新的腫瘤抑制基因或蛋白及其應用的製作方法

2023-12-09 04:44:16

專利名稱：：新的腫瘤抑制基因或蛋白及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種新的腫瘤抑制基因或蛋白及其應用，具體地涉及CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的基因或蛋白或它們的免疫性片段及其應用。
背景技術：
：眾所周知，凋亡在所有動物的發育和穩態中起十分重要的作用，決定一個細胞是否處於凋亡狀態的主要標誌包括典型的細胞形態的改變以及一些生化和分子標誌的改變。就形態而言，凋亡細胞變圓、皺縮、脫落，染色體凝集並分布於核邊緣。凋亡發生的主要生化標誌有線粒體失去跨膜電位，質膜磷脂醯絲氨酸外翻，胱冬酶(caspase)的活化，蛋白質如IAPs和聚ADP核糖聚合酶(PARP，Poly(ADP-ribose)polymerase)的酶切，基因組DNA的片斷化和線粒體質量以及f-肌動蛋白成分的改變等。在哺乳類動物中，胱冬酶是一組與細胞凋亡有關的蛋白酶。胱冬酶激活的一個主要途徑是細胞色素c從線粒體的釋放，胞漿中的細胞色素c可與Apaf-l形成複合物，此複合物可識別並酶切胱冬酶原-9，活化後的胱冬酶-9酶切並激活胱冬酶-3，從而引起細胞進行一系列凋亡的形態改變。癌症對人類健康和生命的威脅很大，是全世界造成死亡的重要原因。對腫瘤的治療和診斷，成為現代醫學需要解決的重要課題。細胞凋亡異常是腫瘤發生、發展的重要因素，因此通過誘導腫瘤細胞凋亡來清除腫瘤已成為當前腫瘤治療的一個新的重要策略。在許多表皮的惡性腫瘤細胞中，表皮生長因子受體(EGFR)都是高表達、失調或突變的，EGFR介導信號通路的激活對於腫瘤的生長是非常重要的。
發明內容本發明的一個目的是提供CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的蛋白或由它們衍生的蛋白或它們的免疫性片段。本發明的另一目的是提供編碼以下蛋白或它們的免疫性片段的多核苷酸序列CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的蛋白或由它們衍生的蛋白。本發明的另一目的是提供CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的基因或蛋白或它們的免疫性片段在誘導細胞凋亡中的應用。本發明的另一目的是提供CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的基因或蛋白或它們的免疫性片段在製備治療和/或抑制腫瘤的藥物中的應用。本發明的另一目的是提供一種包含CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的載體。本發明的另一目的是提供一種用於治療和/或抑制腫瘤的藥物組合物。本發明的另一目的是提供檢測CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的基因和蛋白或它們的免疫性片段的表達的試劑的應用。本發明提供了如下(a)、(b)、(c)或(d)所示的蛋白或其免疫性片段(a)由SEQIDNO:2所示的胺基酸序列組成的蛋白；(b)在(a)限定的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且與(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白；(c)由SEQIDNO:4所示的胺基酸序列組成的蛋白；或(d)在(c)限定的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且與(c)具有相同功能的由(c)衍生的蛋白。本發明還提供了編碼所述的蛋白或其免疫性片段的多核苷酸序列；所述的多核苷酸序列優選為SEQIDNO:1所示的多核苷酸序列、SEQIDNO:1的核苷酸295813所示的多核苷酸序列或SEQIDNO:3的核苷酸1345所示的多核苷酸序列；所述免疫性片段優選為SEQIDNO:2的胺基酸157173所示的序列、SEQIDNO:2的胺基酸121所示的序列、SEQIDNO:2的胺基酸2242所示的序列或SEQIDNO:2的胺基酸127143所示的序列。本發明還提供了所述的蛋白或其免疫性片段或所述的多核苷酸序列在誘導細胞凋亡中的應用；所述細胞凋亡尤其是腫瘤細胞凋亡；所述的腫瘤細胞凋亡優選為通過降低Bad第112位絲氨酸磷酸化程度而導致的腫瘤細胞凋亡。本發明還提供了所述的蛋白或其免疫性片段或所述的多核苷酸序列在製備治療和/或抑制腫瘤的藥物中的應用；所述的腫瘤優選為表皮生長因子受體高表達的腫瘤；所述的表皮生長因子受體高表達的腫瘤優選為前列腺癌、前列腺增生、宮頸癌或肝癌。本發明還提供了一種載體，其包含所述的多核苷酸序列；所述的載體優選為質粒或病毒；所述的病毒優選為腺病毒。本發明還提供了一種用於治療和/或抑制腫瘤的藥物組合物，該藥物組合物含有所述的蛋白或其免疫片段或所述的多核苷酸序列或所述的載體，和一種或多種藥用賦形劑或藥用載體。本發明還提供了檢測所述的蛋白或其免疫性片段或所述的多核苷酸序列的表達的試劑在製備用於檢測腫瘤的組合物中的應用。圖1A顯示CMTM8的PCR產物。圖IB顯示CMTM8和其可變剪切體CMTM8-v2在人血細胞文庫的PCR擴增結果，其中泳道3為DNA標準(100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp);泳道l、2、49分別為活化的〔019+B細胞、靜息的CD19+B細胞、活化的CD14+單核細胞、靜息的CD14+單核細胞、活化的CD8+T細胞、靜息的008+T細胞、活化的CD4+T細胞和靜息的CD4+T細胞cDNA的CMTM8和其可變剪切體CMTM8-v2的PCR產物，可以看到兩個條帶(較大的522bp和較小的348bp)。圖2A圖2D顯示瞬時轉染CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2誘導了細胞的凋亡。圖2A顯示CMTM8轉染所引起的細胞形態學的改變；圖2B顯示ArmexinV單陽性細胞的比率和AnnexinV/PI雙陽性細胞的比率；圖2C顯示瞬時轉染CMTM8-v2或CMTM8誘導了細胞的凋亡用對照質粒、CMTM8-v2的表達質粒或CMTM8的表達質粒轉染HeLa細胞，轉染後48小時採集圖像，並用DAPI染細胞核，螢光顯微鏡觀察，可見CMTM8-v2或CMTM8轉染引起細胞形態學改變；圖2D顯示收穫轉染後的細胞，用AnnexinV/PI染色，如圖所示為AnnexinV單陽性細胞的比率和ArmexinV/PI雙陽性細胞的比率。圖3顯示CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的瞬時轉染誘導了細胞色素c的釋放和胱冬酶的激活。細胞轉染後60小時，Western印跡分析胞漿的細胞色素c、胱冬酶原-9、胱冬酶原-3和PARP的酶切割片段。用e-肌動蛋白作為蛋白上樣量的對照。圖4顯示感染後24、48、72和96小時用螢光顯微鏡觀察的細胞形態變化。圖5A圖5D顯示CMTM8瞬時轉染細胞會導致Bad-S112磷酸化程度的降低，瞬時轉染CMTM8所誘導的細胞凋亡可被siBad所抑制。其中，圖5A顯示siCMTM8對內源性CMTM8的抑制效果；圖5B顯示用Western印跡分析的Bad-pS112和總的Bad的水平；圖5C顯示用Western印跡觀察的siBad對內源性Bad的幹擾作用；圖5D顯示AnnexinV單陽性細胞的比率和AnnexinV/PI雙陽性細胞的比率。圖6顯示用Western印跡檢測的內源性CMTM8表達情況。圖7顯示CMTM8或CMTM8-v2對細胞增殖的影響。用質粒pCDB、pCDB-CMTM8或pCDB-v2轉染服K293或PC3細胞。其中，圖片(A)和(B)分別顯示用MTT觀察HEK293和PC3細胞的增殖狀況；圖片(C)顯示用克隆形成實驗來觀察CMTM8或CMTM8-v2對細胞增殖能力的長期影響。圖8顯示CMTM8或CMTM8-v2(圖中簡寫為v2)對EGF刺激產生信號的影響。用pCDB、pCDB-CMTM8-v2、pCDB-CMTM8轉染HeLa細胞，轉染後24小時，撤血清20小時後，用EGF因子刺激並進行Westernblot分析pERK1/2、ERK1/2和P-actin的表達量。圖9A和圖9B顯示Westernblot檢測可見CMTM8轉染細胞的培養上清中的CMTM8蛋白分泌表達情況。圖10A和圖10B顯示免疫組織化學檢測CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2在前列腺增生組織中的表達；其中圖10A顯示抗兔IgG對照；圖10B顯示抗CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2兔多抗。具體實施方式根據本發明的一個方面，本發明提供如下(a)、(b)、(c)或(d)所示的蛋白或其免疫性片段(a)由SEQIDNO:2所示的胺基酸序列組成的蛋白；(b)在(a)限定的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且與(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白；(c)由SEQIDNO:4所示的胺基酸序列組成的蛋白；或(d)在(c)限定的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且與(c)具有相同功能的由(0衍生的蛋白。