一種山茶花細胞提取物及其提取方法和應用與流程

2023-12-05 16:33:46 2

本發明涉及植物提取
技術領域：
，具體涉及一種山茶花細胞提取物及其提取方法和應用。
背景技術：
：山茶花，又名茶花，為山茶科山茶屬植物，因其植株形姿優美，花形豔麗繽紛，受到世界園藝界的珍視，是中國傳統的觀賞花卉，亦是世界名貴花木之一。山茶花含有豐富的黃酮類、皂苷類、多酚類化合物，具有優異的抗氧化抗自由基的功效，以其製備的化妝品具有抗自由基、抗衰、淡斑、保溼、防曬的效果。山茶花具有諸多功效，在中國廣泛種植，資源充足，但大多用於城市景觀綠化，供人們欣賞，每年山茶花的花卉因凋零未被利用而白白浪費。目前，山茶花的提取多採用有機溶劑高溫回流提取或蒸餾提取或直接用水做溶劑高溫提取，這兩種方法都需要進行高溫長時間蒸煮。上述提取方法及提取物存在以下缺點：山茶花中存在較多的雜質，所得的提取液中抗氧化、抗自由基功效活性成分低，不利於後續工序的精製純化，每個批次提取物的成分也不確定；工序多、工藝繁瑣複雜、所需時間較長；安全性低，生產過程中使用大量有機溶劑，極易殘留在成品中，不利於身體健康；會造成環境汙染，生產過程中會向環境中排放大量有機溶劑。要推廣使用山茶花的活性物質，必須能夠有效地提取到大量的山茶花提取物。現有植物提取一般是採用植株進行提取，但植株生長需要多年時間，而且受到地域，氣候，季節以及病蟲害等的影響與威脅，其提取物品質不穩定，其效果難以控制。因此，研究如何獲取大量的品質穩定的山茶花提取物是推廣應用山茶花提取物必須解決的難題。技術實現要素：有鑑於此，有必要針對上述的問題，本發明提供一種山茶花細胞提取物及其提取方法和應用。為了實現上述目的，本發明採用如下技術方案：一種山茶花細胞提取物的提取方法，包括以下步驟：s1、山茶花單細胞的分離：無菌山茶花中加入ms(murashigeandskoog)培養基中培養，並加入纖維素酶和果膠酶進行酶解，調ph至5～6，在26～30℃、30～60rpm條件下，消化2～4小時，過濾除雜，濾液離心去上清液，獲得山茶花細胞株；s2、山茶花細胞的培養：將獲得的山茶花單細胞株接種到含有生長素2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸、2,4-dichlorophenoxyaceticacid)、細胞分裂素6-ba(6-苄氨基嘌呤、6-benzylaminopurine)的ms培養基中，23～27℃黑暗培養，直至長出愈傷組織；將得到的愈傷組織分割成小塊，轉入到ms液體培養基中置於發酵罐中進行懸浮培養，通入過濾空氣且速率為0.04～0.06m3/s，在24～28℃、120～160rpm的條件下培養7～10天。優選地，所述山茶花細胞提取物的提取方法，還包括步驟s3、山茶花細胞提取物的凍幹：收集培養液，濃縮，過濾除菌後進行凍幹處理，凍幹溫度為-30～-40℃，真空度為180～220pa，凍幹時間為30～40小時，即得到山茶花細胞提取物凍乾粉。優選地，所述無菌山茶花通過以下方法製備：取無病蟲害、生長飽滿的山茶花幼蕾，在含洗滌劑的自來水中浸泡10～40min，將表面不光滑或長絨毛的部位清洗乾淨，轉到超淨工作檯上，晾乾。更優選地，所述山茶花清洗後還進行表面消毒，消毒的方法為：75％乙醇消毒15～40s，無菌水衝洗乾淨，分別再用飽和次氯酸鈣消毒5～25min和0.1％氯化汞消毒5～15min，無菌水衝洗乾淨，放在無菌濾紙上吸乾表面水分。優選地，所述洗滌劑為洗衣粉、洗衣液或洗潔精。優選地，步驟s1中每1.0g無菌山茶花中加入10mlms(murashigeandskoog)培養基、0.05ml質量分數0.3％的纖維素酶溶液和0.05ml質量分數0.3％的果膠酶溶液。優選地，步驟s1中無菌山茶花在28℃、40rpm消化3小時。優選地，步驟s2中將獲得的山茶花單細胞株接種到含有1.0mg/l2，4-d、1.126mg/l6-ba的ms培養基中，25℃黑暗培養，直至長出愈傷組織；將得到的愈傷組織分割成小塊，轉入到ms液體培養基中置於發酵罐中進行懸浮培養，通入過濾空氣且速率為0.05m3/s，在26℃、140rpm的條件下培養9天。優選地，所述步驟3中收集培養液後用0.45μm的濾膜過濾，濃縮並調整濃縮液中蛋白濃度為50±0.5μg/ml，濃縮液用0.22μm過濾除菌後進行凍幹處理，凍幹溫度為-35℃，真空度為200pa，凍幹時間為36小時。