TI(CC5。/EC5。)。結果見下表5。本實驗中石榴皮提取物SL1、SL2、SL3對HIV_1P24抗原抑制作用的選擇指數SI表明本發明石榴皮提取物具有明顯的抗愛滋病毒作用。從上述實施例可以看出，本發明石榴皮提取物具有廣譜抗病毒作用，可用於製備防治流感、B型肝炎和愛滋病的廣譜抗病毒藥物。下面為表1至表5:表1樣品對MDCK培養細胞的TC。和TC5。樣品原液(毫克/毫升)TC。(微克/毫升)TC5。(微克/毫升)SL1105001349.619tableseeoriginaldocumentpage20表2.石榴皮提取物對流感病毒的抑制作用tableseeoriginaldocumentpage20表3樣品在2.2.15細胞培養內的毒性tableseeoriginaldocumentpage20表4樣品在2.2.15細胞培養中第8天對HBV-DNA的抑制作用tableseeoriginaldocumentpage21權利要求一種用於製備廣譜抗病毒藥物的石榴皮提取物，其特徵在於該石榴皮提取物按重量百分比含有30％至70％的黃酮類成分和10％至30％的鞣質類成分。2.根據權利要求1所述的石榴皮提取物，其特徵在於該提取物按下述步驟得到第一步，石榴皮粗粉用水和/或乙醇粗提，其中，水粗提為將石榴皮粗粉加8倍至10倍量水，在8(TC至10(TC下提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液；乙醇粗提為將石榴皮粗粉加8倍至10倍量30%至70%的乙醇，在6(TC至8(TC提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液；第二步，將上述濾液濃縮至原體積的三分之一，加相當於濃縮液體積2倍量的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱得到乙醇溶液；第三步，將上述乙醇溶液濃縮後調節ra值為3至7，上大孔樹脂層析柱吸附；其中，大孔樹脂採用HPD400、HPD600、D-101、D-201、AB-8型弱極性大孔樹脂中的一種；第四步，以相當於3至8個層析柱體積的去離子水衝洗上述層析柱，再以30%至70%的乙醇為洗脫劑進行洗脫，洗脫劑的用量相當於3至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液並合併；第五步，將上述合併後的乙醇洗脫液在6(TC至9(TC下濃縮，回收乙醇，再在5(TC至8(TC下減壓乾燥，即得所需的石榴皮提取物。3.—種石榴皮提取物的生產方法，其特徵在於該方法按下述步驟進行第一步，石榴皮粗粉以水和/或乙醇粗提；第二步，加乙醇沉澱粗提物中的雜質；第三步，乙醇溶液濃縮後調節Kl值，以大孔樹脂吸附粗提物中的總黃酮；第四步，用乙醇從大孔樹脂上洗脫總黃酮得到洗脫液；第五步，將洗脫液濃縮並回收乙醇，減壓乾燥，即得石榴皮提取物。其中，大孔樹脂採用HPD400、HPD600、D_101、D_201、AB-8型弱極性大孔樹脂中的一種。4.根據權利要求3所述石榴皮提取物的生產方法，其特徵在於在第一步中將石榴皮粗粉加8倍量至10倍量的水，在6(TC至8(TC提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液。5.根據權利要求3所述石榴皮提取物的生產方法，其特徵在於在第一步中將石榴皮粗粉加8倍量至10倍量30%至70%的乙醇，在6(TC至8(TC提取兩次，每次2小時至3小時，過濾，合併濾液。6.根據權利要求3或4或5所述的石榴皮提取物的生產方法，其特徵在於在第二步中將濾液濃縮後加相當於濃縮液體積2倍量的無水乙醇，放置沉澱24小時，濾除沉澱得到乙醇溶液；在第三步中將乙醇溶液濃縮後調節ra值為3至7，上大孔樹脂層析柱吸附；其中，所用大孔樹脂選用HPD400、HPD600、D_101、D_201、AB-8型弱極性大孔樹脂中的一種；在第四步中以相當於3至8個層析柱體積的去離子水衝洗層析柱，再以30%至70%的乙醇為洗脫劑進行洗脫，洗脫劑的用量相當於3至8個層析柱體積，流速為2至5個層析柱體積/小時，收集乙醇洗脫液並合併；在第五步中將乙醇洗脫液在6(TC至9(TC下濃縮，回收乙醇，再在5(TC至8(TC下真空乾燥，即得到所需的石榴皮提取物。7.弱極性大孔樹脂在權利要求3或4或5或6所述石榴皮提取物的生產方法中的應用，其特徵在於所用大孔樹脂為HPD400、HPD600、D_101、D_201、AB-8型弱極性大孔樹脂的一種。8.—種根據權利要求1或2所述的石榴皮提取物應用於製備針對流感病毒和/或B肝病毒和/或愛滋病毒的廣譜抗病毒藥物:全文摘要本發明涉及從植物石榴的果皮中提取的提取物及其生產方法和應用的
技術領域：
，是一種石榴皮提取物及其生產方法和應用。該石榴皮提取物含有黃酮類成分和鞣質類成分。本發明石榴皮提取物具有明顯的抗流感病毒、B肝病毒及愛滋病毒作用，可用於製備廣譜抗病毒藥物；本發明首次提出石榴皮提取物在抗流感病毒、B肝病毒及愛滋病毒方面的作用；並在該石榴皮提取物的生產方法中首次應用大孔樹脂吸附分離技術，從石榴皮粗提物中富集石榴皮中的黃酮類成分，並得到總黃酮含量達30％至70％(重量百分比)，並含10％至30％(重量百分比)鞣質類的提取物。該方法簡單易行，工藝可靠，適合工業化生產。文檔編號A61K131/00GK101695511SQ20091011350公開日2010年4月21日申請日期2009年10月29日優先權日2009年10月29日發明者劉砥威,姚華,徐芳,趙軍,顧政一,黃華申請人:新疆維吾爾自治區藥物研究所;