如SEQIDNO:2所述的胺基酸序列為本發明的CMTM8蛋白序列，共173個胺基酸。CMTM8基因為編碼本發明的SEQIDNO:2的多核苷酸序列，其可以為SEQIDNO:2所示胺基酸的編碼序列，除了上述胺基酸序列的編碼序列之外，還可以包括非編碼序列，例如內含子、編碼序列5'或3'端的非編碼序列等。所述多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因組DNA以及合成的DNA。其中優選的基因為SEQIDNO:1所示的多核苷酸序列，該序列全長1185個核苷酸，其包含編碼CMTM8蛋白的序列(例如編碼序列(CDS:核苷酸295813)和5'非編碼區(核苷酸1294)及3，非編碼區(核苷酸8141185)。或者，更優選一種分離的核苷酸序列，其只包含CMTM8蛋白的編碼序列，例如SEQIDNO:1所示的編碼序列核苷酸295813。CM頂8-v2蛋白為如SEQIDN0:4所述的胺基酸序列，其編碼115個胺基酸。CMTM8-v2為CMTM8的可變剪切體，其中剪切掉了第二個外顯子，即CMTM8-v2(SEQIDNO:4)缺少CMTM8(SEQIDNO:2)的胺基酸殘基50107。所述CMTM8-v2編碼基因優選為SEQIDNO:4所示胺基酸的編碼序列，例如本發明SEQIDNO:3所示的多核苷酸序列，其相當於SEQIDNO:1的核苷酸295441加616813，即缺少SEQIDNO:1的編碼序列(CDS:核苷酸295813)中的核苷酸442615。本領域普通技術人員已知，本發明CMTM8的核苷酸序列可以完全相同於如SEQIDNO:l所示的編碼序列，CMTM8-v2的核苷酸序列可以完全相同於如SEQIDN0:3所示的編碼序列，也可以由於遺傳密碼的簡併性，不完全等同於上述核苷酸的編碼序列。例如，根據每個具體的原核宿主或者真核宿主所使用的密碼子的頻率不同，可以選擇相應的密碼子，從而提高所述的多核苷酸在相應的宿主中表達效率。也可以為了獲得比天然的核苷酸序列具有更好性能的多核苷酸(如更長的半衰期)而轉換密碼子。本發明的CMTM8基因或蛋白的免疫性片段包括本發明的CMTM8蛋白的免疫性片段或本發明的CMTM8基因的免疫性片段。本發明的CMTM8蛋白的免疫性片段可以為CMTM8蛋白的任何具有免疫原性的片段，例如SEQIDNO:2的胺基酸157173所示的序列、SEQIDNO:2的胺基酸121所示的序列、SEQIDNO:2的胺基酸2242所示的序列或SEQIDNO:2的胺基酸127143所示的序列。本發明的CMTM8基因的免疫性片段可以為編碼所述CMTM8蛋白的免疫性片段的核苷酸序列。本發明的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的多核苷酸序列或其免疫性片段可以依據標準的PCR擴增技術將cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，並選取合適的寡核苷酸引物擴增得到。這樣得到核苷酸可以克隆進合適的載體中，然後利用在所述載體中的複製得到。也可以通過標準DNA合成技術得到，例如，使用可以按本領域熟知的固相亞磷酸醯胺三酯法在DNA合成儀上合成。本發明的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的蛋白或其免疫性片段可以通過常規方法獲得，例如通過用CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的基因或其免疫性片段轉化宿主細胞並在被轉化的宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用適當的方法(如溫度變動或化學特質誘導)誘導啟動子，然後繼續培養。培養完成後，可用離心法收集細胞，並用任何已知的方法，如凍融法、超聲處理法、溶菌酶溶解法或機械破碎法破碎細胞。可以用各種已知的方法從宿主細胞培養物中回收和純化本發明的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的蛋白或其免疫性片段，這些方法包括硫酸銨或乙醇沉澱法、酸萃取法、超濾法、離子交換層析法、磷酸纖維層析法、疏水相互作用層析法、凝膠過濾法、親和層析法及高壓液柱層析法。根據本發明的一個方面，提供了CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的基因或蛋白或它們的免疫性片段在誘導細胞凋亡中的應用。細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是一種在特定時空主動發生的、受基因嚴密調控的細胞逐漸死亡的現象。細胞凋亡在腫瘤發生、腫瘤治療、胚胎發育、免疫反應、神經系統發育、組織代謝過程中有重要的作用。由於本發明的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的基因或蛋白或它們的免疫性片段能夠誘導細胞凋亡，所以本發明的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的基因或蛋白或它們的免疫性片段可以廣泛用於清除衰老、受損或病變的細胞，尤其可以用於誘導腫瘤細胞。本發明的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的基因或蛋白或它們的免疫性片段也可以在體外實驗中用於誘導細胞凋亡，尤其是腫瘤細胞的凋亡。細胞凋亡異常是腫瘤發生、發展的重要因素，因此通過誘導腫瘤細胞凋亡來清除腫瘤己成為當前腫瘤治療的一個新的重要策略。在本發明的一個實施例中，證明了本發明的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2在腫瘤細胞中的表達能夠誘導腫瘤細胞的凋亡，從而本發明的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2或其免疫性片段可用於治療和/或抑制腫瘤。Bel-2家族的成員之一Bad可以與Bel-2或Bel-xL在線粒體的外膜形成二聚體，從而抑制它們抗凋亡的活性，促進細胞走向死亡。特定位點絲氨酸殘基的磷酸化可調節Bad的活性，例如EGF可刺激Bad第112位的絲氨酸磷酸化，磷酸化的Bad與Bel-xL解偶聯，而與胞漿中的14-3-3蛋白質結合。在本發明的一個實施例中，CMTM8瞬時轉染細胞會導致Bad-S112磷酸化程度的降低，瞬時轉染CMTM8所誘導的細胞凋亡可被siBad所抑制。因此，本發明的CMTM8基因或蛋白或它們的免疫性片段可通過降低Bad第112位絲氨酸磷酸化程度而導致細胞凋亡。根據本發明的另一方面，本發明提供CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的基因或蛋白或它們的免疫性片段在製備治療和/或抑制腫瘤的藥物中的應用。本發明的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的基因或蛋白或它們的免疫性片段在腫瘤細胞的表達可以抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞的凋亡，而且CMTM8在肝癌組織中的表達水平顯著低於正常肝組織。因此，本發明的CMTM8基因為新的腫瘤抑制基因。從而，本發明的CMTM8基因或蛋白或它們的免疫性片段可用於製備治療和/或抑制腫瘤的藥物。本發明的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的基因和蛋白可以以基因和蛋白的形式直接包含在用於治療和/或抑制腫瘤的藥物中利用其瞬時表達產物進行治療，也可以以包含在表達載體中的形式包含在用於治療和/或抑制腫瘤的藥物中利用瞬時和穩定的表達產物進行治療。根據本發明的另一方面，本發明提供一種含有本發明的多核苷酸序列的載體。適當的載體通常為基因工程載體，其可以為染色體、非染色體來源的或合成的DNA序列，例如細菌質粒、噬菌體DNA、酵母質粒、病毒(如痘苗病毒、腺病毒)以及病毒DNA，條件是這些載體能夠在所選擇的宿主細胞中複製並存活。插入到表達載體中的DNA序列與適當的表達控制序列如啟動子可操作地連接，以指導mRNA的合成。這樣的啟動子的例子包括RSV、HIV、CMV或SV40啟動子，大腸桿菌lac或trp啟動子、噬菌體入PL啟動子及在原核或真核細胞或其病毒中控制基因表達的其他啟動子。此外，表達載體可含有啟動翻譯的核糖體結合位點及轉錄終止子，還可以包括用於擴增表達的合適序列。必要時，為了提高編碼本發明CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的DNA在高等真核細胞中的轉錄效率，可在載體中插入增強子序列。簡單起見，可以將本發明的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的基因導入市售載體中，這樣的市售載體包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)、pMT-hIL-3(馬大龍、狄春輝、龐健等(1991)高技術通訊11:2629)、pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia),以及pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。