一種巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒及其製備方法
2023-12-04 19:34:51 1
專利名稱：一種巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒及其製備方法
技術領域：
本發明屬於醫藥生物領域，涉及一種試劑盒及其製備方法，更特別的，本發明涉及一種可用於臨床疾病檢測的一種巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒及其製備方法。
背景技術：
肌酸激酶(CK)是由M和B亞單位組成的二聚體，在細胞質內共有三種同工酶CK-MM、CK-MB和CK-BB。在細胞線粒體內還有另一種同工酶，稱為CK-Mt(又稱巨CK)。巨CK又分為巨CK1和巨CK2。巨CK1是一種CK同工酶與自身抗體的複合物，因其分子量大，在體內不易排出，又因其有較長的半衰期，故在血中存留時間較長。文獻認為CK1與疾病無明顯聯繫，甚至有的在健康人血中檢出巨CK1。巨CK2是一種低聚的線粒體CK，不會在健康人血中出現，近年來由於其在某些腫瘤病人血清中的高檢出率而使國外眾多研究者一致認為它與惡性腫瘤密切相關，可作為一種新的腫瘤標誌物。
CK-BB存在於健康人腦組織，胃腸道和子宮平滑肌內，正常人血清中無CK-BB。組織壞死或某些惡性腫瘤時可出現血清CK-BB升高，在血清中升高通常提示腫瘤擴展或對治療的應答。
免疫抑制法檢測CK-MB作為早期診斷急性心肌梗死的特異性指標已被臨床廣泛應用，其測定原理是用抗CK-M抗體將M亞基抑制，測定B亞基，結果乘2即為CK-MB活性。而當血清中出現正常人不含有或含量甚微的巨CK或CK-BB時，由於它們不受抗M亞基抗體抑制，其活性已百分之百測出，再乘上係數2，就會出現「CK-MB」等於或高於總CK活性的現象(事實上，CK-MB活性佔總CK活性的比例很少出現30％以上)。極易將健康人或腫瘤患者誤診為心臟病病人入院治療，造成病人嚴重的精神負擔，浪費不必要的醫療費用和延誤腫瘤患者的早期診斷。
目前隨著檢驗技術的不斷改善，全自動生化儀在中小型醫院也越來越普及，巨CK或CK-BB對臨床檢驗結果所造成的幹擾越來越明確。已經嚴重影響檢驗結果的正確性，造成對酶測定結果的錯誤判斷，甚至引起不必要的醫療糾紛。因此，臨床上需要找到一種更準確、可避免因免疫抑制法檢測CK-MB時所造成的假陽性的發生的檢測方法。
目前，美國海倫那及法國西比亞公司研製除了配套全自動(半自動)電泳儀用瓊脂糖電泳試劑盒，也可用於檢測巨肌酸激酶。其主要結構為全自動(半自動)電泳儀、瓊脂糖凝膠板、樣品杯(樣品梳)、試劑底物、顯色劑等。血清樣品加至樣品杯內(樣品梳圓孔內)，放置樣品架上備用，另取一片瓊脂糖凝膠板放在電泳板上，瓊脂板兩側各放一根碳棒(浸透緩衝液的膜條)，另配置一小瓶試劑底物放入試劑槽內(由樣品板小孔內注入)，事先定好測定程序，按下開關即開始電泳。
但是，上述全自動或半自動電泳儀價格昂貴，一般醫院不能購買，另外其專用配套試劑盒不能小批量標本檢測，目前推銷的試劑盒最小包裝量一次檢測8個標本，如標本少於8份，成本將大大提高，而臨床上往往是發現一例可疑標本需即刻進行鑑定，因此，不適合鑑定用。
發明內容
本發明的目的在於提供一種巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒及其製備方法，應用本發明的巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒鑑定血清標本，可以避免因免疫抑制法檢測CK-MB時所造成的假陽性的發生，為臨床提供正確的檢測報告，為腫瘤的早期診斷提供新的腫瘤標誌物。
