通過糖化血紅蛋白質譜對糖尿病和前驅糖尿病的快速篩選和評價的製作方法

2023-12-09 21:12:02 1

本發明涉及使用直接質譜分析測量血液樣品中非糖化和糖化血紅蛋白水平的方法。可使用糖化血紅蛋白分子的比例來診斷前驅糖尿病(pre-diabetes)或糖尿病。

背景

糖尿病，並且尤其是2型糖尿病，現在是發達世界和發展中世界的公共健康問題。代價高的糖尿病併發症包括心血管疾病、視網膜病、神經病變、和腎病。因此，在檢測和評價患者中以及針對國家人口篩選早發糖尿病中都存在明顯未滿足的醫學需求。例如，在2011年，在美國估計有2580萬兒童和成年人(佔人口的8.3％)患有糖尿病。雖然估計有1880萬人已經診斷患有2型糖尿病，大約700萬人並不知道它們患有該疾病。基於2005-2008年的血糖測量，疾病控制和預防中心(cdc)報導美國成年人口中35％患有前驅糖尿病，即估計7900萬美國成年人處於發展2型糖尿病的風險中。類似地，在英國，在2014年，前驅糖尿病的數量聲稱已從2003年的11.6％上升至2013年的35.3％。即估計1730萬英國成年人估計患有前驅糖尿病。僅在美國，與治療糖尿病相關的2007年總年度成本為1740億美元。因此，預防並控制糖尿病及其併發症是全球公共健康挑戰並且許多國家醫療系統的頭等大事。

常規通過測量血液和尿中的葡萄糖水平來進行糖尿病檢測。對於前驅糖尿病，進行葡萄糖耐量測試，其中，在口腔葡萄糖刺激之後，測量一段時間上的血糖水平以監測在水平回到正常之前的最大值和幅度。另外，可平行測量胰島素水平，然而，葡萄糖耐量測試需要患者入院(admittanceasadaypatient)。

糖化血紅蛋白(hb)在非酶促糖化途徑中形成，從中血紅蛋白(hb)與血漿葡萄糖自由反應，即便其包含在血紅細胞內。由於血紅細胞在體內循環約100-120天，在其組分被脾臟和肝臟回收之前，測量糖化hb因此反映了對葡萄糖的累積暴露：正常水平的葡萄糖產生正常量的糖化血紅蛋白；隨著血漿葡萄糖的平均量增加，糖化血紅蛋白的分數也增加。因此，其是在治療前的數個月中平均血糖水平的標記物。與一次性測試不同，這提供了增加的代謝問題如前驅糖尿病的確鑿證據。對糖化hb的實際測量提供了比食物和血糖日誌可靠得多的對患者如何控制其糖尿病的測量。

因此，最近青睞的糖化hb測試是相對於hba水平測量hba1c水平。如此命名hba1c是因為hb通常通過從反相高壓液相色譜中洗脫來測量並分析。總hb的色譜分離解析(resolve)了不同類型的血紅蛋白，主要是a和a2，與胎兒hb和這兩種類型的疾病變體。少量解析的洗脫峰是稱為hba1c的糖化hb。hba1c測量是優選的針對糖尿病和代謝疾病發生的測試，因為糖化hb是累積的且非患者併發症依賴性的測試。美國糖尿病協會推薦了針對hba1c的護理點測試，因為其是快速的並且使臨床醫師立即確定患者狀態，改善了患者併發症。最近批准血紅蛋白a1c用作診斷工具，並且大於或等於6.5％的hba1c是診斷的截留點。前驅糖尿病狀態被引用為hba1c>5.7-6.4％。最近在患有2型糖尿病的患者中驗證了hba1c與平均葡萄糖濃度的關係。

然而，一個診斷問題是hba1c並不適於具有變體hb或血紅蛋白病如鐮狀細胞表型的患者。這可能是因為糖化hb的洗脫概況可被變體hb的洗脫概況遮蔽或者幹擾hba1c免疫試驗的差異特異性。

第二個問題是，如who2011報告who/nmh/chp/cpm/11.1，「糖化血紅蛋白(hba1c)在糖尿病診斷中的用途(useofglycatedhemoglobin(hba1c)inthediagnosisofdiabetesmellitus)」所報告，目前的hba1c試驗「在大部分中低收入國家環境中是難以負擔的」。