在本發明的一個實施例中(參見實施例l)，將CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2多核苷酸序列的PCR產物克隆至pGEM-TEasy載體中(Promega)。優選將本發明的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2序列或其免疫性片段或含有CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2序列或其免疫性片段的載體通過轉導、轉化或轉染的方法直接施用於患有腫瘤的動物體的腫瘤部位，從而達到治療或抑制腫瘤的目的。轉導、轉化或轉染的方法包括本領域已知的病毒感染(尤其是腺病毒介導的轉染法和痘苗病毒介導的轉染法)、氯化鈣轉染法、脂質體轉染法、電穿孔法或微粒轟擊法等。目前構建的腺病毒載體主要有3類，即腺病毒E3區缺失表達載體(非缺陷型載體)、腺病毒E,區缺失表達載體(缺陷型載體)和腺病毒沉默區表達載體。利用同源重組技術，腺病毒所攜帶的外源基因長度可達7.5kb，能感染處於不同周期的細胞，且不整合於宿主細胞基因組中，其安全性較高。痘苗病毒作為載體有如下特點插入外源基因容量大，可以表達2540kb的DNA，並能同時表達多種外源基因；病毒宿主範圍廣；病毒在胞漿中繁殖，不與宿主細胞的染色體整合，無致癌性；表達的產物可以糖基化，能保持外源基因產物的生物學和理化性質。表皮生長因子受體在多種腫瘤如肝癌、結直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、宮頸癌、前列腺癌和非小細胞肺癌等中都有過表達。由於本發明通過體外實驗證實，CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2能夠降低EGFR介導的信號通路下遊分子ERK的磷酸化程度，CMTM8能夠降低EGFR介導的信號通路下遊分子Bad第112位絲氨酸的磷酸化程度，從而抑制腫瘤細胞生長、誘導了腫瘤細胞的凋亡，所以CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2特別適用於治療和抑制表皮生長因子受體高表達的腫瘤，尤其是前列腺癌、前列腺增生、宮頸癌或肝癌。而且本發明還證明CMTM8在肝癌組織中的表達水平顯著低於正常肝組織。本發明還提供一種用於治療和/或抑制腫瘤的藥物組合物，該藥物組合物含有CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的基因或蛋白或它們的免疫性片段，和一種或多種藥用賦形劑或藥用載體。藥用賦形劑或藥用載體指無毒固態、半固態或液態填充劑、稀釋劑、包囊材料或其他製劑輔料。所述藥物組合物適於胃腸外、舌下、腦池內、陰道內、腹膜內、直腸內、頰內、腫瘤內或表皮給藥。胃腸外給藥包括靜脈內、肌內、腹膜內、胸骨內、皮下、關節內注射和輸注。適於胃腸外給藥的藥物組合物包括無菌水溶液或非水溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及用於在臨使用前在無菌可注射溶液或分散液中配製的粉末。適宜的水性或非水性載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、羧甲基纖維素、植物油和可注射的有機酯如油酸乙酯。這些組合物還可以含有防腐劑、潤溼劑、乳化劑和分散劑等輔劑。加入等滲劑如糖類、氯化鈉等可能是有利的。表皮給藥包括在皮膚、黏膜上、以及在肺和眼的表面給藥。這樣的藥物組合物包括粉劑、軟膏、滴劑、透皮貼劑、離子電滲療法裝置以及吸入劑等。直腸或陰道給藥的組合物優選為栓劑，它可以通過將本發明的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2序列或其免疫性片段或含有CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2多核苷酸序列或其免疫性片段的載體與適宜的非刺激性藥用賦形劑或藥用載體如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟混合製備，所述藥用賦形劑或藥用載體在室溫為固態，在體溫下為液態，因此在直腸或陰道腔內熔化並釋放出活性化合物。當以上述或其他方式進行治療時，治療有效量的本發明的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2可以是本發明CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的基因或蛋白或它們的免疫片段的純淨形式、藥用鹽形式，或選擇性與藥用賦形劑組合。對任何特定患者的具體治療有效劑量取決於許多因素，包括所治療的疾病和其嚴重程度；所用具體化合物的活性；所用的特定組合物；患者的年齡、體重、性別、飲食和一般健康狀況；給藥時間；給藥途徑；具體化合物的排洩速度；治療的持續時間聯合或同時服用的其他藥物等。本發明還提供檢測CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的基因或蛋白或它們的免疫片段的表達的試劑在製備用於檢測腫瘤的組合物中的應用。所述試劑可以為蛋白、核酸、碳水化合物等，優選為抗體、反義RNA或小幹擾RNA(siRNA)。本發明的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的基因或蛋白或它們的免疫片段可以作為診斷指標。因此，可以利用限制性片段長度多態性分析(RFLP)、反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、螢光原位雜交法(FISH)等方法或它們的組合，檢測體內因本發明的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2表達不足或過量所致的病理狀態。同樣，也可以使用本發明CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2蛋白的抗體，通過放射性免疫分析、競爭性結合法、Western印跡分析法或酶聯免疫吸附法(ELISA)達到相同的目的。實施例下面結合具體實施例進一步闡明本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例lCMTM8基因的克隆利用CKLF2蛋白質序列(參見國際申請PCT/CH00/00026)對蛋白質資料庫(NCBI的blastp)和人的表達序列標籤(ExpressionSequenceTag,簡稱EST)進行數據檢索和同源性比較，發現一組EST序列(AL528672,AL570224,AL528671,AL543749,BG761693,BE740519,BG761693,BE740519,BG477819,BG340845,BG282018,BG478235,BI459684)，通過ESTAssemblymachine(網址為http:〃爾，tigem.it)進行EST拼接，形成重疊群(contig)再次進行BLAST拼接，找到完整的讀碼框架；根據EST拼接得到的CMTM8全長cDNA序列設計引物(上遊引物ACGATGGAGGAGCCGC，SEQIDNO:5;下遊引物TCACTGTATGGTCCTGGATCTC,SEQIDNO:6)，根據EST來源不同和Unigene分析結果，選擇高表達該基因的單鏈扁桃體cDNA文庫(購自Clontech)，進行PCR擴增(94°C，5分鐘；94°C，20秒，58°C，20秒，72°C，30秒，35循環；72°C，7分鐘)。純化PCR產物(純化結果見圖1A)，克隆至pGEM-TEasy載體中(Promega)，連接產物轉化XL-1Blue菌，用藍白斑篩選陽性克隆。測序質粒用Tip-20Mini-pr印aration試劑盒(Qiagen)進行純化，3100測序儀進行DNA序列分析，證明EST拼接正確。實施例2CMTM8-v2基因的克隆用CMTM8的引物(上遊引物序列為5，〉GAATTCAGATGGAGGAGCC〈3，(SEQIDNO:7)，下遊引物序列為5，〉GGATCCTCACTGTATGGTC〈3，(SEQIDNO:8))擴增血液系統文庫，PCR產物跑1%的瓊脂糖電泳，電泳結果(見圖1B)發現除全長CMTM8(522bp)產物外，還有一條較小的條帶，將這條小帶酶切回收後，與pzeroT載體進行T-A克隆，PCR擴增(仍用CMTM8的引物)鑑定插入目的片段的克隆，經測序驗證的克隆命名為T-zero-CMTM8-v2。DNA測序結果表明，這個較小的條帶為CMTM8剪切掉了第二個外顯子的產物，命名為CMTM8-v2。實施例3CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2表達質粒的構建根據CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2全長cDNA序列設計引物上遊引物5'〉GAATTCAGATGGAGGAGCC〈3'(SEQIDNO:7)EcoRI下遊引物-5，〉GGATCCTCACTGTATGGTC〈3'(SEQIDNO:8)BamHI上下遊引物分別引入了EcoRI和BamHI酶切位點。以實施例1中得到的已克隆有CMTM8的pGEM-TEasy質粒為模板，進行PCR擴增(94°C，5分鐘；94°C，20秒，53°C，20秒，72°C，30秒，35循環；72°C，7分鐘)。純化PCR產物，克隆至pGEM-TEasy載體中(表示為T-easy-CMTM8)，連接產物轉化XL-1Blue菌，用藍白斑篩選陽性克隆。