番茄病原細菌的接種方法

2023-12-10 10:11:42

專利名稱：番茄病原細菌的接種方法
技術領域：
本發明涉及一種植物病原細菌的接種方法，具體是番茄病原細菌的接種方法。
背景技術：
植物病原細菌的常用接種方法包括剪葉法、浸(蘸)根法、針刺法等，各種方法均存在各自的優缺點，研究不同細菌病害應選用不同的接種方法。生產中較為重要的番茄細菌性病害包括番茄潰瘍病、青枯病、細菌性斑點病和瘡痂病等。其中番茄細菌性潰瘍病是全世界番茄生產中一種極為重要的毀滅性病害，病原菌為Clavibactermichiganensis subsp.michiganensis(以下簡稱Cmm)，是中國檢疫性有害生物；該病菌以種子傳帶為主要傳播方式，目前世界上尚無針對番茄細菌性潰瘍病的有效防治方法，而且中國對該病害的研究較少，已有的研究僅限於病原菌的鑑定及病害的發生與防治報導。
在植物病害的防治實踐中，抗病品種的使用是最為經濟有效的方法，也是控制病害的最根本措施之一。在抗病品種的選育過程中，需要進行大量的抗病性檢測試驗，而建立病原菌對寄主植物穩定的致病體系是進行此項研究的重要前提。因此，一種操作簡單、發病迅速、效果穩定的接種方法是研究中不可或缺的。
傳統的幾種接種方法中用於番茄苗期接種Cmm時具有不同的缺陷，如剪葉法發病不穩定；針刺法接菌量小，在苗期不易操作並易對幼苗造成機械傷害；浸(蘸)根法操作複雜，不適合用於大樣本容量的試驗等。本發明人在嘗試了已報導的幾種常用細菌病害接種方法之後，認為這些接種方法均不適合用於番茄苗期接種Cmm和在苗期對番茄進行抗潰瘍病鑑定。
本發明人從果樹修剪中的打頂操作中受到啟發，由於番茄在打頂後還能繼續生長，因此設想通過打頂將病原菌接種到受體植物上。在經過大量試驗驗證後，發明了接種番茄病原細菌的打頂法，可作為番茄苗期接種潰瘍病菌及其它病原細菌的新方法。

發明內容
本發明目的是提供一種快速、簡便的對番茄幼苗接種病原細菌的接種方法。
為實現上述目的，本發明番茄病原細菌的接種方法，包括如下步驟(1)準備接種體製備濃度為108-109cfu/mL的番茄病原細菌菌懸液作為備用接種體；(2)番茄幼苗生長至3～4片真葉期時，在番茄幼苗子葉上部1-2cm處將主莖剪斷；(3)使接種體接觸主莖剪斷部位傷口，病原細菌侵入番茄幼苗。
優選地，用蘸有接種體的接種用手術剪刀剪斷主莖，同時使病原細菌侵入番茄幼苗。
本發明的接種方法的優點和積極效果在於可用於對番茄幼苗進行快速、簡便的病原細菌接種，接種量穩定均一，並能夠通過調整接種體的濃度控制接菌量，適合進行大樣本容量的試驗，可操作性很強，顯著減輕工作強度；接種後植株顯症時間短，不同細菌病害顯症時間不同，如接種Cmm後的幼苗在14～21天後可見到穩定且典型的番茄潰瘍病症狀，解決了其它幾種傳統接種方法的不足，如剪葉法發病不穩定；針刺法接菌量小，在苗期不易操作並易對幼苗造成機械傷害；浸(蘸)根法操作複雜，不適合用於大樣本容量的試驗等；並對於豐富植物病原細菌的接種方法具有積極意義。作為一種新的具有標準特徵的方法，可以用於番茄種質資源抗細菌性病的鑑定、不同來源番茄病菌的致病性差異檢測等規範性試驗，具有潛在的社會經濟意義。
具體實施例方式
實施例1以番茄細菌性潰瘍病菌為例，本發明的接種方法包括如下步驟(1)播種及苗期管理將健康的番茄種子播種在盛有滅菌基質的育苗盤內，適當澆水保持基質的溼度，在溫室條件下正常管理，播後25天，視不同的氣候日照等條件在21～28天範圍內都是可行的，即當番茄幼苗生長至3～4片真葉期時作為接種受體植物。
