一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒及其構建方法

2023-12-10 04:26:41

專利名稱：一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒及其構建方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，尤其涉及一種穿梭質粒，特別是一種雙啟動子可誘導 可分泌型穿梭質粒及其構建方法。
背景技術：
生物工程領域中，為了有效表達克隆基因，常常需要進行表達載體的構建。大腸杆 菌表達系統是基因工程研究中最常用的一種。它雖然不能如真核系統那樣進行翻譯後加 工，但大腸桿菌其遺傳背景相對清楚，操作簡便、生長周期短、經濟安全，因此仍然是使用最 廣泛、也是不可被替代的系統，在基因工程基礎研究和實際應用中成為不可缺少的重要工 具。一些重要的外源基因在大腸桿菌中獲得了佔菌體總蛋白30%甚至40%多的高效表達 量。通常大腸桿菌表達載體應滿足以下要求1、適用範圍要廣；2、基因表達量高；3、表達的 產物容易純化；4、質粒穩定性要好。可是迄今為止還沒有一個表達載體能完全滿足上述要 求。就表達基因的質粒載體來說，一般最好要符合下面的條件1、表達載體要具有多拷貝 或高拷貝性；2、最好具有可誘導的強啟動子；3、有強的轉錄終止序列；4、有最佳最有效的 翻譯起始序列。而要是具有分泌表達則更具優越性，這樣表達蛋白可正確摺疊，更具生物 活性且產物可溶；而且表達的蛋白分泌到胞外，能方便分離純化。在這些系統中，枯草桿菌 就具有這種功能，枯草桿菌還是一種非致病性微生物，對人畜無害，所以常被許多研究者作 為表達系統加以應用。但是在實際應用過程中，枯草桿菌質粒的提取與轉化效率明顯不如 常用的大腸桿菌。如果在大腸桿菌中進行DNA分子操作，顯得簡便易行，完成了基因操作 後，再在枯草桿菌中進行外源蛋白的高效表達，表達產物分泌於胞外，可以較好的解決和克 服大腸桿菌表達產生包涵體，需要變性復性的煩瑣操作。所以構建大腸桿菌_枯草桿菌穿 梭表達分泌載體成為一個重要選擇[工業微生物，1989，19(1) :1_6 ；生物工程學報，2002， 18(4) =438-4411 ；遺傳學報，2000，27 (7) =647-6531] 0上個世紀後期，許多科學工作者構建 各類表達載體，以期能夠在大腸桿菌、或者在枯草桿菌、或者在大腸桿菌-枯草桿菌等不同 的載體中同時高效表達基因。有的構建多功能啟動子同時啟動表達以提高表達水平等等。 所有的研究目的只有一個，那就是千方百計以最小成本換取最大表達產量，以降低表達產 物如生物醫藥產品的生產成本；或者大大減少研究開發的時間和成本。所以，公開發表有許 多不同表達載體構建成功的報導，以滿足不同研究和生產目的的需要。這些表達載體進行 融合表達、有的非融合表達、有的進行分泌型表達、有的帶純化標籤的表達等等。本發明構建的表達載體符合上述條件。本發明以殺菌肽牛乳鐵蛋白、人源LL-37、 溶菌酶等這些對宿主產生毒殺作用的蛋白作為報告基因進行操作，更有優越性。能夠克服 其對宿主的毒殺作用，進行在原核生物中表達重要目的蛋白更具有實際意義。溶菌酶是廣泛存在於生物體內各器官、組織、血清或唾液的水解酶，在動植物、噬 菌體等生物體內都有發現。迄今相關的報導如鳥類溶菌酶、T4溶菌酶、P22溶菌酶、蛋清 溶菌酶等，有數十種之多。其中蛋清中的溶菌酶含量尤為豐富，佔蛋清總蛋白的3. 4% 3.5%，使用也最廣。溶菌酶是一種非特異性免疫分子，能夠提高機體的免疫功能，同時還具有抗腫瘤、抗病毒、改善和增強巨噬細胞吞噬、消化功能。目前溶菌酶更多的是殺菌功能 的應用。溶菌酶是以裂解細菌細胞壁的N-乙醯胞壁酸(NAM)和N-乙酸葡萄糖酸(NAG) 間的(1-4)糖苷鍵而使細菌裂解殺滅細菌的。然而溶菌酶只能對部分革蘭氏陽性菌起作 用，在作用於一類人、畜易感疾病的金葡菌時卻難以湊效，對一些易致病的陰性菌(如大腸 桿菌)難有強的殺滅作用，表現出殺菌譜不廣、效率有限的局限性。此後，研究者對溶菌酶 進行定點突變，開展對溶菌酶的基因改造研究，情況雖有改善但效果不顯著。為解決殺菌 譜問題，實際應用中常需要與其他殺菌物質配伍使用，如添加抗生素，或添加生物鹼、聚磷 酸、甘氨酸等其他物質，以此來增加殺菌效果和擴大殺菌譜，這些物質對於溶菌酶來說起到 了增效使用。人源溶菌酶是溶菌酶的一種來源，DNA序列與蛋清溶菌酶十分相似，僅多了 一個胺基酸，分子中同樣含有八個半胱氨酸，八個半胱氨酸兩兩摺疊形成四對二硫鍵，活性 位點也相同。除若干個別胺基酸有變化外，酶的作用方式和功能相同，人源溶菌酶作用溶 壁微球菌的活性要高出蛋清溶菌酶3倍。由於人源溶菌酶獲得極其困難，不少研究者開 始利用基因工程技術複製人源溶菌酶基因[動物醫學進展，2009，30 (4) :5-7;科學通報， 48(20) 2149-2153 ；Agric Biol Chem,1986,50(3) :713 723 ；Gene,1987,56 53-59 ；Appl Microbiol Biotechnol, 1992,38 109-114 J. FEBSLetters, 2001, 506 (1) :27_32]。人溶菌 酶與蛋清溶菌酶一樣存在殺菌譜問題。尋找生物活性肽與之聯合應用可以解決上述缺陷。如抗菌肽(Antibacterial peptides, ABP)就是一類功能肽，或稱抗微生物肽或肽抗生素，是生物體內先天免疫的重 要組成成分。殺菌肽殺菌譜廣，能殺滅抗生素耐藥菌株，能抑殺真菌、病毒、寄生蟲，甚至腫 瘤細胞和實體瘤等特點，重要的是殺菌肽使用不易產生耐藥性突變，理化性質穩定、抗菌 機理獨特，又容易溶於水，對高等動物正常細胞少有毒害等許多優點。因此專家預言經過 努力，有朝一日有望開發成為新一代抗細菌、真菌、病毒甚至是抗癌的藥物。在美、日等發 達國家，用這些功能肽製成健康食品，如多肽飲料、多肽兒童餐、老人餐、多肽保健食品、抗 輻射含片等。可預見的將來活性多肽的應用將充滿希望，成為最具綠色安全的一類殺菌 劑，充滿活力。