測序質粒用Tip-20Mini-pr印aration試劑盒(Qiagen)進行純化，3100測序儀進行DNA序列分析驗證正確的克隆。用EcoRI限制性內切酶(TaKaRa公司)和BaraHI(TaKaRa公司)限制性內切酶雙酶切T-easy-CMTM8質粒和真核表達質粒pCDNA3.1/Myc-HisB(-)(縮寫為pCDB)(Irivitrogen)，瓊脂糖凝膠回收純化後進行連接反應(16°C，過夜連接)。連接產物轉化大腸桿菌XL-1Blue,PCR篩選正向插入克隆，並測序驗證無誤，表示為pCDB-CMTM8。因為全長CMTM8的上下遊引物已分別引入了EcoRI和BamHI的切點，用EcoRI和BamHI雙酶切實施例2中得到的克隆T-zero-CMTM8-v2，和pcDNA3.1/Myc-HisB(-)質粒，凝膠回收後進行連接反應，所得質粒表示為pCDB-CMTM8-v2。測序質粒用Tip-20Mini-pr印aration試劑盒(Qiagen)進行純化，3100測序儀進行DNA序列分析驗證正確的克隆。轉染細胞所用的空載體質粒pCDB、CMTM8的真核表達質粒pCDB-CMTM8或CMTM8-v2的真核表達質粒pCDB-CMTM8-v2分別用QiagenMaxi純化柱(Qiagen)製備，過程簡述如下。待純化質粒轉化大腸桿菌ToplO後塗至相應抗性的細菌培養皿上，1416小時後挑單細菌菌落於1ml抗性培養基中，37'C搖床(300轉/分鐘)培養8小時，擴大培養體系至lOOml，繼續培養1416小時；6000g離心10分鐘收穫細菌，加入10mlPI(Qiagen)(含O.5mg/mlRNase)，充分重懸後加入10mlP2(Qiagen)，輕柔翻轉34次，液體澄清後加入10ml4t:預冷的P3(Qiagen)，輕柔翻轉34次，冰浴10分鐘後20000g離心15分鐘；用15mlQBT(Qiagen)預先平衡Qiagen純化柱，將離心上清經濾紙過濾後上柱，用30mlQC(Qiagen)洗滌純化柱，重複1次；加入10mlQF(Qiagen)洗脫質粒，重複1次，在質粒洗脫溶液中加入12ml異丙醇，翻轉充分混勻後4'C離心30分鐘；棄上清，加入70%乙醇洗滌，離心15分鐘；棄上清，空氣乾燥10分鐘後加入400ul的超純水，待沉澱完全溶解後移入EP管；紫外分光光度計定量，調整濃度為lug/ul，並進行瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，高速離心除菌並分裝備用。實施例4CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2序列的生物信息學分析利用BLAST程序(http:〃ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)對蛋白質序列資料庫進行序列比對，結果發現在CMTM8序列的第36168位胺基酸之間有一個MARVEL結構域，這提示CMTM8可能參與膜蛋白的分選和轉運。MARVEL結構域是一與膜相關的結構域，可能與膜蛋白的附著(apposition)事件有關，例如轉運泡的生物合成，神經遞質的分泌和極化細胞膜蛋白的轉運等。Physins,Gyrins，Occludin，MAL和CKLFSF家族的成員都具有這-一結構域。另外，有些複雜的疾病如Bardet-Biedl綜合症，精神分裂症(schizophrenia)和腦膜炎球菌病(meningococcaldiseases)都與MARVEL結構域分子有關。在CMTM8的胞內Loop區有一個參與內化的共同基序YXX①(①代表一個大的疏水性的殘基)。YXX①基序可與接頭分子AP2的P2亞單位結合。AP2是膜蛋白通過網格蛋白(clathrin)內化的關鍵分子。CMTM8-v2是CMTM8的可變剪切體，由於缺少第二外顯子所以使編碼的蛋白缺少MARVEL結構域和胞槳的YXXO基序。SAGE資料庫分析，CMTM8在肺癌組織、肝癌組織、卵巢癌組織、皮膚癌組織的表達較其相對應的正常組織的表達降低。實施例5凋亡形態的觀察和磷脂醯絲氨酸(PS)外翻的檢測將HeLa(宮頸癌細胞系，ATCCCCL2)和PC3細胞(前列腺癌細胞系，ATCCCRL-1435)培養於含10呢熱滅活的胎牛血清(FBS)(Hyclone,USA)、100U/ml青黴素、100g/ral鏈黴素、2mML-穀氨酸的RPMI1640培養基(LifeTechnologies,USA)中。用實施例3製備的CMTM8或CMTM8-v2表達質粒或對照質粒(空載體)分別轉染HeLa細胞和PC3細胞，以約3000個經轉染的細胞鋪96孔板。轉染後60小時，用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染細胞核，通過螢光顯微鏡觀察細胞並拍照。細胞凋亡的典型生物化學的標誌是PS從質膜的胞漿側轉位到細胞的外表面，螢光標記的AnnexinV能特異識別暴露在凋亡細胞表面的PS，從而可以用流式細胞計數儀很方便地進行檢測。用2X15個轉染後的細胞鋪24孔板，分別在約轉染後40小時和60小時後收穫細胞，用PBS(磷酸緩衝鹽溶液)洗兩次，將細胞垂懸在200ix1AnnexinV專用的緩衝液(10mMHEPES、pH7.4、140mMNaCl、1mMMgCl2、5mMKC1、2.5mMCaCl》中，然後加入異硫氰酸螢光素(FITC)偶聯的AnnexinV，使其終濃度達到0.5tig/ml。於室溫避光孵育20分鐘後，加入碘化丙啶(propidineiodide,PI)，使其終濃度為lug/ral，立即用流式細胞計數儀對細胞進行分析。收集的細胞數為1X104，凋亡的細胞數用百分比表示。結果如圖2A圖2D所示，與對照細胞相比，CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2轉染的細胞呈現典型的凋亡形態變化變圓、皺縮、出泡等。MPI染色顯示，CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2轉染的細胞染色體凝集並斷裂(圖2A、2C)，Annexin-V陽性染色的比率也明顯增加(圖2B、2D)。實施例6CMTM8或其可變剪切體CMTM8i2轉染細胞中胱冬酶的活化和細胞色素c的釋放經典的細胞凋亡途徑為胱冬酶依賴的細胞凋亡，所以用Western印跡方法檢測了胱冬酶-3和胱冬酶-9的酶原切割情況以及胱冬酶3底物PARP的酶切。另外細胞色素c在凋亡的過程中起十分重要的作用，是胱冬酶3活化的關鍵分子，所以本發明也檢測了細胞色素c從線粒體釋放到胞漿中的情況。分別收穫CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2轉染60小時後的細胞，用PBS洗細胞三次，用裂解液(50mMTris-HCL(pH7.4)、150mMNaCl、l%NonidetP-40、0.25%脫氧膽酸鈉、lmMEDTA(乙二胺四乙酸)、2mM歸04、1mMNaF和ProteaseInhibitorCocktailTablets(Roche))在4。C裂解細胞30min。細胞裂解液於18000Xg離心20min，上清液即為所需總蛋白的裂解液。以牛血清白蛋白作為標準品，用BCA蛋白測定試劑盒(Pierce，美國)定量總蛋白的濃度。總蛋白上樣量30"g，用8%SDS-PAGE膠分離，並用溼式法將蛋白轉到尼龍膜(HybondTM，ECLTM，AmershamPharmacia,英國)上。己轉有蛋白條帶的尼龍膜用5%BSA(牛血清白蛋白)(用含0.05%Tween-20的TBS-T配製)於室溫封閉1小時，用TBS-T於室溫洗膜兩遍，加入用TBS-T配製的一抗(抗胱冬酶-3、胱冬酶-9和PARP的單克隆抗體均購自美國的信號轉導實驗室)，於4。C過夜孵育，次日用TBS-T洗膜三次，10min/次，加入AlexaFluor780標記的工gG二抗(LI-CORBIOSCIENCEINC)，室溫孵育1.5小時。用TBS-T洗膜三次之後用LI-CORInfraredImagingSystem(Odyssey,Lincoln,NE)掃描成像。細胞色素c的提取方法如下收集細胞，用PBS洗兩次，垂懸細胞於0.2ml裂解液(20mMH印es-K0H(pH7.5)、lOmMKCl、1.5mMMgCl2、1mMEDTA-Na2、ImMEGTA-Na2、IraMDTT、0.ImMPMSF、250raM蔗糖)中，細胞懸液用勻漿器(DounceHomogenizer)輕輕地研磨約45次左右，細胞勻漿在4。C於2000rpm離心15分鐘，離心後所得上清再在4。C於12000rpm離心30分鐘，隨後離心所得上清液即為胞漿成分，進行蛋白定量後用Western印跡檢測細胞色素c。用間接免疫螢光法觀察細胞色素c從線粒體的釋放。將用CMTM8表達質粒或對照質粒轉染的HeLa細胞以1X103細胞/100u1鋪到共聚焦專用的小皿MatTekCultureware(MatTekCorporation,美國)中，於37。C孵育約46小時後，補加1ml新鮮的完全培養基。轉染後60小時，細胞用PBS洗兩次，用3%多聚甲醛於室溫固定30分鐘。用含0.1%tritonX-100的3%的多聚甲醛於室溫通透30分鐘，以PBS洗三次之後，用2%BSA於室溫封閉30分鐘。封閉後的細胞與用封閉液配製的抗細胞色素c的單抗(美國信號轉導實驗室)孵育30分鐘1小時，於室溫用PBS洗三次後，加入若丹明偶聯的羊抗鼠二抗(Sigma，St.Louis，M0)，在室溫放置30分鐘。最後在用PBS洗細胞之後，用75%甘油封片，或用DAPI於室溫染色10分鐘。用TCS-SP雷射掃描共聚焦顯微鏡(LeicaMicrosystems,Mannheim,德國)觀察結果。