本發明為解決上述技術問題所採用的技術方案是提供一種巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒，其中含有瓊脂糖凝膠板、Tris緩衝液、巴比妥鈉-巴比妥電泳緩衝液、底物、底物緩衝液和顯色劑，在每1000ml所述的Tris緩衝液中，含有20mmolTris，14克蔗糖，500毫克疊氮鈉，4-6gL-天冬酸乾粉；所述的瓊脂糖凝膠板中含有1％的瓊脂糖；在每升所述的巴比妥鈉-巴比妥電泳緩衝液中含有10.3克巴比妥鈉，1.84克巴比妥；在每升所述的底物中含有4.0mmolADP，10.0mmol LAMP，20μmol二腺苷五磷酸，4.0mmolNADP，60mmol酸肌酸鈉，≥5.0U已糖激酶，≥3.0U 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，40mmolN-乙醯半胱氨酸；在每升所述的底物緩衝液中含有20mmol的咪唑，40mmol的葡萄糖，20mmol的醋酸鎂，4.0mmolEDTA；每1ml所述的顯色劑中含有氯化硝基四氮唑藍2mg，吩嗪二甲酯硫酸鹽0.1mg。
優選的，所述的Tris緩衝液的PH值為7.4。
優選的，所述的巴比妥鈉-巴比妥電泳緩衝液的PH8.6。
優選的，所述的底物緩衝液的PH值為6.7。
本發明的目的還在於提供一種巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒的製備方法，包括以下步驟(1)配製PH7.4Tris緩衝液稱取20mmolTris，14克蔗糖，500毫克疊氮鈉，然後放置於容器中，再加入約800ml蒸餾水攪拌，將容器置於37℃水箱內，再向容器內加L-天冬酸乾粉，邊加邊攪拌溶解，用PH試紙條粗調PH約7.4，最後用PH測定儀調整PH值至7.4，加水至1000ml；(2)製備1％瓊脂糖凝膠稱取1克瓊脂糖，加熱溶解於PH為7.4的Tris緩衝液100ml中，分裝8ml/管；(3)製備瓊脂糖凝膠板取出8ml/管1％瓊脂糖凝膠，隔水加熱溶解，在鐵板上放一片110mm×80mm透明的聚酯膜作支撐，上面壓一塊中間挖有100mm×70mm×1mm大小孔的矽膠片，四周與聚酯膜用水貼緊，將加熱溶解的8ml瓊脂糖倒入孔內，順勢用管底將瓊脂糖鋪平，待冷卻後，揭去矽膠片洗淨待用，在凝膠板上覆蓋一張保鮮膜，取下凝膠板，放入一密封的塑料盒內；(4)製備PH8.6，0.05mol/L巴比妥鈉-巴比妥電泳緩衝液稱取巴比妥鈉10.3克，巴比妥1.84克溶於1L蒸餾水中；(5)製備底物將4.0mmol LADP，10.0mmol LAMP，20μmol二腺苷五磷酸，4.0mmolNADP，60mmol磷酸肌酸鈉，≥5.0U已糖激酶，≥3.0U6-磷酸葡萄糖脫氫酶，40mmolN-乙醯半胱氨酸加入1L蒸餾水中混合；(6)製備底物緩衝液將20mmol咪唑、40mmol葡萄糖、20mmol醋酸鎂、4.0mmolEDTA溶於1L蒸餾水，用醋酸調節PH至6.7；(7)製備顯色劑稱取氯化硝基四氮唑藍(NBT)2mg，吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)0.1mg，使用前加蒸餾水至1ml。
本發明的目的還在於提供巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒在腫瘤檢測上的應用，包括以下步驟1)取已配製好的1％瓊脂糖凝膠板一片，在離陰極側1.5cm處覆蓋一條2cm寬濾紙條，吸去部分水分，除去濾紙後將一加樣孔膜條置於其上，輕按加樣孔膜使其與膠板貼緊，避免氣泡，然後將5-7μl樣品加入孔內，靜置5-10分鐘，待樣品擴散進入膠內，用一條新的吸水紙蓋於加樣膜孔上，輕輕吸去多餘樣品，然後除去膜條；2)將膠板放入兩側已加有緩衝液的電泳槽上，加樣側放於陰極側，二端用四層紗布搭橋，電泳20分鐘，電泳條件為每板40mA，電壓150V；3)用底物緩衝液溶解底物，待電泳畢，取出凝膠板，將底物均勻施加於膠板上，上面覆蓋一張與膠板大小一致的塑料薄膜，置37℃恆溫水浴槽內，溫育40分鐘，或在45℃溫育20分鐘；4)溫育畢，除去覆蓋的塑料薄膜，置乾燥箱內20分鐘烤乾，烘乾溫度低於75℃；5)在螢光光密度計上掃描測定各同工酶區帶的百分率，或在340nm紫外燈下直接觀察是否出現紫藍色巨CK、CK-BB或CK-MB的陽性區帶。
更特別的，本發明所述的巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒在用可見光掃描定量時，在完成操作4)以後，將1ml顯色劑鋪加於凝膠板上，再次覆蓋塑料薄膜，室溫避光放置10-15分鐘，用5％醋酸漂洗背景，於530-570nm掃描。