現在被發現並研究的殺菌肽有上百種之多，如天蠶素(cecropins)、蛙皮素 (Magainins)、蜂毒素(melittins)、蟬、蠶抗菌肽及雞、奶牛和人的殺菌/通透性增加蛋白 (BPI)、人源抗菌肽LL-37等等。在生物體內這些殺菌多肽分泌量極少，獲取十分困難，現在 以化學合成這些殺菌多肽在國內還基本局限在研究領域，有規模的應用其趨勢並沒形成， 原因就是成本成了擴大應用的最大問題。應用基因工程方法克隆並表達殺菌肽成為首選[Biochimica et Biophysica Actal758(2006) 1351-1358 ；微生物通報，1997，24 (6) 350-353 ；中國衛生檢驗雜誌， 2009，19(6) :1202-1205 ；中國獸醫學報，2009，29(8) =1041-1044] 克隆和表達殺菌肽都需 要克服幾個障礙。1，由於殺菌肽分子量都比較小，一般都在幾十個胺基酸左右，所以表達時 表達量並不高；2，適合於表達抗菌肽的表達系統十分有限，一般只能在真核生物如酵母或 奶牛乳腺或昆蟲等進行表達，如果用原核生物作為宿主來表達存在表達產物毒害或殺滅宿 主自身的問題，所以一般並不能直接在原核生物中表達，高表達或分泌型表達更為困難；3， 正因為殺菌肽分子量小，一旦表達過量非常容易被宿主菌蛋白酶識別降解。因此表達殺菌 肽常與其他大分子蛋白融合表達，但融合表達會使殺菌肽失去殺菌功能；4，為使表達的融 合蛋白具有生物學活性，需要對表達產物進行有效切割，從融合狀態釋放出殺菌肽恢復殺菌功能。目前常用切割方法有使用腸激酶、凝血酶、Xa因子或BrCN等。BrCN是有毒化學 品；使用凝血酶等酶類則價格昂貴而制約了融合殺菌多肽規模化生產和應用。只有解決了 上述這些問題才能真正進行規模化生產。本發明以殺菌肽、溶菌酶為報告基因，比較構建的 雙啟動子誘導分泌型穿梭質粒表達殺菌肽、溶菌酶情況。效果顯著。不同的基因克隆到表達 載體後同時能夠在不同表達系統中獲得分泌型表達，方便地找到最佳表達殺菌肽的表達系 統，減少研究時間和成本。通過本發明的穿梭質粒載體表達更具重要藥用價值的酶、蛋白、 激素等將更具現實意義。

發明內容
本發明的目的在於提供一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒及其構建方法，所 述的這種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒及其構建方法要解決現有技術中的載體表達 殺菌肽的量小，或成本過大而不能大規模生產的技術問題。本發明提供了一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒，所述的穿梭質粒由一個酶 切的大腸桿菌pET-28a質粒和一個酶切的枯草桿菌pE194質粒構成，所述的酶切的大腸杆 菌pET-28a質粒上插入有溶菌酶-抗菌肽功能片段和牛乳鐵蛋白。進一步的，所述的抗菌肽基因為一種、或者任意兩種或者兩種以上的殺菌功能肽 胺基酸片段的組合，或者任意一個功能片段的重複串聯融合。進一步的，所述的抗菌肽基因為牛乳鐵蛋白肽基因、或人源殺菌肽基因、或人源溶 菌酶基因、或天蠶素基因、或蛙皮素基因、或蜂毒素基因、或其他來源抗菌肽基因。進一步的，所述的溶菌酶-抗菌肽功能片段中的溶葡球菌酶的酶切識別位點氨基 酸序列為GGG。本發明還提供了上述的這種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒的構建方法，包 括一個在NdeI和XhoI位點酶切大腸桿菌pET-28a質粒的步驟，在所述的酶切大腸桿菌 pET-28a質粒NdeI和XhoI酶切位點之間插入至少一個抗菌肽功能片段，還包括一個構建 啟動子信號肽片段的步驟，在所述的啟動子信號肽片段上依次設置有Bglll、PstI, NheI, KpnI和BglII酶切位點，所述的啟動子信號肽片段的序列如SEQ ID NO :2所示，然後分別用 BGlII酶切啟動子信號肽片段和大腸桿菌pET-28a質粒，採用連接酶連接，形成一個插入有 啟動子信號肽片段的大腸桿菌pET-28a質粒，還包括一個構建溶菌酶_抗菌肽功能片段的 步驟，在溶菌酶_抗菌肽功能片段的兩端分別設置有NheI和KpnI酶切位點，然後在插入有 啟動子信號肽片段的大腸桿菌pET-28a質粒的NheI和KpnI位點酶切，插入溶菌酶-抗菌肽 功能片段，採用連接酶連接，形成一個插入有溶菌酶_抗菌肽功能片段的大腸桿菌pET-28a 質粒，還包括一個在插入有溶菌酶_抗菌肽功能片段的大腸桿菌pET-28a質粒的PstI位點 酶切的步驟，在PstI位點酶切的枯草桿菌pE194質粒，然後插入有溶菌酶-抗菌肽功能片 段的大腸桿菌pET-28a質粒，構成本發明的雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒。進一步的，在一個構建啟動子信號肽片段的步驟中，PCR擴增啟動子信號肽功能片 段的引物序列為Pl 5-AAGATCTCTGCAGCCGGAACTCTTGAATG (BglII 和 PstI)，P2 5-AAGATCTGCTTCAACTTTAGGAA(BglII)，在所述的啟動子信號肽功能片段中克隆有效的終止子片段，
採用人工合成三段DNA片段，通過重疊PCR擴增獲得終止子片段，引物序列為P3 5-CATGCTAGCGGTACCGGCGGCGGCGGCCATCATCACCACCACCACTGAGCGCGC,P4 5-ACCACCACTGAGCGCGCTTTTTATAAACTTATATGATAATTAGAGCAAATAAAA,P5 5-CGCCATGCCGGCAAGCTTCAACTTTAGGAATGAGAAAAAATTTTTATTTGCTCTAA,再通過啟動子信號肽片段和終止子片段的重疊PCR，獲得完整的啟動子信號肽功 能片段，正向P7 5-AAAATGAAACACATGCTAGCGGTACCGGCGGCGGCGGCC (NheI、KpnI)反向P8 :5~GGCCGCCGCCGCCGGTACCGCTAGCATGTGTTTCATTTTG (NheI、KpnI)合成出啟動子信號肽功能片段後，以此片段為模板，以引物Pl與引物P8，引物P7 與引物P5，分別合成出二個片段，電泳回收後，混合回收的二片段，再以P1、P5 二引物進行 重疊PCR，獲得含有BglII、PstI, NheI, KpnI和Bgl11酶切位點的啟動子信號肽功能片段。