實驗結果表明，在CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2瞬時轉染的HeLa細胞中，胱冬酶原-3和胱冬酶原_9明顯降低(圖3)，可檢測到了胱冬酶3底物PARP的酶切片段(24kDa)，但在對照細胞組中幾乎沒有明顯的PARP的切割條帶(圖3)，這進一步證實了胱冬酶3的活化。CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的瞬時轉染也導致了大量的細胞色素c從線粒體釋放到胞漿中(圖3)。實施例7腺病毒介導的CMTM8在腫瘤細胞中的表達可以誘導腫瘤細胞的凋亡用HeLa細胞鋪96孔板，每孔3000個細胞，於37。C、5%0)2孵箱培養約24小時，用空載體腺病毒對照(Ad5-null)和CMTM8腺病毒(Ad5-CMTM8)都由本元正陽公司按照標準方法進行重組、包裝、純化獲得。TCID50亦由該公司按照標準方法測定。用Ad5-null和Ad5-CMTM8感染所培養的HeLa細胞，MOI為500。在病毒感染後24小時、48小時、72小時和96小時，用螢光顯微鏡觀察細胞的形態變化。如圖4所示，在感染後24小時，與空載體腺病毒相比，CMTM8腺病毒感染組的細胞有30%開始變圓，隨著時間的延長，CMTM8腺病毒感染組細胞出現明顯的凋亡形態變化變圓、皺縮、出泡等。實施例8Bad第112位絲氨酸磷酸化程度的降低可能是CMTM8超表達引起細胞凋亡的原因將服K293細胞(人胚胎腎細胞系，ATCCCRL1573)培養於含1(F。熱滅活的胎牛血清(FBS)(Hyclone，美國)、100U/ml青黴素、100g/ml鏈黴素、2mML-穀氨酸的RPMI1640培養基(LifeTechnologies,美國)中。Bad是一個只含BH3結構域的蛋白質，能與拮抗凋亡的蛋白質Bc卜xL結合，因此幹擾Bcl-xL的活性。Bad的活性可通過磷酸化的過程進行調節。表皮生長因子(EGF)可以刺激Bad的第112位胺基酸磷酸化，從而導致Bad在胞漿內的聚集，這是因為胞漿內的14-3-3蛋白質可與磷酸化的Bad結合。為了研究CMTM8超表達引起細胞凋亡的原因，觀察了CMTM8超表達對Bad磷酸化的影響。首先合成了針對CMTM8的siRNA(siCMTM8，有義鏈的序列為CCGUCUUCUUCCUCAUUAU，SEQIDNO:9)和作為對照的非沉默siRNA(腿-silencingsiRNA，有義鏈的序列為UUCUCCGAACGUGUCACGU，SEQIDNO:10)(上海基凱公司)。SiRNAs合成後去RNase處理並純化。非沉默siRNA經BLAST程序搜索NCBI資料庫(vww.ncbi.nlm.nih.gov)進行序列相似性分析結果表明與全人類基因組無匹配。用緩衝液(20mMKCl，6mM服PES(pH7.5)和0.2mMMgCl2)溶解siRNAs凍乾粉使其終濃度都達到20uM。siRNAs用電轉的方法轉染進細胞。電轉過程如下，將細胞的密度調整到1x107350iU，將加有siRNAs的細胞懸液移入電轉杯，以單脈衝120V，20ms電轉，電轉後的細胞靜置室溫約lOmin，隨後將細胞轉移到預溫的完全培養基中於37r培養。應用RT-PCR的方法檢測siCMTM8對內源性CMTM8的抑制效果。首先，用TRIZ0L試劑提取細胞總固A。具體方法如下收穫對數生長期的細胞，在35mm培養皿中加入lmlTRIZ0L「M試劑，反覆吹打破碎細胞，並將其轉移到1.5ml無RNA酶的離心管中，於室溫靜置5分鐘，加入0.2ml氯仿，猛烈振蕩15秒，在4。C於不大於12000g離心15分鐘，收集上層水相，加入500"1異丙醇來沉澱RNA，用70%乙醇洗一遍，於室溫乾燥後，將沉澱得到的RNA復懸於DEPC(焦碳酸二乙酯)處理的H20中，通過分光光度計定量後將所得RNA溶液用於逆轉錄。其次，通過逆轉錄合成單鏈cDNA，並進行PCR擴增，具體方法如下利用Invitrogen公司的S叩erScriptII試劑盒，用2pg總RNA合成單鏈cDNA。PCR反應所用引物序列如表1所示，反應條件如表2所示，GAPDH作為系統內參(對照)。表1PCR反應所,目的引物序列tableseeoriginaldocumentpage17表2PCR反應條件tableseeoriginaldocumentpage17最後，對PCR產物進行鑑定。以CMTM8和GAPDH的PCR產物分別跑2%和1%的瓊脂糖凝膠電泳，以EB染色後用凝膠成像系統成像。從圖5A可以看出，siCMTM8明顯降低了內源性CMTM8mRNA的水平。為了檢測CMTM8表達量的變化對Bad第112位絲氨酸磷酸化的影響，用對照質粒、CMTM8表達質粒、非沉默siRNA或siCMTM8轉染HeLa細胞，在轉染後60小時收穫細胞，用Western印跡方法檢測Bad-pSu2的磷酸化水平，具體實驗方法與實施例6中所述的Western印跡方法基本相同。如圖5B所示，與對照細胞相比，在CMTM8瞬時轉染的細胞中，Bad第112位絲氨酸磷酸化的程度顯著下降；然而，siCMTM8下調內源性CMTM8的表達對Bad的磷酸化沒有顯著影響，推斷細胞內還存在其它的調節通路可以補償CMTM8下調引起的Bad磷酸化的變化。隨後，本發明合成了針對Bad的siRNA(siBad，有義鏈的序列為AAGMGGGACUUCCUCGCCCG,SEQIDNO:15)，siRNA的合成和處理見實施例8。並用Western印跡的方法觀察了siBad對內源性Bad的下調作用。如圖5C所示，siBad能有效降低內源性Bad的表達水平。接著觀察了siBad對CMTM8轉染誘導凋亡的作用，質粒和siRNA的轉染如實施例8，其中通過檢測轉染細胞PS外翻的情況來判斷細胞的凋亡程度。如圖5D所示。與對照細胞相比，siBad的轉染能顯著降低CMTM8瞬時轉染引起的凋亡細胞的比率。實施例9CMTM8在肝癌組織中的表達量顯著低於正常肝組織本發明利用組織晶片的原位雜交實驗證明了CMTM8在肝癌組織的低表達。原位雜交的具體實驗方法如下(1)探針的製備。首先製備用於體外轉錄的模板。以實施例2中製備的pCDB-CMTM8質粒為模板，用引物(上遊引物5'-TgCTggAACTgAgTACTTCCg-3'，(SEQIDNO:11);下遊引物5'-AgAgAggTACAAgACgAAggC-3'，(SEQIDNO:12))擴增得到長為184個鹼基對的DNA片段，將此片段連接在pGEM-TEasy載體中(Promega)上，表示為184-T-easy,並將其轉化到處於感受狀態的XL-1Blue菌，次日挑取克隆並培養於約lmlLB培養基(內含IOO)^g/ml的青黴素)中。於37。C空氣搖床培養約8小時10小時，用T-easy克隆載體的上遊引物T7和目的片段的下遊引物進行PCR鑑定正向插入的克隆，選一陽性克隆進行測序驗證。用Takara公司的限制性內切酶SalI和NcoI於37。C過夜酶切測序正確的質粒，酶切體系(50lil)如下質粒約10ug;內切酶(SalI或NcoI):lul2^1;10X緩衝液(H或K):5"1;10XBSA:5";H20:xul(補充到50ul)。次日，用1%的瓊脂糖電泳酶切產物，切膠回收目的條帶，目的條帶的回收採用玻璃奶(siliC0)進行，具體回收步驟如下①切取含目的條帶的凝膠，加入3倍於凝膠體積的6M的Nal(將0.75g的NaS(V溶解於40ml水中，加入Nal45g至完全溶解，過濾除菌保存)和5iil玻璃奶(lul可吸附約0.5ixg的DNA);②於55。C放置至凝膠完全溶化，溶化過程中需顛倒混勻含凝膠的EP管。以S000rpm離心1分鐘；③棄掉上清液，用500ii1DNA洗滌緩衝液(20mMTris(pH7.4)、lmMEDTA、100mMNaCl，加入等體積的無水乙醇)洗3次，最後將玻璃奶置於55i:至完全乾燥成粉末狀，加入50ul水於55。C溶解約1030分鐘；以1200015000rpm高速離心約10分鐘，將上清液收集於一乾淨的離心管中，向玻璃奶沉澱再加入約50y1水並於55。C溶解約1030分鐘，以④的條件再進行高速離心，將得到的上清液與第一次收集的上清液合併；⑤混勻收集得到的上清液，取l"1跑1%的瓊脂糖電泳，觀察目的片段的回收量和純度。將通過玻璃奶回收得到的目的片段用QIAquickNucleotideRemovalKit(QIAGEN)去Rnase(RNA酶)處理，整個實驗過程中謹防RNase的汙染。具體步驟如下①力口5倍體積的PN緩衝液(500ul)到100ul的樣品中，混勻；②將兩個試劑盒提供的回收柱置於兩個收集管中；③將樣品加到回收柱中，以6000rpm離心l分鐘；④棄去穿過液，將回收柱放於同一收集管中，加750"1的PE緩衝液，以6000卬m離心l分鐘；⑤棄去穿過液，將回收柱再放於同一收集管中，以不低於13000rpm離心l分鐘；將回收柱放於一乾淨的EP管中；⑦加約15"1的DEPC水於回收柱中，於室溫放置1分鐘，以不低於13000rpm離心1分鐘。將得到的無RNase的目的片段用分光光度計定量，並取1P1通過跑1%的瓊脂糖電泳來估計目的片段的含量。體外轉錄。本發明採用DIGRNALabelingKit(SP6/T7)(Roche公司，貨號No.11175025910)迸行體外轉錄標記腦A探針。轉錄體系(10u1)如下模板(無RNase的目的片段)0.5ullug;NTP標記混合物lul;轉錄緩衝液1"1;RNase抑制齊廿0.5Pl;T7/SP6聚合酶lul;H20:XUl(補充到10ul)。反應條件37°C，3小時4小時。理論上，lPg的DNA模板可以轉錄出10ug的RNA探針。反應完畢後，向反應體系中加入15ul甲醯胺，分裝後保存於-2(TC冰箱中。