(2)接種體的準備將番茄潰瘍病菌接種在YDC培養基，即酵母提取物、葡萄糖、碳酸鈣培養基上，置於28℃下培養60小時，培養時間在48～72小時內都是可行的，然後用含0.85％NaCl的無菌生理鹽水配製成濃度為108的菌懸液，菌懸液濃度在108～109cfu/mL範圍內均是可行的。菌懸液濃度可根據試驗需要進行調整，濃度參照麥法蘭(McFarland)雲度計比濁法確定。
(3)接種方法用滅菌後的接種用手術剪蘸取上述製備的接種體於番茄幼苗子葉上部1.5cm處將主莖剪斷，剪斷位置在子葉上部1～2cm範圍內都是可行的；每剪一株則將手術剪置於菌懸液中蘸取一下接種體，接種後棄去幼苗頂部，從而造成傷口使番茄潰瘍病菌侵入。
接種後的症狀顯現在接種後5～7天，可見番茄幼苗子葉與主莖的葉腋處有新枝長出；14～21天後可見到接種番茄潰瘍病菌的幼苗子葉及長出的新枝出現典型的萎蔫和壞死症狀，有時可見到莖部出現開裂的潰瘍症狀，萎蔫或莖部潰瘍等症狀的出現與不同菌株的致病力有關，一般來說，強致病力菌株在短期內會造成子葉萎蔫、植株壞死或死亡，致病力稍弱的菌株則造成莖部潰瘍，而接種無菌生理鹽水的對照幼苗則無任何潰瘍病症狀。
在接種體濃度為108cfu/ml，晝夜最低、最高溫度分別為15～18℃、32～35℃和相對溼度為30％～60％的溫室條件下，用本發明的接種法接種番茄幼苗後潰瘍病發病率為87.5％-100％，病情指數隨接種體濃度提高而增大，經柯赫氏法則(Koch’s postulate)驗證，血清學和PCR技術鑑定表明，從發病後的幼苗上可再分離得到與原接種用的番茄潰瘍病菌特性相同的病原細菌。多次重複試驗表明，使用本發明的接種方法在感病番茄品種幼苗上均能產生穩定的潰瘍病症狀。
應用實施例1本申請人將本發明的方法用於中國主栽番茄品種苗期抗細菌性潰瘍病的鑑定，已完成對中國內61個主栽番茄品種的抗性鑑定，並根據番茄發病後的病情指數，將這些番茄品種初步分為高度感病品種、感病品種、中度抗/耐病品種、耐病品種等。
具體應用條件及方法(1)播種及苗期管理將健康的番茄種子播種在盛有滅菌基質的50孔育苗盤內，每個品種播種1盤，適當澆水保持基質的溼度，在溫室條件下正常管理，出苗後10天左右進行定苗，使每孔保留1株幼苗，每個品種50株；播後約26天，即當番茄幼苗生長至3～4片真葉期時作為接種受體。
(2)接種體的準備將1株來自中國的番茄潰瘍病菌Cmm-BX接種於YDC培養基上，置於28℃下培養48小時後，用含0.85％NaCl的無菌生理鹽水配製成濃度為108cfu/mL的菌懸液，菌懸液濃度參照麥法蘭(McFarland)雲度計比濁法確定。
(3)接種方法用滅菌後的接種用手術剪蘸取上述製備的接種體於番茄幼苗子葉上部1.5cm處將主莖剪斷，每剪一株則將手術剪置於菌懸液中蘸取一下接種體，接種後棄去幼苗頂部。每個品種中留下10株「接種」無菌生理鹽水，作為空白對照。
(4)病情調查接種後14天即可在大多數品種見到番茄潰瘍病症狀，接種21天後症狀趨於穩定，此時按以下分級標準對各品種植株發病後的病情進行調查0級，不出現葉片(或子葉)萎蔫或莖壞死；1級，葉片(或子葉)輕度變黃或萎蔫；2級，葉片(或子葉)中度萎蔫或莖輕度壞死；3級，葉片(或子葉)嚴重萎蔫或莖嚴重壞死；4級，植株死亡；並依照下列公式計算病情指數。
病情指數＝[∑(病級數值×該病級株數)×100]/(病級最高值×調查株數)結果根據接種21後天調查的數據，經分析計算出病情指數後，按照不同品種對番茄潰瘍病菌Cmm-BX的敏感程度，將供試的61個番茄品種初步分為高度感病品種、感病品種、中度抗/耐病品種、耐病品種4個等級。即將病情指數＞75的品種視為高度感病品種，共有20個，將50＜病情指數≤75的品種視為感病品種，共29個，將25＜病情指數≤50的品種視為中度抗/耐病品種，共11個，將病情指數≤25的品種視為耐病品種，共1個。