本發明公開了一種用於通過分析血液樣品針對糖尿病和前驅糖尿病代謝症候群篩選人口的快速穩健且可負擔的方法。

本發明公開了對血液樣品的直接質譜分析，其可經裂解並任選在水中稀釋100-1000倍。可通過直接質譜分析，如基質輔助的雷射解吸飛行時間質譜來解析樣品中存在的hb物質。可例如通過曲線下標準化面積或峰高度來測量從糖化物質-hbα-球蛋白glc解析的hbα-球蛋白鏈和/或從hbβ-球蛋白glc解析的hbβ-球蛋白。hb的變體和血紅蛋白病經解析並且不影響對糖化hb百分數的測量，因為hbα-鏈和/或hbβ-鏈和相應糖化(glc)直系系同源物可用作糖尿病糖基化的差異標記物。

本發明描述了通過早期檢測和監測，輔助控制並降低對國家的社會經濟負擔的方法。

該方法公開了對全血樣品，如針刺樣品和血點卡的快速篩選，其經過直接質譜分析，如maldi–tof質譜。可在裂解，例如在蒸餾去離子水中，或通過冷凍，並且任選地在例如蒸餾去離子h2o或含0.1％三氟乙酸(tfa)的蒸餾去離子h2o中進行1/10至1/8000(優選1/2000)的大量稀釋後進行分析。所得的譜檢驗為15,000m/z至16,200m/z的質/荷比範圍的單電荷離子；和/或7,550至8,100m/z或7,550至8,200m/z的雙電荷離子。

●優選在7,564m/z處測量未糖化α-球蛋白

●優選在7,645m/z處測量糖化α-球蛋白

●優選在7,934m/z處測量未糖化β-球蛋白

●優選在8,017m/z處測量糖化β-球蛋白

使用基質，優選芥子酸來生成譜，並且測量α-球蛋白和糖化α-球蛋白、和/或β-球蛋白和糖化β-球蛋白的特徵性解析質量峰並且比率確定了糖化球蛋白的相對百分數。確定的相對百分數指示前驅糖尿病、糖尿病和糖尿病患者對之前2-3個月的累積平均血糖的控制。

因此，本發明提供了監測前驅糖尿病或糖尿病的方法，包括使得獲自對象的血液樣品經過直接質譜分析並確定糖化血紅蛋白(hb)，例如，樣品中存在的糖化α-球蛋白和/或糖化β-球蛋白的比例。

「直接質譜分析」指的是所述方法中採用由質譜分析產生的數據，而非樣品中存在的組分的推斷質量。

前驅糖尿病，也稱為邊界糖尿病，通常是糖尿病的先兆。其在血糖水平高於正常但不足夠高至患者被認為患有糖尿病時發生。其通常描述為正常血糖和糖尿病水平之間的「灰色地帶」。如果患者在一段時間禁食之後比正常血糖水平更高，前驅糖尿病也可稱為受損禁食血糖(ift)，或者如果患者在進食後比正常血糖水平更高，則稱為受損葡萄糖耐受(igt)。

血液樣品可以是未處理的樣品。或者，血液樣品可經稀釋或處理(濃縮、過濾等)。

血液樣品可以是使用常規靜脈切開術方法收集的全血樣品。例如，可通過微靜脈穿刺(venupuncture)或以針刺樣品獲得樣品，如指穿刺或腳跟針刺。血液樣品可以是在濾紙或其他合適的血液點捕獲材料上捕獲的乾燥血液點。

優選處理血液樣品以裂解紅細胞。這可通過在裂解劑，如去離子蒸餾水中以1/1(即，1份血液對1份裂解劑或蒸餾去離子水)的濃度稀釋血液樣品來進行。或者，可冷凍樣品以裂解細胞。如果血液樣品是乾燥血液點，其上樣品經乾燥的血液點捕獲材料可置於裂解劑，例如，蒸餾去離子水中以重建該樣品。或者，血液點可在裂解前在合適緩衝劑中重建。

優選地，血液樣品優選在裂解後稀釋。血液樣品能以1/10(即，一份樣品在10份稀釋劑中)、1/500、1/1000、1/200、1/2500、1/8000或更大比例稀釋。最優選地，所述樣品以1/2000，即一份血液樣品在2000份稀釋劑中，稀釋。優選地，稀釋劑是含0.1％三氟乙酸的蒸餾去離子水，更優選蒸餾去離子水。

優選地，血液樣品在裂解和稀釋之間未經處理。換而言之，血液樣品僅經裂解和稀釋。這類處理包括濃縮感興趣蛋白質，例如，hb、α-球蛋白和/或β-球蛋白；通過例如hplc或用化學劑處理破壞或打斷分子內鍵來分離hb、α-球蛋白和/或β-球蛋白。具體而言，所述樣品優選不用還原劑處理。更優選地，所述樣品不用二硫蘇糖醇(dtt)處理。