注意避免反覆凍融以防探針量損失。(2)探針的檢測。1)RNA電泳。取1"1標記好的RNA探針用1%的瓊脂糖電泳約10分鐘(200V)，通過EB染色觀察探針的質量。由於RNA二級結構的存在，很難得到單-的探針條帶，可煮沸5分鐘後電泳即可。2)尼龍膜檢測。尼龍膜法可以對標記好的探針進行相對準確的定量。首先要將探針點到尼龍膜上，點樣的具體方法是將試劑盒所帶的標準品RNA及本實施例中所標記的探針稀釋成一定量，例如，首先按l:IO稀釋，之後按l:3進行梯度稀釋，稀釋7個梯度，每個稀釋度取lul按一定的順序點在尼龍膜上。一般將標準品點在第一行，本實施例所標記的探針點在第二行和第三行。待點好的樣品完全乾透後，將膜放入8(TC的烤箱中交聯2小時3小時。接著對膜上的探針進行檢測，檢測的具體步驟如下①將交聯好的膜放入洗滌緩衝液(1乂馬來酸緩衝液+0.3%Tween-20，1X馬來酸緩衝液的配方是0.1M的馬來酸、0.15M的氯化鈉、用NaOH調pH至7.5)中於室溫洗2分鐘；②將膜放入封閉液(Blockingbuffer)(以馬來酸緩衝液為溶劑，溶解1%的封閉粉，封閉粉購自Roche公司)中於室溫封閉30分鐘；③用封閉液配製anti-DIG抗體(Roche)，anti-DIG抗體與封閉液的比例為1:2500，將膜與配製好的抗體於室溫孵育30分鐘至3小時；用洗滌緩衝液室溫洗膜兩次，每次15分鐘；⑤將膜放入檢測緩衝液(O.1MTris-HC1、0.1MNaCl、用Na0H調pH值至9.5)中浸泡2分鐘；⑥用檢測緩衝液配製NBT/BCIP顯色工作液(1ml檢測緩衝液、3.3mlBCIP和6.6mlNBT)，將膜放入該工作液中於室溫顯色；⑦觀察結果。根據樣品和標準品的點的顏色的深淺，找到相對接近的點，根據樣品的稀釋度估計探針的濃度。一般在雜交前，用雜交液將探針濃度稀釋至2ng/n15ng/u1。(3)原位雜交。將從陝西超英生物科技有限公司買的肝癌組織的晶片(編號CC03-02)6(TC烤過夜，接下來進行一系列下列的步驟①脫蠟二甲苯I，37°C，30分鐘；然後二甲苯II，室溫，30分鐘；然後二甲苯ni，室溫，30分鐘。②水化梯度酒精100%乙醇1，室溫浸泡，5分鐘；然後100%乙醇11，室溫浸泡，5分鐘；然後95%乙醇，室溫浸泡，5分鐘；然後70%乙醇，室溫浸泡，5分鐘；然後50%乙醇，室溫浸泡，5分鐘；然後lxraS，室溫浸泡，5分鐘。③變性0.2MHC1，室溫浸泡，20分鐘；然後1XPBS，室溫浸泡，3分鐘，兩次。蛋白酶K處理蛋白酶K(PK)處理，用PBS稀釋使其終濃度為100ug/ml，37°C，20分鐘，用1XPBS室溫浸泡兩次，每次2分鐘。⑤後固定用新鮮配製的4%的多聚甲醛室溫固定5分鐘；然後1XPBS，室溫浸泡，3分鐘；然後1XPBS，室溫浸泡，3分鐘；然後1XPBS，室溫浸泡，2分鐘。⑥脫水70%乙醇，室溫浸泡，3分鐘；然後95%乙醇，室溫浸泡，3分鐘；然後100%乙醇I，室溫浸泡，5分鐘；然後100%乙醇11，室溫浸泡，5分鐘。晶片室溫乾燥l小時以上。同時將雜交液預熱至5(TC。⑦預雜交將預熱的雜交液滴到組織晶片上，4CTC孵箱中預雜交約12小時。⑧探針處理將水煮沸，關掉火，探針放入沸水中變性約10分鐘，取出後馬上置於冰上，待探針冷卻後將探針用1X雜交液稀釋到應有濃度。⑨雜交:將稀釋好的探針(正義鏈探針(sense)作為對照組，反義探針(Anti-sense)為實驗組)滴到預雜交完的組織晶片上，38'C過夜雜交約16小時。⑩雜交後處理含50%甲醯胺的4SSC(用20X的SSC稀釋而來，20XSSC的配方是3MNaCl,0.3MNaAc，用NaOH調pH值至7.0)，37°C，30分鐘；然後2XSSC，37°C，15分鐘；然後2XSSC，37°C，15分鐘；然後0.1XSSC，37°C，15分鐘；然後1XPBS，室溫浸泡，5分鐘；然後RNase(40ug/mlRNaseA，10mMTris-HC1(pH7.5)，5mMEDTA，0.3mMNaCl)滴片消化，37°C，15分鐘；然後O.1XSSC，37°C，IO分鐘；然後1XPBS，室溫，5分鐘；然後洗滌緩衝液(見上)，室溫浸泡，2分鐘；然後1X封閉緩衝液(見上)，室溫滴片，30分鐘；然後鹼磷酶(AP)標記的抗DIG抗體(1:250)，滴片，37°C，1小時，吸去抗體；然後洗滌緩衝液，室溫浸泡，15分鐘；然後洗滌緩衝液，室溫浸泡，15分鐘；然後檢測緩衝液，室溫滴片，2分鐘；然後NBT/BCIP滴片，室溫避光顯色，顯微鏡下隨時觀察顯色效果，以便及時終止反應。顯色完畢後用自來水衝洗終止反應，用明膠甘油封片。(4)結果觀察。將可疑陽性病人(±)歸為陰性進行X2檢驗。如表3所示，在對照組，X2=0.73，這說明CMTM8在正常肝組織和肝癌組織中的表達無差異；而在實驗組，X2=8.40，表明CMTM8在正常肝組織和肝癌組織中的表達具有顯著差異。CMTM8在肝癌組織中的低表達進一步證實了CMTM8的腫瘤抑制作用。tableseeoriginaldocumentpage20進行免疫前，將四條KLH偶聯的肽段用5ml雙蒸水稀釋成濃度為lmg/ml，分裝，-7(TC保存備用。本發明利用混合免疫的方法製備多抗，免疫的具體過程如下①選擇雄性兔子兩隻；②四條肽各100yg混合，共400ug，將這400yg混合肽與弗氏完全佐劑以1:1的比例混勻，多點注射兔子的足躕部和背部皮下；③兩周後加強免疫，四條肽各100"g混合，共40(^g，將這400ug混合肽與弗氏不完全佐劑以1:1混勻，僅背部皮下多點注射。1014天後可以試血，用ELISA檢測抗體效價。要是抗體效價不夠高的話，兩周後可以再次加強免疫，具體方法同第一次加強免疫。本發明採用直接ELISA的方法檢測抗體的效價，具體方法如下(1)抗原包被①四條裸肽用雙蒸水分別稀釋至10mg/ml，分裝凍存備用；②混合四條裸肽，用包被液(Na2C031.59g，NaHC032.93g，加雙蒸水至1000ml，pH9.6)將混合裸肽稀釋至lug/ml;③每孔薩1(相當於每孔100ng)，37'C包被4個小時；用PBS-T(0.5%。Tween-20)洗包被好的酶標板三次；⑤1%BSA37。C封閉4小時，拍幹，-20。C備用。(2)檢測①用抗體稀釋液(PBS-T+0.3y。BSA)將抗血清按照不同的滴度稀釋(如102，10:!，104，105，106……)，每孔100ul，37"反應2小時；②PBS-T洗三遍；③加50ul/孔服P偶聯的抗兔二抗(抗體稀釋液，1:5000)，37°C反應l小時；④PBS-T洗三遍；⑤每孔50u1顯色液(5ml顯色緩衝液，lulH202，0.5ugOPD粉末)顯色。顯色緩衝液的配方是Na2HP04.12H20，1.84g;檸檬酸，0.51g;加雙蒸水至100ml;⑥用酶標儀490nm讀數。本發明也用Western印跡的方法檢測了CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2兔多抗對內源性CMTM8的識別情況。Western印跡的具體實施方法與實施例6基本相同。ELISA檢測結果顯示，CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2多肽免疫產生的多抗效價都達到了1X106以上。如圖6所示，第二隻兔的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2兔多抗(用表4所示肽段14混合免疫)能識別內源性的CMTM8蛋白，進一步，將第二隻兔的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2兔多抗血清，經實施例10所示4條肽段各2mg偶聯溴化氰活化的S印horose4B的親和層析柱純化後用於Western印跡檢測和免疫組織化學分析。實施例11CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2對細胞增殖的影響用MTT法檢測細胞的增殖情況，將質粒pCDB、pCDB-CMTM8或pCDB-CMTM8-v2轉染HEK293,PC3細胞，轉染後24小時，用含有20ng/mlEGF的培養液將胰酶消化下來的細胞濃度調整到2x103細胞/100iU，鋪96孔板，每組三個復孔，每孔加細胞懸液100ul。每天觀察細胞的生長狀況。對於MTT測定，每孔加IOn1MTT(5ug/u1PBS)，在含有5%032的37。C孵箱中孵育，46小時後用細胞裂解液(20%SDS,50%DMS0，pH4.7)過夜裂解細胞，用EL-311SXELISAReader測定在570nm波長下的吸光度值。為了觀察CMTM8、CMTM8-v2對細胞增殖的長期抑制效果，我們用質粒pCDB、pCDB-CMTM8或pCDB-CMTM8-v2轉染HEK293細胞進行了克隆形成實驗，轉染48小時後的細胞用胰酶消化，並用完全培養基垂懸，每100-mm的平皿鋪約1000個細胞，在所鋪的100-mm的平皿中加入20ng/mlEGF和600800mg/ml的G418，細胞放入37°C的C02孵箱培養，每兩天更換新鮮培養液，同時添加EGF和G418。培養三周後的細胞克隆用5%的多聚甲醛固定，並用結晶紫染色，計數細胞數多於50個的克隆。MTT法檢測結果顯示，在35天的時間內，pCDB-CMTM8或pCDB-CMTM8-v2轉染的細胞生長速度明顯慢於空載體對照pCDB轉染的細胞(圖7中圖片A和B)。CMTM8、CMTM8-v2對細胞的生長起負調節作用，CMTM8-v2更明顯。克隆形成實驗結果顯示，如圖7中圖片C所示，在pCDB-CMTM8或pCDB-CMTM8-v2轉染組的細胞克隆數明顯少於pCDB轉染組。