一種山茶花細胞提取物，由上述提取方法製備得到。山茶花細胞提取物在製備抗衰老和/或抗氧化化妝品中的應用。本發明用酶解法從材料中分離出山茶花單細胞，獲得單細胞接種在ms培養基中進行黑暗培養，直至長出愈傷組織，再通過懸浮培養獲得大量的山茶花細胞培養物，收集山茶花細胞培養物對其過濾、濃縮和凍幹處理，獲得的山茶花細胞提取物具有很強的抗氧化作用，是理想的美容抗衰老用品。與現有技術相比，本發明的有益效果是：1、本發明通過接種山茶花進行組織培養來為獲取山茶花細胞提取物提供原材料，原材料不再受地域、氣候等自然條件限制，而且化學性質穩定，為推廣應用山茶花提取物奠定了基礎。2、本發明的山茶花細胞提取物具有較強的抗氧化能力及抗皺效果，適合應用於抗衰老的化妝品中。具體實施方式為了更好的說明本發明，下面結合具體實施方式做進一步說明。本發明中所用試劑或儀器均可由市場購得，使用的檢測方法等都是本領域所熟知的，在此不再贅述。實施例1取無病蟲害、生長飽滿的山茶花幼蕾，在含洗衣粉或洗潔精的自來水中浸泡30min，將表面不光滑或長絨毛的部位清洗乾淨，必要時用毛刷刷洗乾淨然後轉到超淨工作檯上，晾乾。對一些容易汙染、較難滅菌的外植體進行表面消毒時，用單一消毒劑不能得到好的消毒效果，所以常選用兩種消毒劑交替浸泡法。在本實施例中，洗滌劑浸泡後的山茶花先經過75％乙醇消毒30s，無菌水中衝洗1遍，然後分別用飽和次氯酸鈣消毒5～25min和0.1％氯化汞消毒5～15min，無菌水衝洗6遍，放在無菌濾紙上吸乾表面水分，得無菌山茶花。用得到的無菌山茶提取山茶花細胞提取物，具體方法如下：s1、山茶花單細胞的分離：將無菌山茶花轉移至無菌乾淨的燒杯中，每1.0g山茶花加入10mlms培養基、0.05ml質量分數0.3％的纖維素酶溶液和0.05ml質量分數0.3％的果膠酶溶液，調ph在5～6之間，在28℃、40rpm條件下消化3小時。本實施例中使用的纖維素酶是降解纖維素生成葡萄糖的一組酶總稱，能夠降解果膠，使細胞分開；果膠酶指分解植物主要成分果膠質的酶類，可降解細胞壁。經過這兩種酶處理，可以分離出大量單個的山茶花細胞；若不進行酶處理，則分離出的山茶花細胞很少甚至無法分離出山茶花細胞。用200目無菌網篩對消化液進行過濾，除去雜質；抽取20μl山茶花細胞過濾液，加進countstar細胞計數器中，進行細胞計數，根據計數結果，按細胞密度進行細胞培養；其餘過濾液在250g離心力下離心10min後，除去上清液，獲得山茶花單細胞株。s2、山茶花細胞的培養：將獲得的山茶花單細胞株接種到含有1.0(mg·l-1)的2,4-d、1.126(mg·l-1)的6-ba的ms培養基中，25℃黑暗培養，直至長出愈傷組織；經過初步培養後，將得到的愈傷組織用無菌解剖刀分割成小塊，使愈傷組織塊小於3mm，轉入到ms液體培養基中置於發酵罐中進行懸浮培養，通入過濾空氣且速率為0.05m3/s，在26℃的環境下和轉速為140rpm/min的條件下培養9天。s3、山茶花細胞提取物的凍幹：收集培養用0.45μm的濾膜對其進行過濾，濃縮，採用蛋白質定量試劑盒(bca)檢測濃縮上清的蛋白濃度，調整濃縮液中蛋白濃度為50±0.5μg/ml。將得到的濃縮上清用0.22μm過濾除菌。除菌後進行凍幹處理，凍幹溫度為-35℃，真空度為200pa，凍幹時間為36小時，即得到山茶花細胞提取凍乾粉。將凍乾粉分裝成1ml/支。山茶花細胞在培養過程中會分泌蛋白因子等次生代謝產物，這些次生代謝產物存在於培養液中，因此培養液也具有抗衰老等生物學作用。對比實施例1按照實施例1所述方法製備無菌山茶花。取無菌山茶花加入等體積的蒸餾水，超聲破碎後，再絞碎，200g離心10min，上清液經冷凍乾燥後研磨成粉末，過40目篩。效果實施例1、清除dpph自由基試驗dpph(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)分析方法是依據dpph自由基具有單電子，在含有自由基的化學反應中作為一種監測反應的物質，用以抗氧化成分的體外抗氧化性評價。分別將0.125g、0.25g、0.5g、1.0g、2.0g和4.0g實施例1製備的山茶花細胞提取物加溶媒(溶解凍乾粉的製劑)至100g進行稀釋，得到含有提取液0.125％、0.25％、0.5％、1.0％、2.0％和4.0％的檢測液作為實驗組。