可計算糖化α-球蛋白和/或β-球蛋白的比例，即糖化的α-球蛋白和/或β-球蛋白的百分數。百分數計算如下

≥4％糖化α-球蛋白和≥6％β-球蛋白的水平指示糖尿病。3-4％糖化α-球蛋白和4-6％糖化β-球蛋白的水平指示前驅糖尿病。優選地，在具有血紅蛋白病或血紅蛋白病性狀的患者中計算糖化α-球蛋白的比例。

生成質譜，如maldi-tofms的方法通常不是定量技術。例如，這些質譜中的y軸是譜中質量峰的「相對強度」的指標，但並不是一個樣品與另一樣品之間的質量峰之間。為了克服該不足，需要標準化以使樣品譜之間的y軸值相當。因此，從直接質譜分析獲得的譜優選經標準化。該譜經過數據處理，其產生標準化的統計學確定的質譜的相對比例指數。這將定性質譜轉化成定量值。標準化是產生數據結構以減少數據重複和不一致性的過程。可採用若干種標準化技術。典型的標準化方法包括給定點處的總面積百分數、方差算法和比率差異。百分數差計算如下

百分數差＝(y1-y參比/y參比x100％)

其中y參比是譜中最小y值，而y1是各點的y值。

方差計算如下

方差＝(y1–y參比)2

比率差異計算如下

比率差異＝(比率1-比率2)

因此，來自質譜的數據經控制以提供對於質譜上所見定性變化的定量度量。

優選地，該譜模型通過數據處理方法產生，所述數據處理方法產生給定範圍內質譜的相對比例的標準化的統計學確定指數。這使所有譜相當，從而能夠對任何給定質量值的中值和百分位數變化建模。優選地，範圍是約7,000-16,500m/z，更優選7,500-16,200m/z，最優選7,500-8,200m/z。可測量單電荷和/或雙電荷球蛋白分子。對於單電荷離子，檢驗了15000m/z至16200m/z的質/荷比範圍處的譜。對於雙電荷離子，檢驗了6000至8100m/z，更優選7550至8100m/z或7550至8200m/z的質/荷比範圍處的譜。

●優選在7,564m/z±5m/z處測量α-球蛋白

●優選在7,645m/z±5m/z處測量糖化α-球蛋白

●優選在7,934m/z±5m/z處測量β-球蛋白

●優選在8,017m/z±5m/z處測量糖化β-球蛋白

給定範圍內質譜的相對比例的標準化的統計學確定指數可採用質譜曲線下總面積來計算。然後，這可用於計算相對強度。

質譜的曲線下面積如下計算：將質譜分為給定數量的m/z的多個箱(bin)。本文中所述的「箱」具有其常規統計學含義，例如，是一系列數值範圍之一，其中數據按統計學分析分選。例如，所述箱的大小可以是100m/z、50m/z、25m/z、10m/z或5m/z。所用箱的大小越小，該方法越精確。優選地，箱大小是5m/z。

相對強度(y軸值)可通過「方差」法計算，因而各箱中給定的y值相當。在該方法中，從各箱y值減去譜最小y值(y參比)，並且將該差值平方化。用於計算方差的式子＝(y1-y參比)2，並且計算出的方差隨後稱為「相對強度」。

可使用市售統計學測試如statsdirecttm和origin8tm來捕獲樣品中各質量箱處的相對強度。可使用(i)α-球蛋白和糖化α-球蛋白和/或(ii)β-球蛋白和糖化β-球蛋白的質量箱的相對強度來計算存在的糖化球蛋白的比例。

一旦譜已經過產生標準化的統計學確定的質譜的相對比例指數的數據處理方法，可通過測量對應於糖化和未糖化球蛋白的峰的相對高度來確定糖化球蛋白的比例。對於單電荷離子，檢驗了15000m/z至16200m/z的質/荷比範圍處的譜。對於雙電荷離子，檢驗了6000至8100m/z，更優選7550至8200m/z的質/荷比範圍處的譜。

●優選在7564m/z±10m/z處測量α-球蛋白

●優選在7645m/z±10m/z處測量糖化α-球蛋白

●優選在7934m/z±10m/z處測量β-球蛋白

●優選在8038m/z±10m/z處測量糖化β-球蛋白

該質譜分析能夠採用合適的計算機軟體程序而被容易地計算。

優選地，所進行的質譜分析是基質輔助雷射解吸/電離飛行時間質譜法(maldi-tofms)。

還公開了檢測前驅糖尿病或糖尿病的方法，包括

a)從對象獲得血液樣品；

b)對該樣品進行直接質譜分析；

c)計算存在的糖化球蛋白的比例；其中糖化α-球蛋白百分數≥4％並且糖化β-球蛋白百分數≥6％指示糖尿病，並且α-球蛋的3-4％的糖化球蛋白百分數和β-球蛋白的3-6％的糖化球蛋白百分數指示前驅糖尿病。優選地，糖化球蛋白的百分數是糖化α-球蛋的百分數，尤其在患有血紅蛋白病的對象中。

