苦苣苔科植物超低溫保存方法

2023-12-04 22:45:31

苦苣苔科植物超低溫保存方法
【專利摘要】本發明提供苦苣苔科植物超低溫保存方法，利用葉圓片法誘導不定芽後通過微滴玻璃化法進行超低溫保存。將圓葉唇柱苣苔(Chirita dielsii)、美麗唇柱苣苔(Chirita speciosa)、吊石苣苔(Lysionotus pauciflorus vac.Pauciflorus)、齒葉吊石苣苔(Lysionotus serratus var.serratus)和保山吊石苣苔(Lysionotus sulphureoides)的葉圓片誘導不定芽後進行預培養、裝載處理、植物玻璃化溶液處理。超低溫保存的葉圓片在經過恢復培養後可以再生完整植株。本發明提供的圓葉唇柱苣苔、美麗唇柱苣苔、吊石苣苔、齒葉吊石苣苔和保山吊石苣苔超低溫保存方法簡便易行、穩定可靠，超低溫保存葉圓片再生的後植株生長狀態良好。
【專利說明】苦苣苔科植物超低溫保存方法

【技術領域】
:
[0001]本發明屬於植物種質資源的超低溫保存【技術領域】，具體涉及苦苣苔科植物超低溫保存方法以及再培養方法。

【背景技術】
:
[0002]苦苣苔科在全球有大約133屬3000種。廣泛分布在非洲、中南美洲、東亞、南亞、南歐和大洋洲的熱帶和亞熱帶地區。中國苦苣苔科植物有56屬和約442種，其中25屬和354種為中國特有。
[0003]中國苦苣苔科分布的狹域性，生境的隱蔽性和花期的不一致性，多數種採集難度較大(中國苦苣苔科植物)。苦苣苔科植物種子微小，一些種類結實困難(文和群)。一些瀕危種的數量非常少，其種子的收集和保存更加困難。苦苣苔科植物部分種類對環境條件要求高，適生的溫度範圍、溼度範圍和土壤酸鹼度範圍比較小。在北方地區引種栽培過程中，一些種類存活比較困難。由於分布的狹域性、生境的隱蔽性和花期的不一致性，多數種採集難度較大。在中國苦苣苔科植物中，約有25%的屬和30%的種知道20世紀50年代以後才陸續被採集和命名。例如，報春苣苔屬在2010年以後被描述的種就至少包括:Primulina mabaensis、Primulina chizhouensis、Primulina debaoensis、Primulinaguangxiensis、Primulina bullata、Primulina huaijiensis>Primulina qingyuanensis、Primulina beiliuensis、Primulina purpurea、Primulina yangshuoensis、Primulinafengshanensis、Primulina lutvittata、Primulina sinovietnamica 和 Primulinacardaminifolia。而唇柱苣苔屬在2010年以後被描述的新種至少包括了:Chiritagrandibracteata、Chirita lutea、Chirita Iuochengensis 和 Chirita luzhaiensis。上述最近被發現和描述的物種無論其分類學地位是否成立都代表了某些特殊的性狀，這對於不斷追求新奇感的園藝產業來說都是重要的育種資源。
[0004]苦苣苔科植物的超低溫保存研究比較有限。Moges等在2004年以離體莖尖為外植體，通過包埋脫水、玻璃化和包埋玻璃化途徑建立了非洲紫羅蘭(Saintpaulia 1nanthaWendl)的超低溫保存體系。在包埋脫水中，以0.3M蔗糖預培養2天後進行空氣脫水(airdehydrat1n)或娃膠乾燥脫水,分別可以得到75%和30%的再生率。在玻璃化程序中不同的滲透保護會對再生率產生影響，而以經典的滲透保護溶液效果最佳，可獲得55%的再生率。在包埋脫水方法中存活率和再生率可以分別達到80%。李佳以菸葉唇柱苣苔(Chiritaheterotricha Merr.)和藥用唇柱苣苔(Chirita medica D.Fang ex ff.T.Wang)葉片外植體為材料，經過自然乾燥、裝載液處理、玻璃化溶液處理、液氮冷凍保存，成功實現了玻璃化超低溫冷凍保存，經過液氮冷凍保存後的材料可以繼續分化、生長。存活率分別達到50.0%和27.8%。湯正輝以離體葉圓片為外植體，建立了菸葉唇柱苣苔、菱葉唇柱苣苔、半蒴苣苔玻璃化法超低溫保存方案。繼代培養20天的外植體在室溫下乾燥處理3天以誘導其脫水耐受性，隨後以一個經典的玻璃化超低溫保存程序進行超低溫保存。在優化的條件下，外植體的凍存後的存活率可以分別達到50.0%、38.9%和28.9%，但存活的外植體僅有1_2個芽可以繼續分化和生長。同時指出，葉片外植體在不定芽形成以後再加入玻璃化程序，其凍存後再生率很低。但實驗中的液氮凍存時間為6小時，凍存8小時後的外植體解凍後沒有繼續存活。


