用突變體BaEV糖蛋白假型化的慢病毒載體的製作方法

2023-12-08 19:38:21

用突變體BaEV糖蛋白假型化的慢病毒載體的製作方法
【專利摘要】本發明涉及用於將生物材料轉移到細胞中的假型化病毒載體顆粒，其中所述載體顆粒至少包含：嵌合包膜糖蛋白，其包含或由狒狒內源性逆轉錄病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外結構域與鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞質尾結構域的融合體組成；或修飾的BaEV包膜糖蛋白，其中胞質尾結構域缺乏融合抑制性R肽。
【專利說明】用突變體BaEV糖蛋白假型化的慢病毒載體

【技術領域】
[0001]本發明涉及能夠有效基因轉移造血細胞的假型化慢病毒載體。

【背景技術】
[0002]基因治療對於許多遺傳性和獲得性疾病的治癒是有希望的，如其在X連鎖重症聯合免疫缺陷(SCID-Xl)、腺苷脫氨酶(ADA)缺乏症和慢性肉芽腫病的治療中的成功所證明的。最近，報導了使用慢病毒載體成功治療患有X-連鎖腎上腺腦白質營養不良(ALD)的患者。在該試驗中，基於造血幹細胞(HSC)的基因治療能夠阻止患有這種中樞神經系統的致命性脫髓鞘性疾病的兩名患者的疾病進展。重要的是，為了校正造血系統的所有這些缺陷，必須將治療基因遞送到既能夠自我更新又能夠分化為所有造血譜系的細胞中。由於HSC符合這些標準，所以它們代表基因治療應用的有吸引力的候選。
[0003]然而，HSC的慢病毒載體轉導中的主要障礙在於，75%的HSC停留在細胞周期的Gtl期，並且對於經典慢病毒載體轉導不是非常容許。該限制阻礙了常規慢病毒載體用於HSC基因治療的應用，因為它們不允許有效地將基因轉移到靜態(Gtl)HSC的亞群(Sutton等人(1999) J.Virol.73:3649-3660)。為了克服該限制，許多使用慢病毒載體用於hCD34+細胞轉導的研究採用高載體輸入且存在非常強的細胞因子雞尾酒(TP0、SCF、Flk-3、IL-6、IL-3)以誘導HSC周期進入。很多時候，纖維連接蛋白(纖連蛋白的片段)用於共定位載體顆粒和靶細胞，或應用多次載體施用以實現HSC中的高基因轉移率。然而，延長細胞因子刺激的不良影響是人HSC的多潛能和長期移植的降低。而且，過高的載體劑量產生多拷貝整合(特別是插入突變)的風險。
[0004]因此，對能夠轉導靜態HSC且限制性多拷貝整合的風險的病毒載體存在需要。
[0005]有效地將基因轉移到靜態T和B淋巴細胞中用於基因治療或免疫治療目的可以允許治療造血系統的幾種遺傳障礙(諸如免疫缺陷)，和對於癌症和獲得性疾病開發新的治療策略。慢病毒載體(LV)不能夠轉導一些特定的靜態細胞類型，諸如靜息T細胞和B細胞(Bovia 等人(2003)BloodlOl:1727-1733 ;Verhoeyen 等人(2003)BloodlOl:2167-2174)。在T細胞中，用水皰性口炎病毒的包膜糖蛋白(VSV-G)假型化的慢病毒載體的基因組的逆轉錄、核輸入(nuclear import)和隨後整合的完成無法有效進行，除非它們經由T細胞受體或通過誘導它們進入細胞周期的Glb期的存活-細胞因子而活化。B細胞的慢病毒轉導是另一回事，因為甚至B細胞受體(BCR)刺激誘導增殖也不足以允許VSV-G假型化慢病毒載體(VSV-G-LV)的有效轉導。
[0006]因此，對能夠轉導靜息T細胞和B細胞的病毒載體存在重要需要。
[0007]為了通過慢病毒載體將基因遞送至造血細胞中，需要將允許有效的載體-細胞融合的「進入」包膜蛋白遞呈在其表面。將異源包膜糖蛋白引入慢病毒載體的核心上的過程被稱為「假型化」。與由HIV-1衍生的病毒核心相關的VSV-G已經使用很長時間。儘管如此，使用VSV-G-LV 存在缺點。毒性與VSV-G的長期表達相關，這使得生成穩定細胞系變得困難。此外，VSV-G-LV對人補體敏感，這使得它們不適合體內使用。只有高VSV-G-LV劑量(感染複數=50-100的MOI)允許高效h⑶34+細胞轉導，這增加了多拷貝整合的風險，從而增加了遺傳毒性的風險(Di Nunz1等人(2007)Hum.GeneTher.18:811-820)。人類也可以發展針對VSV-G的強烈免疫應答，這可能降低第二次施用VSV-G-LV的效力。所有這些證據限制VSV-G-LV的體外和體內使用。
[0008]包含與鼠白血病病毒A (MLV-A)包膜糖蛋白的胞質尾(被稱為TR)融合的RDl 14貓白血病病毒包膜糖蛋白的胞外和跨膜結構域的嵌合包膜糖蛋白(下文稱為RD114/TR且在國際申請WO 03/091442中描述)似乎是一種相當好的替代性包膜。事實上，該假型對人補體系統不敏感，這使得其對體內應用具有吸引力。RD114/TR-LV允許有效轉導人和獼猴⑶34+細胞。然而，轉導水平保持遠低於VSV-G-LV的轉導水平，且RDl 14的滴度遠低於VSV-G-LV的滴度。此外，RD114/TR糖蛋白不能有效進入鼠細胞。所以，該受體特異性限制了該LV起作用的潛力，因為大多數適合用於基因治療的臨床前疾病模型是小鼠模型。
[0009]發明概述
[0010]本發明源自本發明人的意外發現:用嵌合包膜糖蛋白(其包含或由狒狒內源性逆轉錄病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外結構域與鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞質尾結構域的融合體組成)或修飾的BaEV包膜糖蛋白(其中胞質尾結構域缺乏融合抑制性R肽)假型化的慢病毒載體顯示特別適合於將基因轉移到造血細胞(包括HSC和靜息T細胞和B細胞)中的轉導特性。事實上，在溫和細胞因子刺激後，這些新的LV假型可以低載體劑量非常有效且穩定地轉導多達70%的h⑶34+細胞。對於獼猴和人⑶34+細胞的轉導，BaEV-LV遠勝過VSV-G和RD114/TR-LV。此外，本發明人表明，BaEV-LV轉導非常早期的h⑶34+祖細胞 (包括HSC)，因為這些細胞能夠重構免疫缺陷小鼠模型，並且在幾種造血組織中和那些組織中在不同的血細胞譜系中發現高水平轉導的血細胞。重要的是，BaEV-LV能夠以高水平轉導IL-7預刺激的記憶性和初始T細胞(naive T cell)。此外，與VSV-G-LV和RD114/TR-LV相反，這些BaEV-LV也允許高水平轉導靜息和BCR刺激的B細胞而不誘導表型轉換。
[0011]因此，本發明涉及用於將生物材料轉移到細胞中的假型化病毒載體顆粒，其中所述載體顆粒至少包含:
[0012]-嵌合包膜糖蛋白，其包含或由狒狒內源性逆轉錄病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外結構域與鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞質尾結構域的融合體組成；或
[0013]-修飾的BaEV包膜糖蛋白，其中胞質尾結構域缺乏融合抑制性R肽。
[0014]本發明還涉及根據本發明的假型化病毒載體顆粒，其用於治療造血功能障礙。
[0015]本發明的另一個目的涉及包含作為活性成分的根據本發明的假型化病毒載體顆粒的藥物。
[0016]本發明還涉及根據本發明的假型化病毒載體顆粒用於將生物材料離體轉移到造血細胞中的用途。
[0017]本發明的另一個目的涉及一種用於轉導造血細胞的方法，其包括在實現通過假型化病毒載體顆粒轉導造血細胞的條件下將造血細胞與根據本發明的假型化病毒載體顆粒接觸。
[0018]本發明還涉及產生如上述定義的假型化病毒載體顆粒的穩定病毒包裝細胞系。
[0019]發明詳述
[0020]假型化病毒載體顆粒
[0021]本發明涉及用於將生物材料轉移到細胞中的假型化病毒載體顆粒，其中所述載體顆粒至少包含:
[0022]-嵌合包膜糖蛋白，包含或由狒狒內源性逆轉錄病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外結構域與鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞質尾結構域的融合體組成；或
[0023]-修飾的BaEV包膜糖蛋白，其中胞質尾結構域缺乏融合抑制性R肽。
[0024]如本文所預期，術語「載體顆粒」是指易於在其表面顯示嵌合包膜糖蛋白或修飾的BaEV包膜糖蛋白並可逆地結合生物材料的任何顆粒。優選的是，此類載體顆粒是病毒載體顆粒，特別是逆轉錄病毒載體顆粒。優選地，所述逆轉錄病毒載體顆粒選自癌病毒載體顆粒，包括鼠白血病病毒(MLV)、禽白血病病毒(ALV)、呼吸道合胞病毒(RSV)或Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)載體顆粒；慢病毒載體顆粒，諸如人免疫缺陷病毒(HIV)，例如HIV-1或HIV-2、猴免疫缺陷病毒(SIV)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、馬感染性貧血病毒(EIAV)和山羊關節炎腦炎病毒(CAEV)載體顆粒；和泡沫病毒載體顆粒，諸如人泡沫病毒(HFV)載體顆粒。
[0025]慢病毒載體顆粒是本領域技術人員眾所周知的，且特別在Naldini等人(2000)Adv.Virus.Res.55:599-609 和 Negre 等人(2002) B1chimie84:1161-1171 中描述。通常，根據本發明的慢病毒載體顆粒至少包含以下組分:(i)包膜組分，其由與包膜蛋白結合的磷脂雙分子層構成，其中所述包膜蛋白至少包含上述定義的嵌合或修飾的糖蛋白，所述包膜環繞Qi)由gag蛋白結合構成的核心組分,所述核心本身環繞(iii)通常由核糖核酸(RNA)構成的基因組組分和(iv)酶組分(pol)。所述生物材料可以存在於包膜內、核心內和/或基因組組分內。
[0026]慢病毒載體顆粒可以容易地由本領域技術人員，例如，通過遵循由Sandrin等人(2002)BloodlOO:823-832提供的通用指導來製備。簡而言之，慢病毒載體顆粒可通過在所謂生產細胞(例如293T人胚胎腎細胞)中共表達包裝元件(即核心和酶組分)、基因組組分和包膜組分來生成。通常可以採用3至4種質粒，但數目可以根據慢病毒組分被分解成單獨單元的程度而更多。