進一步的，所述的啟動子信號肽功能片段上克隆有啟動子序列、信號肽序列、終止 子序列、六個組氨酸，所述的啟動子包括-35區、-10區和核糖體結合位點AGGAGGT。所述的 信號月太序列為TTGAAGAAAACAAAAAACAATTATTATACGAGACCTTTAGCTATTGGACTGAGTACATTTGCCT TAGCATCTATTGTTTATGGAGGGATTCAAAATGAAACACATGCTAGC,所述的終止子序列為 TGAGCGCGCT TTTTATAAACTTATATGATAATTAGAGCAAATAAAAATTTTTTCTCATTCCTAAAGTTGCCGGCATGGCG,所述的 啟動子信號肽片段上還克隆有BglII、PstI、NheI、KpnI和BglII酶切位點。進一步的，在所述的啟動子信號肽功能片段上克隆有溶葡球菌酶的酶切識別位點 GGC(3Gly)和 6His。進一步的，在一個構建溶菌酶_抗菌肽功能片段的步驟中，所述的抗菌肽基因為 一種、或者任意兩種或者兩種以上的殺菌功能肽胺基酸片段的組合，或者任意一個功能片 段的重複串聯融合。進一步的，所述的抗菌肽基因為牛乳鐵蛋白肽基因、或人源殺菌肽基因、或人源溶 菌酶基因、或天蠶素基因、或蛙皮素基因、或蜂毒素基因、或其他抗菌肽基因。進一步的，在融合蛋白的抗菌肽之間插入有溶葡球菌酶切割位點。進一步的，在大腸桿菌pET_28a質粒的NheI和KpnI位點之間插入有溶葡球菌酶 切割位點。進一步的，在牛乳鐵蛋白基因C端有溶葡球菌酶的切割識別位點GGG，所述的牛乳 鐵蛋白基因的鹼基序列如SEQ ID NO :1所示，所述的牛乳鐵蛋白的胺基酸序如SEQ ID NO 3所示。進一步的，所述的抗菌肽基因中含有二分子串連的人源殺菌肽基因LL-37，所述的 人源殺菌肽基因LL-37，其N端胺基酸改變為Gly，第4、30位胺基酸變為Asn，第11、16、36 位胺基酸改變為Gln，第13、20、24、33胺基酸改變為Pro，C端增加Gln和Gly 二個胺基酸， 所述的人源溶菌酶與二分子人源LL-37融合蛋白基因的鹼基序列為SEQ ID NO :4所示，所 述的人源溶菌酶與二分子人源LL-37融合蛋白基因的胺基酸序如SEQ ID NO :5所示。本發明還提供了上述的雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒在製備治療抗菌藥物 中的應用。本發明提供了一種雙功能誘導分泌型穿梭表達載體，同一表達載體克隆的目的蛋 白基因可在不同表達系統中高效表達，特別是表達一類對原核生物有毒殺作用的如殺菌
7肽、溶菌酶、毒蛋白等基因。本發明的構建過程是在pET_28a質粒上克隆有牛乳鐵蛋白基 因於多克隆位點的NdeI和XhoI位點之間，成功刪除NheI位點的步驟，本發明包括了一個 在克隆的啟動子信號肽功能片段上引入BglII和PstI酶切位點步驟，不改變pET-28a結 構，把啟動子信號肽功能片段克隆到pET-28a上，還包括了 BglII單酶切pET_28a和PCR擴 增的啟動子信號肽功能片段，將BglII酶切後的pET-28a與PCR擴增的功能片段採用連接 酶連接步驟，包括一個將連接後的質粒轉化的步驟；包括Bgl11單酶切插入pET-28a後鑑定 功能片段插入方向的步驟；包括含分泌型表達啟動子信號肽功能片段的pET-28a與pE194 穿梭的步驟，將PstI酶切pET-28a與pE194，純化後採用連接酶連接的步驟，包括一個將連 接後的質粒轉化的步驟，得到能在大腸桿菌、枯草桿菌和球形芽孢桿菌中穿梭表達克隆基 因的穿梭質粒轉化子。本發明擴增的啟動子信號肽片段引入BglII和PstI，BglII位點在pET_28a載體 上是唯一的酶切點，可以在不改變pET-28a功能的情況下把啟動子信號肽功能片段克隆到 pET-28a上；pET-28a載體上沒有PstI，通過PCR引物擴增引入PstI位點，方便與枯草桿菌 PE194質粒穿梭，構建能在大腸桿菌、枯草桿菌、球形芽孢桿菌中均能表達基因的穿梭質粒。 引入的NheI和KpnI位點可以使表達的目的蛋白基因以正確方向插入表達。NheI位點還是 信號肽酶的識別切割位點，有利於表達蛋白分泌於胞外。本發明的雙啟動子誘導分泌型表達穿梭質粒中的抗菌肽基因可以通過誘導表達， 也可以分泌型胞外表達，也可以抗菌肽部分胺基酸片段中任意一個功能片段的重複串聯融 合表達，也可以同一基因重複串聯表達，其間引入溶(葡球)菌酶切割位點，表達後經溶 (葡球)菌酶酶切恢復殺菌功能。本發明提供了一種可以誘導表達，也可以外分泌表達目的蛋白的穿梭質粒，以及 高效表達溶菌酶或殺菌肽或毒蛋白等基因的方法。本發明構建的表達載體適合於在原核生 物(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、球形芽孢桿菌)中表達。該穿梭質粒轉入原核生物以融合 方式表達毒蛋白、殺菌肽等蛋白對宿主不表現毒殺作用。通過本發明的穿梭質粒表達人源 LL-37、牛乳鐵蛋白、溶菌酶等多肽蛋白或融合蛋白獲得成功。本發明構建的表達載體質粒 引入6His，方便通過M柱純化。純化後的融合蛋白經溶(葡球)菌酶對各融合肽段間酶切 位點的識別(GGG)，並正確切割，釋放各功能肽使其恢復原有活性，而用於切割的溶(葡球) 菌酶免去分離而被直接使用，溶(葡球)菌酶本身就是專一殺滅金黃色葡萄球菌的酶。該 方法對於表達一類對宿主有毒殺作用的蛋白特別有效，方法簡便，易於操作，構建一個表達 的目的蛋白表達載體可以同時在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、球形芽孢桿菌中進行表達，從中 方便地找到最適合高產的表達系統，具有一定的共用性。省時省力，事半功倍。本發明構建 的穿梭表達載體質粒也可以經IPTG或者乳糖誘導，以提高基因表達水平；也適合於外分泌 表達，外分泌表達的目的蛋白處理方便又沒有內毒素汙染。