在本說明書中，術語「包含(包括)」具有其常規字典含義，以表示非排他性涵蓋。即，詞語「包含(包括)」(或其任何衍生形式)用於涵蓋一個或多個特徵，不排除還涵蓋其它特徵的可能性。詞語「優選的」(或其任何衍生形式)指示一個或多個特徵是優選但非必需的。

本說明書(包括任何所附權利要求、摘要和附圖)中公開的所有或任意特徵和/或如此公開的任意方法或工藝的所有或任意步驟可以任何方式組合，除了其中至少一些此類特徵和/或步驟相互排斥的組合。

除非另有說明，本說明書(包括任何所附權利要求、摘要和附圖)中所公開的各特徵可由具有相同、等同或類似目的替代性特徵替換。因此，除非另有說明，所公開的各特徵僅僅是一系列等同或相似特徵的一個示例。

本發明不限於上述實施方式的細節。本發明延伸至本說明書(包括任何所附的權利要求、摘要和附圖)所公開特徵的任一新型種類或任何新型組合，或者延伸至如此公開的任何方法或工藝步驟的任一新型種類或任何新型組合。

現參考下述附圖，以下述實施例描述本申請：

圖1顯示了12歲男性中正常血液的譜

圖2顯示了52歲肥胖男性中正常血液的譜

圖3顯示了患有鐮狀細胞病hbsc的患者中血液的譜

圖4顯示了12歲男孩和52歲男性血液譜的重疊。

圖5-在9名成年人和7名患有各種血紅蛋白病的患者中糖化α-球蛋白和β-球蛋白以及其他球蛋白分子的計算相對量的表

實施例1

方法

樣品處理

在用ddh2o(1:1v/v)初始裂解樣品之後，全血或乾燥血點的最優稀釋為在ddh2o或含0.1％tfa的ddh2o中1/1000至1/2000。該稀釋步驟從血液的其他組分中有效純化hb用於質譜分析，因為hb是最豐富的蛋白質。另外，在ddh2o(0.1％tfa/ddh2o)中的稀釋解離了組成性球蛋白用於通過maldi-tof質譜的解析分析。

高於1/8000的稀釋產生逐漸變弱的質譜信號。

malditof質譜分析

最優基質是芥子酸(sa)、阿魏酸(fa)和α4-氰基羥基肉桂酸(chca)。芥子酸作為優選的基質混合或者作為1/1000至1/8000稀釋的樣品(最優1/2000)的混合液滴的預塗層。

maldi鋼板(384孔)如下製備：吸移0.5μl基質溶液(芥子酸-20mg/ml，溶解於50/50v/v乙腈(acn)/ddh2o和0.1％三氟乙酸(tfa))，並使其乾燥。0.5μl樣品與sa混合併點樣到幹基質上。允許其室溫乾燥1小時，然後進行malditofms分析。

採用shimadzuaximaplusmaldi質譜儀進行質譜分析：氮脈衝雷射器(λ最大＝337nm)以75-80％任意單位功率噴射。所示離子以20kv電場以1.2m線性管向下加速，並用微通道板探測器以500mhz的取樣速率進行檢測。光譜通過加和20-30個雷射射擊來產生。採用延遲引出的正線性模型，以獲取譜。

該設備經內部校準，其中用10皮摩爾/ul細胞色素c(1:2，v/v)摻入1/1000稀釋的血液樣品。產生的兩點校準在[m+h]+＝12361m/z和[m+2h]2+＝6181m/z處。

收集並分析6000至17000m/z的質譜區域，並且尤其檢驗7500至8200m/z的區域中雙電荷球蛋白。

這些都相對於質心質量分配和相對峰強度而表徵為檢驗的譜範圍中相對標準化峰高度或標準化峰面積。

結果

圖1，來自12歲男孩的血液球蛋白的譜。

來自正常12歲男孩的血液樣品證明具有對應於α和β球蛋白以及相應基質(芥子酸-sa)加合物(參見圖1和表1)的明顯峰的譜。幾乎沒有檢測到其他球蛋白加合物和其他球蛋白(δ、gγ、aγ和ε)(參見表1)。此外，糖化α和β-球蛋白直系同源物在<1％的起源(parent)球蛋白下幾乎是不可見的(圖1所示)。