[0027]如本文中所使用，術語「假型化病毒載體」是指包含外來病毒包膜糖蛋白的病毒載體。通常，根據本發明的病毒載體用上文定義的嵌合或修飾的糖蛋白假型化。
[0028]狒狒內源性逆轉錄病毒或BaEV是以多個前病毒拷貝存在於狒狒DNA中的C型逆轉錄病毒。BaEV包膜糖蛋白特別地在Benveniste等人(1974)Nature248:17-20和Todaro等人(1974)Cell2:55-61 中描述。
[0029]在本發明的上下文中，術語「BaEV包膜糖蛋白」是指BaEV包膜糖蛋白的野生型形式或與所述野生型BaEV包膜糖蛋白至少80%、優選至少85%、還優選至少90%、更優選至少95 %、還更優選至少99 %相同的所述野生型BaEV包膜糖蛋白的突變體，條件是所述突變體糖蛋白保留野生型糖蛋白結合造血細胞膜並與造血細胞膜融合的能力。
[0030]通常，野生型BaEV包膜糖蛋白由核酸序列SEQ ID N0:1編碼。優選地，它由序列SEQ ID N0:2組成。如技術人員已知的，BaEV包膜糖蛋白由胞質尾結構域、跨膜結構域和胞外結構域構成。包膜糖蛋白序列中對應於胞質尾結構域、跨膜結構域和胞外結構域的區域可以由技術人員容易地確定。通常，胞質尾結構域位於野生型BaEV包膜糖蛋白的胺基酸530至564之間。優選地，BaEV包膜糖蛋白的野生型胞質尾結構域包含或由胺基酸序列SEQID NO:3組成。通常，跨膜結構域位於野生型BaEV包膜糖蛋白的胺基酸507至529之間。優選地，BaEV包膜糖蛋白的野生型跨膜結構域包含或由胺基酸序列SEQ ID N0:4組成。通常，胞外結構域位於野生型BaEV包膜糖蛋白的胺基酸I至506之間。優選地，BaEV包膜糖蛋白的野生型胞外結構域包含或由胺基酸序列SEQ ID NO:5組成。
[0031]在本發明的特定實施方案中，BaEV包膜糖蛋白的胞質尾結構域缺乏融合抑制性R肽。
[0032]在本發明的上下文中，術語「融合抑制性R肽」是指包膜糖蛋白的胞質尾結構域的C-末端部分，其攜帶酪氨酸內吞信號-YXXL，並在病毒顆粒成熟過程中被病毒蛋白酶裂解，從而增強包膜糖蛋白的膜融合。BaEV包膜糖蛋白的融合抑制性R肽通常位於野生型BaEV包膜糖蛋白的胺基酸547和564之間。優選地，BaEV包膜糖蛋白的融合抑制性R肽包含或由胺基酸序列SEQ ID NO:6組成。
[0033]因此，在一個特別優選的實施方案中，其中胞質尾結構域缺乏融合抑制性R肽的修飾的BaEV包膜糖蛋白包含或由胺基酸序列SEQ ID N0:7組成。此類修飾的BaEV包膜糖蛋白在下文中稱為「BaEVRLess」。
[0034]在另一個特定實施方案中，BaEV包膜糖蛋白的胞質尾結構域被鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞質尾結構域替代。
[0035]鼠白血病病毒包膜糖蛋白特別地在Ott等人(1990) J.Virol.64:757-766中描述。鼠白血病病毒包膜糖蛋白優選是菌株4070A的包膜糖蛋白。
[0036]在本發明的上下文中，術語「MLV包膜糖蛋白」是指MLV包膜糖蛋白的野生型形式或與所述野生型MLV包膜糖蛋白至少80%、優選至少85%、還優選至少90%、更優選至少95 %、還更優選至少99 %相同的所述野生型MLV包膜糖蛋白的突變體，條件是所述突變體糖蛋白保留野生型包膜糖蛋白與病毒核心蛋白、特別是慢病毒核心蛋白相互作用的能力。
[0037]包膜糖蛋白序列中對應於胞質尾結構域的區域可以由技術人員容易地確定。通常，MLV包膜糖蛋白的胞質尾結構域位於野生型MLV包膜糖蛋白的胺基酸622至654之間。優選地，MLV包膜糖蛋白的野生型胞質尾結構域包含或由胺基酸序列SEQ ID NO:8組成。
[0038]因此，在一個特別優選的實施方案中，包含或由BaEV包膜糖蛋白的跨膜和胞外結構域與MLV包膜糖蛋白的胞質尾結構域的融合體組成的嵌合包膜糖蛋白包含或由胺基酸序列SEQ ID N0:9組成。此類嵌合包膜糖蛋白在下文中稱為「BaEV/TR」。
[0039]本發明人證明了 BaEV/TR和BaEVRLess糖蛋白比野生型BaEV糖蛋白以更高的水平結合至慢病毒表面上。
[0040]本發明人進一步證明，病毒載體顆粒上共同顯示特定細胞因子使得增強目標細胞的革巴向轉導。
[0041]因此，在一個特定的實施方案中，根據本發明的病毒載體顆粒可優選在其表面上進一步顯示，選自幹細胞因子(SCF)、血小板生成素(TP0)、IL-2、IL-15和IL-7的至少一種細胞因子。
[0042]優選地，所述至少一種細胞因子選自人SCF、人ΤΡ0、人IL-2、人IL-15和人IL_7。
[0043] 在本發明的上下文中，細胞因子可以是野生型細胞因子或任何與所述野生型細胞因子至少80 %、優選至少85 %、還優選至少90 %、更優選至少95 %、還更優選至少99 %相同的所述野生型細胞因子的突變體，條件是所述突變體細胞因子呈現與衍生其的野生型細胞因子基本上相同的特性。
[0044]野生型SCF細胞因子優選包含或由序列SEQ ID NO:10組成。野生型TPO優選包含或由序列SEQ ID N0:11組成。野生型IL-2優選包含或由序列SEQ ID N0:12組成。野生型IL-7優選包含或由序列SEQ ID NO: 13組成。野生型IL-15優選包含或由序列SEQ IDNO: 14組成。
[0045]相同性百分比可以通過執行基於Needleman-Wunsch比對算法的成對總體比對來發現兩個序列沿其整個長度的最佳比對(包括空位)(例如，使用Needle)和使用BL0SUM62矩陣(空位開放罰分為10且空位延伸罰分為0.5)來計算。
[0046]在一個特別優選的實施方案中，根據本發明的假型化病毒載體顆粒通過本文以下部分「用於產生假型化病毒載體顆粒的方法」中描述的方法可獲得或獲得。
[0047]生物材料
[0048]本發明的假型化病毒載體顆粒對於將生物材料轉移入細胞、特別是造血細胞是特別感興趣的。
[0049]因此，在一個優選的實施方案中，如上定義的假型化病毒載體顆粒進一步包含生物材料。
[0050]如本文中所預期，表述「生物材料」涉及易於改變細胞的結構和/或功能的一種或多種化合物。在本發明的上下文中，優選的是，所述生物材料是一種或多種核酸，在慢病毒載體顆粒的情況下，其可以包含在載體顆粒的基因組內。基因組通常包含一種或多種核酸，其優選連接至對於其在靶細胞中表達所需的基因元件，諸如啟動子和終止子，側翼為對於在核心元件中包括基因組、其逆轉錄成脫氧核糖核酸(DNA)、逆轉錄的基因組輸入靶細胞的核和逆轉錄的基因組整合在靶細胞的基因組內所需的順式作用元件。
[0051]目標核酸的實例包括球蛋白基因，造血生長因子，其包括促紅細胞生成素(EPO)；白細胞介素(特別是白細胞介素-1、白細胞介素-2、白細胞介素-3、白細胞介素-6、白細胞介素12等)和細胞集落刺激因子(諸如粒細胞集落刺激因子，粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子，或幹細胞集落刺激因子)；血小板特異性整合素a IIbii ;多藥耐藥基因；患有慢性肉芽腫病(CGD)的患者中缺陷的gp91或gp47基因；使細胞耐受病原體諸如人免疫缺陷病毒感染的抗病毒基因；編碼以下的基因:在血友病患者中突變的凝血因子VIII或IX、參與T細胞介導的免疫應答的配體諸如T細胞抗原受體、B細胞抗原受體(免疫球蛋白)、白細胞介素受體常見Y鏈、單獨的T和B細胞抗原受體的組合和/或T和B細胞抗原受體與單鏈抗體(ScFv)的組合、IL2、IL12、TNF、Y幹擾素、CTLA4、B7等；腫瘤細胞中表達的基因，諸如 Me I ana、MAGE 基因(諸如 MAGE-1、MAGE-3)、PI98、P1A、gplOO 等。
[0052]如本文所預期，「轉移」涉及載體顆粒在結合靶細胞後初始將生物材料遞送至靶細胞的膜或細胞質的能力。遞送後，生物材料可以被轉運至細胞的其它隔室。
[0053]如本文中所預期，待轉移生物材料的受體細胞或靶細胞涉及易於被上述定義的載體顆粒結合的任何細胞。當載體顆粒是慢病毒載體顆粒時，祀細胞涉及易於被載體顆粒轉導的任何細胞。這些細胞優選是造血細胞，特別是人造血細胞。
[0054]造血細胞
[0055]如本文中所使用，術語「造血細胞」通常是指血細胞，來自髓樣和淋巴樣譜系兩者。特別地，術語「造血細胞」包括未分化或分化不良的細胞，諸如造血幹細胞和祖細胞，和分化細胞，諸如T淋巴細胞、B淋巴細胞或樹突狀細胞。優選地，造血細胞選自造血幹細胞，⑶34+祖細胞，特別是外周血⑶34+細胞，非常早期⑶34+祖細胞，B細胞⑶19+祖細胞，髓樣⑶13+祖細胞，T淋巴細胞，B淋巴細胞，單核細胞，樹突狀細胞，腫瘤B細胞，特別是B細胞慢性淋巴細胞性白血病(BCLL)細胞和邊緣區淋巴瘤(MZL)B細胞和胸腺細胞。
[0056]如技術人員已知，每個造血細胞都從骨髓造血幹細胞產生。
[0057]如本文中所使用，術語「造血幹細胞」或「HSC」是指能夠補充所有血細胞類型並自我更新的細胞。造血幹細胞特別可以被定義為當被注入造血系統被耗盡的受體小鼠的循環中時將髓樣細胞、T細胞和B細胞維持在穩健可檢測水平(通常大於外周血細胞的1% )持續 16 周的細胞(Schroeder (2010)Cell Stem Cell6:203-207)。
[0058]如本文中所使用，術語「⑶34+祖細胞」是指包括HSC亞群、多能幹細胞和譜系發生(lineage commitment)的早期階段的細胞的異質細胞群體。在正常成年動物中，⑶34+祖細胞連續遷移到骨髓並從骨髓遷移出。它們可以分化以產生在循環中發現的所有造血細胞譜系。表述「外周血⑶34+細胞」更具體是指血液中存在的⑶34+細胞。
[0059]本發明人用強細胞因子雞尾酒(SCF、TPO和Flt3-L)預刺激人⑶34+早期祖細胞並用BaEV/TR和BaEVRLess假型化慢病毒載體顆粒轉導它們。他們證明，假型化慢病毒載體顆粒可有效地轉導人⑶34+早期祖細胞，特別是在存在纖維連接蛋白的情況下轉導超過70%。
[0060]發明人進一步證明用BaEV/TR和BaEVRLess假型化慢病毒載體顆粒獲得的高人CD34+細胞轉導是由於短期祖細胞的穩定轉導。事實上，在SCF/TP0預刺激後BaEV/TR和BaEVRLess慢病毒載體顆粒轉導的CD34+細胞與由它們衍生的集落形成祖細胞的比例之間沒有顯著差異。相反，對於用VSV-G假型化的慢病毒載體顆粒，轉導的集落形成祖細胞的比例顯著低於衍生它們的轉導的⑶34+細胞的比率。