由於具有雙功能啟動子，不同基 因都可在合適的正確方向插入基因進行表達。本發明構建的穿梭質粒設計考慮以下特點pET-28a是Novagen公司商業化表達 載體，質粒載體上含有單一 BglII酶切位點，BglII酶切不改變原質粒載體功能，利用BglII 酶切點把PCR擴增的分泌型啟動子信號肽功能片段插入於pET-28a ；pET-28a載體上沒有 PstI，在PCR擴增分泌型啟動子信號肽功能片段時引入PstI，擴增後用PstI酶切含分泌型 啟動子信號肽功能片段的pET-28a和pE194 二質粒，T4連接酶連接，CaC12法轉化感受態大腸桿菌DE3，得到能在大腸桿菌和枯草桿菌中穿梭表達克隆基因的穿梭質粒轉化子。在此穿 梭質粒表達基因時所克隆的啟動子有較廣的共用性，克隆一個表達載體質粒就能夠在大腸 桿菌、枯草桿菌和球形芽孢桿菌中啟動表達；質粒上克隆有信號肽序列，能夠使表達的目的 蛋白分泌於胞外，方便分離純化；設計了有效的終止子和終止子序列，能夠使蛋白翻譯有效 終止；信號肽酶切割位點設計有利酶切後克隆基因的正確方向的連接；穿梭質粒載體上克 隆有6His，能夠方便地通過M柱進行分離純化；穿梭質粒載體克隆有溶葡球菌酶的酶切識 別點(GGG)，當M柱純化的目的蛋白有多個功能肽融合表達時，通過溶葡球菌酶酶切，方便 地釋放出融合肽蛋白，對表達如抗菌肽、毒蛋白這樣一類對宿主有毒害或殺滅作用的蛋白 更有意義。總之，本發明設計的穿梭質粒具有一定的共用性，可以將不同的基因克隆於載體 進行表達。本發明和已有技術相比，其效果明顯，主動性、針對性強。發明在各融合功能肽 之間引入連接小肽，該連接小肽能被溶葡球菌酶專一性切割[Recsei，PNAS，1987，Vol84, PP1127-1131]，通過溶葡球菌酶專一性切割恢復原有肽的殺菌功能。在工程菌的培養過程 中，融合的殺菌肽表達對宿主菌自身不再產生毒害，融合表達又使分子量增大不再被宿主 菌降解，表達量隨之增加，尤其表達象人溶菌酶這樣的一類酶，該酶本身就是一個抑殺細菌 的酶。同時，考慮到表達產物的分離純化，在融合蛋白C端融合了 6His，當發酵結束，利用 Ni柱方便地將融合蛋白純化，再用溶葡球菌酶對融合蛋白進行專一性切割，釋放出多肽使 其恢復原有殺菌功能。本發明特徵表現在，表達的溶菌酶和殺菌多肽及用於切割融合多肽 的溶葡球菌酶均具殺菌功能，本發明是用基因工程方法提高大量生產高活性殺菌多肽為目 的，因而不需要對切割用溶葡球菌酶進行分離和純化被直接使用。本發明是一種應用基因 工程技術生產各種殺菌多肽、人溶菌酶或它們之間的融合蛋白的一種技術方法。


圖1為雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒的構建示意圖。圖2是抗菌肽的殺菌效果圖。
具體實施例方式實施例1雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒的構建雙啟動子可誘導分泌型大腸桿菌和枯草桿菌穿梭質粒的構建如圖1所示。大腸 桿菌pET-28a為Novagen商品化表達質粒。NdeI和XhoI雙酶切pET_28a，插入含NdeI和 XhoI酶切位點的牛乳鐵蛋白的二段功能肽，以此刪除多克隆位點中的Nhel。刪除NheI是 為隨後構建的啟動子信號肽功能片段中引入有信號肽酶的切割位點Nhel，NheI也是基因 以正確方向插入的位點；插入的0. 3kb牛乳鐵蛋白基因可以在IPTG或乳糖的誘導下進行誘 導表達。克隆的牛乳鐵蛋白的DNA序列如SEQ ID NO 1所示，胺基酸序列如SEQID N0:3所 示。CATATGGGCGGCGGCTTCAAATGCTGGCGCTGGCAGTGGCGCTGGAAGAAACTGGGCGCGCCGAGCATTACCTG CGTGCGCCGCGCGTTTGGCGGCGGCTTCAAATGCTGGCGCTGGCAGTGGCGCTGGAAGAAACTGGGCGCGCCGAGCA TTACCTGCGTGCGCCGCGCGTTTGCGGGCCGCCGCCTCGAG克隆分泌型的啟動子信號肽片段可以使表達的目的蛋白分泌於胞外。設計的啟動子信號肽片段PCR擴增引物。Pl5-AGCCGGCATGGCCTGCAGCCGGAACTCTTGAATG,P2 5-CCGGTACCGCTAGCATGTGTTTCATTTTGA,在擴增的啟動子和信號肽功能片段中引入BglII和PstI，BglII位點在pET_28a 載體上是唯一的酶切點，可以在不改變pET-28a功能的情況下能把啟動子信號肽功能片段 克隆到pET-28a上；pET-28a載體上沒有PstI，通過PCR引物擴增引入PstI位點，方便與枯 草桿菌pE194質粒穿梭，構建能在大腸桿菌、枯草桿菌、球形芽孢桿菌中都能表達基因的穿 梭質粒。引入的NheI位點既是信號肽酶切割位點，也是表達基因以正確方向插入的位點。 用PCR方法擴增出啟動子信號肽功能片段。啟動子信號肽功能片段的PCR擴增條件，94°C 變性3分鐘後，94°C變性30s，55°C退火40s，72 °C延伸30s。30循環後72°C延伸3分鐘。用 純化kit純化PCR擴增產物。在所述的啟動子信號肽功能片段中克隆有有效的終止子區，以及6His以方便純 化，所含的三個Gly密碼子可以在表達純化後由溶(葡球)菌酶酶切除6His，使表達產物更 接近於原始序列。採用人工合成三段DNA片段，通過重疊PCR擴增獲得終止子片段，引物序列為