圖2，來自52歲男性的血液球蛋白的譜。

正常但是肥胖的成年人血液樣品顯示α-球蛋白和β-球蛋白及其相關的sa加合物的峰。另外，注意到升高的δ-球蛋白與其他α和β-球蛋白加合物，而幾乎沒有檢測到其他球蛋白(gγ、aγ和ε)(參見圖2和表1)。血液樣品顯示佔起源球蛋白3％和5％的糖化α-球蛋白和β-球蛋白峰。

圖3，來自患有hbsc-鐮狀細胞疾病的患者的血液球蛋白譜。

血液樣品來自患有鐮狀細胞疾病(hbsc)的患者。圖3顯示了正常和糖化α-球蛋白峰並且從7934m/z處的β-球蛋白和約7933m/z處的cβ清楚地解析在7920m/z處sβ的峰。對7965和7996m/z處的δ和gγ球蛋白的基線升高是明顯的，如8023m/z處的新峰。血液樣品顯示正常且糖化α-球蛋白峰並且強度比較％為1.8％，而糖化β-球蛋白為起源β-球蛋白的6.3％。

圖4，52歲男性和12歲男孩的血液球蛋白的比較。

在來自12歲男孩的血液譜上疊加52歲成年男性的血液譜，顯示在成年人樣品中循環的糖化α和β球蛋白的升高(圖4)。

圖5，9個成年人譜峰強度與來自7個判定的血紅蛋白病患者的譜峰強度的列表比較。

在所有樣品中檢測到糖化α-鏈並在表型正常的樣品和患有血紅蛋白病，包括鐮狀細胞疾病的那些中清楚解析。糖化β-球蛋白在所有正常樣品中明顯可區分，但被胎兒球蛋白表達削弱，其通常在所有血紅蛋白病中升高(圖5)。表示為α-球蛋白強度百分數，對於表型正常的成年人，糖化直系同源物佔0.5-3％(平均1.78％，sd0.79％)；並且對於患有血紅蛋白病的那些，包括攜帶者，糖化直系同源物佔1-2.7％(平均2.1，sd0.57％)。表示為β-球蛋白強度百分數，對於表型正常的成年人，糖化直系同源物佔2-5.2％(平均3.15％，sd1.07％)；並且對於患有血紅蛋白病的那些，包括攜帶者，糖化直系同源物佔0-9.1％(平均5.1％，sd2.78％)(參見圖5)。

討論

升高的血紅蛋白糖化與血糖調控較弱相關。hba1c首先在1971年被鑑定為血紅蛋白的色譜部分，並且表徵為血紅蛋白的β-n-1-脫氧果糖基組分的量度。正常水平的葡萄糖產生正常量的糖化血紅蛋白。隨著血漿葡萄糖的平均量增加，糖化血紅蛋白的分數以可預測的方式增加。這用作在測量前3個月的平均血糖水平的標記物，因為這是紅細胞的半衰期。

在糖尿病中，表明較弱控制的血糖水平的較高量的糖化血紅蛋白已經與心血管疾病、腎病、和視網膜病相關。也已採用監測1型患者中的hba1c作為改善結果的量度。幾種測量「hba1c」的方法，包括hplc、免疫試驗和毛細管電泳正處於臨床應用中。β-球蛋白糖化的量度被大量關注，其測量被胎兒β-狀球蛋白表達和β-球蛋白基因突變(如鐮狀細胞疾病和β-地中海貧血、以及這類突變的攜帶者中)削弱。然而，最近已經顯示升高的糖化與這種血紅蛋白病相關並且可能反映了這類受影響的血細胞中對糖化的化學易感性的增加。

本發明的方法清楚地解析了α-和β-球蛋白各自的糖化形式以及相應的非糖化起源。這給出了對血紅蛋白糖化的更精細甄別並且不受存在突變或異常球蛋白基因表達的削弱，這可能對測量hb糖化的其他方法有不利影響。

結論

在ddh2o中1/2000稀釋後對液滴或乾燥點全血的maldi-tofms譜分析顯示解析的球蛋白以及對α和β球蛋白的糖化直系同源物的清楚解析。比較糖化α-球蛋白峰與起源α-球蛋白峰的信號強度代表了針對糖尿病和前驅糖尿病的快速、經濟的篩選和監測測試方法。

表1.球蛋白鑑定-在對應於[m＝2h]2+離子的7500-8100的m/z範圍中實現最佳解析。