一種酶固定化載體的製備及在免疫分析中的應用的製作方法

2023-12-02 10:24:26

一種酶固定化載體的製備及在免疫分析中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種酶固定化載體的製備方法及應用，尤其公開了一種利用聚電解質球刷為載體，採用靜電吸附後化學偶聯法實現對酶的固定化，並將製備得到的複合物應用於酶聯免疫檢測。本發明的方法實現了酶的高結合量和高活性，應用於酶聯免疫檢測中，顯著提高酶聯免疫檢測的靈敏度。
【專利說明】一種酶固定化載體的製備及在免疫分析中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物材料【技術領域】，尤其涉及一種酶固定化載體的製備方法及在酶聯 免疫分析中的應用。

【背景技術】
[0002] 酶的固定化在催化、檢測等諸多領域有廣泛的用途，固定化酶載體能夠在發揮酶 的功能的同時實現簡便的分離，從而獲得更加純淨的產物。為了提高催化效率，通常希望載 體具有較高的酶結合量，同時能夠較好地保持酶的活性。
[0003] 酶的固定化通常是藉助載體表面與酶的物理吸附或化學反應來實現的。然而，常 規載體通常面臨酶結合量低，結合過程對酶的活性影響大等問題，使得固定化酶的催化效 率大幅下降。利用聚電解質刷的三維結構能夠固定多層的酶，從而大幅提高酶的結合量。同 時，柔性的聚合物鏈能夠更好地保持固定化酶的活性，進一步提高催化活性。
[0004] Haupt等在2005年《生物大分子》第6期948-955頁報導用聚電解質球刷，通過靜 電吸附的方式結合葡萄糖澱粉酶和β-葡萄糖苷酶，結果表明，兩種酶固定化後的活性基 本保持不變。Kudina等在2014年《德國應用化學》第53期483-487頁報導用含有磁核的 聚丙烯酸球刷，通過靜電吸附結合纖維素酶進行催化，發現由於聚丙烯酸球刷對酶的高結 合量、高活性以及球刷的三維結構增大了載體和基體的接觸面積、酶在球刷內可移動等特 點，大幅提高了催化效率。然而，在上述方法中，球刷對酶的結合是可逆的，必須在應用過程 中保持鹽濃度和pH值不變，否則會導致酶的釋放。這一缺陷大大限制了這種酶載體的應用 領域。
[0005] 免疫分析技術是一種利用抗原-抗體之間高親和性的特異性結合而建立的高靈 敏度檢測方法。酶聯免疫分析（Elisa)是以酶作為檢測標記，將酶的高效催化能力與免疫 反應相結合而發展起來的一種常用的免疫分析技術。
[0006] 疾病的早期診斷對檢測靈敏度提出了更高的要求，提高檢測靈敏度的重要途徑之 一是在檢測系統中引入信號放大機制，以納米顆粒或微球作為集群酶的載體是一種重要的 放大方法。
[0007] 在常規酶聯免疫（Elisa)體系中，通常是以酶標記的抗體作為信號分子，它能夠 識別待測物並催化底物給出檢測信號。但是，一個抗體通常只能結合1?2個酶，因此，待 測物與作為標記的酶之間基本是一一對應的關係，不具有信號放大的效果。而用顆粒代替 抗體作為酶的載體可以大幅提高酶結合量，使待測物與酶之間形成一對多的關係，從而顯 著放大信號，提高檢測靈敏度。