分別將0.125g、0.25g、0.5g、1.0g、2.0g和4.0g對比例1製備的山茶花提取物加溶媒至100g進行稀釋，得到含有提取液0.125％、0.25％、0.5％、1.0％、2.0％和4.0％的檢測液作為對照組。分別檢測實驗組和對照組不同濃度檢測液的dpph自由基清除率，結果如表1所示。表1、不同濃度檢測液的dpph自由基清除率由表1中的數據可以看出，實驗組和對照組均隨著檢測液中提取液含量的增加，檢測液的dpph自由基清除率不斷增加，當濃度大於1.0％時，dpph自由基清除率趨於平穩，說明山茶花提取液在濃度1.0％時即可以達到較好的抗氧化性。且相同濃度的檢測液條件下，實驗組的dpph自由基清除率明顯高於對照組，幾乎是對照組的兩倍，說明本發明的山茶花細胞提取物具有優異的抗氧化性能。效果實施例2、清除abts自由基試驗abts(2,2-連氮基-雙-(3-乙基苯並二氫噻唑啉-6-磺酸))在適當的氧化劑作用下氧化成綠色的abts·+，在抗氧化物存在時abts·+的產生會被抑制，在734nm或405nm測定abts的吸光度即可測定並計算出樣品的總抗氧化能力，廣泛應用於天然水溶性酚類物質抗氧化活性的測定。分別將0.125g、0.25g、0.5g、1.0g、2.0g和4.0g實施例1製備的山茶花細胞提取物加溶媒(溶解凍乾粉的製劑)至100g進行稀釋，得到含有提取液0.125％、0.25％、0.5％、1.0％、2.0％和4.0％的檢測液作為實驗組。分別將0.125g、0.25g、0.5g、1.0g、2.0g和4.0g對比例1製備的山茶花提取物加溶媒至100g進行稀釋，得到含有提取液0.125％、0.25％、0.5％、1.0％、2.0％和4.0％的檢測液作為對照組。分別檢測實驗組和對照組不同濃度檢測液的abts自由基清除率，結果如表2所示。表2、不同濃度檢測液的abts自由基清除率由表2中的數據可以看出，實驗組和對照組均隨著檢測液中提取液含量的增加，檢測液的abts自由基清除率不斷增加，當濃度大於1.0％時，abts自由基清除率趨於平穩，說明山茶花細胞提取物在濃度1.0％時即可以達到較好的抗氧化性。且相同濃度的檢測液條件下，實驗組的abts自由基清除率明顯高於對照組，說明本發明的山茶花細胞提取物具有優異的抗氧化性能。效果實施例3、對人體抗衰老作用的測試按自願原則選擇年齡在29-56，無嚴重心、肝、腎臟等主要臟器疾患的臉部有明顯皺紋者為受試者，共36例，全部為女性，平均年齡35歲。分為a、b、c三組，每組12人，a組使用實施例1製備的山茶花細胞提取物作為受試物，b組使用對比例1的山茶花提取物作為受試物，c組使用溶媒作為受試物。a組：將2ml溶酶完全倒入中0.05g山茶花細胞提取物凍乾粉中，充分混勻，全部均勻地塗抹至人臉部，每兩天塗抹一次，連續塗抹15次，試驗期間停止使用臉部有關化妝品。實驗期間使用同一批次的山茶花細胞提取物。b組：將2ml溶酶完全倒入中0.05g山茶花提取物凍乾粉中，充分混勻，全部均勻地塗抹至人臉部，每兩天塗抹一次，連續塗抹15次，試驗期間停止使用臉部有關化妝品。實驗期間使用同一批次的山茶花提取物。c組：取同一批次的山茶花細胞提取物配對的溶酶，將2ml溶酶全部均勻地塗抹至人臉部，每兩天塗抹一次，連續塗抹15次，試驗期間停止使用臉部有關化妝品。使用前後對比臉譜儀測試光線下面部皮膚表面皺紋度(數值越小代表皺紋程度越輕)，結果如表3所示。表3、兩種凍乾粉使用前後皺紋度(x±sd，n＝1)組別使用前使用後a8.32±8.695.82±8.09b8.38±8.547.12±8.23c8.42±8.109.48±8.02從表3結果可以得出，c組作為陰性對照，使用前後無明顯差別，b組使用後對皮膚皺紋有所改善，a組使用前後效果明顯，其改善皮膚皺紋的效果明顯優於b組，證明山茶花細胞提取物連續使用15次後，對於皮膚上的皺紋有很好的改善，具有抗衰老的功效。以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對本發明專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬於本發明的保護範圍。因此，本發明專利的保護範圍應以所附權利要求為準。當前第1頁12