P3 5-CATGCTAGCGGTACCGGCGGCGGCGGCCATCATCACCACCACCACTGAGCGCGC,P4 5-ACCACCACTGAGCGCGCTTTTTATAAACTTATATGATAATTAGAGCAAATAAAA,P5 :5~CGCCATGCCGGCAAGCTTCAACTTTAGGAATGAGAAAAAATTTTTATTTGCTCTAA,用引物P2和P3重疊PCR擴增出9Ibp片段，再以此片段為模板，用Pl和P3引物 PCR擴增出終止子引物序列132bp。終止序列PCR擴增條件，94°C變性3分鐘後，94°C變性 30s，55°C退火40s，72°C延伸30s，30循環。完成二次PCR後用純化kit純化PCR擴增產物。得到啟動子信號肽片段和終止子片段後，再以擴增啟動子信號肽片段的Pl引物 和擴增終止子片段的P3引物進行重疊PCR，擴增出含有啟動子信號肽和終止子區的功能片 段。PCR擴增體系50uL，啟動子信號肽片段和終止子片段各2uL為模板，啟動子信號肽片 段Pl引物luL，終止子片段P3引物IuL, Taq酶緩衝液5uL，10mmol/L dNTP 1. 5uL，Taq酶 0. 3uL，水 37. 2uL。PCR 擴增條件94°C變性 3 分鐘後，94°C變性 30s，54°C退火 40s, 72°CM 伸45s，30循環，再72°C延伸2分鐘。再通過啟動子信號肽片段和終止子片段的重疊PCR，獲得完整的啟動子信號肽功 能片段，ιΗ向 P7 :5~AAAATGAAACACATGCTAGCGGTACCGGCGGCGGCGGCC (NheI、KpnI)反向P8 :5~GGCCGCCGCCGCCGGTACCGCTAGCATGTGTTTCATTTTG (NheI、KpnI)合成出啟動子信號肽功能片段後，以此片段為模板，以引物Pl與引物P8，引物P7 與引物P5，分別合成出二個片段，電泳回收後，混合回收的二片段，再以P1、P5 二引物進行 重疊PCR，獲得含有BglII、PStI、NheI、KpnI和BglII酶切位點的整個啟動子信號肽功能片 段。完成重疊PCR後用純化kit純化PCR擴增產物。純化的啟動子信號肽功能片段，在PCR儀上16°C與pMD 18-T連接過夜，CaCl2法轉 化感受態大腸桿菌DE3，待轉化液被固體培養基吸收後於37°C培養箱倒置培養過夜，Amp+ 平皿上長出的轉化子轉接保存，並送測序列。測定結果與設計預期相同。結果如下(SEQID NO 2)。
分泌型啟動子信號肽功能片段測序序列AGCCGGCATGGCCTGCAGCCGGAACTCTTGAATGTTTAGTTTTGAAAATTCCAAAAAAAAACCTACTTT CTTAATATTGATTCATATTATTTTAACACAATCAGTTAGAATTTCAAAAATCTTAAAGTCAATTTTTGAGTGTGTTT GTATATTTCATCAAAATCAATCAATATTATTTTACTTTCTTCATCGTTAAAAAATGTAATATTTATAAAAATATGCT ATTCTCATAAATGTAATAATAAATTAGGAGGTATTAAGGTTGAAGAAAACAAAAAACAATTATTATACGAGACCTTT AGCTATTGGACTGAGTACATTTGCCTTAGCATCTATTGTTTATGGAGGGATTCAAAATGAAACACATGCTAGCGGTA CCGGCGGCGGCGGCCATCATCACCACCACCACTGAGCGCGCTTTTTATAAACTTATATGATAATTAGAGCAAATAAA AATTTTTTCTCATTCCTAAAGTTGAAGCTTGCCGGCATGGCG,下劃線斜體字母依次分別為BglII、PStI、NheI、KpnI和BglII ；其他下劃線依次分 別為-35區AGAATTT、-10區TCAATTTTTG、核糖體結合位點AGGAGGT、起始密碼子TTG、3Gly、 6His、終止密碼子TGA。BglII單酶切含啟動子信號肽功能片段的pMD 18-T和含殺菌肽的pET_28a，37°C 酶切3h，1 %瓊脂糖電泳，並對BglII單酶切的pET-28a用鹼性磷酸酯酶脫磷防止自身環 化(脫磷緩衝溶液5uL，鹼性磷酸酯酶2. 5uL, BglII酶切回收的pET 28a片段5uL，補水到 50uL)65°C作用30min，補水到lOOuL，分別用苯酚/氯仿/異戊醇與氯仿/異戊醇處理各一 次，水相加2. 5倍-20°C無水乙醇，沉澱DNA，並高速離心回收pET_28a。然後和用純化kit 純化的啟動子信號肽功能片段適量混合，用T4連接酶連接。連接體系10uL，啟動子信號肽 功能片段5uL，含溶菌酶的pET-28a載體2uL，連接緩衝液luL，T4連接酶0. 2uL，水1. 8uL。 PCR儀16°C連接過夜。CaCl2法轉化感受態大腸桿菌DE3，待轉化液被固體培養基吸收後於 37 0C培養箱倒置培養過夜，Kan+平皿上長出的轉化子轉接保存。同時擴大培養，用小提質粒 kit提取質粒，進行酶切方法鑑定插入片段方向。用PstI和NdeI雙酶切，瓊脂糖膠電泳， 與標準分子量比對。不管以什麼方向插入，結果總有二種可能的酶切組成。一組是1. 9kb和 4. 2kb 二個片段，另一組是2. 4kb和3. 7kb 二組片段。電泳結果顯示，二條帶分別為1. 9kb 和4.2kb。所以，實際酶切連接後得到如圖1所示結果。所克隆的啟動子序列AGGAGGT與 mRNA和16S核糖體RNA的連接位點完全互補，啟動子的_35區和-10區與枯草桿菌的σ 37 啟動子完全同源[Recsei，PNAS，1987，Vol84，ppllll_1127]。因此構建的穿梭質粒適合於在 枯草桿菌中克隆基因表達，也適合於在球形芽孢桿菌中表達。當在大腸桿菌表達時以Kan+ 作為篩選標記，可以通過IPTG和乳糖誘導的高效表達克隆基因；在枯草芽孢桿菌和球形芽 孢桿菌中表達克隆基因表達時，以Em+作為篩選標記，並進行分泌型高效表達克隆基因。以人溶菌酶、人殺菌肽LL-37作為報告基因，克隆後進行不同表達系統的表達比 較。同時對個別胺基酸進行密碼子突變，進行二分子LL-37的PCR擴增串連表達，引入溶 (葡球)菌酶切割位點GGG，人源溶菌酶與人源LL-37融合蛋白基因的DNA序列如SEQ ID NO :4所示，人源溶菌酶與人源LL-37融合蛋白基因的胺基酸序列如SEQ ID N0:5所示。