[0008] 在基於顆粒的檢測體系中，靈敏度的放大倍數取決於載體對酶的結合量。Nilsson 在1989年《免疫學方法雜質》122期273?277頁報導用40nm氧化矽顆粒作為載體，以共 價鍵固定辣根過氧化物酶（HRP)和抗體，實現了基於顆粒的免疫檢測。但在該方法中，酶的 結合量相對較低（20 μ g/mg)，並且抗體和酶的結合存在競爭關係，因而在檢測過程中需要 加入大量的顆粒（150?300yg)，且只在低濃度的檢測範圍內實現了有限的信號放大（約 4倍）。Ke等人2010年《分析生物化學》406期第8-13頁發表的論文中對上述工作進行了 改進，採用層層自組裝（LBL)技術，實現了對辣根過氧化物酶（HRP)和抗體的分別結合，提 高了酶的結合量，同時克服了酶和抗體在結合時相互競爭的問題。但這一方法過程較為繁 瑣，多步的化學修飾和偶聯反應將不可避免地對酶的活性產生影響，削弱了載體的信號放 大效果。
[0009] 上述工作的共同問題在於載體的外表面只能結合單層的酶和抗體，因此結合量相 對較為有限，而酶的結合過程通常伴隨著酶活性的大幅下降，進一步制約了載體的信號放 大效果。
[0010] 基於上述問題，需要一種以共價鍵實現酶的穩定固定化，同時又能保持高的酶結 合量和酶活性的固定化方法，以實現酶的高效催化並擴大固定化酶載體的應用範圍。


【發明內容】

[0011] 有鑑於現有技術的上述缺陷，本發明所要解決的技術問題是提供一種利用聚電解 質球刷為載體進行酶固定化的製備方法，以及應用在酶聯免疫檢測中，顯著提高現有酶聯 免疫檢測的靈敏度。
[0012] 本發明是通過以下技術路線實現的：
[0013] 本發明提供了一種利用聚電解質球刷固定酶的方法，其特徵在於：用靜電吸附後 化學偶聯（CCEE)法將酶以共價鍵固定於聚電解質球刷內部，得到具有催化能力的聚電解 質球刷-酶複合物；
[0014] 本發明中，具體過程如下：
[0015] 在緩衝液A中，將所述聚電解質球刷與所述過量酶在室溫下混合，使所述酶充分 吸附於所述聚電解質球刷內部；用所述緩衝液A洗滌除去過量的所述酶；在所述緩衝液A 中用交聯劑EDC將所述酶以共價鍵形式與所述聚電解質球刷偶聯；用緩衝液B洗滌所述聚 電解質球刷-酶複合物並將所述聚電解質球刷-酶複合物複合物分散於所述緩衝液B中。
[0016] 本發明中，所述緩衝液A的選擇方法如下：
[0017] 當所述酶為等電點低於7的酸性酶時：
[0018] 針對聚丙烯酸或其他含有羧基的聚電解質球刷，選擇pH = 5. 0的10mM MES緩衝 液；
[0019] 針對聚N-(2-氨基乙基）丙烯醯胺或其他含有氨基的聚電解質球刷，選擇pH = 7. 4的10mM磷酸緩衝液；
[0020] 當酶為等電點高於7的鹼性酶時：
[0021] 針對聚丙烯酸或其他含有羧基的聚電解質球刷，選擇pH = 7. 4的10mM磷酸緩衝 液；
[0022] 針對聚N-(2-氨基乙基）丙烯醯胺或其他含有氨基的聚電解質球刷，選擇pH = 8. 5的10mM磷酸緩衝液。
[0023] 優選地，所述的聚電解質球刷是指將聚電解質鏈段的一端接枝在球形載體表面所 形成的材料結構。
[0024] 優選地，其中所述的球形載體可以是粒徑5納米至1000納米的微球。
[0025] 優選地，所述聚電解質為帶有電荷且具有可反應基團的聚合物。
[0026] 本發明還提供了一種利用聚電解質球刷-酶複合物偶聯抗體的方法，其特徵在 於：用共價偶聯過程將抗體共價固定於聚電解質球刷外側，得到能夠特異性識別待測抗原 的聚電解質球刷-酶-抗體複合物。
[0027] 本發明中，偶聯抗體方法採取如下選擇：
[0028] 對聚丙烯酸或其他含有羧基的聚電解質球刷，採用NHS/EDC過程偶聯抗體；
[0029] 對聚N-(2_氨基乙基）丙烯醯胺或其他含有氨基的聚電解質球刷，採用戊二醛作 為交聯劑偶聯抗體。
[0030] 本發明中，NHS/EDC過程的具體操作為：