此結果進一步驗證了CMTM8、CMTM8-v2對細胞增殖的負調節作用，而且CMTM8-v2更明顯。實施例12CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2對EGF刺激產生信號的影響Ras/MAPK通路是EGFR信號向細胞內轉導的重要途徑，調節著細胞凋亡、生長以及一些重要基因的表達。為了檢測了CMTM8、CMTM8-v2對EGFR通路的影響，用對照質粒、CMTM8表達質粒、CMTM8-v2表達質粒轉染HeLa細胞，轉染24小時後的細胞撤血清20小時，用10ng/mlEGF刺激，在刺激的不同時間檢測pERK。刺激後的細胞吸去含EGF的培養液，並用冷的PBS洗細胞三次，用裂解液(50mMTris-HCL,pH7.4,150mMNaCl，1%NonidetP-40，0.25%脫氧膽酸鈉，1mMEDTA，2mMNa3V04，1mMNaFandProteaseInhibitorCocktailTablets)4。C裂解細胞30分鐘。收穫細胞，細胞裂解液18000xg，20分鐘離心，上清即為所需總蛋白的裂解液，以牛血清白蛋白作為標準品，用BCA蛋白測定試劑盒(Pierce,USA)定量總蛋白的濃度。總蛋白上樣量30ug，用8%SDS-PAGE膠分離，並用溼式法將蛋白轉到尼龍膜(HybondTM，ECLTM，AmershamPharmacia,UK)上。已轉有蛋白條帶的尼龍膜用5%BSA(用含0.05%Tween-20的TBS-T配製)室溫封閉1小時，用TBS-T室溫洗膜兩遍，加入用TBS-T配製的一抗，4'C過夜孵育，次日用TBS-T洗膜三次，10分鐘/次，加入AlexaFluor780標記的IgG二抗，室溫孵育1.5小時。用TBS-T洗膜三次之後用LI-CORInfraredImagingSystem(Odyssey,Lincoln,NE)掃描成像。Westernblot結果顯示用EGF刺激pCDB、pCDB-CMTM8-v2或pCDB-CMTM8轉染的HeLa細胞，與pCDB轉染組相比，pCDB-CMTM8和pCDB-CMTM8_v2轉染的細胞，EGF刺激後的ERK1/2磷酸化程度較低，CMTM8-v2更明顯(圖8)。結果表明，CMTM8-v2的表達對EGFR介導的信號具有更強的負向調節作用。實施例13抗體檢測CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的表達本發明用Western印跡的方法檢測了CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2兔多抗對哺乳動物細胞超表達CMTM8蛋白的識別情況。用實施例3製備的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2表達質粒或對照質粒(空載體)分別轉染HeLa細胞細胞，轉染後48小時，用Westernblot的方法檢測了CMTM8兔多抗對哺乳動物超標達CMTM8及細胞內源性表達CMTM8的識別情況。Western印跡的具體實施方法與實施例6基本相同。免疫組織化學檢測脫蠟組織晶片置於二甲苯中浸泡20分鐘，換新鮮二甲苯重複一次；再水化將脫臘後的組織切片於10(F。乙醇中浸泡5分鐘x2次，95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸餾水各浸泡3分鐘xl次；抗原修復抗原修復液為檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液，將抗原修復液微波高火加熱至沸騰，將切片放入，再用微波高火加熱5分鐘，補加蒸餾水恢復體積後再用微波高火加熱5分鐘，自然冷卻至室溫；去除內源性過氧化物酶新鮮配置3%HA，滴片，室溫下避光孵育10分鐘；PBS洗5分鐘x3次，不時晃動；封閉用1(F。正常羊血清PBS封閉液室溫封閉20分鐘；一抗反應滴片，加1:100的CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2兔多抗(以封閉液稀釋)，4。C過夜反應，以同樣稀釋度的正常兔IgG作為陰性對照；PBS洗5分鐘x3次，不時晃動；二抗反應HRP-抗兔IgG抗體1:1000PBS稀釋，37。C反應30分鐘；PBS洗5分鐘x3次，不時晃動；DAB顯色，滴片，鏡下觀察反應結果，蘇木精復染細胞核後，中性樹膠封片，於顯微鏡下觀察並記錄結果。Westernblot結果顯示，如圖9A和圖9B所示，anti-CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2兔多抗檢測到pCDB-CMTM8轉染組、pCDB-CMTM8-myc轉染組在細胞培養上清出現的條帶。anti-myc抗體檢測到pCDB-CMTM8-myc轉染組在細胞培養上清出現的條帶。免疫組織化學檢測結果如圖10A和圖10B顯示可以觀察到，CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2在前列腺增生中有陽性表達，CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2主要在前列腺增生腺體的細胞漿中表達。序歹U表北京大學〈120〉新的腫瘤抑制基因或蛋白及其應用GBI07CN0474-C〈160〉15Patentlnversion3.1<210〉1〈211〉1185CDS(295)..(813)cgctcgctctcctcttcctc60ctaggggcaccgcgcactag120cccctcgcacctcctgcccc180ggcgcagggccgcgcgtcca240gcagtggctcgacgatg297Met1gagccgcagcgcgcccgctegC3Cgtc3CC3CC3CCgccage345GluGluProGin5ArgAlaArgSerHis10ThrValThrThrThr15AlaSertecttcgcagagaacttctec3CCageageageagettcgcctacgac393SerPheAla20GluAsnPheSerThr25SerSerSerSerPhe30AlaTyrAspegggagttcetccgcaccctgcccggcUcetcategtggccgagate441ArgGlu35PheLeuArgThrLeu40ProGlyPheLeulie45ValAlaGluliegttctggggctgctggtatggacgcttattgetggaactgagtacUc489ValLeuGlyLeuLeuValTrpThrLeulieAlaGlyThrGluTyrPhe50556065egggtccccgCEltttggctgggtcatgtttgtagetgtattttactgg537ArgValProAlaPhe70GlyTrpValMetPhe75ValAlaValPheTyr80TrpgtcetcaccgtcUcttcetcattatetacataatg3CCtac3CC585ValLeuThrVal85PhePheLeulielie90TyrlieThrMetThr95TyrThraggattccccaggtgccctgggtgggcctgtgctttascggc633ArgliePro100GinValProTrpThr105ThrValGlyLeuCys110PheAsnGlyagtgccttcgtcttgtacetctctgccgetgttgtagsttcttec681SerAla115PheValLeuTyrLeu120SerAlaAlaValVal125AspAlaSerSergtcteccctgag'agggacagtC3Cttctgggcggcctea729ValSerProGluArgAspSerHisAsnPheAsnSerTrpAlaAlaSer130135140145〈400〉1ggcctccacctagggccccaagggacacccgcgcgggccggccccagaccgccttccccggcgcagctcggccgcgcctgcgctcccctccgccggggtcgctgcccggcggagcccgcggacagcccccccccgcgcctcctggggacgagcctcccctcaccgaggcgggcgggcgccgtgtccccagcgccagcccgtcgttctttgccttcctggtcaccatetgctacSerPhePheAlaPheLeuValThrlieCysTyr150155ttcagttttatagcatggagatecaggaccataPheSerPhelieAlaTrpArgSerArgThrlie165170ttttgataattaaaaggaaaaaaaa已ggasgactctcactaatgt已tattccc已gagaattgtattta已ctaattaatgtctcacaaattgtggtttgttac已已ttaaactggatacttaataatgaactcttaagtatcttattaatgtattaatgtctg已caatgtttaaatagat已aattgetaatattgagaatgtttttaagatgccagattcttttttgattaaatgttgcaaa犯getgga犯tacatatAlaGlyAsnThrTyr160cagtgatttaccaGingtaaaaacagtttttatatttttgcaaagttcatagatcagtcaagtttgatcccaaaaactgtaggt已tcttaaatttggttgtagctttattttctta77782388394