GCTAGCAAAGTGTTCGAACGTTGCGAACTGGCGCGTACCCTGAAACGTCTGGGTATGGATGGCTACCGT GGTATCAGCCTGGCCAACTGGATGTGCCTGGCGAAATGGGAATCTGGCTACAACACCCGCGCCACCAACTATAACGC CGGCGATCGCTCGACCGACTACGGTATTTTTCAGATTAACAGCCGCTATTGGTGCAACGACGGCAAGACCCCGGGTG CGGTGAACGCGTGTCATCTGTCGTGCTCGGCGCTGCTGCAGGATAACATTGCGGATGCGGTTGCGTGCGCGAAACGT GTGGTTCGCGATCCGCAGGGTATTCGTGCGTGGGTGGCGTGGCGTAACCGCTGCCAGAACCGTGACGTGCGTCAGTA CGTGCAGGGTTGCGGTGTGGGCGGCGGCCTGCTGAACTTCTTTCGCAAGAGCAAGCAGAAGCCGGGCAAGCAGTTCAAACGCCCGGTGCAGCGCCCGAAGAACTTCTTACGCAACCTGCCGCCGCGCACCCAGAGCCAGGGCGGTGGCCTGCTG AACTTCTTTCGCAAGAGCAAGCAGAAGCCGGGCAAGCAGTTCAAACGCCCGGTGCAGCGCCCGAAGAACTTCTTACG CAACCTGCCGCCGCGCACCCAGAGCCAGGGCGGCGGTACC用PstI酶切含啟動子信號肽功能片段的pET_28a和pE194，37°C酶切3h，瓊脂 糖電泳，分別回收含啟動子信號肽功能片段的pET-28a和pE194，用純化kit純化，用T4連 接酶連接。連接體系10uL，含啟動子信號肽功能片段的pET-28a 4uL，pE194質粒4uL，連接 緩衝液luL，連接酶0. 3uL，水0. 7uL。PCR儀16°C連接過夜。CaCl2法轉化感受態大腸桿菌 DE3，待轉化液被固體培養基吸收後於37°C培養箱倒置培養過夜，Kan+平皿上長出的轉化 子轉接保存。由此構建的大腸桿菌-枯草桿菌穿梭質粒可以作為共用表達載體，在該穿梭質粒 上克隆有啟動子、信號肽和終止子序列。該啟動子適合於基因在原核生物中的表達。實施 例2穿梭質粒在球形芽孢桿菌中的轉化在球形芽孢桿菌中質粒的轉化基本採用原生質體方法[Chang S S, Cohen S N. MolGen Genet，1979，168 :111_115]。普通培養基採用VY培養基(2. 5%小牛肉膏粉， 酵母粉)，原生質體轉化培養基有DM3、PAB、SMM, SMMP培養基。把枯草芽孢桿菌活化，其單 菌落接入3mL VY液體培養基，37°C振蕩培養過夜。轉接1 %到新鮮培養液，37°C振蕩培養 2. 5h，即菌生長至對數生長中後期。丁二酸鈉濃度改為0. 3mol/L，用甘油代替葡萄糖，轉化 培養基和試劑中均加牛血清白蛋白，在PEG 6000中同時加入5xl0_5mOl/LCaCl2。原生質制 備中採用溶菌酶作用後在不同時間取樣，然後加稀釋培養液SMMP稀釋離心除去溶菌酶。用 實施例1的保存質粒對TE透析過夜後用於轉化。接一環球形芽孢桿菌於5mL的VY培養液，37°C振蕩培養過夜。第二天轉接2%到 新鮮30mL培養液，37°C振蕩培養2. 5h，即菌生長至對數生長中後期。然後離心，用2XSMM ImL懸浮，加等體積新鮮配的溶菌酶，溶菌酶的終濃度為200u/mL，37°C振蕩培養20min，這 時菌體基本呈現球狀。用IOmL的SMMP溶液稀釋，3000rpm/min離心。離心的原生質體加 0. 5mL SMM懸浮，然後加實施例1保存的質粒5ug混勻，立即加1. 5mL PEG6000，滴管吹吸兩 次，37°C作用2min，立即加IOmL的SMMP稀釋。3000rpm/min離心，用ImL的SMMP懸浮原生 質體，然後30°C慢搖90min，分別吸取0. 15mL塗布於加有終濃度Eml0ug/mL培養基的平皿 上，室溫下實驗臺放置lh。後再倒置於37°C培養箱培養至轉化子長出。長出的轉化子點種 保存。並進行發酵培養，測定並比較其表達水平和殺菌效率。殺菌效率測定按實施例4進 行。實施例3穿梭質粒在枯草芽孢桿菌中的轉化枯草桿菌的轉化採用感受態法。在新枯草桿菌生孢子培養基(0. 蛋白腖， 0. 07% 酵母粉，0. 1% KH2PO4,0. 葡萄糖，0.02% MgSO4,0.02% (NH4)2SO4)的平板上挑 單菌落接種在 SPI (1. 4 % K2HPO4,0.6% KH2PO4,0. 028 % MgSO4,0.2% (NH4) SO4,0.1% B 母粉，0.5% 葡萄糖，0.6% Na3Citrate,0.02% casamino acid)培養液中，30 °C 11 Orpm/ min振蕩培養過夜，以1/25體積的種量接到新鮮的SPI，37°C 250rpm/min振蕩培養4_5h， OD600 ^ 2.0，然後以培養液體積的1/10接種量轉接到SPII (即在SPI中加0. 0005mol/L CaCl2,0. 0025mol/L MgCl2)培養液中，37°C 110rpm/min振蕩培養 1. 5h，以 5000rpm/min離心 收集菌體，菌體留下1/10體積的上清液進行懸浮，以此菌體進行感受態細胞的質粒轉化。
取250uL上述感受態細胞加終濃度為lmmol/L的EDTA，然後在37 °C條件下 110rpm/min振蕩培養lOmin，加實施例1中構建的純化質粒DNA 2ug，繼續在37°C搖床上 110rpm/min振蕩培養，約Ih左右，再以250rpm/min繼續振蕩培養30min，然後以每皿IOOuL 體積塗布在含10ug/mL培養基的Em+固體培養基平皿上，室溫放置Ih左右，待培養液被吸 收後倒置放於37°C培養箱培養，直至單菌落長出。挑取單菌落點種保存。並進行發酵培養， 檢測其生物學活性。實施例4溶菌酶測定溶壁微球菌溶菌試驗本發明對於溶菌酶的活性測定採用二種方法。方法一將活化的溶壁微球菌單菌 落接入LB培養液，37°C搖床培養過夜，將固體LB培養基加熱熔化，緩慢冷卻至50°C左右， 吸0. 2mL培養過夜的溶壁微球菌到此熔化的LB培養基中，輕搖混合均勻，不允許產生氣泡， 迅速倒皿，大約20m/皿，放於水平檯面上(培養基水平有利於相互比較殺菌斑大小，以減少 誤差)，然後在凝固了的培養基上用滅菌的5mm大小不鏽鋼管打孔，挑出膠塊，滴加上述實 施例中不同融合蛋白的溶葡球菌酶酶切液或M柱純化的酶切過夜的酶切液，並在培養。