[0061]如本文中所使用，術語「非常早期CD34+祖細胞」是指在HSC中富集的CD34+祖細胞的亞群。
[0062]如本文中所使用，術語「B細胞⑶19+祖細胞」是指表達細胞表面⑶10、⑶34和⑶19的B譜系細胞群體。
[0063]如本文中所使用，術語「髓樣⑶13+祖細胞」是指表達細胞表面⑶34和⑶13和任選CD33的髓樣譜系細胞群體。
[0064]本發明人證明了 BaEV/TR和BaEVRLess假型化慢病毒載體顆粒能夠高效轉導能夠再植免疫缺陷小鼠的造血祖細胞。他們評價了這些假型化慢病毒載體顆粒轉導的人⑶34+細胞在Rag2+ Y +Balbc免疫缺陷小鼠模型和NOD/SCID/ y c-/_ (NSG)小鼠模型中的長期重構能力。他們證明了非常早期⑶34+祖細胞，以及B細胞⑶19+祖細胞和髓樣⑶13+細胞通過本發明的BaEV/TR和BaEVRLess假型化慢病毒載體顆粒以低感染性載體顆粒劑量轉導至相同的程度。此外，BaEV/TR-LV和BaEVRLess-LV轉導的hCD34+細胞導致骨髓中的高重構水平和骨髓中SCID再植細胞的最高轉導水平(高達90%⑶45+GFP+細胞)。他們還證明，在初級受體小鼠中在所有造血組織(骨髓、胸腺、脾臟)中都持續這些高轉導水平。對於骨髓中的未成熟的祖細胞(hCD34+細胞)、淋巴樣細胞(CD19+)和髓樣細胞(CD13+和CD14+)檢測到相同高水平轉導。相反，用VSV-G假型化的慢病毒載體顆粒以低得多的水平轉導早期CD34+祖細胞、CD13+髓樣祖細胞和單核細胞。對於用RD114/TR假型化的慢病毒載體顆粒，還檢測到所有不同骨髓細胞譜系的低轉導。在脾中，發現T細胞和B細胞和單核細胞的相同圖象。RD114/TR-LV表明SCID再植細胞的可變轉導水平(範圍為3.2-76%的GFP+CD45+ 細胞)。
[0065]本發明人還表明，在免疫缺陷小鼠中，在脾臟和骨髓中，在從初始受體分離的h⑶34+細胞的二次移植後，GFP+h⑶45+細胞的百分比維持或增加。此外，對於BaEV/TR-和BaEVRLess-LV兩者，在這些二級受體小鼠的骨髓中檢測到高水平的GFP+h⑶34+早期祖細胞、淋巴樣(⑶19+)和髓樣(⑶13+)細胞，並且在這些不同譜系中檢測到相同百分比的GFP+細胞。因此本發明人表明，二級重構SCID再植細胞能夠多向分化，並且真正人HSC被BaEV/TR-和BaEVRLess-LV基因修飾至高水平。
[0066]本發明人還表明，BaEV/TR和BaEVRLess假型化的慢病毒載體顆粒允許有效轉導人T細胞，特別是IL-7預刺激的人T細胞。在存在纖維連接蛋白的情況下，對於相同載體劑量，這些假型化的慢病毒載體顆粒優於用VSV-G假型化的慢病毒載體顆粒。重要的是，BaEV/TR和BaEVRLess假型化的慢病毒載體顆粒允許有效轉導初始和記憶IL-7預刺激的T細胞兩者。事實上，它們允許轉導IL-7刺激的T細胞而不折損它們的初始表型。高度感興趣的是，它們在MOI為10時也允許T細胞受體(TCR)刺激後接近100%的T細胞基因轉移。
[0067]因此，在一個特定實施方案中，造血靶細胞是T細胞，優選初始或記憶T細胞。
[0068]BaEV/TR和BaEVRLess假型化的慢病毒載體顆粒也允許高效轉導20_30 %的靜息B細胞，因此遠勝過用VSV-G或RD114/TR假型化的慢病毒載體顆粒(其無法轉導或非常低效地轉導靜息人B細胞)。而且，B細胞受體(BCR)刺激後，BaEV/TR和BaEVRLess假型化的慢病毒載體顆粒轉導高達70%的B細胞，而用VSV-G假型化的慢病毒載體顆粒的轉導效率不超過5%。重要的是，BaEV/TR和BaEVRLess假型化的慢病毒載體顆粒有效地轉導記憶以及初始B細胞。
[0069]因此，在一個特定實施方案中，造血靶細胞是B細胞，特別是靜息B細胞，優選初始或記憶B細胞。它也可以是癌B細胞，特別是B細胞慢性淋巴細胞性白血病(BCLL)細胞或邊緣區淋巴瘤(MZL)B細胞。
[0070]因為胸腺細胞基因轉移對於免疫調節的潛在價值，本發明人評價了 BaEVgp-LV與其他LV假型相比用於轉導不同的胸腺細胞亞群的表現。從人胸腺分離胸腺細胞之後，他們在存在存活細胞因子IL-7的情況下用編碼GFP報導分子的VSV-G-、RD114/TR-、BaEV/TR-和 BaEVRLess-LV 以 10 的 MOI 轉導它們。發明人表明，RD114/TR-LV、BaEV/TR-LV 和BaEVRLess-LV允許優先轉導在早期發育階段的胸腺細胞(雙陰性和未成熟的CD4單陽性細胞)，而它們轉導更成熟細胞仍然處於較低水平。如已經對於成人T細胞所檢測的，BaEVgpLV比RD114/TR-LV更有效地轉導所有不同的胸腺細胞亞群。而且，用不同的慢病毒載體假型轉導對不同胸腺細胞亞群的分布沒有影響。因此本發明人證明，BaEVgp-LV是用於轉導胸腺細胞的優異工具，且它們對於轉導未成熟的雙陰性(DN)和未成熟的CD4單陽性細胞(ISP)胸腺細胞亞群尤其優於VSV-G-和RD114/TR-LV。
[0071]因此，在一個特定實施方案中，造血靶細胞是胸腺細胞。
[0072]最後，本發明人用T細胞存活細胞因子IL-7預刺激新鮮分離的總CBT細胞來保持T細胞初始表型，並隨後以10或20的Μ0Ι、或對於VSV-G-LV以50的MOI用編碼GFP報導分子的不同載體:VSV-G-、RD114/TR-、BaEV/TR-和BaEVRLess-LV轉導它們。他們表明，BaEV/TR-和BaEVRLess-LV在MOI = 10時的轉導效率(40-50%轉導)高度優於VSV-G或RDl 14/TR-LV。重要的是，當載體劑量2倍增加時，BaEV/TR-和BaEVRLess-LV容易達到65%轉導(Μ0Ι = 20)。在所有情況下，初始近期胸腺細胞遷移者(⑶69L+⑶45RA+CD31+)轉導的程度與更成熟的初始CB T細胞0:D69L+ra45RA+ra31-)相同。而且，轉導對這兩種初始CB T細胞群體的分布沒有影響。
[0073]因此，在一個特定實施方案中，造血靶細胞是初始細胞。如本文中所使用，術語「初始細胞」是指還沒有經歷響應刺激的細胞活化的細胞。特別地，「初始細胞」可以是尚未暴露於抗原的細胞。
[0074]因為細胞因子雞尾酒的強烈刺激誘導HSC分化和其自我更新能力的喪失，特別感興趣的是，預刺激儘可能少的細胞，以儘可能避免它們分化和保持更多它們的「幹細胞特徵」。
[0075]本發明人對於人CD34+早期祖細胞採用固定的10的MOI (感染性顆粒的數量/每個細胞)的本發明的假型化病毒載體和不同的細胞因子預刺激方案:1)無刺激；2)用SCF或TPO刺激；3)用SCF和TPO刺激；4)用SCF、TP0和Flt3_L刺激。重要的是，使用的最強細胞因子預刺激比目前在臨床設置中使用的目標在於限制細胞分化的預刺激雞尾酒更低。本發明人證明了 BaEV/TR和BaEVRLess慢病毒載體顆粒能夠轉導10-20%的未刺激的人CD34+早期祖細胞，而用VSV-G或RDl 14/TR假型化的慢病毒載體(如國際申請W02009/013324中描述)在相同載體劑量未能有效轉導未刺激的靜態人CD34+早期祖細胞。而且，對於BaEV/TR和BaEVRLess假型化的慢病毒載體，單一 TPO刺激足以轉導高達60%的人⑶34+早期祖細胞，而用VSV-G或RDl 14/TR假型化的慢病毒載體在這些條件下僅轉導8-20%的人⑶34+早期祖細胞。SCF單一預刺激允許用BaEV/TR和BaEVRLess假型化的慢病毒載體轉導高達30-50%的人⑶34+早期祖細胞，而用VSV-G或RD114/TR假型化的慢病毒載體只達到10%的轉導水平。最後，TPO和SCF預刺激或TP0、SCF和Flt3_L預刺激與單一 BaEV/TR或BaEVRLess假型化的慢病毒載體孵育的組合導致轉導高達75%的人⑶34+早期祖細胞，而用RD114/TR假型化的慢病毒載體只實現40%的轉導。
[0076]因此，在一個優選實施方案中，造血靶細胞沒有用至少一種細胞因子預刺激。特別地，它沒有用SC、TPO和/或Flt3-L預刺激。
[0077]在另一個優選實施方案中，造血靶細胞僅用SCF或TPO預刺激。在又一個優選實施方案中，造血靶細胞僅用SCF和TPO預刺激。
[0078]如本文中所使用，術語「預刺激(prestimulat1n)」或「預刺激的(prestimulated) 」是指造血細胞以適於誘導造血細胞的特定活化的濃度或持續適於誘導造血細胞的特定活化的時間與至少一種細胞因子接觸。
[0079]如本文中所使用，術語「fms樣酪氨酸激酶受體-3配體」、「Flt3配體」或「Flt3_L」是指通過活化造血祖細胞增加免疫細胞的數量的細胞因子。Flt3-L優選是人Flt3-L，更優選包含或由SEQ ID NO:15組成。
[0080]用於產生假型化病毒載體顆粒的方法
[0081]本發明還涉及用於產生假型化病毒載體顆粒的方法，其包括:
[0082]a)用以下物質轉染細胞以得到生產細胞:
[0083](i)至少一種第一核酸序列，包含具有包裝能力的逆轉錄病毒衍生的基因組；
[0084](ii)至少一種第二核酸序列，包含編碼來自所述逆轉錄病毒的核心蛋白的cDNA ;和
[0085](iii)至少一種第三核酸序列，包含編碼以下的cDNA:
[0086]-嵌合包膜糖蛋白，包含或由狒狒內源性逆轉錄病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外結構域與鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞質尾結構域的融合體組成，如上所定義；或
[0087]-修飾的BaEV包膜糖蛋白，其中胞質尾結構域缺乏融合抑制性R肽，如上所定義；
[0088]b)將生產細胞在培養物中維持足夠時間，以允許表達cDNA以產生編碼蛋白；和
[0089]c)允許編碼蛋白形成本發明的病毒載體顆粒。