本發明利用的主要原理為CK同工酶在瓊脂糖介質上電泳分離，CK-BB遷移向陽極白蛋白區域，CK-MB位於α2至β球蛋白區域，而CK-MM位於陰極側γ球蛋白區，巨CK1位於CK-MB和CK-MM之間，巨CK2遷移率較低，位於CK-MM陰極側。電泳畢，覆蓋底物，溫育後乾燥，在340nm光密度計掃描檢測，或在底物溫育後再覆蓋PMS-NBT，酶條帶呈紫藍色，可用可見光掃描檢測。
本發明的試劑盒使用前，需放置於4℃冰箱中備用，不可冰凍。
本發明和已有技術相比，成本低，操作簡便，適合小批量或個別的檢測。無需特殊的儀器設備，大部分實驗室均可完成。另外瓊脂糖凝膠支撐物聚酯膜無色透明，可在340nm紫外燈下直接觀察，拍照，並可連接電腦保留圖像。而進口試劑盒瓊脂糖凝膠支撐物是黑色的，不能在340nm紫外燈下直接觀察，拍照，保留圖像。同時，本發明的巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒鑑定血清標本，可以避免因免疫抑制法檢測CK-MB時所造成的假陽性的發生，為臨床提供正確的檢測報告，為腫瘤的早期診斷提供新的腫瘤標誌物。
圖1是CK同工酶和巨CK在瓊脂糖介質上的電泳示意圖。
圖2是採用本發明的巨肌酸酶試劑盒檢測的一個樣品的電泳圖。
圖3是採用本發明的巨肌酸酶試劑盒檢測的另一個樣品的電泳圖。
具體實施例方式
實施例1 本發明的巨肌酸酶試劑盒的製備本發明的巨肌酸酶試劑盒包括的試劑如下1)PH7.4Tris緩衝液20mmolTris，14克蔗糖，500毫克疊氮鈉，加蒸餾水約800ml，將燒杯置於37℃水箱內，直接向燒杯內加L-天冬酸乾粉，邊加邊攪拌溶解，用PH試紙條粗調PH約7.4(大約用L-天冬酸乾粉5克左右)，最後用PH測定儀調整PH至7.4，加水至1000ml置於冰箱備用。
2)1％瓊脂糖凝膠稱量1克瓊脂糖，加熱溶解於PH7.4Tris緩衝液100ml中，分裝8ml/管置於4℃冰箱內備用。
3)瓊脂糖凝膠板取出8ml/管1％瓊脂糖凝膠，隔水加熱溶解，在鐵板上放一片110mm×80mm透明的聚酯膜作支撐，上面壓一塊中間挖有100mm×70mm×1mm大小孔的矽膠片，四周與聚酯膜用水貼緊，不要有空隙(否則瓊脂糖易逸出)，將加熱溶解的8ml瓊脂糖倒入孔內，順勢用管底將瓊脂糖鋪平，待冷卻後，揭去矽膠片洗淨待用，在凝膠板上覆蓋一張保鮮膜，取下凝膠板，放入一密封的塑料盒內置4℃冰箱內保存。
4)PH8.6，0.05mol/L巴比妥鈉-巴比妥電泳緩衝液稱取巴比妥鈉10.3克，巴比妥1.84克溶於1L蒸餾水中。
5)製備底物將4.0mmol LADP，10.0mmolLAMP，20μmol二腺苷五磷酸，4.0mmolNADP，60mmol磷酸肌酸鈉，≥5.0U已糖激酶，≥3.0U6-磷酸葡萄糖脫氫酶，40mmolN-乙醯半胱氨酸加入1L蒸餾水中混合；6)製備底物緩衝液將20mmol咪唑、40mmol葡萄糖、20mmol醋酸鎂、4.0mmolEDTA溶於1L蒸餾水，用醋酸調節PH至6.7；7)顯色劑氯化硝基四氮唑藍(NBT)2mg，吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)0.1mg，使用前加蒸餾水1ml。
實施例2 本發明的巨肌酸酶試劑盒的樣品檢測本發明使用的電泳儀和電泳槽為市場上有銷售的。本發明採用的加樣孔膜條如下製備將一稍硬質的塑料薄膜，裁製成150mm×20mm大小尺寸。用一根2mm×5mm大小尺寸的鐵針加熱後將塑料薄膜燙出一隻孔，一條塑料薄膜可燙十隻孔。
具體採用如下步驟1)取瓊脂糖凝膠板一片，在離陰極側1.5cm處覆蓋一條2cm寬濾紙條，吸去部分水分，除去濾紙後將一加樣孔膜條置於其上，輕按加樣孔膜使其與膠板貼緊，避免氣泡，然後將5-7μl樣品加入孔內，注意使孔內全部均勻地充滿，靜置5-10分鐘，待樣品擴散進入膠內，用一條新的吸水紙蓋於加樣膜孔上，輕輕吸去多餘樣品，然後除去膜。
2)將膠板放入兩側已加有緩衝液的電泳槽上，注意將加樣側放於陰極側，二端用四層紗布搭橋(如房間溫度較高，上空架一冰袋降溫)，電泳20分鐘，電泳條件為每板40mA，電壓150V。