[0031] 在所述緩衝液中，將所述聚電解質球刷-酶複合物與濃度為50mg/ml的NHS和EDC 混合，室溫反應15?30min以活化所述聚電解質球刷上的羧基；用所述緩衝液洗滌除去多 餘的反應物；加入過量抗體，室溫反應2小時，使抗體與活化的球刷通過共價鍵加以固定； 離心，棄去上清液後，加入0. 1M Tris-HCl，室溫反應0. 5小時以淬滅剩餘NHS酯的反應位 點；產物用含有〇. 5% BSA的PBS洗滌後，4°C封閉過夜；封閉後的產物4°C保存於PBS中。
[0032] 優選地，所述的緩衝液是指：
[0033] 對等電點低於7的酸性抗體，優選為pH = 5. 0的10mM MES緩衝液；
[0034] 對等電點高於7的鹼性抗體，優選為pH = 7. 4的10mM磷酸緩衝液。
[0035] 本發明中，戊二醛偶聯的具體操作為：
[0036] 在pH = 7. 4的10mM磷酸緩衝液中，將所述聚電解質球刷-酶複合物與濃度為 100mg/ml的戊二醛混合，室溫反應1小時；用所述緩衝液洗滌除去多餘的戊二醛；加入過量 抗體，室溫反應2小時；離心，棄去上清液後，加入0. 1M Tris-HCl和10mM NaCNBH3,室溫反 應1小時；產物用含有〇. 5% BSA的PBS洗滌後，4°C封閉過夜；封閉後的產物4°C保存於PBS 中。
[0037] 另一方面，本發明中，還提供了依據上述製備方法得到的複合物在酶聯免疫檢測 的應用。
[0038] 在本發明的優選實施方式中，所述複合物在酶聯免疫檢測的應用方法，具體包括 以下步驟：
[0039] 將15 μ g結合了捕獲抗體的磁珠、100 μ 1待測樣本以及1 μ g上述結合了酶和抗體 的球刷加入到微孔板中，混勻，37°C培養1小時；產物磁分離；棄去上清後，加入底物，催化 反應一段時間後，上機讀取信號值。
[0040] 聚合物球刷是將聚合物一端以較高密度固定於球形載體表面而形成的具有三維 結構的新型載體，具有結合多層蛋白的能力。並且，柔性的聚合物鏈在作為固定化的模板時 能夠較好地保留酶的活性。同時，由於球刷含有大量的蛋白結合位點，能夠在結合了大量酶 後進一步結合充足的抗體用於識別待測物，從而克服了常規載體中酶和抗體的競爭性結合 問題。
[0041] 本發明採用聚電解質球刷為載體固定高活性高結合量的酶，在本發明中，辣根過 氧化物酶以共價鍵結合到球刷的三維聚合物網絡內部實現多層固定化，其結合量較常規載 體提高45倍。同時，固定化酶的活性得到了較好的保持，達到自由酶的59. 4%，比常規載 體提高了一個數量級。所得的複合物作為酶的集群化載體，其催化活性等效於5300個自由 酶，比傳統羧基載體提高近3個數量級。
[0042] 以下將具體實施例對本發明的構思、具體結構及產生的技術效果作進一步說明， 以充分地了解本發明的目的、特徵和效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0043] 圖1是本發明實施例1的紫外-可見分光光度圖譜；
[0044] 圖2是酶催化底物顯色的動力學特徵圖。

【具體實施方式】
[0045] 下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限於下述實施例。
[0046] 在實施例中，所採用的試劑除另有說明外均為市售商品。
[0047] 實施例1
[0048] 用靜電吸附後化學偶聯（CCEE)法將辣根過氧化物酶共價固定化於聚丙烯酸球刷 內部
[0049] 首先，採用《膠體與界面科學雜誌》2013年第398卷82?87頁發表的表面引發 RAFT聚合法製備得到球核為80納米的氧化矽，聚合物毛刷狀鏈段在中性水溶液中的長度 為145納米，接枝密度為0. 34ηπΓ2的聚丙烯酸球刷。