[0090]「逆轉錄病毒」是指基因組由RNA分子組成且包含逆轉錄酶的病毒，即逆轉錄病毒科的成員。逆轉錄病毒分為癌病毒、慢病毒和泡沫病毒。優選地，所述逆轉錄病毒是癌病毒，例如，MLV、ALV、RSV或MPMV ;慢病毒，例如HIV-1、HIV_2、SIV、EIAV或CAEV ;或泡沫病毒，諸如HFV。這些逆轉錄病毒的基因組容易從資料庫中獲得。更優選地，所述逆轉錄病毒是慢病毒，特別是 HIV-l、HIV-2 或 SIV0
[0091]在本發明的上下文中 ，「包含具有包裝能力的逆轉錄病毒衍生的基因組的核酸序列」是指包含被稱為「順式作用」序列的逆轉錄病毒核酸序列的序列。這些包括用於控制轉錄和整合的長末端重複序列(LTR),對於衣殼化(encapsidat1n)所需的psi序列，和對於逆轉錄病毒基因組的逆轉錄所需的引物結合位點(PBS)和多聚嘌呤追蹤(polypurinetrack, PPT)序列。有利地，所述包含具有包裝能力的逆轉錄病毒衍生的基因組的核酸序列進一步包含轉基因。
[0092]在不存在任何反式互補功能的情況下，所述逆轉錄病毒基因組可以是複製缺陷型或具有複製能力的。具有複製能力的基因組可以進一步包含gag、pol和env逆轉錄病毒基因。在複製缺陷型基因組中，病毒基因gag、pol和env缺失。然而，本發明的病毒載體顆粒的裝配可以通過反式提供另一種編碼gag、pol和/或env糖蛋白、但對於「順式」序列有缺陷的質粒來實現。它們的表達允許轉基因的衣殼化，不包括對於病毒基因組的增殖和完整病毒顆粒的形成所必需的基因。
[0093]「來自逆轉錄病毒的核心蛋白」是指gag和pol基因編碼的蛋白。gag基因編碼由逆轉錄病毒蛋白酶進一步加工成包含核心的結構蛋白的多蛋白。Pol基因編碼逆轉錄病毒蛋白酶、逆轉錄酶和整合酶。
[0094]出於轉染的目的，所述第一、第二和第三核酸序列可以在相同載體或在兩種或三種分開的載體上攜帶。通常，一種質粒編碼病毒載體顆粒的核心逆轉錄病毒組分。gag和pol基因的來源為病毒載體顆粒給出了其名稱。例如，表述「HIV-1衍生的載體顆粒」通常表明載體顆粒的gag和pol基因是HIV-1的gag和pol基因。
[0095]術語「轉染」是指將外來核酸(DNA、cDNA或RNA)引入細胞，使得宿主細胞將表達引入的基因或序列以產生所需物質，通常是由引入的基因或序列編碼的蛋白。引入的基因可以包括調節或控制序列，諸如由細胞的遺傳機制使用的啟動、終止、啟動子、信號、分泌或其它序列。接受並表達引入的DNA或RNA的宿主細胞已經被「轉染」。
[0096]為了產生載體顆粒，可以採用與慢病毒Gag和Pol基因的表達相容的任何細胞，或可工程化為支持此類表述的任何細胞。例如，可以使用生產細胞，諸如293T細胞和昆蟲細胞(特別是對於HIV衍生的載體)、TE671和HT1080細胞(特別是對於MLV衍生的載體)。
[0097]治療應用
[0098]本發明還涉及包含作為活性成分的如上所定義的假型化病毒載體顆粒(特別是進一步包含優選是一種或多種核酸的生物材料的如上所定義的假型化病毒載體顆粒)的藥物。
[0099]其還涉及包含如上所定義的假型化病毒載體顆粒(特別是進一步包含優選是一種或多種核酸的生物材料的如上所定義的假型化病毒載體顆粒)和藥學可接受的載體的藥物組合物。
[0100]本發明還涉及一種用於治療需要其的受試者的方法，其包括向需要其的受試者施用治療有效量的如上所定義的假型化病毒載體顆粒(特別是進一步包含優選是一種或多種核酸的生物材料的如上所定義的假型化病毒載體顆粒)。
[0101]在本發明的上下文中，「受試者」是指人或非人哺乳動物，諸如嚙齒類動物(大鼠、小鼠、兔)，靈長類動物(黑猩猩)，貓科動物(貓)，犬科動物(狗)。優選地，受試者是人。
[0102]如本文中所使用，術語「藥學可接受的載體」是指可以與本發明的病毒載體一起向患者施用且不破壞其藥理活性的載體，並且當以足以遞送藥學有效量的病毒載體的劑量施用時，所述載體是無毒的。
[0103]可用於本發明的藥物組合物中的藥學可接受的載體和媒介物可包括，但不限於，離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、自乳化藥物遞送系統(SEDDS)諸如d-α -生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯、藥物劑型中使用的表面活性劑諸如吐溫或其他類似的聚合物遞送基質、血清蛋白諸如人血清白蛋白、緩衝物質諸如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質諸如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉，磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體二氧化矽、三矽酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、基於纖維素的物質、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。環糊精諸如α _、β -和Y -環糊精，或化學修飾的衍生物諸如羥基烷基環糊精，包括2-和3-羥基丙基-β-環糊精，或者其他溶解的衍生物也可有利地用於增強根據本發明的組合物的遞送。
[0104]可以使用本領域技術人員已知的任何合適的施用方法。特別地，根據本發明的假型化病毒載體顆粒可例如通過口服途徑或通過腸胃外途徑(特別是通過靜脈內注射和股骨(骨髓腔)內注射)而施用。當選擇腸胃外途徑時，假型化病毒載體顆粒可以是在安瓿或燒瓶中條件化的可注射溶液和懸浮液形式。用於腸胃外遞送的形式通過將根據本發明的假型化病毒載體顆粒與緩衝劑、穩定劑、防腐劑、增溶劑、等滲劑和漿化劑混合而常規獲得。然後根據已知技術，將這些混合物滅菌且以靜脈內注射劑的形式條件化。本領域技術人員可使用基於有機磷酸鹽的緩衝劑作為緩衝劑。漿化劑的實例包括甲基纖維素、阿拉伯膠和羧甲基纖維素鈉。穩定劑的實例包括亞硫酸鈉和偏亞硫酸鈉，以及防腐劑的實例包括對羥基苯甲酸鈉、山梨酸、甲酚和氯甲酚。
[0105]「治療有效量」是指病毒載體賦予治療的受試者治療效果的量。治療效果可以是客觀的(即，可通過一些測試或標記測量)或主觀的(即，受試者給出效果的指示或感覺效果)。如技術人員已知，有效劑量將取決於施用途徑、受試者的大小和/或重量以及與其他試劑共同使用的可能性而變化。
[0106]當假型化病毒載體顆粒被用作藥物並在治療方法中向受試者施用時，優選通過靜脈內途徑或通過髓狀途徑、特別是股骨或肱骨髓狀途徑施用。對於靜脈內施用，可以使用如上所定義的約5.1O8至約19個假型化病毒載體顆粒的單位劑量，而對於髓狀施用，可以使用如上所定義的約18至約5.1O8個假型化病毒載體顆粒的單位劑量。
[0107]在一個特定實施方案中，本發明的假型化病毒載體顆粒用於治療造血功能障礙或自身免疫性疾病。
[0108]本發明還涉及如上所定義的假型化病毒載體顆粒用於製備意欲用於治療造血功能障礙或自身免疫性疾病的藥物的用途。其還涉及用於治療受試者的造血功能障礙或自身免疫性疾病的方法，其包括向需要其的受試者施用治療有效量的本發明的假型化病毒載體顆粒。
[0109]如本文中所使用，表述「造血功能障礙」是指血液疾病，特別是涉及造血細胞的疾病。優選地,所述造血功能障礙是單基因造血疾病。
[0110]如本文中所使用，表述「單基因造血疾病」是指由於單一基因的突變導致的遺傳性造血疾病。
[0111]造血功能障礙的實例包括脊髓發育不良、再生障礙性貧血、範可尼貧血、陣發性睡眠性血紅蛋白尿症、鐮狀細胞病、Diamond Blackfan貧血、Schachman Diamond障礙、科斯特曼氏症候群、慢性肉芽腫病、腎上腺腦白質營養不良、白細胞粘附缺陷、血友病、地中海貧血、地中海貧血、白血病諸如急性淋巴細胞性白血病(ALL)、急性粒細胞性(髓性)白血病(AML)、成人淋巴母細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、B細胞慢性淋巴細胞性白血病(B-CLL)、慢性髓性白血病(CML)、幼年慢性粒細胞性白血病(CML)和幼年骨髓單核細胞性白血病(JMML)、重症聯合免疫缺陷病(SCID)、X-連鎖重症聯合免疫缺陷、Wiskott-Aldrich症候群(WAS)、腺苷脫氨酶(ADA)缺乏症、慢性肉芽腫病、Chediak-Higashi症候群、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和AIDS。
[0112]優選地，造血功能障礙選自範可尼貧血、血友病、β -地中海貧血、Wiskott-Aldrich症候群、X-連鎖重症聯合免疫缺陷、腺苷脫氨酶缺乏症、慢性肉芽腫病和腎上腺腦白質營養不良。
[0113]如本文中所使用，表述「自身免疫性疾病」是指由於機體對通常存在於機體中的物質和組織的過度活躍的免疫應答導致的疾病。因此，通過特異性靶向參與該過度活躍的免疫應答的免疫細胞(造血細胞)，本發明的載體顆粒可以是治療自身免疫性疾病的有用工具。