【發明內容】

:
[0005]本發明的目的在於針對現有技術存在的上述不足之處，提供利用葉圓片的苦苣苔科植物的高效超低溫保存方法。該方法簡便易行，穩定可靠，保存後苦苣苔科植物恢復生長狀況良好，植株再生率大幅提高。
[0006]為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案:
[0007]苦苣苔科植物超低溫保存方法，該方法包括如下步驟:
[0008](I)在無菌條件下取苦苣苔科植物葉圓片，將葉圓片轉入不定芽誘導培養基完成不定芽誘導；
[0009](2)對完成不定芽誘導的葉圓片進行預培養；
[0010](3)取完成步驟(2)的葉圓片，轉入裝有裝載液的冷凍管中，在25°C下裝載處理20分鐘；
[0011](4)步驟(3)中的葉圓片置於植物玻璃化溶液中，冷凍處理；
[0012](5)步驟(4)處理完後的葉圓片投入液氮中保存。
[0013]根據所述的保存方法，其中所述步驟(I)的苦苣苔科植物為苦苣苔科植物唇柱苣苔、美麗唇柱苣苔、吊石苣苔、齒葉吊石苣苔、保山吊石苣苔，取上述植物的組培苗葉片，用打孔器打成3mm的葉圓片，進行不定芽誘導。
[0014]根據所述的保存方法，其中所述步驟(2)的預培養是將所述不定芽在含有0.3M的蔗糖的MS液體培養基中，在25°C下暗培養24小時。
[0015]根據所述的保存方法，其中所述步驟(3)中所述的裝載液為MS基礎培養基添加2M甘油和0.4M蔗糖。
[0016]根據所述的保存方法，其中所述步驟(4)中的植物玻璃化溶液為PVS3溶液，由MS基礎培養基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖。
[0017]根據所述的保存方法，其中所述步驟(4)中的植物玻璃化溶液處理時間為:圓葉唇柱苣苔、美麗唇柱苣苔、吊石苣苔、齒葉吊石苣苔、保山吊石苣苔分別經PVS3處理40、40、60、80、80 分鐘。
[0018]根據所述的保存方法，其中所述步驟(3)為:將所述葉圓片轉移到25°C下裝有植物玻璃化溶液冷凍管中，每管裝有10個葉圓片。
[0019]根據所述的保存方法，其中所述步驟(4)冷凍處理是先將所述的葉圓片轉移至放無菌鋁箔條上，然後將所述鋁箔條直接插入液氮。
[0020]根據所述的保存方法，將經過步驟(5)保存後的苦苣苔科植物進行再培養，將超低溫保存的苦苣苔科植物的葉圓片進行解凍，再經恢復培養，所述的解凍為將鋁箔條從液氮中取出，並快速插入培養皿中裝有1ml MS基礎培養基添加1.2M蔗糖的卸載溶液裡，在25°C下處理20分鐘。
[0021]根據所述的保存方法，其中所述的恢復培養是將解凍後的葉圓片轉入MS基礎培養基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1Phytagel的恢復培養基中培養，首先在25°C下暗培養7天，然後在25°C，光周期光照/黑暗14/10小時，光強40μ mol JiT2iT1下培養。
[0022]本發明提供的技術方案實現了五種苦苣苔科植物的超低溫保存，該方法簡便易行，穩定可靠，保存後這五種苦苣苔科植物恢復生長狀況良好，植株再生率大幅提高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1.圓葉唇柱苣苔超低溫保存莖尖和葉圓片的再生情況。(al)超低溫保存莖尖再生單個植株(標尺為Imm)。(a2)超低溫保存莖尖再生一簇植株(標尺為Imm)。(bl)超低溫保存葉圓片再生單個植株(標尺為Imm)。(b2)超低溫保存葉圓片再生一簇植株(標尺為Imm)。(Cl)移栽3周的圓葉唇柱苣苔超低溫再生植株(標尺為Icm)。(c2)超低溫再生植株在移栽後月的植株開花(標尺為Icm)。
[0024]圖2.美麗唇柱苣苔超低溫保存葉圓片的再生情況。(a，b)超低溫保存葉圓片解凍後恢復培養6周再生情況(標尺為Imm)。(c)以超低溫保存葉圓片重新建立起來的美麗唇柱苣苔組培系(標尺為Icm)。(d)超低溫保存葉圓片再生植株移栽溫室(標尺為2cm)。
[0025]圖3.吊石苣苔超低溫保存後再生植株。(a)以超低溫保存葉圓片重新建立起來的組織培養體系(標尺為Icm)。(b)超低溫保存再生植株移栽後3個月(標尺為2cm)。(c)超低溫保存再生植株移栽後7個月(標尺為2cm)。
[0026]圖4.齒葉吊石苣苔超低溫保存葉圓片的再生情況。(a)經過超低溫保存處理但沒有再生的葉圓片(標尺為1_)。(b)超低溫保存葉圓片在恢復培養8周後再生植株(標尺為2_)。(c)以超低溫保存葉圓片重新建立起來的保山吊石苣苔組培系(標尺為lcm)。(d)超低溫保存葉圓片再生植株移栽溫室(標尺為lcm)。