[0050] 採用離心-重懸的方式，將所述聚丙烯酸球刷用10mM pH = 5. 0的MES緩衝液洗 滌2次，超聲分散於所述緩衝液中。同時，用該緩衝液溶解辣根過氧化物酶配製成蛋白溶 液，加入到所述聚丙烯酸球刷分散液中，均勻混合。最終所述聚丙烯酸球刷濃度為0. 8mg/ ml，所述辣根過氧化物酶濃度為2mg/ml。室溫培養15分鐘，使所述辣根過氧化物酶充分吸 附於所述聚丙烯酸球刷內部。
[0051] 離心，棄去上清,用所述MES緩衝液洗滌產物1次。同時用該緩衝液溶解EDC配製 成濃度為〇. 5mM的EDC溶液，並加入到含有產物的離心管中，混合均勻。繼續在室溫培養2 小時，使吸附在所述聚丙烯酸球刷上的蛋白通過共價鍵連接在所述聚丙烯酸球刷上。
[0052] 離心，棄去上清，用10mM PBS (pH = 7. 4)洗滌產物除去多餘的EDC和未偶聯的辣 根過氧化物酶，產物以2 mg/ml分散於PBS中。通過nanodrop檢測產物在403nm處的HRP 特徵吸收峰可確定所述辣根過氧化物酶成功結合到所述聚丙烯酸球刷內部，並可估算出所 述辣根過氧化物酶的結合量約為550 μ g/mg球刷。用TMB作為底物測定所述聚丙烯酸球 刷-辣根過氧化物酶複合物的活性可確定單個固定化酶相對於所述自由辣根過氧化物酶 的活性為60 %，計算可得每個球刷上結合的所述有效的辣根過氧化物酶數約為5000個。所 述聚丙烯酸球刷-辣根過氧化物酶複合物在PBS等條件下能夠穩定存在，不存在釋放現象。
[0053] 圖1所示，編號1為辣根過氧化物酶的光譜圖，2為聚丙烯酸球刷的光譜圖，3為聚 丙烯酸球刷-辣根過氧化物酶的複合物的光譜圖，所述聚丙烯酸球刷-辣根過氧化物酶的 複合物和純的辣根過氧化物酶均在403nm出表現出明顯的特徵吸收峰，未結合辣根過氧化 物酶的聚丙烯酸球刷不存在特徵峰。
[0054] 圖2所示，在催化反應初期，生成的產物與反應時間呈線性關係，其斜率反映了酶 催化的活性。設自由HRP的活性為100%，則用CCEE法固定於聚丙烯酸球刷內的HRP活性 為67 %，固定於常規羧基氧化矽載體上的HRP活性為5 %。聚丙烯酸球刷作為酶的載體固 定化酶的相對活性提高了 13. 4倍。
[0055] 實施例2
[0056] 用CCEE法將辣根過氧化物酶共價固定化於聚N-(2-氨基乙基）丙烯醯胺球刷內 部
[0057] 在本例中，所用的聚電解質球刷為含有氨基功能基團的聚N-(2_氨基乙基）丙烯 醯胺球刷，其球核為80納米，聚合物毛刷狀鏈段在中性水溶液中的長度為75納米，接枝密 度為 0. 3nm 2。
[0058] 採用離心-重懸的方式，將所述聚N-(2-氨基乙基）丙烯醯胺球刷用10mM pH = 7. 4的磷酸緩衝液洗滌2次，超聲分散於所述磷酸緩衝液中。同時，用所述磷酸緩衝液溶解 辣根過氧化物酶配製成蛋白溶液，加入到球刷分散液中，均勻混合。最終所述聚N-(2-氨基 乙基）丙烯醯胺球刷濃度為1. 2mg/ml，所述辣根過氧化物酶濃度為2mg/ml。室溫培養15 分鐘，使所述辣根過氧化物酶充分吸附於所述聚N- (2-氨基乙基）丙烯醯胺球刷內部。
[0059] 離心，棄去上清，用所述磷酸緩衝液洗滌產物1次，同時用所述緩衝液溶解EDC配 製成濃度為2mM的EDC溶液，並加入到含有產物的離心管中，混合均勻。繼續在室溫培養2 小時，使吸附在所述聚N-(2-氨基乙基）丙烯醯胺球刷上的蛋白通過共價鍵連接在所述聚 N-(2_氨基乙基）丙烯醯胺球刷上。