[0114]自身免疫性疾病特別包括急性播散性腦脊髓炎、急性出血性腦白質炎、阿狄森氏病、丙種球蛋白血症、斑禿、肌萎縮性側索硬化症、強直性脊柱炎、抗磷脂症候群、抗合成酶症候群、特應性變態反應、自身免疫性再生障礙性貧血、自身免疫性心肌病、自身免疫性腸病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性內耳病、自身免疫性淋巴增生症候群、自身免疫性周圍神經病、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多內分泌腺病症候群、自身免疫性孕酮性皮炎、自身免疫性血小板減少性紫癜、自身免疫性蕁麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、巴洛病、巴洛同心圓硬化、Bechets症候群、伯格氏病、比克斯塔夫氏腦炎、布勞症候群、大皰性類天皰瘡、癌症、卡爾斯曼氏病、乳糜瀉、慢性炎症性脫髓鞘性多發性神經病、慢性復發性多灶性骨髓炎、Churg-Strauss症候群、瘢痕性類天皰瘡、科根症候群、冷凝集素病、補體組分2缺乏症、顱動脈炎、CREST症候群、克羅恩病、庫欣氏症候群、皮膚白血球血管炎、德戈氏病、德爾肯氏病、皰疹樣皮炎、皮肌炎、I型糖尿病、瀰漫性皮膚全身性硬化症、德雷斯勒氏症候群、盤狀紅斑性狼瘡、溼疹、接骨點炎相關的關節炎、嗜酸細胞性筋膜炎、嗜酸細胞性胃腸炎、獲得性大皰性表皮鬆解症、結節性紅斑、原發性混合型冷球蛋白血症、埃文氏症候群、進行性骨化性纖維發育不良(firodysplasia ossificans progressiva)、纖維化肺泡、胃炎、胃腸道類天皰瘡、巨細胞動脈炎、腎小球腎炎、肺出血腎炎症候群、格雷夫斯氏病、格林-巴利症候群(GBS)、橋本氏腦炎、橋本氏甲狀腺炎、溶血性貧血、Henoch-Schonlein紫癜、妊娠皰疹、低丙球蛋白血症、特發性炎症性脫髓鞘疾病、特發性肺纖維化、特發性血小板減少性紫癜、IgA腎病、包涵體肌炎、炎性脫髓鞘性多發性神經病、間質性膀胱炎、幼年特發性關節炎、幼年型類風溼關節炎、川崎病、蘭伯特-伊頓肌無力症候群、白血球破裂性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線狀IgA病(LAD)、盧伽雷氏病、狼瘡狀肝炎、紅斑狼瘡、馬吉德症候群、美尼爾氏病、顯微性多血管炎、米勒-費雪症候群、混合性結締組織病、硬皮病、穆哈-哈伯曼病、多發性硬化、重症肌無力、肌炎、正視神經脊髓炎(neu1pyelitisoptica)、神經性肌強直、眼瘢痕性類天皰瘡、斜視性陣攣肌陣攣症候群、奧德甲狀腺炎(ordthyroiditis)、復發性風溼、副腫瘤性小腦變性、陣發性睡眠性血紅蛋白尿症(PNH)、ParryRomberg症候群、Parsonnage-Turner症候群、扁平部睫狀體炎、天皰瘡、尋常型天皰瘡、惡性貧血、靜脈周圍性腦脊髓炎、POEMS症候群、結節性多動脈炎、風溼性多肌痛、多肌炎、原發性膽汁性肝硬化、原發性硬化性膽管炎、進行性炎性病變、銀屑病、銀屑病關節炎、壞疽性膿皮病、純紅細胞再生障礙、Rasmussen氏腦炎、雷諾現象、復發性多軟骨炎、萊特爾氏症候群、多動腿症候群、腹膜後纖維化、類風溼性關節炎、類風溼性發燒、結節病、施密特症候群、施尼茨勒症候群、鞏膜炎、硬皮病、乾燥症候群、脊椎關節病、斯蒂爾病、僵人症候群、亞急性細菌性心內膜炎、Susac氏症候群、Sweet氏症候群、西德納姆舞蹈病、交感性眼炎、高安氏動脈炎、顳動脈炎、Tolosa-Hunt症候群、橫貫性脊髓炎、潰瘍性結腸炎、未分化結締組織病、未分化脊柱關節病、 血管炎、白癜風和韋格納氏肉芽腫病。
[0115]優選地，自身免疫性疾病選自癌症、糖尿病、血友病、葡萄膜炎和腦脊髓炎。
[0116]如本文中所使用，術語「癌症」包括任何類型的癌症，但優選包括由造血細胞產生的癌症，包括白血病，特別是B-CLL、CML或基於T細胞的白血病，諸如ALT，以及黑色素瘤。
[0117]轉導方法
[0118]本發明還涉及如上所定義的假型化病毒載體顆粒用於將上述「生物材料」部分中所定義的生物材料離體轉移入上述「造血細胞」部分中定義的造血細胞的用途。
[0119]本發明的另一個目的涉及用於轉導如上述「造血細胞」部分中定義的造血細胞的方法，其包括在實現通過假型化病毒載體顆粒轉導造血細胞的條件下將造血細胞與如上所定義的假型化病毒載體顆粒接觸。
[0120]如本文所預期，「轉移」或「轉導」涉及載體顆粒在結合靶細胞後初始將生物材料遞送至靶細胞的膜或細胞質的能力。遞送後，生物材料可以被轉運至細胞的其它隔室。
[0121]實現轉導靶細胞的條件是技術人員眾所周知的，並且通常包括優選以1、5、10或100的Μ0Ι、優選在無血清培養基中將待轉導的細胞(優選在用纖維連接蛋白包被的燒瓶、板或皿中培養，並且任選用細胞因子雞尾酒預刺激)與本發明的假型化病毒載體顆粒孵育。
[0122]包裝細胞系
[0123]本發明還涉及穩定的病毒包裝細胞系，其產生如上所定義的假型化病毒載體顆粒，所述假型化病毒載體顆粒包含至少一種嵌合包膜糖蛋白，所述嵌合包膜糖蛋白包含或由BaEV包膜糖蛋白的跨膜和胞外結構域與MLV包膜糖蛋白的胞質尾結構域的融合體組成。
[0124]事實上，本發明人證明了 BaEV/TR糖蛋白對293T生產細胞沒有細胞毒性。
[0125]在本發明的上下文中，穩定的病毒包裝細胞系是指穩定表達本發明的假型化病毒載體顆粒的不同組分的細胞系。通常，將編碼本發明的假型化病毒載體顆粒的不同組分的核酸整合到細胞系的基因組中。
[0126]特別地，此類穩定的病毒包裝細胞系可以是與慢病毒gag和pol基因的表達相容的任何細胞，或可工程化為支持此類表達的任何細胞。例如，它們可以是293T細胞和昆蟲細胞(特別是對於HIV衍生的載體)，可以使用TE671和HT1080細胞(特別是對於MLV衍生的載體)。
[0127]本發明將通過以下附圖和實施例來進一步說明。
[0128]附圖簡要說明
[0129]圖1顯示BaEV野生型糖蛋白、RDl 14/TR和BaEV/TR嵌合糖蛋白和BaEVRLess糖蛋白的示意性表示。RDl 14和BaEV野生型糖蛋白的胞質結構域交換成MLV-A糖蛋白之一，分別導致嵌合的RD114/TR和BaEV/TR糖蛋白。刪除BaEV野生型糖蛋白的胞質尾R肽，導致BaEVRLess突變體糖蛋白。
[0130]圖2顯示代表通過用系列稀釋的濃縮載體製劑感染HEK293T細胞而獲得的編碼GFP標記基因的不同假型化慢病毒載體顆粒(假型化的VSV-G⑴、RD114/TR⑵、BaEVwt (3)、BaEV/TR (4)和BaEVRLess (5))的滴度的柱狀圖。感染後3天通過細胞計數法測定GFP+細胞的百分比。感染性滴度計算為GFP感染單位(IU)/ml。顯示平均值(η = 7)，除了 BaEVwt (η = 3) ο
[0131]圖3 顯示代表通過 VSV-G (I)、RDl 14/TR (2)、BaEV/TR (3)或 BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒轉導HEK293T細胞相對於在FCS中孵育的相同病毒顆粒轉導的相對百分比的柱狀圖，所述假型化慢病毒載體顆粒在37°C下在熱滅活的人血清(白色條；血清在56°C下熱滅活，然後與載體孵育以滅活補體，其中新鮮血清含有活性補體)或在新鮮人血清(黑色條)中孵育I小時。顯示載體與3種不同供體(A、B和C)的血清孵育的值。
[0132]圖4 顯示代表通過 VSV-G (I)、RDl 14/TR (2)、BaEV/TR (3)或 BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以10的MOI轉導未刺激(白色條)、SCF預刺激(虛線條)、ΤΡ0預刺激(垂直陰影線條)，SCF+TP0預刺激(水平陰影線條)或SCF+TP0+FU3-L預刺激(黑色條)的人CD34+細胞的百分比的柱狀圖。轉導後6天進行表達GFP的細胞的分析。
[0133]圖5 顯示代表通過 VSV-G(X)、RD114/TR(_)、BaEV/TR(A)或 BaEVRLess 假型化慢病毒載體顆粒以1、5、10、20 (和對於VSV-G假型化慢病毒載體顆粒為100)的MOI轉導SCF/TP0預刺激的⑶34+細胞的百分比的圖。轉導後6天通過FACS進行表達GFP的細胞的分析。
[0134]圖6 顯示代表通過 VSV-G(X)、RD114/TR(_)、BaEV/TR(A)或 BaEVRLess 假型化慢病毒載體顆粒以1、5、10、20 (和對於VSV-G假型化慢病毒載體顆粒為100)的MOI轉導SCF+TP0+FU3-L預刺激的⑶34+細胞的百分比的圖。轉導後6天通過FACS進行表達GFP的細胞的分析。
[0135]圖7 顯示代表通過 VSV-G (I)、RDl 14/TR (2)、BaEV/TR (3)或 BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以100 (對於VSV-G)和10 (對於其他假型)的MOI轉導SCF+TP0預刺激(白色條)或SCF+TP0+FU3-L預刺激(黑色條)臍血衍生的⑶34+細胞後表達GFP的紅細胞、粒細胞和樹突狀細胞集落形成細胞(CFC)的百分比的柱狀圖。轉導後3天，將細胞接種在供給細胞因子的培養基中以誘導髓樣分化。接種後，在培養的第14天，通過螢光顯微鏡對紅細胞、粒細胞和樹突狀細胞集落形成細胞(CFC)進行評分。
[0136]圖8 顯示代表通過 VSV-G (I)、RDl 14/TR (2)、BaEV/TR (3)或 BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以100 (對於VSV-G)和10 (對於其他假型)的MOI轉導SCF+TP0預刺激的臍血衍生的CD34+細胞後表達GFP的紅細胞、粒細胞和樹突狀細胞集落形成細胞(CFC)(黑色條)和表達GFP的CD34+細胞(白色條)的百分比的柱狀圖。轉導後3天，將細胞接種在供給細胞因子的培養基中以誘導髓樣分化。在轉導後6天通過FACS分析測定GFP+⑶34+細胞的百分比。在轉導後17天通過FACS分析測定GFPCFC的百分比。星號表明GFP+⑶34+細胞的比例統計學上不同於GFP+集落轉導的細胞的比例(Student’s T檢驗:*:p < 0.05，NS:不顯著)ο
[0137]圖9 顯示代表用 VSV-G (I)、RDl 14/TR ⑵、BaEV/TR (3)和 BaEVRLess ⑷假型化慢病毒載體顆粒以括號中註明的MOI轉導SCF+TP0預刺激的CD34+細胞48小時後在骨髓中表達GFP的⑶45+人細胞(白色條)、⑶34+⑶19—未成熟祖細胞(黑色條)、⑶34+CD19+B祖細胞(虛線條)、CD20+B細胞(垂直陰影條)、CD13+髓樣祖細胞(水平陰影條)和CD14+粒細胞和單核細胞(斜線陰影條)的百分比的柱狀圖。照射新生Rag2+小鼠後，它們分別肝內注射2.1O5個轉導的人CD34+細胞。重構12周後，分析小鼠骨髓中的人細胞移植(⑶45)，並且如指示通過FACS分析不同造血細胞的轉導(GFP+細胞)的百分比。
[0138]圖10顯示代表用VSV-G、RD114/TR、BaEV/TR和BaEVRLess假型化慢病毒載體顆粒以括號中註明的MOI轉導SCF/TP0預刺激的CD34+細胞48小時後在脾臟中表達GFP的⑶45+人細胞(白色條)、⑶34+⑶10TD19—極不成熟祖細胞(黑色條)、⑶34+⑶1+CD19—B前/原B細胞(虛線條)、CD19+CD20-前B細胞(垂直陰影條)、CD34+CD10+CD19.未成熟B細胞(水平陰影條)、CD20+成熟B細胞(斜線陰影條)和CD3+T細胞(交叉陰影條)的百分比的柱狀圖。照射新生Rag2+ ； Y C^BalbC小鼠後，它們分別肝內注射2.1O5個轉導的人⑶34+細胞。重構12周後，分析小鼠脾臟中的人細胞移植(⑶45)，並且如指示通過FACS分析不同造血細胞的轉導(GFp+細胞)的百分比。