[0027]圖5.保山吊石苣苔超低溫保存葉圓片的再生情況。(a，b)超低溫保存葉圓片在恢復培養8周後再生植株(標尺為2_)。(C)以超低溫保存葉圓片重新建立起來的保山吊石苣苔組培系(標尺為lcm)。(d)超低溫保存葉圓片再生植株移栽溫室(標尺為2cm)。
[0028]圖6.PVS2處理時間對圓葉唇柱苣苔莖尖超低溫保存再生率的影響。莖尖經過預培養和滲透保護後以PVS2在0°C下處理一定時間。PVS2處理結束後按照微滴玻璃化程序進行冷凍和解凍。
[0029]圖7.PVS3處理時間對圓葉唇柱苣苔莖尖超低溫保存再生率的影響。莖尖經過預培養和滲透保護後以PVS3在25°C下處理一定時間。PVS3處理結束後按照微滴玻璃化程序進行冷凍和解凍。
[0030]圖8.PVS3處理時間對圓葉唇柱超低溫保存葉圓片再生率的影響。葉圓片經過預培養和滲透保護後以PVS3在25°C下處理一定時間。PVS3處理結束後按照微滴玻璃化程序進行冷凍和解凍。
[0031]圖9.PVS3處理時間對美麗唇柱超低溫保存葉圓片再生率的影響。葉圓片經過預培養和滲透保護後以PVS3在25°C下處理一定時間。PVS3處理結束後按照微滴玻璃化程序進行冷凍和解凍。
[0032]圖10.PVS3處理時間對吊石苣苔超低溫保存葉圓片再生率的影響。葉圓片經過預培養和滲透保護後以PVS3在25°C下處理一定時間。PVS3處理結束後按照微滴玻璃化程序進行冷凍和解凍。
[0033]圖11.PVS3處理時間對齒葉吊石苣苔超低溫保存葉圓片再生率的影響。葉圓片經過預培養和滲透保護後以PVS3在25°C下處理一定時間。PVS3處理結束後按照微滴玻璃化程序進行冷凍和解凍。
[0034]圖12.PVS3處理時間對保山吊石苣苔超低溫保存葉圓片再生率的影響。葉圓片經過預培養和滲透保護後以PVS3在25°C下處理一定時間。PVS3處理結束後按照微滴玻璃化程序進行冷凍和解凍。

【具體實施方式】
:
[0035]以下結合附圖，用本發明的實施例進一步說明本發明的實質性內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明的方法、步驟或條件所做的修改或替換，均應屬於本發明的範圍。
[0036]若未特別指明，下述實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0037]本發明的技術方案總體包括如下步驟:
[0038](I)利用打孔器在無菌條件下獲取直徑為3mm的圓葉唇柱苣苔、美麗唇柱苣苔、吊石苣苔、齒葉吊石苣苔、保山吊石苣苔葉圓片。將葉圓片轉入不定芽誘導培養基完成不定芽誘導。
[0039](2)對完成不定芽誘導的葉圓片進行預培養。
[0040](3)取完成步驟(2)的葉圓片，轉入裝有裝載液的冷凍管中，在25°C下裝載處理20分鐘。
[0041](4)步驟(3)中的葉圓片置於裝有植物玻璃化溶液溶液的冷凍管中，在冰上處理一定時間。
[0042](5)步驟(4)中處理完後的葉圓片轉入無菌鋁箔片後直接投入液氮中，待降溫過程完成後轉入凍存管進行超低溫保存。
[0043]上述方法中，所述步驟(I)為將五種苦苣苔科植物的組培苗葉片用打孔器打成3mm的葉圓片並進行不定芽誘導。所述步驟(2)為對完成不定芽誘導的葉圓片進行預培養。所述預培養處理可以減少細胞水分含量，提高細胞可溶性糖含量，提高脫水耐受性，從而提高莖尖抗凍力，減少或避免冷凍傷害，達到提高存活率的目的。預培養培養基主要是添加蔗糖的培養基。步驟(2)所述的預培養方法是將所述不定芽在含有0.3M的蔗糖的MS液體培養基中，在25°C下暗培養24小時。由於植物玻璃化溶液濃度較高，將不定芽轉入植物玻璃化溶液中時會使細胞快速脫水，容易對莖尖造成傷害，因而，所述不定芽在玻璃化保護職權需要進行裝載。步驟(3)中所述的預處理方法是將經預培養後的不定芽用轉載溶液(loading solut1n)中處理20分鐘。轉載溶液的組成為MS基礎培養基添加2M甘油和0.4M蔗糖。步驟(4)所述的植物玻璃化溶液為PVS3溶液的組成是MS基礎培養基添加50%(w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖。步驟(4)所述的植物玻璃化溶液處理時間，圓葉唇柱苣苔和美麗唇柱苣苔經PVS3處理40分鐘，吊石苣苔、齒葉吊石苣苔和保山吊石苣苔經PVS3處理80分鐘。所述步驟(4)為:將所述不定芽轉移到室溫放置的裝有植物玻璃化溶液冷凍管中，每管裝有10個莖尖。所述步驟(5)為:先將所述的5個葉圓片轉入無菌鋁箔條上，然後將所述鋁箔條直接投入放置在液氮中的凍存管中，待降溫過程完成後將凍存管轉入液氮罐進行超低溫保存。