[0060] 離心，棄去上清，用10mM PBS(pH = 7. 4)洗滌產物除去多餘的EDC和未偶聯的辣根 過氧化物酶，產物以2mg/ml分散於PBS中。通過nanodrop檢測產物在403nm處的HRP特 徵吸收峰可確定所述辣根過氧化物酶成功結合到所述聚N-(2-氨基乙基）丙烯醯胺球刷內 部，並可估算出所述辣根過氧化物酶的結合量約為1500 μ g/mg球刷。用TMB作為底物測定 所述聚N- (2-氨基乙基）丙烯醯胺球刷-辣根過氧化物酶複合物的活性可確定單個固定化 酶相對於自由HRP的活性為58 %，計算可得每個所述聚N- (2-氨基乙基）丙烯醯胺球刷上 結合的有效辣根過氧化物酶數約為11000個。所述聚N-(2-氨基乙基）丙烯醯胺球刷-辣 根過氧化物酶複合物在PBS等條件下能夠穩定存在，不存在釋放現象。
[0061] 實施例3
[0062] 用NHS/EDC過程將抗β -hCG抗體共價固定於聚丙烯酸球刷外側
[0063] 將實施例1中得到的所述聚丙烯酸球刷-辣根過氧化物酶的複合物以離心-重懸 的方式分散於10mM pH = 5. 0的MES緩衝液中，濃度為2mg/ml。將NHS和EDC溶解於MES 中配製成濃度為50mg/ml的溶液，加入到含有聚丙烯酸球刷-辣根過氧化物酶複合物的離 心管中，室溫反應15?30min以活化所述聚丙烯酸球刷上的剩餘羧基。用緩衝液洗滌3次 除去多餘的反應物。
[0064] 棄去上清液後，將過量的抗β-hCG抗體溶於MES中加入到離心管中，室溫反應2 小時，使抗體與活化的所述聚丙烯酸球刷通過共價鍵加以固定。離心，棄去上清液後，加入 0. 1M Tris-HCl，室溫反應0. 5小時以淬滅剩餘NHS酯的反應位點。
[0065] 得到的聚丙烯酸球刷-辣根過氧化物酶-抗體複合物用含有0. 5 % BSA的PBS洗 滌後，4°C封閉過夜。封閉後的產物以0. 5mg/ml的濃度4°C保存於PBS中。
[0066] 經BCA法測試，用上述方法得到的所述聚丙烯酸球刷-辣根過氧化物酶-抗體復 合物的抗體結合量為58 μ g/mg。
[0067] 實施例4
[0068] 用戊二醛作為交聯劑將抗β-hCG抗體共價固定於聚N-(2_氨基乙基）丙烯醯胺 球刷外側
[0069] 將聚N- (2-氨基乙基）丙烯醯胺球刷-辣根過氧化物酶複合物以離心-重懸的方 式分散於10mM pH = 7. 4的磷酸緩衝液中，濃度為2mg/ml。將戊二醛溶解於磷酸緩衝液中 配製成濃度為l〇〇mg/ml的溶液，加入到含有所述聚N-(2-氨基乙基）丙烯醯胺球刷-辣根 過氧化物酶複合物的離心管中，室溫反應1小時以活化所述聚N-(2-氨基乙基）丙烯醯胺 球刷上的剩餘氨基。用緩衝液洗滌3次除去多餘的反應物。
[0070] 棄去上清液後，將過量的抗β-hCG抗體溶於磷酸緩衝液中加入到離心管中，室溫 反應2小時，使抗體與活化的聚N-(2-氨基乙基）丙烯醯胺球刷通過共價鍵加以固定。離 心，棄去上清液後，加入0. 1M Tris-HCl和10mM NaCNBH3，室溫反應1小時以淬滅剩餘醛基 的反應並將Schiff鹼還原。
[0071] 得到的聚N-(2-氨基乙基）丙烯醯胺球刷-辣根過氧化物酶-抗體複合物用含有 0. 5% BSA的PBS洗滌後，4°C封閉過夜。封閉後的產物以0. 5mg/ml的濃度4°C保存於PBS 中。
[0072] 經BCA法測試，用上述方法聚N-(2-氨基乙基）丙烯醯胺球刷-辣根過氧化物 酶-抗體複合物的抗體結合量為50 μ g/mg.