[0139]圖11 顯示代表通過 VSV-G (I)、RDl 14/TR ⑵、BaEV/TR (3)或 BaEVRLess ⑷假型化SIV載體顆粒轉導獼猴骨髓CD34+細胞相對於在FCS中孵育的相同病毒顆粒轉導的相對百分比的柱狀圖，所述假型化SIV載體顆粒在37°C下在熱滅活的獼猴血清(白色條；血清在56°C下熱滅活，然後與載體孵育以滅活補體，其中新鮮血清含有活性補體)或在新鮮獼猴血清(黑色條)中孵育I小時。顯示載體與2種不同獼猴(A和B)的血清孵育的值。
[0140]圖12顯示代表在存在纖維連接蛋白的情況下通過VSV-G⑴、BaEV/TR⑵或BaEVRLess (3)假型化SIV載體顆粒以括號中註明的MOI轉導後表達GFP的SCF+FU3-L+IL-3+IL-6預刺激的食蟹猴骨髓CD34+細胞的百分比的柱狀圖。
[0141]圖13顯示代表在存在纖維連接蛋白的情況下通過VSV-G⑴、BaEV/TR⑵或BaEVRLess (3)假型化SIV載體顆粒以括號中註明的MOI轉導後表達GFP的SCF+FU3-L+IL-3+IL-6預刺激的恆河猴骨髓CD34+細胞的百分比的柱狀圖。
[0142]圖14顯示代表在存在(黑色條)或不存在(白色條)纖維連接蛋白的情況下通過 VSV-G(I)、RDl 14/TR(2)、BaEV/TR(3)或 BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以 10 的MOI轉導後表達GFP的IL-7預刺激的T細胞的百分比的柱狀圖。
[0143]圖15 顯示代表通過 VSV-G(I)、RD114/TR(2) ,BaEV/TR(3)或 BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以括號中註明的MOI轉導後表達GFP的IL-7預刺激的記憶性T細胞(白色條)和初始T細胞(黑色條)的百分比的柱狀圖。
[0144]圖16顯示代表在存在(黑色條)或不存在(白色條)纖維連接蛋白的情況下通過 VSV-G(I)、RD114/TR(2)、BaEV/TR(3)或 BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以 10 的MOI轉導後表達GFP的TCR預刺激的T細胞的百分比的柱狀圖。
[0145]圖17顯示代表在存在(黑色條)或不存在(白色條)纖維連接蛋白的情況下通過VSV-G(I)、RD114/TR(2)、BaEV/TR (3)或BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以括號中註明的MOI轉導後表達GFP的靜息B細胞的百分比的柱狀圖。
[0146]圖18 顯示代表通過 VSV-G(I)、RD114/TR(2) ,BaEV/TR(3)或 BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以括號中註明的MOI轉導後表達GFP的記憶性靜息B細胞(白色條)和初始靜息B細胞(黑色條)的百分比的柱狀圖。
[0147]圖19 顯示代表通過 VSV-G(I)、RD114/TR(2)、BaEV/TR (3)或 BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以括號中註明的MOI轉導後表達GFP的BCR預刺激的記憶性靜息B細胞(白色條)和初始靜息B細胞(黑色條)的百分比的柱狀圖。
[0148]圖20顯示代表在存在(黑色條)或不存在(白色條)纖維連接蛋白的情況下通過VSV-G(I)、RD114/TR(2)、BaEV/TR (3)或BaEVRLess (4)假型化慢病毒載體顆粒以括號中註明的MOI轉導後表達GFP的MZL B細胞的百分比的柱狀圖。
[0149]圖2IA顯示代表在小鼠的第一次和第二次移植後通過FACS檢測的GFP+h⑶45+細胞的百分比的圖。臍血h⑶34+細胞用細胞因子雞尾酒(TP0+SCF+Flk-3L)預刺激16h，並用BaEV/TR-LV和BaEVRLess-LV以MOI = 10轉導36h。隨後，將細胞(2xl05個)注射到照射的新生NOD/SCIDyc-/-小、鼠(NSG小鼠)的肝臟中。重構8-9周後，這些初始小鼠移植(第一次)的不同造血組織(骨髓、脾臟和胸腺)通過抗hCD45染色分析人細胞移植。對於每種載體類型和各造血組織註明通過FACS檢測的GFP+hCD45+細胞的百分比。隨後，從各這些初始移植小鼠的骨髓中分離hCD34+細胞，並且在初始移植的相同程序後將1-2χ105個分離的h⑶34+細胞注射到一隻或兩隻小鼠中。移植後8-9周，分析這些第二次(第2次)移植小鼠的骨髓、脾臟和胸腺中轉導的人細胞移植(hCD45+GFP+)。初始和相應第二次移植通過相同符號註明。圖21B顯示代表針對BaEV/TR-LV轉導通過FACS檢測代表性第二次受體NSG小鼠的骨髓樣品中GFP+人B細胞(CD19+)、人未成熟祖細胞(CD34+)和髓樣祖細胞(CD13+)的圖。
[0150]圖22A顯示胸腺細胞分化的示意圖。HSC，造血幹細胞；DN，雙陰性；ISP，未成熟的CD4單陽性細胞；DP，雙陽性；SP4，單陽性CD4+ ;SP8，單陽性CD8+ ;TCR，T細胞受體。圖22B顯示代表用編碼GFP報導分子的VSV-G-、RD114/TR-、BaEV/TR-和BaEVRLess-LV以10的MOI轉導後表達GFP的新鮮分離的胸腺細胞的百分比的柱狀圖。對⑶3、⑶4和⑶8多重染色後，通過FACS測定不同胸腺細胞亞群中的轉導。圖22C顯示代表與未轉導的胸腺細胞相t匕，將總胸腺細胞與不同載體孵育後不同胸腺細胞亞群的分布的柱狀圖。
[0151]圖23A顯示代表用IL-7預刺激48h且隨後用編碼GFP報導分子的不同載體:VSV-G-、RD114/TR-、BaEV/TR-和 BaEVRLess-LV 以 50 的 MOI 轉導後表達 GFP 的新鮮分離的總CB T細胞的百分比的柱狀圖。轉導第3天，針對人表面標記(⑶45RA、⑶62L、⑶31)對細胞進行染色，並且通過FACS分析測定最近胸腺細胞遷移者(RA+/62L+/31+)和更成熟的初始CB T細胞(RA+/62L+/31-)的轉導效率。圖23B顯示代表與未轉導的T細胞相比，將CBT細胞與不同載體孵育後不同初始CB T細胞亞群的分布的柱狀圖。

【具體實施方式】
[0152]以下實施例表明了 BaEV/TR-和BaEVRLess假型慢病毒載體顆粒用作基因轉移載體相比於之前的假型慢病毒載體的有利特性。
[0153]材料與方法
[0154]慢病毒載體的產生和滴定
[0155]通過瞬時轉染HEK293T細胞(美國典型培養物保藏中心，Rockville, MD，CRL-1573)生成自我失活的HIV-1-衍生的載體。在轉染前24小時，將2.6106個HEK293T細胞接種至10-cm2組織培養皿上。使293T細胞在補充有10%胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM, Invitrogen)中生長。使用8.6 μ g Gag-Pol包裝構建體8.91和編碼GFP的HIV-1衍生的SIN轉移載體pHIV-SFFV-GFP-SIN和2.5 μ g編碼VSV-G糖蛋白(GP)的 pMD.G 或 7 μ gphCMV-RD 114/TR, phCMV-BaEVWT, phCMV-BaEV/TR 或 phCMV-BaEVRLess通過磷酸沉澱轉染細胞。在轉染後16小時,用無血清培養基(Opt1-MEM, Invitrogen)替代DMEM培養基，並在轉染後36小時，收穫載體，過濾通過0.45 μ m孔徑的膜，並使用超濾濃縮系統(Vivaspin，Satorius ;3000g，2小時(4°C ))，或通過將病毒上清液在4°C下以3000g離心過夜而低速濃縮或者通過超速離心(4°C，25000rpm，2小時)而濃縮。隨後，將載體儲存於-80°C。為了測定HIV載體的轉染效率和感染滴度，將載體製備物的系列稀釋液添加至293T細胞，並在轉導後3天通過流式細胞術測定GFP+細胞的百分比。將感染滴度表示為感染性載體顆粒/每毫升(感染性單位IU/mL)。在增殖的293T細胞上測定感染複數(MOI)，並在所有轉導實驗中標明。
[0156]假型載體在人或獼猴血清中的穩定性。
[0157]將感染性假型HIV或SIV載體顆粒(在50 μ I懸浮緩衝液中150000個GFP感染性單位)與50 μ I熱滅活或新鮮的人血清混合。作為參考，將病毒顆粒在37°C下孵育I小時，然後用於轉導HEK293T靶細胞。計算人血清孵育的病毒顆粒的轉導相對於FCS中孵育的相同病毒顆粒的轉導的百分比。
[0158]樣品收集和人⑶34+細胞的分離
[0159]根據赫爾辛基宣言在知情同意後將來自足月妊娠的臍帶血(CB)樣品收集在含有抗凝血劑(SIGMA)的無菌試管中。通過在Lymphoprep墊(Axis shield)上離心分離低密度PBMC細胞。根據製造商的說明書使用CD34磁性分離試劑盒(Miltenyi MACS7MiltenyiB1tec)從單核細胞級分純化⑶34+幹細胞/祖細胞。用APC-結合的抗⑶34抗體(BDPharmingen)通過FACS分析評估所選擇的⑶34+級分的純度,其對於所有實驗均超過95 %。隨後，將CD34+細胞冷凍在FCS (胎牛血清，Lonza)，10% DMSO中並儲存於_80°C。
[0160]T細胞和B細胞分離和慢病毒轉導