在 樣品孔附近滴加已知濃度的標準溶菌酶溶液。第二天觀察殺菌斑，與已知濃度溶菌酶比對 殺菌斑的大小，預估表達的酶活相對大小。方法二 基本上按Sigma公司所附測定方法和 [工具酶的活力測定，P82，上海科學技術出版社，1982]稍作修改的方法進行。配製pH6. 2 的 0. lmol/L 磷酸緩衝液，稱取 NaH2P042H20 1. 17 克，Na2HPO412H20 0. 786 克，EDTA 0. 0392 克，溶於煮沸滅菌的去離水中並稀釋至IOOmL,較正pH在6. 15 6. 25之間。溶菌酶對特 定溶壁微球菌胞壁有溶解作用，在一定濃度的溶壁微球菌、溫度和作用時間條件下，溶壁微 球菌濁度的下降與酶的濃度和活性呈正相關。利用這一原理進行濁度法測定酶活性。稱取 溶壁微球菌幹菌粉[中國藥品生物製品檢定所產品]於容量瓶，加PH6. 2的0. lmol/L磷酸 緩衝液，輕搖溶解，置25°C水浴預保溫。準確量取25°C水浴預保溫底物懸液3mL，置Icm光 徑比色皿，測定OD45tlnm吸光度0. 70左右，作空白調零，讀數為&。同時精確稱取溶菌酶標準 品20mg，用pH6. 2的0. lmol/L磷酸緩衝液溶解，定容至250mL，相當於80ug/mL酶標準液。 精確吸取25°C預保溫酶標準液0. ImL(即8. Oug溶菌酶)，加到已校零比色皿，迅速混勻，秒 表計時，至180s時記下此時吸收度為A ；精確吸取預保溫磷酸緩衝液(pH6. 2)0. ImL,同上操 作做空白樣試驗，測得零秒時讀數為A0』，180s時讀數為A』。每樣品做2次重複以減少誤 差。用已預熱的分光光度計校正450nm處空白比色皿讀數為零。通過加樣量的加或減調節 濁度法測定酶活性即讀數在一個合適範圍內。濁毒法測定溶菌酶的活力單位定義為25°C， pH6. 2，波長450nm下，酶作用引起吸光度OD45tlnm每下降0. 001為一個酶活力單位。
(A0-A)-(A0' -A')
權利要求
一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒，其特徵在於由一個PstI酶切的大腸桿菌pET 28a質粒和一個PstI酶切的枯草桿菌pE194質粒構成，所述的酶切的大腸桿菌pET 28a質粒上插入有溶菌酶 抗菌肽功能片段和抗菌肽基因，所述的溶菌酶 抗菌肽功能片段由溶菌酶和抗菌肽基因融合而成。
2.如權利要求1所述的一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒，其特徵在於所述的 抗菌肽基因的兩端設置有NdeI和XhoI酶切位點。
3.如權利要求1所述的一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒，其特徵在於所述的 溶菌酶_抗菌肽功能片段的兩端設置有KpnI和NheI酶切位點。
4.如權利要求1所述的一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒，其特徵在於所述的 抗菌肽基因為一種、或者任意兩種、或者兩種以上的殺菌功能肽胺基酸片段的組合，或者任 意一個功能片段的重複串聯融合。
5.如權利要求4所述的一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒，其特徵在於所述的 抗菌肽基因為牛乳鐵蛋白肽基因、或者人源殺菌肽基因、或者人源溶菌酶基因、或者天蠶素 基因、或者蛙皮素基因、或者蜂毒素基因、或者人源抗菌肽LL-37基因。
6.如權利要求1所述的一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒，其特徵在於所述的 溶菌酶_抗菌肽功能片段中的溶葡球菌酶的酶切識別位點胺基酸序列為GGG。
7.權利要求1所述的一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒的構建方法，其特徵在 於包括一個在NdeI和XhoI位點酶切大腸桿菌pET-28a質粒的步驟，在所述的酶切大腸杆 菌pET-28a質粒NdeI和XhoI酶切位點之間插入至少一個抗菌肽功能片段，還包括一個構 建啟動子信號肽片段的步驟，在所述的啟動子信號肽片段上依次設置有BglII、PStI、NheI、 KpnI和BglII酶切位點，所述的啟動子信號肽片段的序列如SEQID NO 2所示，然後分別用 BglII酶切啟動子信號肽片段和大腸桿菌pET-28a質粒，採用連接酶連接，形成一個插入有 啟動子信號肽片段的大腸桿菌pET-28a質粒，還包括一個構建溶菌酶_抗菌肽功能片段的 步驟，在溶菌酶_抗菌肽功能片段的兩端分別設置有NheI和KpnI酶切位點，然後在插入有 啟動子信號肽片段的大腸桿菌pET-28a質粒的NheI和KpnI位點酶切，插入溶菌酶-抗菌肽 功能片段，採用連接酶連接，形成一個插入有溶菌酶_抗菌肽功能片段的大腸桿菌pET-28a 質粒，還包括一個在插入有溶菌酶_抗菌肽功能片段的大腸桿菌pET-28a質粒的PstI位點 酶切的步驟，在PstI位點酶切的枯草桿菌pE194質粒，然後插入有溶菌酶-抗菌肽功能片 段的大腸桿菌pET-28a質粒，構成本發明的雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒。