[0073] 實施例5
[0074] 用聚電解質球刷作為酶結合物載體檢測hCG抗原
[0075] 在本實施例中，所用的磁珠為Dynal M-270鏈黴親和素（SA)磁珠。所用的捕獲抗 體為生物素標記的抗a -hCG抗體（biotin- a -hCG)。所用的聚電解質球刷-酶-抗體複合 物可以是實施例3或實施例4得到的複合物。
[0076] 首先，將SA磁珠與過量的biotin- a -hCG在室溫下混合30min，使抗a -hCG抗體 結合到磁珠上。
[0077] 將15 μ g結合了捕獲抗體的磁珠、100 μ 1含有hCG抗原的待測樣本以及1 μ g結合 了酶和抗體的聚電解質球刷加入到微孔板中，混勻，37°C培養1小時。產物磁分離，用PBS 洗滌5次除去未反應的雜質。棄去上清後，加入100μ1 TMB底物，25°C反應10min。磁分離 後取出50μ 1，用50μ 1 4M H2S04終止，讀取450nm處的吸光度值。
[0078] 經測試，採用所述聚電解質球刷-酶複合物的檢測所得到的檢測信號和靈敏度比 常規體系提高了 100倍。
[0079] 實施例6
[0080] 採用化學發光作為檢測方法得到檢測信號
[0081] 基於聚電解質球刷的Elisa檢測過程與實施例5相同。在Elisa檢測過程中，將 底物由實施例5中的TMB替換為魯米諾化學發光底物。檢測過程為：加入100 μ 1化學發光 工作液，室溫培養5min，上機讀取化學發光值。
[0082] 經測試，採用聚電解質球刷-酶-抗體複合物的檢測所得到的檢測信號和靈敏度 比常規體系提高了 500倍。
[0083] 實施例7
[0084] 採用球核為500納米的聚丙烯酸球刷作為酶結合物載體檢測hCG抗原
[0085] 基於球刷的Elisa檢測過程與實施例5相同。
[0086] 經nanodrop測試，聚電解質球刷球刷-辣根過氧化酶複合物對辣根過氧化酶的結 合量約為1〇〇μ g/mg球刷。TMB測試表明，固定化酶的相對活性為63%，計算可得每個球刷 上結合的有效HRP數約為1. 7 X 105個。
[0087] 用TMB作為底物進行Elisa檢測，採用聚電解質球刷-酶-抗體複合物的檢測所 得到的檢測信號和靈敏度比常規體系提高了 3000倍。
[0088] 以上詳細描述了本發明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術無需創 造性勞動就可以根據本發明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本【技術領域】中技術人員 依本發明的構思在現有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術 方案，皆應在由權利要求書所確定的保護範圍內。
【權利要求】
1. 一種利用聚電解質球刷固定酶的方法，其特徵在於：用靜電吸附後化學偶聯法將酶 以共價鍵固定於聚電解質球刷內部，得到具有催化能力的聚電解質球刷-酶複合物。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，具體過程如下： 在緩衝液A中，將所述聚電解質球刷與過量的所述酶在室溫下混合，使所述酶充分吸 附於所述聚電解質球刷內部；用所述緩衝液A洗滌除去過量的所述酶；在所述緩衝液A中 用交聯劑EDC將所述酶以共價鍵形式與所述聚電解質球刷偶聯；用緩衝液B洗滌所述聚電 解質球刷-酶複合物並將所述聚電解質球刷-酶複合物分散於緩衝液B中。
3. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述緩衝液A的選擇方法如下： 當所述酶為等電點低於7的酸性酶時： 針對聚丙烯酸或其他含有羧基的聚電解質球刷，優選為選擇pH = 5. 0的10mM MES緩 衝液； 針對聚N-(2-氨基乙基）丙烯醯胺或其他含有氨基的聚電解質球刷，選擇pH = 7. 4的 10mM磷酸緩衝液； 當所述酶為等電點高於7的鹼性酶時： 針對聚丙烯酸或其他含有羧基的聚電解質球刷，選擇pH = 7. 4的10mM磷酸緩衝液； 針對聚N-(2-氨基乙基）丙烯醯胺或其他含有氨基的聚電解質球刷，選擇pH = 8. 5的 10mM磷酸緩衝液。
4. 一種利用聚電解質球刷-酶複合物偶聯抗體的方法，其特徵在於：用共價偶聯過 程將抗體共價固定於聚電解質球刷外側，得到能夠特異性識別待測抗原的聚電解質球 刷-酶-抗體複合物。
5. 如權利要求4所述的方法，其特徵在於，偶聯抗體方法採取如下選擇： 對聚丙烯酸或其他含有羧基的聚電解質球刷，採用NHS/EDC過程偶聯抗體； 對聚N-(2-氨基乙基）丙烯醯胺或其他含有氨基的聚電解質球刷，採用戊二醛作為交 聯劑偶聯抗體。
6. 如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述NHS/EDC過程的具體操作為： 在緩衝液中，將聚電解質球刷-酶複合物與濃度為50 mg/ml的NHS和EDC混合，室溫反 應15?30min以活化所述聚電解質球刷上的羧基；用所述緩衝液洗滌除去多餘的反應物； 加入過量抗體，室溫反應2小時，使抗體與活化的所述聚電解質球刷-酶複合物通過共價鍵 加以固定；離心，棄去上清液後，加入〇. 1M Tris-HCl，室溫反應0. 5小時以淬滅剩餘NHS酯 的反應位點；產物用含有0. 5% BSA的PBS洗滌後，4°C封閉過夜；封閉後的產物4°C保存於 PBS 中。
7. 如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述緩衝液是指： 對等電點低於7的酸性抗體，選擇pH = 5. 0的10mM MES緩衝液； 對等電點高於7的鹼性抗體，選擇pH = 7. 4的10mM磷酸緩衝液。
8. 如權利要求5所述的方法，其特徵在於，戊二醛偶聯的具體操作為： 在pH = 7. 4的10mM磷酸緩衝液中，將聚電解質球刷-酶複合物與濃度為100mg/ml的 戊二醛混合，室溫反應1小時；用所述磷酸緩衝液洗滌除去多餘的所述戊二醛；加入過量抗 體，室溫反應2小時；離心，棄去上清液後，加入0. 1M Tris-HCl和10mM NaCNBH3，室溫反應 1小時；產物用含有〇. 5% BSA的PBS洗滌後，4°C封閉過夜；封閉後的產物4°C保存於PBS 中。
9. 如權利要求4-8任一所述的方法製備得到的聚電解質球刷-酶-抗體複合物。
10. 如權利要求9所述的複合物在酶聯免疫檢測的應用。
【文檔編號】C12N11/08GK104195127SQ201410391019
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月11日 優先權日:2014年8月11日
【發明者】徐宏, 瞿振元, 古宏晨 申請人:上海交通大學