本發明還提供了一種超低溫保存後的苦苣苔科植物的再培養方法，採用上述方法進行超低溫保存，現將超低溫保存的五種苦苣苔科植物的葉圓片進行解凍，再經過培養即可得到這五種苦苣苔科植物的植株。所述的解凍過程為將鋁箔條從液氮中取出，並快速插入6cm直徑培養皿中的1ml卸載溶液(unloading solut1n)裡,並在25°C下處理20分鐘。卸載溶液的組成是MS基礎培養基添加1.2M蔗糖。在卸載溶液處理結束後，將葉圓片轉入恢復培養基。恢復培養基的組成是MS基礎培養基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1PhytageK解凍的不定芽首先在25°C下暗培養7天，至不定芽返綠並有萌動跡象時轉入MS固體培養基中，在25°C，光周期14/10小時(光照/黑暗)，光強40 μ mol IrT2iT1下培養。
[0044]實施例1:
[0045]五種苦苣苔的超低溫保存:
[0046]實驗材料:五種苦苣苔科植物圓葉唇柱苣苔、美麗唇柱苣苔、吊石苣苔、齒葉吊石苣苔和保山吊石苣苔。
[0047]預培養培養基:添加0.3M蔗糖MS的液體培養基；
[0048]裝載溶液:MS基礎培養基添加2M甘油和0.4M蔗糖；
[0049]植物玻璃化溶液PVS3:MS基礎培養基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖；
[0050]恢復培養基:MS基礎培養基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1Phytagel (植物凝膠)。
[0051]方法:
[0052]選取完成不定芽誘導的圓葉唇柱苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M的MS培養基暗環境下預培養24小時，將莖尖在裝載溶液中25°C處理20分鐘，再轉移至植物玻璃化溶液PVS3中25°C下處理40分鐘。然後將葉圓片轉移到無菌鋁箔條上，用一把細鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產生時，將鋁箔條轉入放置在液氮中的凍存管，投入液氮中保存即可。
[0053]選取完成不定芽誘導的美麗唇柱苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M的MS培養基暗環境下預培養24小時，將葉圓片在裝載溶液中25°C處理20分鐘，再轉移至植物玻璃化溶液PVS3中在25°C下處理80分鐘。然後將葉圓片轉移到無菌鋁箔條上，用一把細鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產生時，將鋁箔條轉入放置在液氮中的凍存管，投入液氮中保存即可。
[0054]選取完成不定芽誘導的吊石苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M的MS培養基暗環境下預培養24小時，將莖尖在裝載溶液中25°C下處理20分鐘，再轉移至植物玻璃化溶液PVS3中25°C 60分鐘。然後將葉圓片轉移到無菌鋁箔條上，用一把細鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產生時，將鋁箔條轉入放置在液氮中的凍存管，投入液氮中保存即可。
[0055]選取完成不定芽誘導的齒葉吊石苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M的MS培養基暗環境下預培養24小時，將葉圓片在裝載溶液中25 °C下處理處理20分鐘，再轉移至植物玻璃化溶液PVS3中在25°C下處理40分鐘。然後將葉圓片轉移到無菌鋁箔條上，用一把細鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產生時，將鋁箔條轉入放置在液氮中的凍存管，每管5個不定芽，投入液氮中保存即可。
[0056]選取完成不定芽誘導的保山吊石苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M的MS培養基暗環境下預培養24小時，將葉圓片在裝載溶液中25 °C下處理20分鐘，再轉移至植物玻璃化溶液PVS3中在25°C處理80分鐘。然後將葉圓片轉移到無菌鋁箔條上，用一把細鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產生時，將鋁箔條轉入放置在液氮中的凍存管，投入液氮中保存即可。
[0057]再培養及存活率統計:
[0058]解凍時，將鋁箔條從液氮中取出，並快速插入6cm直徑培養皿中的1ml卸載溶液裡，並在25°C下處理20分鐘。在卸載溶液處理結束後，將葉圓片轉入恢復培養基。解凍的不定芽首先在25°C下暗培養7天，至不定芽返綠並有萌動跡象時轉入MS固體培養基中，在25°C,光周期14/10小時(光照/黑暗)，光強40 μ mol IrTiV1下培養。
[0059]恢復培養結果表明:不定芽超低溫保存後再培養後五種苦苣苔科植株恢復生長狀況良好(圖1-5)。圓葉唇柱苣苔、美I?唇柱苣苔、吊石苣苔、齒葉吊石苣苔和保山吊石苣苔這五種苦苣苔科植株再生率分別為53.3%,86.7%,70.0%,53.3%,43.3% (圖8-12)。
[0060]實施例2:
[0061]圓葉唇柱苣苔的超低溫保存一不同植物玻璃化溶液對保存效果的影響:
[0062]實驗材料:圓葉唇柱苣苔離體莖尖
[0063]預培養培養基:0.3M蔗糖MS的液體培養基；
[0064]裝載溶液:MS基礎培養基添加2M甘油和0.4M蔗糖；
[0065]植物玻璃化溶液PVS3:MS基礎培養基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖；PVS2:MS基礎培養基添加15% (w/v)甘油、15%乙二醇、15%二甲基亞碸和0.4M蔗糖。
[0066]恢復培養基:MS基礎培養基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1Phytagel。
[0067]方法:
[0068]選取圓葉唇柱苣苔莖尖，在蔗糖濃度為0.3M蔗糖的MS培養基暗環境下預培養24小時，用裝載溶液處理在25°C處理20分鐘，再分別經過PVS2和PVS3在25°C下處理20、40和60分鐘。然後將莖尖轉移到無菌鋁箔條上，用一把細鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產生時，將鋁箔條轉入放置在液氮中的凍存管，並保持在液氮保存。
[0069]再培養及存活率統計:
[0070]解凍時，將鋁箔條從液氮中取出，並快速插入6cm直徑培養皿中的1ml卸載溶液裡，並在25°C下處理20分鐘。在卸載溶液處理結束後，將莖尖轉入恢復培養基。解凍的莖尖首先在25°C下暗培養7天，至不定芽返綠並有萌動跡象時轉入MS固體培養基中，在25°C，光周期14/10小時(光照/黑暗)，光強40 μ mol m—Y1下培養。
[0071]恢復培養結果表明:圓葉唇柱苣苔超低溫保存莖尖在20-60分鐘PVS2處理下的再生率均不超過10%，且實驗穩定性比較差(圖6)。在PVS3處理20分鐘時，圓葉唇柱苣苔莖尖的再生率為13% ;當PVS3處理時間延長到40分鐘時，圓葉唇柱苣苔莖尖的再生率上升到20% ;當PVS3處理60分鐘時，其莖尖的再生率出現到10% (圖7)。所以在苦苣苔科植物的超低溫保存中PVS3是更為理想的植物玻璃化溶液。
[0072]實施例3:
[0073]圓葉唇柱苣苔的超低溫保存一外植體不同對超低溫保存效果的影響:
[0074]實驗材料:圓葉唇柱苣苔。切取葉片繁殖試管苗，獲得莖尖和葉圓片誘導的不定芽。
[0075]預培養培養基:0.3M蔗糖MS的液體培養基；
[0076]裝載溶液:MS基礎培養基添加2M甘油和0.4M蔗糖；
[0077]植物玻璃化溶液PVS3:MS基礎培養基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖；
[0078]恢復培養基:MS基礎培養基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1Phytagel (植物凝膠)。
[0079]方法:
[0080]選取圓葉唇柱苣苔葉圓片上誘導出的不定芽或者莖尖為外植體，在蔗糖濃度為
0.3M蔗糖的MS培養基暗環境下預培養24小時，用裝載溶液處理在25°C處理20分鐘，再經過PVS3在25°C分別處理20、40和60分鐘。然後將不定芽轉移到無菌鋁箔條上，用一把細鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產生時，將鋁箔條轉入放置在液氮中的凍存管，並保持在液氣保存。
[0081]再培養及存活率統計:
[0082]解凍時，將鋁箔條從液氮中取出，並快速插入6cm直徑培養皿中的1ml卸載溶液裡，並在25°C下處理20分鐘。在卸載溶液處理結束後，將葉圓片轉入恢復培養基。解凍的不定芽首先在25°C下暗培養7天，暗培養棘手後轉入MS固體培養基中，在25°C，光周期14/10小時(光照/黑暗)，光強40 μ mol IrTiV1下培養。
[0083]恢復培養結果表明:
[0084]在PVS3處理20分鐘時，圓葉唇柱苣苔莖尖的再生率為13% ;當PVS3處理時間延長到40分鐘時，其莖尖的再生率上升到20% ;當PVS3處理時間進一步上升時，其莖尖的再生率出現了下降，為10% (圖7)。以葉圓片誘導的不定芽為外植體時，在PVS3處理20分鐘時，圓葉唇柱苣苔葉圓片的再生率達到了 43.3% ;當PVS3處理延長到40分鐘時，其葉圓片的再生率上升到了 53.3% ;在？￥33處理進一步延長到60分鐘時，其葉圓片的再生率下降為36.7% (圖8)。
[0085]實施例4:
[0086]圓葉唇柱苣苔的超低溫保存一玻璃化處理時間對保存效果的影響:
[0087]植物玻璃化溶液可以是植物細胞脫水並進入細胞使得細胞在降溫過程中玻璃化，有效地保存細胞結構。但由於植物玻璃化溶液濃度過高，且低溫保護劑對細胞有毒害作用，需要嚴格控制植物玻璃化溶液的處理時間。在保證有足夠高的成活率的前提下，儘量縮短處理時間。
[0088]實驗材料:圓葉唇柱苣苔
[0089]預培養培養基:0.3M蔗糖MS的液體培養基；裝載溶液:MS基礎培養基添加2M甘油和0.4M蔗糖；
[0090]植物玻璃化溶液PVS3:MS基礎培養基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖；
[0091]恢復培養基:MS基礎培養基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1Phytagel。
[0092]方法:
[0093]選取完成不定芽誘導的圓葉唇柱苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M蔗糖的MS培養基暗環境下預培養24小時，用裝載溶液處理在25°C處理20分鐘，再經過PVS3在25°C分別處理20、40和60分鐘。然後將葉圓片轉移到無菌鋁箔條上，用一把細鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產生時，將鋁箔條轉入放置在液氮中的凍存管，並保持在液氮保存。
[0094]再培養及存活率統計:
[0095]解凍時，將鋁箔條從液氮中取出，並快速插入6cm直徑培養皿中的1ml卸載溶液裡，並在25°C下處理20分鐘。在卸載溶液處理結束後，將葉圓片轉入恢復培養基。解凍的不定芽首先在25°C下暗培養7天，暗培養結束時轉入MS固體培養基中，在25°C，光周期14/10小時(光照/黑暗)，光強40 μ mol IrTiV1下培養。
[0096]恢復培養結果表明:
[0097]在PVS3處理20分鐘時，圓葉唇柱苣苔葉圓片的再生率達到了 43.3% ;當PVS3處理延長到40分鐘時，其葉圓片的再生率上升到了 53.3% ;在PVS3處理進一步延長到60分鐘時，其葉圓片的再生率下降為36.7% (圖8)。
[0098]實施例5:
[0099]美麗唇柱苣苔的超低溫保存一玻璃化處理時間對保存效果的影響:
[0100]實驗材料:美麗唇柱苣苔
[0101]預培養培養基:0.3M蔗糖MS的液體培養基；
[0102]裝載溶液:MS基礎培養基添加2M甘油和0.4M蔗糖；
[0103]植物玻璃化溶液PVS3:MS基礎培養基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖；
[0104]恢復培養基:MS基礎培養基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1Phytagel。
[0105]方法:
[0106]選取完成不定芽誘導的美麗唇柱苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M蔗糖的MS培養基暗環境下預培養24小時，用裝載溶液處理在25°C處理20分鐘，再經過PVS3在25°C分別處理20、40和60分鐘。然後將不定芽轉移到無菌鋁箔條上，用一把細鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產生時，將鋁箔條轉入放置在液氮中的凍存管，並保持在液氮保存。
[0107]再培養及存活率統計:
[0108]解凍時，將鋁箔條從液氮中取出，並快速插入6cm直徑培養皿中的1ml卸載溶液裡，並在25°C下處理20分鐘。在卸載溶液處理結束後，將葉圓片轉入恢復培養基。解凍的不定芽首先在25°C下暗培養7天，暗培養結束時轉入MS固體培養基中，在25°C，光周期14/10小時(光照/黑暗)，光強40 μ mol IrTiV1下培養。
[0109]恢復培養結果表明:
[0110]在PVS3處理為20分鐘時，超低溫保存葉圓片的再生率為93.3% ;在PVS3處理為40分鐘時，超低溫保存葉圓片的再生率為86.7% ;而當PVS3處理為60分鐘時，再生率為100% (圖9)。儘管20、40和60分鐘PVS3處理的超低溫保存再生率之間存在差異，但都非常接近和達到100%，顯示這個方案對美麗唇柱苣苔非常高效。在對美麗唇柱苣苔進行以長期儲存為目標的超低溫保存實驗中，PVS3的處理時間可以選擇20-40分鐘之間的任何時間點，方便了操作。
[0111]實施例6:
[0112]吊石唇柱苣苔的超低溫保存一玻璃化處理時間對保存效果的影響:
[0113]實驗材料:吊石唇柱苣苔
[0114]預培養培養基:0.3M蔗糖MS的液體培養基；
[0115]裝載溶液:MS基礎培養基添加2M甘油和0.4M蔗糖；
[0116]植物玻璃化溶液PVS3:MS基礎培養基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖；
[0117]恢復培養基:MS基礎培養基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1Phytagel。
[0118]方法:
[0119]選取完成不定芽誘導的吊石苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M蔗糖的MS培養基暗環境下預培養24小時，用裝載溶液處理在25°C處理20分鐘，再經過PVS3在25°C分別處理40、60和80分鐘。然後將不定芽轉移到無菌鋁箔條上，用一把細鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產生時，將鋁箔條轉入放置在液氮中的凍存管，並保持在液氮保存。
[0120]再培養及存活率統計:
[0121]解凍時，將鋁箔條從液氮中取出，並快速插入6cm直徑培養皿中的1ml卸載溶液裡，並在25°C下處理20分鐘。在卸載溶液處理結束後，將葉圓片轉入恢復培養基。解凍的不定芽首先在25°C下暗培養7天，暗培養結束時轉入MS固體培養基中，在25°C，光周期14/10小時(光照/黑暗)，光強40 μ mol IrTiV1下培養。
[0122]恢復培養結果表明:
[0123]在PVS3處理為40分鐘時，超低溫保存葉圓片的再生率為33.3% ;在PVS3處理延長為60分鐘時，超低溫保存葉圓片的再生率顯著性的增長為70.0%;當PVS3處理進一步延長到80分鐘時，再生率有下降達到15.0% (圖10)。以上結果表明吊石苣苔葉圓片對PVS3處理時間較為敏感。
[0124]實施例7:
[0125]齒葉吊石唇柱苣苔的超低溫保存一玻璃化處理時間對保存效果的影響:
[0126]實驗材料:齒葉吊石唇柱苣苔
[0127]預培養培養基:0.3M蔗糖MS的液體培養基；
[0128]裝載溶液:MS基礎培養基添加2M甘油和0.4M蔗糖；
[0129]植物玻璃化溶液PVS3:MS基礎培養基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖；
[0130]恢復培養基:MS基礎培養基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1Phytagel。
[0131]方法:
[0132]選取完成不定芽誘導的齒葉吊石苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M蔗糖的MS培養基暗環境下預培養24小時，用裝載溶液處理在25°C處理20分鐘，再經過PVS3在25°C分別處理60、80和100分鐘。然後將不定芽轉移到無菌鋁箔條上，用一把細鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產生時，將鋁箔條轉入放置在液氮中的凍存管，並保持在液氮保存。
[0133]再培養及存活率統計:
[0134]解凍時，將鋁箔條從液氮中取出，並快速插入6cm直徑培養皿中的1ml卸載溶液裡，並在25°C下處理20分鐘。在卸載溶液處理結束後，將葉圓片轉入恢復培養基。解凍的不定芽首先在25°C下暗培養7天，暗培養結束時轉入MS固體培養基中，在25°C，光周期14/10小時(光照/黑暗)，光強40 μ mol IrTiV1下培養。
[0135]恢復培養結果表明:
[0136]在PVS3處理為60分鐘時，超低溫保存葉圓片的再生率為33.3% ;在PVS3處理延長為80分鐘時，超低溫保存葉圓片的再生率為53.3% ;當PVS3處理進一步延長到100分鐘時，再生率有所下降，達到36.7% (圖11)。
[0137]實施例8:
[0138]保山吊石唇柱苣苔的超低溫保存一玻璃化處理時間對保存效果的影響:
[0139]實驗材料:保山吊石唇柱苣苔
[0140]預培養培養基:0.3M蔗糖MS的液體培養基；
[0141]裝載溶液:MS基礎培養基添加2M甘油和0.4M蔗糖；
[0142]植物玻璃化溶液PVS3:MS基礎培養基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖；
[0143]恢復培養基:MS基礎培養基添加0.09M蔗糖、0.5mg F1BA和2.Sgr1Phytagel。
[0144]方法:
[0145]選取完成不定芽誘導的保山吊石苣苔葉圓片，在蔗糖濃度為0.3M蔗糖的MS培養基暗環境下預培養24小時，用裝載溶液處理在25°C處理20分鐘，再經過PVS3在25°C分別處理60、80和100分鐘。然後將不定芽轉移到無菌鋁箔條上，用一把細鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產生時，將鋁箔條轉入放置在液氮中的凍存管，並保持在液氮保存。
[0146]再培養及存活率統計:
[0147]解凍時，將鋁箔條從液氮中取出，並快速插入6cm直徑培養皿中的1ml卸載溶液裡，並在25°C下處理20分鐘。在卸載溶液處理結束後，將葉圓片轉入恢復培養基。解凍的不定芽首先在25°C下暗培養7天，暗培養結束時轉入MS固體培養基中，在25°C，光周期14/10小時(光照/黑暗)，光強40 μ mol IrTiV1下培養。
[0148]恢復培養結果表明:
[0149]在PVS3處理為60分鐘時，超低溫保存葉圓片的再生率為26.7% ;在PVS3處理延長為80分鐘時，超低溫保存葉圓片的再生率為43.3% ;當PVS3處理進一步延長到100分鐘時，再生率為43.3% (圖12)。
【權利要求】
1.苦苣苔科植物超低溫保存方法，其特徵在於該方法包括如下步驟: (1)無菌條件下取苦苣苔科植物葉圓片，將葉圓片轉入不定芽誘導培養基中完成不定芽誘導； (2)對完成不定芽誘導的葉圓片進行預培養； (3)取步驟(2)的葉圓片，轉入裝有裝載液的冷凍管中，在25°C下裝載處理20分鐘； (4)步驟(3)中的葉圓片置於植物玻璃化溶液中，冷凍處理； (5)步驟(4)處理完後的葉圓片投入液氮中保存。
2.根據權利要求1所述的保存方法，其特徵在於，所述步驟(I)的苦苣苔科植物為苦苣苔科植物唇柱苣苔、美麗唇柱苣苔、吊石苣苔、齒葉吊石苣苔、保山吊石苣苔，所述不定芽誘導是取上述植物的組培苗葉片用打孔器打成3_的葉圓片，進行不定芽誘導。
3.根據權利要求1所述的保存方法，其特徵在於，所述步驟(2)的預培養是將完成不定芽誘導的葉圓片在含有0.3M的蔗糖的MS液體培養基中，25°C下暗培養24小時。
4.根據權利要求1所述的保存方法，其特徵在於，所述步驟(3)中所述的裝載液為MS基礎培養基添加2M甘油和0.4M蔗糖。
5.根據權利要求1所述的保存方法，其特徵在於，所述步驟(4)中的植物玻璃化溶液為PVS3溶液，由MS基礎培養基添加50% (w/v)甘油和50% (w/v)蔗糖。
6.根據權利要求1所述的保存方法，其特徵在於，所述步驟(4)中的植物玻璃化溶液處理時間為:圓葉唇柱苣苔、美麗唇柱苣苔、吊石苣苔、齒葉吊石苣苔、保山吊石苣苔分別經PVS3 處理 40、40、60、80、80 分鐘。
7.根據權利要求1所述的保存方法，其特徵在於，所述步驟(3)是將葉圓片轉移到25°C下裝有植物玻璃化溶液冷凍管中，每管裝10個葉圓片。
8.根據權利要求1所述的保存方法，其特徵在於，所述步驟(4)冷凍處理是先將葉圓片轉移至無菌鋁箔條上，然後將所述鋁箔條直接插入液氮。
9.根據權利要求1- 8任一項所述的保存方法，其特徵在於，將經過步驟(5)保存後的苦苣苔科植物進行再培養，將超低溫保存的苦苣苔科植物的葉圓片進行解凍，再經恢復培養，所述的解凍為將鋁箔條從液氮中取出，快速插入1ml MS基礎培養基添加1.2M蔗糖的卸載溶液裡，25°C下處理20分鐘。
10.根據權利要求9所述的保存方法，其特徵在於，所述的恢復培養是將解凍後的葉圓片轉入MS基礎培養基添加0.09M蔗糖、0.5mg 1_1BA和2.Sgr1Phytagel的恢復培養基中培養，先在25 °C下暗培養7天，後在25°C，光周期光照/黑暗14/10小時，光強40 μ mo I nT2s_1下培養。
【文檔編號】A01N3/00GK104430306SQ201410627634
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月10日 優先權日:2014年11月10日
【發明者】李唯奇, 林亮, 袁彬, 王丹丹, 覃香世 申請人:中國科學院昆明植物研究所