8.如權利要求7所述的一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒的構建方法，其特徵在 於在一個構建啟動子信號肽片段的步驟中，PCR擴增啟動子信號肽功能片段的引物序列 為Pl :5-AAGATCTCTGCAGCCGGAACTCTTGAATG(Bgl11 和 PstI)，P2 5-AAGATCTGCTTCAACTTTAGGAA(BglII)，在所述的啟動子信號肽功能片段中克隆有效的終止子片段，採用人工合成三段DNA片段，通過重疊PCR擴增獲得終止子片段，引物序列為P3 5-CATGCTAGCGGTACCGGCGGCGGCGGCCATCATCACCACCACCACTGAGCGCGC，P4 :5-ACCACCACTGAGCGCGCTTTTTATAAACTTATATGATAATTAGAGCAAATAAAA,P5 :5~CGCCATGCCGGCAAGCTTCAACTTTAGGAATGAGAAAAAATTTTTATTTGCTCTAA,再通過啟動子信號肽片段和終止子片段的重疊PCR，獲得完整的啟動子信號肽功能片段，正向引物 P7 5-AAAATGAAACACATGCTAGCGGTACCGGCGGCGGCGGCC (Nhe I、KpnI) 反向引物 P8 :5~GGCCGCCGCCGCCGGTACCGCTAGCATGTGTTTCATTTTG (NheI、KpnI) 合成出啟動子信號肽功能片段後，以此片段為模板，以引物Pl與引物P8，引物P7與引 物P5，分別合成出二個片段，電泳回收後，混合回收的二片段，再以PI、P5 二引物進行重疊 PCR,獲得含有BglII、PstI, NheI, KpnI和Bgl11酶切位點的啟動子信號肽功能片段。
9.如權利要求7所述的一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒的構建方法，其特徵在 於所述的啟動子信號肽功能片段上克隆有啟動子序列、信號肽序列、終止子序列、六個組 氨酸，所述的啟動子包括-35區、-10區和核糖體結合位點AGGAGGT，所述的信號肽序列為 TTGAAGAAAACAAAAAACAATTATTATACGAGACCTTTAGCTATTGGACTGAGTACATTTGCCTTAGCATCTATTGT TTATGGAGGGATTCAAAATGAAACACATGCTAGC，所述的終止子序列為 TGAGCGCGCTTTTTATAAACTTAT ATGATAATTAGAGCAAATAAAAATTTTTTCTCATTCCTAAAGTTGCCGGCATGGCG,所述的啟動子信號肽片 段上還克隆有BglII、PstI、NheI、KpnI和Bgl II酶切位點。
10.如權利要求7所述的一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒的構建方法，其特徵 在於在所述的啟動子信號肽功能片段上克隆有溶葡球菌酶的酶切識別位點GGG和6His。
11.如權利要求7所述的一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒的構建方法，其特徵 在於在一個構建溶菌酶-抗菌肽功能片段的步驟中，所述的抗菌肽基因為一種、或者任意 兩種或者兩種以上的殺菌功能肽胺基酸片段的組合，或者任意一個功能片段的重複串聯融I=I ο
12.如權利要求11所述的一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒的構建方法，其特徵 在於所述的抗菌肽基因為牛乳鐵蛋白肽基因、或人源殺菌肽基因、或者人源溶菌酶基因、 或天蠶素基因、或蛙皮素基因、或蜂毒素基因、或其他來源抗菌肽基因。
13.如權利要求11所述的一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒的構建方法，其特徵 在於在融合蛋白的抗菌肽之間插入有溶葡球菌酶切割位點。
14.如權利要求7所述的一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒的構建方法，其特徵 在於在大腸桿菌pET-28a質粒的NheI和KpnI位點之間插入有溶葡球菌酶切割位點。
15.如權利要求12所述的一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒的構建方法，其特徵 在於在牛乳鐵蛋白基因C端有溶葡球菌酶的切割識別位點GGG，所述的牛乳鐵蛋白基因的 鹼基序列如SEQ ID NO :1所示，所述的牛乳鐵蛋白的胺基酸序如SEQ ID NO :3所示。
16.如權利要求11所述的一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒的構建方法，其特徵 在於所述的溶菌酶-抗菌肽功能片段中的抗菌肽基因中含有二分子串連的人源殺菌肽基 因LL-37，所述的人源殺菌肽基因LL-37，其N端胺基酸改變為Gly，第4、30位胺基酸變為 Asn, H 11、16、36位胺基酸改變為Gin, H 13、20、24、33胺基酸改變為Pro，C端增加Gln和 Gly 二個胺基酸，二分子LL-37之間引入溶葡球菌酶切割位點GGG，所述的人源溶菌酶與二 分子人源LL-37融合蛋白基因的鹼基序列為SEQ IDNO :4所示，所述的人源溶菌酶與二分子 人源LL-37融合蛋白基因的胺基酸序如SEQID NO :5所示。
17.權利要求1所述的雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒在製備治療抗菌藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬於生物基因工程領域，提供了一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒，由一個酶切的大腸桿菌pET-28a質粒和一個酶切的枯草桿菌pE194質粒構成，所述的酶切的大腸桿菌pET-28a質粒上插入有溶菌酶-抗菌肽功能片段和抗菌肽基因，本發明還提供了一種雙啟動子可誘導可分泌型穿梭質粒的構建方法，該穿梭質粒轉入原核生物以融合方式表達毒蛋白、殺菌肽等蛋白對宿主不表現毒殺作用，本發明構建的穿梭質粒可以經IPTG或者乳糖誘導，以提高基因表達水平；也適合於外分泌表達，外分泌表達的目的蛋白處理方便又沒有內毒素汙染，由於具有雙功能啟動子，不同基因都可在合適的正確方向插入基因進行表達。
文檔編號A61P31/10GK101948865SQ201010255590
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月17日 優先權日2010年8月17日
發明者樂科易, 張培德 申請人:復旦大學