3)電泳結束前用1ml底物緩衝液溶解底物。
4)電泳畢，取出凝膠板，將底物均勻施加於膠板上，上面覆蓋一張與膠板大小一致的塑料薄膜，注意避免氣泡，置37℃恆溫水浴槽內，溫育40分鐘，或在45℃溫育20分鐘。
5)溫育畢，除去覆蓋的塑料薄膜，置乾燥箱內20分鐘烤乾(最高溫度不能超過75℃)。
6)在螢光光密度計上掃描測定各同工酶區帶的百分率，也可340nm紫外燈下直接觀察是否出現巨CK、CK-BB或CK-MB的陽性區帶。
7)如用可見光掃描定量，則在完成操作4以後，將1ml顯色劑鋪加於凝膠板上，再次覆蓋塑料薄膜，室溫避光放置10-15分鐘，用5％醋酸漂洗背景，於530-570nm掃描。
圖1是CK同工酶和巨CK在瓊脂糖介質上的電泳示意圖，CK同工酶在瓊脂糖介質上電泳分離，CK-BB遷移向陽極白蛋白區域，CK-MB位於α2至β球蛋白區域，而CK-MM位於陰極側γ球蛋白區，巨CK1位於CK-MB和CK-MM之間，巨CK2遷移率較低，位於CK-MM陰極側。圖2、圖3是採用本發明的巨肌酸酶試劑盒檢測的兩個樣品的電泳圖，其中，a代表質控樣品，b是患者樣品，c是正常對照，圖2說明了該患者的血清中含有CK-MM和巨CK2，圖3說明了該患者的血清中含有巨CK1和CK-MM。
實施例3 臨床檢測試驗應用本發明的巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒和免疫抑制法，本發明人鑑定了133例臨床標本，其中的結果對比見表1。採用本發明的試劑盒，其中20例標本含有巨CK1，107例標本含有巨CK2(其中經病理證實為惡性腫瘤者71例，肝硬化16，其它疾病20例)及6例標本含有CK-BB。而採用免疫抑制法檢測，這些標本均有一個共同的特點，即血清中「CK-MB」佔總CK活性50％以上，而總CK活性正常或輕度增高。因此採用本發明的試劑盒，避免了由於巨CK1、CK2、CK-BB的幹擾而出現CK-MB假陽性的現象，造成錯誤判斷和臨床誤診。從而更加準確的檢測出腫瘤患者和心臟病病人，為臨床提供正確的檢驗報告。
表1
權利要求
1.一種巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒，其中含有瓊脂糖凝膠板、Tris緩衝液、巴比妥鈉-巴比妥電泳緩衝液、底物、底物緩衝液和顯色劑，其特徵在於所述的瓊脂糖凝膠板中含有1％的瓊脂糖；在每升所述的Tris緩衝液中，含有20mmolTris，14克蔗糖，500毫克疊氮鈉，4-6g L-天冬酸乾粉；在每升所述的巴比妥鈉-巴比妥電泳緩衝液中含有10.3克巴比妥鈉，1.84克巴比妥；在每升所述的底物中含有4.0mmolADP，10.0mmol LAMP，20μmol二腺苷五磷酸，4.0mmolNADP，60mmol酸肌酸鈉，≥5.0U己糖激酶，≥3.0U 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，40mmolN-乙醯半胱氨酸；在每升所述的底物緩衝液中含有20mmol的咪唑，40mmol的葡萄糖，20mmol的醋酸鎂，4.0mmolEDTA；每1ml所述的顯色劑中含有氯化硝基四氮唑藍(NBT)2mg，吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)0.1mg。
2.如權利要求1所述的巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒，其特徵在於所述的Tris緩衝液的PH值為7.4。
3.如權利要求1所述的巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒，其特徵在於所述的巴比妥鈉-巴比妥電泳緩衝液的PH8.6。
4.如權利要求1所述的巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒，其特徵在於所述的底物緩衝液的PH值為6.7。