應用實施例2本發明人將本發明的方法用於不同來源的番茄潰瘍病菌菌株的致病力測定，發現不同來源的菌株在同一番茄品種上表現出不同的致病力。
具體應用條件及方法(1)播種及苗期管理將北京主栽的番茄品種佳粉10號的種子播種在盛有滅菌基質的50孔育苗盤內，適當澆水保持基質的溼度，在溫室條件下正常管理，出苗後10天左右進行定苗，使每孔保留1株幼苗，每個育苗盤共50株幼苗；播後約26天，即當番茄幼苗生長至3～4片真葉期時作為接種受體。
(2)接種體的準備將來自於中國(Cmm-BX)和美國的Cmm菌株(Cmm-09)和分別接種於YDC培養基上，置於28℃下培養48小時後，用含0.85％NaCl的無菌生理鹽水配製成濃度為108cfu/mL的菌懸液，菌懸液濃度參照麥法蘭(McFarland)雲度計比濁法確定。
(3)接種方法用滅菌後的接種用手術剪蘸取上述製備的接種體於番茄幼苗子葉上部1.5cm處將主莖剪斷，每剪一株則將手術剪置於菌懸液中蘸取一下接種體，接種後棄去幼苗頂部。在同一育苗盤中，每個菌株接種20株，另外留下10株「接種」無菌生理鹽水，作為空白對照。
(4)病情調查接種後14天即可見到接種Cmm-BX的番茄幼苗產生典型的萎蔫、壞死等潰瘍病症狀，而接種Cmm-09的番茄幼苗僅有個別植株出現輕微的萎蔫症狀，多數植株未見明顯症狀；接種21天後病情趨於穩定，按以下分級標準對植株發病後的病情進行調查0級，不出現葉片(或子葉)萎蔫或莖壞死；1級，葉片(或子葉)輕度變黃或萎蔫；2級，葉片(或子葉)中度萎蔫或莖輕度壞死；3級，葉片(或子葉)嚴重萎蔫或莖嚴重壞死；4級，植株死亡；並依照下列公式計算病情指數。
病情指數＝[∑(病級數值×該病級株數×100]/(病級最高值×調查株數)結果根據接種21後天調查的數據，經分析計算出病情指數後，發現接種Cmm-09的植株病情指數僅為7.8，而接種Cmm-BX的植株病情指數則高達78.3，差異顯著。
本發明的番茄病原細菌的接種方法，接種量穩定均一，並能夠通過調整接種體的濃度控制接菌量，適合進行大樣本容量的試驗，可用於進行抗/耐病品種的篩選、致病性試驗和病原菌的毒力測定。
以上實施例中所述的是番茄潰瘍病菌的接種，本發明的方法也適用於其它病菌的接種，如番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、番茄瘡痂病菌(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)和番茄細菌性斑點病病菌(Pseudomonas syringae pv.tomato)等的接種。本發明的方法不僅僅限於番茄幼苗期潰瘍病菌接種，其同樣適用於其它的適合於打頂操作的植物的幼苗期病菌接種。
權利要求
1.一種番茄病原細菌的接種方法，其特徵在於包括如下步驟(1)準備接種體製備濃度為108-109cfu/mL的番茄病原細菌菌懸液作為備用接種體；(2)番茄幼苗生長至3～4片真葉期時，在番茄幼苗子葉上部1-2cm處將主莖剪斷；(3)使接種體接觸主莖剪斷部位傷口，病原細菌侵入番茄幼苗。
2.根據權利要求1所述的接種方法，其特徵在於步驟(2)中用蘸有接種體的接種用手術剪刀剪斷主莖，同時使病原細菌侵入番茄幼苗。
全文摘要
本發明涉及一種植物病原細菌的接種方法，具體是番茄病原細菌的接種方法。其包括如下步驟首先準備接種體製備濃度為10
文檔編號C12N1/20GK1834224SQ20051001143
公開日2006年9月20日 申請日期2005年3月15日 優先權日2005年3月15日
發明者李健強, 羅來鑫, 劉西莉, 吳學宏, 劉鵬飛, 張文華 申請人:中國農業大學