[0161]將在知情同意後從健康成年供體獲得的成體外周血樣品收集在含有酸性檸檬酸葡萄糖(AO))的管中。使用花環四聚體複合物系統(StemSep Technologies, Vancouver,Canada)通過陰性選擇純化⑶3+T細胞和⑶19+B細胞。分別使用抗h⑶19APC和抗h⑶3APC抗體監測分離的B細胞和T細胞的純度，並通過螢光激活細胞分選法(FACScalibur ；BD)進行分析。將T和B淋巴細胞在補充有10% FCS和青黴素/鏈黴素的RPMI1640培養基(GibcobRL Invitrogen, Auckland, New Zealand)中培養。將 T 細胞在存在 hIL_2 (lng/ml)的情況下用抗⑶3+抗CD28抗體(I μ g/ml)預刺激或者用rIL_7預刺激3天，如Verhoeyen等人(2003)BloodlOl:2167-2174(10ng/ml ；BDB1sciences, Le Pont de Claix, France)所述。將B細胞立即接種用於轉導或用金黃色葡萄球菌Cowan (SAC ；0.001 % ；Calb1chem,San Diego, CA)+IL-2 (lng/ml ；SIGMA)預刺激，如 Levy 等人.(2010)Bloodll6:498-500 所述。簡而言之，將1E5細胞接種在48孔板中，並以指定劑量添加濃縮載體。在轉導後72小時通過FACS測定GFP+細胞的百分比。將轉導的T細胞在補充有rhIL-7的RPMI中繼續培養，每3天補充，並收穫用於FACS分析、qPCR和Alu-PCR。將B細胞轉移至在補充有10%AB 血清、5% FCS、50ng/ml rhSCF、10ng/ml rhIL-15 和 5ng/ml rhIL-2 的 RPMI 中的 MS5 細胞單層，每4天更新培養基。
[0162]獼猴骨髓⑶34+細胞的分離
[0163]根據國家指南，從模里西斯進口 3-4.5kg的成年雄性食蟹猴(食蟹猴(Macacafascicularis)),並單籠圈養在2級生物安全動物設施(CEA, Fontenay-aux Roses)中。所有實驗程序均根據歐洲動物護理指南進行。根據動物實驗區域委員會批准的方案進行研究。在用10mg/kg氯胺酮(ImalgSne 1000)麻醉動物後進行所有程序和血液採樣。
[0164]通過針吸(aspirat1n)從肱骨和髂骨獲得骨髓單核細胞並通過標準Ficoll密度梯度離心來分離。將細胞在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中洗滌兩次並重懸浮於PBS/1%FCS中。然後根據製造商的說明通過陽性免疫磁性選擇(克隆561 ；Dynabeads M-450CD34 ；Dynal)富集級分。免疫選擇後，使用抗⑶34單克隆抗體(克隆563，BD-Pharmingen)將⑶34+細胞純化級分染色。⑶34+選擇細胞的純度範圍為85-95%。
[0165]轉導人和獼獼HSC。
[0166]將人和獼猴CD34+細胞在24孔板中在補充有抗生素(PENSTREP，Invitrogen)和人重組細胞因子(如註明):幹細胞因子(rSCF，100ng/ml)、血小板生成素(ΤΡ0，20ng/ml)和Flt3配體(Flt3_L, 100ng/ml) (Preprotech)(用於人CB CD34+細胞)的無血清培養基(CellGro，CellGenix)中孵育過夜。對於食蟹猴骨髓⑶34+細胞，將人重組白細胞介素(IL-6) (20ng/ml)和白細胞介素(IL-3) (20ng/ml) (Preprotech)添加至之前的雞尾酒中。將5.1O4個預刺激的CD34+細胞在48孔板中在無血清培養基(CellGro，CellGenix)中用MOI為1、5、10、20或100 (如指示)的濃縮慢病毒載體上清液轉導。當指示時,在纖維連接蛋白(retronectin)包被板(重組人纖連蛋白片段CH-296) (Takara)上進行轉導。在轉導後第3天，用細胞因子補充細胞。轉導3天和6天後，通過流式細胞術測定GFP+細胞的百分比。
[0167]⑶34+細胞的克隆形成測定
[0168]將CD34+細胞如上文所述進行轉導，在PBS(Invitrogen)中洗滌並且以1000個細胞/ml的密度鋪板在完全甲基纖維素培養基(1%甲基纖維素，15(%?85，1(%854，牛胰胰島素[I μ g/ml],鐵飽和轉鐵蛋白[200mg/ml], 10-4M2-巰基乙醇,2mM L-穀氨醯胺，SCF[50ng/ml], IL-3 [10ng/ml], IL-6 [10ng/ml],促紅細胞生成素[3U/ml]) (Stem Celltechnologies)中。在接種後14天通過光鏡和突光顯微鏡對GFP+集落評分。
[0169]Western 印跡分析
[0170]通過超速離心(2小時，25000rpm, 4 °C )在蔗糖墊上純化BaEVwt、BaEV/TR和BaEVRLess假型LV，並在重懸浮於PBS中後進行冷凍。膜的上部用針對BaEV糖蛋白的表面結構域的抗體染色，膜的下部用針對P24HIV-1衣殼的抗體染色，以評估純化載體的等同載荷。指示了 BaEV突變體糖蛋白和HIV衣殼的位置。
[0171]動物
[0172]從Mamoro Ito 博士和 Taconic (CIEA, Kawasaki, Japan)獲得 BALB/cRag2+,Yc_7_免疫缺陷小鼠。將使用的所有小鼠飼養在Ecole Normale Superieure de Lyon,France (PBES)的動物設施中。將動物在整個實驗期間保持在無菌條件下，並且由當地倫理委員會批准方案後根據機構動物護理指南進行所有實驗。
[0173]Balb-c Rag2^, Y cv_小鼠的條件化和重構
[0174]將2-4日齡的新生BALB/c Rag2^, Y c+小鼠進行2x1.5Gy的亞致死照射。為了評估轉導的hCB-⑶34+細胞的重構/分化能力，將後者細胞以10的MOI用BaEV/TR-、BaEVRLess-、RDl 14/TR-, VSV-G-LV轉導，並且在轉導後48小時，將2.1O5個細胞肝內注射入新生小鼠。在人細胞移植10-12周時，從面靜脈採集外周血，以通過FACS分析人移植(h⑶45+細胞)的百分比來檢查重構效率。
[0175]FACS 分析
[0176]在人細胞移植的10-12周時根據生物倫理程序處死小鼠，並收穫所有造血組織。隨後，從骨髓、脾、胸腺和外周血提取細胞。為了檢測移植細胞的LV轉導，使用APC-偶聯的抗hCD45抗體進行流式細胞術分析，用於檢測骨髓中的總的人細胞移植。APC-偶聯的抗體(BD Pharmingen)用於檢測h⑶19 (B細胞)、h⑶34 (早期祖細胞)和h⑶13 (髓樣祖細胞)。
[0177]MS
[0178]突變體BaEV/TR糖蛋白和BaEVRLess糖蛋白可以有效假型化HIV-1載體
[0179]本發明人通過用MLV-A糖蛋白之一交換其胞漿結構域來工程化BaEV/TR嵌合糖蛋白(圖1)。通過從羧基末端胞質結構域刪除融合抑制性R肽而工程化第二個突變體，導致BaEVRLess糖蛋白(圖1)。本發明人比較了這些不同的突變BaEV糖蛋白將源自HIV-1的慢病毒載體假型化為VSV-G和RDl 14/TR糖蛋白的能力。
[0180]通過用gagpol包裝和編碼GFP的HIV載體一起瞬時轉染HEK293T細胞而生成RD114/TR、BaEV/TR、BaEVRLess和VSV-G假型化HIV載體。通過低速或超速離心(100倍)濃縮載體上清液。在HEK293T細胞上的感染測定表明，對於BaEV/TR和BaEVRLess假型化LV獲得高於1.107IU/ml的滴度，導致與BaEVwt-LV相比滴度增加40倍。RD114/TR和VSV-G假型化載體得到6.10 7IU/ml和1.109IU/ml的滴度(圖2)。免疫印跡證實，與等量HIV-1衣殼的BaEV/TR和BaEVRLess糖蛋白相比，慢病毒載體表面上BaEVwt糖蛋白的引入更少。這些數據與BaEV/TR和BaEVRLess假型化LV與BaEVwt-LV相比獲得的滴度增加一致。
[0181]BaEV突變體糖蛋白假型化LV (BaEV/TR和BaEVRLess)的感染滴度與RD114/TR-LV之一類似，並因此進一步考慮用於轉導人CD34+早期祖細胞和T細胞和B細胞。
[0182]BaEV突變體假型化載體的穩定性和對人血清滅活的耐受性
[0183]鑑於臨床體內應用，BaEV突變體假型化LV必須耐受人補體系統。該穩定性通過比較在56°C下在人血清中孵育I小時的LV的感染滴度來測定。據報導熱破壞人補體，所以熱滅活的人血清用作對照。將獲得的殘餘感染滴度報導為與胎牛血清孵育的LV的感染性(100 % )(圖3)。如預期的，VSV-G假型化LV被3種不同的人血清滅活。BaEV/TR和BaEVRLess假型化LV在存在含補體的血清的情況下保持穩定，因為對於三種不同供體，在存在人補體的情況下孵育後檢測到轉導效率沒有降低。因此，本發明人得出結論:BaEV/TR和BaEVRLess LV對人補系統統耐受的程度與RD114/TR-LV相同。對於體內應用，BaEV突變體假型化LV在人血清中的穩定性使得它們成為比VSV-G LV假型更好的候選。
[0184]對於人CD34+細胞的轉導，BaEV假型化LV高度優於VSV-G-和RD114/TR-LV
[0185]BaEV/TR和BaEV RLess假型化LV都結合hCD34+細胞的細胞膜上的hASCTl和hASCT2，而RD114/TR LV只結合hASCT2。據之前描述，RD114/TR-LV只能在存在纖維連接蛋白(retronectin)的情況下有效轉導h⑶34+細胞。事實上，纖維連接蛋白是據報導允許結合細胞和載體兩者並因此增加h⑶34+細胞的轉導的纖連蛋白的片段。為了評價纖維連接蛋白在BaEV假型化LV轉導中的作用，本發明人最初用強細胞因子雞尾酒(rSCF+rTP0+rFlt3-L)預先刺激h⑶34+細胞，並且在包被或未包被纖維連接蛋白的孔中用VSV-G, RD114/TR, BaEV/TR, BaEVRLe s s假型化LV以10的MOI轉導它們。本發明人觀察到，在存在纖維連接蛋白的情況下，BaEV-LV都以超過70%轉導h⑶34+細胞。
[0186]如上面所提到的，用細胞因子雞尾酒強烈刺激將誘導HSC分化並使它們喪失自我更新能力。事實上，細胞被預刺激越少，它們分化也越少，且它們保持它們的^幹細胞^特徵越多。此外，細胞因子刺激越強，在高載體劑量時每個細胞將發生多載體整合的風險越高。這可能會增加基因治療應用中基因毒性的風險。因此，本發明人測試了在低細胞因子預刺激與低載體劑量組合後BaEV假型化LV是否可以有效地轉導h⑶34+細胞。