310031063112311831185〈210〉2PRT〈213〉智人〈400〉2MetGluGluProGinArgAlaArg15SerSerPheAla20GluAsnPheSerAspArgGlu35PheLeuArgThrleu40lieValLeuGlyLeuLeuValTrp5055PheArgValProAlaPheGlyTrp6570TrpValLeuThrVal85PhePheLeuThrArgliePro100GinValProTrpGlySerAla115PheValLeuTyrLeu120SerVal130SerProGluArgAsp135SerSerSerPhePheAlaPheLeuVal145150TyrPheSerPhelieAlaTrpArg165SerHisThrValThrThrThrAla1015ThrSerSerSerSerPheAlaTyr2530ProGlyPheLeulieValAlaGlu45ThrLeulieAlaGlyThrGluTyr60ValMetPheValAlaValPheTyr7580lielieTyrlieThrMetThrTyr9095ThrThrValGlyLeuCysPheAsn105110SerAlaAlaValValAspAlaSer125HisAsnPheAsnSerTrpAlaAla140ThrlieCysTyrAlaGlyAsnThr155160SerArgThrlieGin170〈210〉3<211〉348DNA<213〉智人(1)..(348)〈400〉3atggaggagccgcagcgcgcccgctcgcacacagtcaccaccaccgcc48MetGluGluProGinArgAlaArgSerHisThrValThrThrThrAla151015agetecttcgcagagaacSerSerPheAlaGluAsn20egggagttcetccgcAspArgGluPheLeuArg35ateggcctgtgctttaaclieGlyLeuCysPheAsn50getgttgtElgatgcatctAlaValValAspAlaSer6570ttc朋cagetgggcggccPheAsnSerTrpAlaAla85tgctacgetggaCysTyrAlaGlyAsnThr1008CCatacagtgaThrlieGin115〈210〉4:L15〈212〉PRT<213〉智人〈400〉4MetGluGluProGinArg15SerSerPheAlaGluAsn20AspArgGluPheLeuArg35lieGlyLeuCysPheAsn50AlaValValAspAlaSer6570PheAsnSerTrpAhAla85CysTyrAlaGlyAsnThr100ThrlieGin115516DNA人工序列〈223〉引物<400〉5acgatggaggageegettctecaccagePheSerThrSer25accctgcccggcThrLeuProGly40ggcagtgccttcGlySerAlaPhe55tecgtcteccctSerValSerProteategttctttSerSerPhePhe90tatttcagttttTyrPheSerPhe105ageageagettcSerSerSerPhe30ttcetcategtgPheLeulieVal45gtcttgtacetcValLeuTyrLeu60gagagggacagtGluArgAspSer75gccttcctggtcAlaPheLeuValatagcatggagalieAlaTrpArg110gcctac96AlaTyrgccgag144AlaGlutctgcc192SerAlacacaac240HisAsn80accate288Thrlie95tecagg336SerArg348AlaArgSerHisThr10PheSerThrSerSer25ThrLeuProGlyPhe40GlySerAlaPheVal55SerValSerProGlu75SerSerPhePheAla90TyrPheSerPhelie105ValThrThrThrAla15SerSerPheAlaTyr30LeulieValAlaGlu45LeuTyrLeuSerAla60ArgAspSerHisAsn80PheLeuValThrlie95AlaTrpArgSerArg110166〈211>22〈212〉■〈213〉人工序列〈220〉<223〉引物6tcactgtatggtcctggatctc22<210〉7〈211〉19<212〉腿〈213〉人工序列〈223〉引物7gaattcagatggaggagcc1919〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉引物〈400〉8ggatcctcactgtatggtc19〈210〉9〈211〉19〈212〉RNA智人(Homosapiens)〈400〉9ccgucuucuuccucaxiuau19〈210〉10〈211〉19〈212〉RNA<213〉人工序列〈220〉〈223〉非沉默siRNA<400〉10uucuccgaacgugucacgu19〈210〉11<211〉21DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物<400〉11tgctggaactgagtacttccg2121〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400〉12agagaggtacaagacgaaggc21〈210〉13〈211〉26DNA引物〈400〉13tgaaggtcggagtcaacggaUtggt26〈210〉14〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列<220〉〈223〉引物14catgtgggccatgaggtccaccac24<210〉15<211〉21RNA智人<400〉15aagaagggacuuccucgcccg2權利要求1、如下(a)、(b)、(c)或(d)所示的蛋白或其免疫性片段(a)由SEQIDNO2所示的胺基酸序列組成的蛋白；(b)在(a)限定的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且與(a)具有相同功能的由(a)衍生的蛋白；(c)由SEQIDNO4所示的胺基酸序列組成的蛋白；或(d)在(c)限定的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且與(c)具有相同功能的由(c)衍生的蛋白。2、編碼權利要求1所述的蛋白或其免疫性片段的多核苷酸序列；所述的多核苷酸序列優選為SEQIDNO:l所示的多核苷酸序列、SEQIDNO:1的核苷酸295813所示的多核苷酸序列或SEQIDNO:3的核苷酸1345所示的多核苷酸序列；所述免疫性片段優選為SEQIDNO:2的胺基酸157173所示的序列、SEQIDNO:2的胺基酸121所示的序列、SEQIDNO:2的胺基酸2242所示的序列或SEQIDNO:2的胺基酸127143所示的序列。3、權利要求1所述的蛋白或其免疫性片段或權利要求2所述的多核苷酸序列在誘導細胞凋亡中的應用；所述細胞凋亡尤其是腫瘤細胞凋亡；所述的腫瘤細胞凋亡優選為通過降低Bad第112位絲氨酸磷酸化程度而導致的腫瘤細胞凋亡。4、權利要求1所述的蛋白或其免疫性片段或權利要求2所述的多核苷酸序列在製備治療和/或抑制腫瘤的藥物中的應用；所述的腫瘤優選為表皮生長因子受體高表達的腫瘤；所述的表皮生長因子受體高表達的腫瘤優選為前列腺癌、前列腺增生、宮頸癌或肝癌。5、如權利要求4所述的應用，其中所述的多核苷酸序列為SEQIDNO:1所示的多核苷酸序列、SEQIDNO:1的核苷酸295813所示的多核苷酸序列或SEQIDNO:3的核苷酸1345所示的多核苷酸序列，所述免疫性片段為SEQIDNO:2的胺基酸157173所示的序列、SEQIDNO:2的胺基酸121所示的序列、SEQIDNO:2的胺基酸2242所示的序列或SEQIDNO:2的胺基酸127143所示的序列。6、如權利要求4或5所述的應用，其中所述的多核苷酸序列包含於載體中；所述的載體優選為質粒或病毒；所述的病毒優選為腺病毒。7、一種載體，其包含如權利要求2所述的多核苷酸序列；所述的載體優選為質粒或病毒；所述的病毒優選為腺病毒。8、一種用於治療和/或抑制腫瘤的藥物組合物，該藥物組合物含有權利要求1所述的蛋白或其免疫片段或權利要求2所述的多核苷酸序列或如權利要求7所述的載體，和一種或多種藥用賦形劑或藥用載體。9、檢測權利要求1所述的蛋白或其免疫性片段或權利要求2所述的多核苷酸序列的表達的試劑在製備用於檢測腫瘤的組合物中的應用。10、如權利要求9所述的應用，其中所述的試劑為抗體、反義RNA或小幹擾RNA。全文摘要本發明涉及一種新的腫瘤抑制基因或蛋白及其應用，特別是涉及CMTM8或其可變剪切體CMTM8-v2的基因或蛋白或它們的免疫性片段、CMTM8或CMTM8-v2或它們的免疫性片段在誘導細胞凋亡中的應用或在製備治療和/或抑制腫瘤的藥物中的應用、包含CMTM或CMTM8-v2的載體或藥物組合物，以及檢測CMTM8或CMTM8-v2或它們的免疫性片段的表達的試劑的應用。文檔編號C07K14/435GK101148472SQ20071015404公開日2008年3月26日申請日期2007年9月13日優先權日2006年9月13日發明者宋泉聲,丹李,應王,靳彩寧,韓文玲,馬大龍申請人:北京大學