5.權利要求1所述的巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)配製PH7.4Tris緩衝液稱取20mmolTris，14克蔗糖，500毫克疊氮鈉，然後放置於容器中，再加入約800ml蒸餾水攪拌，將容器置於37℃水箱內，再向容器內加L-天冬酸乾粉，邊加邊攪拌溶解，用PH試紙條粗調PH約7.4，最後用PH測定儀調整PH至7.4，加水至1000ml；(2)製備1％瓊脂糖凝膠稱取1克瓊脂糖，加熱溶解於PH為7.4的Tris緩衝液100ml中，分裝8ml/管；(3)製備瓊脂糖凝膠板取出8ml/管1％瓊脂糖凝膠，隔水加熱溶解，在鐵板上放一片110mm×80mm透明的聚酯膜作支撐，上面壓一塊中間挖有100mm×70mm×1mm大小孔的矽膠片，四周與聚酯膜用水貼緊，將加熱溶解的8ml瓊脂糖倒入孔內，順勢用管底將瓊脂糖鋪平，待冷卻後，揭去矽膠片洗淨待用，在凝膠板上覆蓋一張保鮮膜，取下凝膠板，放入一密封的塑料盒內；(4)製備PH8.6，0.05mol/L巴比妥鈉-巴比妥電泳緩衝液稱取巴比妥鈉10.3克，巴比妥1.84克溶於1L蒸餾水中；(5)製備底物將4.0mmol LADP，10.0mmol LAMP，20μmol二腺苷五磷酸，4.0mmolNADP，60mmol磷酸肌酸鈉，≥5.0U己糖激酶，≥3.0U6-磷酸葡萄糖脫氫酶，40mmol N-乙醯半胱氨酸加入1L蒸餾水中混合；(6)製備底物緩衝液將20mmol咪唑、40mmol葡萄糖、20mmol醋酸鎂、4.0mmolEDTA溶於1L蒸餾水，用醋酸調節PH至6.7；(7)製備顯色劑稱取氯化硝基四氮唑藍(NBT)2mg，吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)0.1mg，使用前加蒸餾水至1ml。
6.權利要求1所述的巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒在腫瘤檢測上的應用，其特徵在於，包括以下步驟1)取已製備好的1％瓊脂糖凝膠板一片，在離陰極側1.5cm處覆蓋一條2cm寬濾紙條，吸去部分水分，除去濾紙後將一加樣孔膜條置於其上，輕按加樣孔膜使其與膠板貼緊，避免氣泡，然後將5-7μl樣品加入孔內，靜置5-10分鐘，待樣品擴散進入膠內，用一條新的吸水紙蓋於加樣膜孔上，輕輕吸去多餘樣品，然後除去膜條；2)將膠板放入兩側已加有緩衝液的電泳槽上，加樣側放於陰極側，二端用四層紗布搭橋，電泳20分鐘，電泳條件為每板40mA，電壓150V；3)用底物緩衝液溶解底物，待電泳畢，取出凝膠板，將底物均勻施加於膠板上，上面覆蓋一張與膠板大小一致的塑料薄膜，置37℃恆溫水浴槽內，溫育40分鐘，或在45℃溫育20分鐘；4)溫育畢，除去覆蓋的塑料薄膜，置乾燥箱內20分鐘烤乾，烘乾溫度60-75℃；5)在螢光光密度計上掃描測定各同工酶區帶的百分率，或在340nm紫外燈下直接觀察是否出現紫藍色巨CK、CK-BB或CK-MB的陽性區帶。
7.根據權利要求6所述的巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒在腫瘤檢測上的應用，其特徵在於，用可見光掃描定量時，在完成操作4)以後，將1ml顯色劑鋪加於凝膠板上，再次覆蓋塑料薄膜，室溫避光放置10-15分鐘，用5％醋酸漂洗背景，於530-570nm掃描。
全文摘要
本發明屬於醫藥生物領域，公開了一種巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒，其中含有瓊脂糖凝膠板、Tris緩衝液、巴比妥鈉－巴比妥電泳緩衝液、底物、底物緩衝液和顯色劑；本發明還公開了一種巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒的製備方法，採用本發明的巨肌酸激酶瓊脂糖電泳試劑盒鑑定血清標本，可以避免因免疫抑制法檢測CK－MB時所造成的假陽性的發生，為臨床提供正確的檢測報告，為腫瘤的早期診斷提供新的腫瘤標誌物。
文檔編號G01N21/64GK1880954SQ20051002683
公開日2006年12月20日 申請日期2005年6月16日 優先權日2005年6月16日
發明者王愛華, 於嘉屏, 許紹輝 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學