[0187]首先，他們對於hCD34+細胞採用固定的10的MOI (感染性顆粒的數量/每個細胞)和不同的細胞因子預刺激方案(圖4):1)無刺激；2)用單一細胞因子rSCF或rTPO刺激；3)rSCF和rTPO ；4) rSCF+rTP0+rFlt3_L。重要的是，本文使用的最強細胞因子預刺激低於目前在臨床設置中使用的目標在於限制細胞分化的刺激雞尾酒。本發明人觀察到，對於BaEV假型化LV，單一 TPO刺激足以用於轉導高達60%的hCD34+細胞，而VSV-G-LV和RD114/TR-LV在TPO刺激後只轉導8-20 %的h⑶34+細胞。SCF單一預刺激允許轉導高達30-50 %的h⑶34+細胞，而 VSV-G-LV 和 RD114/TR-LV 只達到 10% 的轉導水平。TP0+SCF 或 TP0+SCF+FLK-3 預刺激與單一 BaEV-LV孵育的組合導致轉導高達75%的h⑶34+細胞，而RD114/TR-LV實現不超過40%的轉導。總之，對於所有不同的細胞因子預刺激方案，對於h⑶34+細胞轉導，BaEVLV假型的表現勝過VSV-G-和RD114/TR-LV。此外，在未刺激的細胞上獲得的結果表明，在存在纖維連接蛋白的情況下，BaEV/TR LV和BaEVRLess LV能夠轉導10-20%的未刺激的hCD34+細胞。相反，VSV-G-和RDll4/TR LV以相同的載體劑量(Μ0Ι = 10)無法有效轉導未刺激的靜態h⑶34+細胞。
[0188]其次，必須避免插入突變的風險以限制基因治療的副作用。因此，為了限制多拷貝整合，本發明人降低載體劑量。在rSCF+rTPO和rSCF+rTP0+rFlt3_L刺激下測試不同的MOI (圖5和6)。BaEV/TR假型化LV在低載體劑量時明顯更好地轉導h⑶34+細胞，在5的MOI 達到 60 % (rSCF+rTPO)和 70 % (rSCF+rTP0+rFlt3-L)。BaEVRLess-LV 在 5 的 MOI 高度優於RD114/TR-LV。VSV-G LV在低載體劑量(M0I5-10)時效率仍低得多。只有在100的MOI (目前用於臨床基因治療試驗的載體劑量)，這些VSV-G-LV允許有效轉導h⑶34+細胞。但VSV-G-LV轉導率仍遠低於BaEV-LV的轉導率(VSV-G-LV(Μ0Ι為100) = 50-60%和BaEV-LV(Μ0120) = 75-90%;圖5和6)。在更高的刺激條件下，本發明人注意到，對於BaEV/TR-LV 和 RDll4/TR LV，BaEV/TR-、BaEVRLess-LV 和 RDl 14/TR-LV 在 10 的 MOI 達到穩態(分別為75%和50%的轉導)。因此，與小於或等於10的低載體劑量的BaEV LV孵育足以非常有效地轉導hCD34+細胞，並且程度比RD114/TR-LV和VSV-G LV高得多。總之，BaEV假型化LV和特別是BaEV/TR-LV似乎比當前可用的VSV-G-LV和RD114/TR-LV載體更有效地轉導h⑶34+細胞。顯然，VSV-G-LV h⑶34+細胞轉導效率取決於細胞因子刺激雞尾酒，而對於BaEV假型化LV則不是這樣的。
[0189]低BaEV-LV載體劑量允許以高比率轉導短期祖細胞。
[0190]本發明人想確認用BaEV假型獲得的高hCD34+細胞轉導是由於短期祖細胞的穩定轉導。因此，他們通過在半固體甲基纖維素培養基中進行克隆形成測定來確定造血祖細胞上BaEV假型化LV的轉導效率。以10的MOI用RD114/TR、BaEV/TR、BaEVRLess假型化載體和以100的MOI用VSV-G轉導rSCF+rTPO和rSCF+rTP0+rFlt3_L預刺激的細胞。本發明人對於VSV-G選擇更高的Μ0Ι，因為臨床試驗目前對於該假型以100的MOI轉導h⑶34+細胞。因此，使用該高載體劑量用於比較似乎更相關。轉導後三天，將細胞在甲基纖維素培養基(補充有細胞因子)中培養，其允許它們分化成髓樣集落。發明人觀察14天後表達或不表達GFP+的成紅細胞集落、粒單核細胞(granulomonocytic)集落和混合集落。首先，他們比較了對於不同預刺激的表達GFP的集落數(圖7)。對於所有測試的載體，兩種刺激都給出了類似結果。以10的MOI用兩種BaEV突變體假型化載體轉導的集落形成祖細胞的比例高於以100的MOI用VSV-G —種轉導的集落形成祖細胞的比例(BaEV/TR-LV = 50-70%,BaEVRLess-LV = 45-70 %, VSV-G-LV = 25-50 % ) ? 在用於 BaEV/TR 和 BaEVRLess 假型化LV的相同載體劑量，只有10-35%的集落形成祖細胞克隆用RD114/TRLV假型轉導。在rSCF+rTPO預刺激後RDl 14/TR-、BaEV/TR-、BaEVRLessLV轉導的CD34+細胞與由它們衍生的集落形成祖細胞的比例之間沒有顯著差異，表明hCD34+細胞轉導是穩定的(圖8)。相反，對於VSV-G LV，集落形成祖細胞的比例顯著低於它們衍生的轉導的⑶34+細胞的比率(圖8)，表明VSV-G假型化載體轉導更多的分化CD34+細胞或者比其它測試載體毒性更大。
[0191]這些結果顯示，BaEV/TR-和BaEVRLess-LV假型以高比率轉導短期再植祖細胞。
[0192]BaEV假型化LV在免疫缺陷小鼠中以高效率轉導再植造血祖細胞
[0193]為了測定兩種BaEV突變體假型化載體在再植造血祖細胞上的轉導效率，臍血CD34.細胞用rSCF、rTPO和FLk_3L預刺激16小時，然後以10的MOI用RD114/TR, BaEV/TR，BaEVRLess假型化載體或以100的MOI用VSV-G-假型化LV轉導，並移植入亞致死照射的免疫缺陷的Balbc, Rag2^, y z+新生小鼠或NOD/SCID/ y c-/_ (NSG)小鼠(表1)。兩種小鼠模型允許移植完整的人血液系統，因為它們缺乏T、B和NK細胞。
[0194]8-10周後，將動物處死，並通過FACS分析測定骨髓中的總人體血液有核細胞表1.BaEV/TR-和BaEVRLess-LV允許有效轉導SCID再植細胞

【權利要求】
1.用於將生物材料轉移到細胞中的假型化病毒載體顆粒，其中所述載體顆粒至少包含: -嵌合包膜糖蛋白，其包含或由狒狒內源性逆轉錄病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外結構域與鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞質尾結構域的融合體組成；或-修飾的BaEV包膜糖蛋白，其中胞質尾結構域缺乏融合抑制性R肽。
2.根據權利要求1所述的假型化病毒載體顆粒，其中所述病毒載體顆粒是慢病毒載體顆粒。
3.根據權利要求2所述的假型化病毒載體顆粒，其中所述慢病毒載體顆粒選自HIV和SIV。
4.根據權利要求1-3任一項所述的假型化病毒載體顆粒，其中所述生物材料是一種或多種核酸。
5.根據權利要求1-4任一項所述的假型化病毒載體顆粒，其中所述病毒載體顆粒進一步顯示至少一種選自幹細胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、IL-2、IL-15和IL-7的細胞因子。
6.根據權利要求1-5任一項所述的假型化病毒載體顆粒，其中所述假型化病毒載體顆粒意欲用於將生物材料轉移入造血細胞。
7.根據權利要求1-6任一項所述的假型化病毒載體顆粒，其用於治療造血功能障礙或自身免疫性疾病。
8.根據權利要求7所述的假型化病毒載體顆粒的用途，其中所述造血功能障礙選自範可尼貧血、血友病、β -地中海貧血、Wiskott-Aldrich症候群、X-連鎖重症聯合免疫缺陷、腺苷脫氨酶缺乏症、慢性肉芽腫病和腎上腺腦白質營養不良。
9.用於產生假型化病毒載體顆粒的方法，其包括 a)用以下物質轉染細胞以得到生產細胞: (i)至少一種第一核酸序列，包含具有包裝能力的逆轉錄病毒衍生的基因組； (?)至少一種第二核酸序列，包含編碼來自所述逆轉錄病毒的核心蛋白的cDNA，和 (iii)至少一種第三核酸序列，包含編碼以下的cDNA: -嵌合包膜糖蛋白，包含或由狒狒內源性逆轉錄病毒(BaEV)包膜糖蛋白的跨膜和胞外結構域與鼠白血病病毒(MLV)包膜糖蛋白的胞質尾結構域的融合體組成，如上所定義；或-修飾的BaEV包膜糖蛋白，其中胞質尾結構域缺乏融合抑制性R肽，如上所定義； b)將所述生產細胞在培養物中維持足夠時間，以允許表達cDNA以產生編碼蛋白；和 c)允許編碼蛋白形成假型化病毒載體顆粒。
10.藥物，其包含作為活性成分的如權利要求1-5任一項中定義的假型化病毒載體顆粒。
11.如權利要求1-5任一項中定義的假型化病毒載體顆粒用於將生物材料離體轉移到造血細胞中的用途。
12.用於轉導造血細胞的方法，其包括在實現通過所述假型化病毒載體顆粒轉導所述造血細胞的條件下將所述造血細胞與如權利要求1-5任一項中定義的假型化病毒載體顆粒接觸。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述造血細胞選自造血幹細胞、⑶34+祖細胞、非常早期⑶34+祖細胞、B細胞⑶19+祖細胞、髓樣⑶13+祖細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、樹突狀細胞、外周血⑶34+細胞、癌B細胞(BCLL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)B細胞和胸腺細胞。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述造血細胞不用至少一種細胞因子預刺激。
15.穩定的病毒包裝細胞系,其產生如權利要求1-5任一項中定義的假型化病毒載體顆粒。
【文檔編號】A61K48/00GK104080917SQ201280053749
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2012年9月28日 優先權日:2011年9月29日
【發明者】阿奈·吉拉爾-加涅潘, 埃爾莎·費爾赫芬, 迪米特裡·拉維爾特, 弗朗西斯-盧瓦克·科塞 申請人:國家健康與醫學研究院, 裡昂高等師範學院