一種人生長素融合蛋白TAT-hGH及其製備方法和應用的製作方法

2023-12-09 09:00:56 1

專利名稱：一種人生長素融合蛋白TAT-hGH及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因生物工程技術領域，具體涉及一種人生長素TAT-hGH重組融合蛋白，更具體涉及含有人生長素基因的基因工程菌株E. coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)，本發明還涉及所述TAT-hGH重組融合蛋白的製備方法以及該融合蛋白TAT-hGH在促細胞增殖、促動物生長和穿腸中的應用。
背景技術：
人生長素(human growth hormo ne, hGH)是一種由人的腦垂體前葉合成並分泌的蛋白類激素。生長激素先翻譯成激素原，即生長激素前提蛋白，生長激素前體蛋白含有217個胺基酸，氨基端f 26個胺基酸為信號肽，若信號肽的不能特異性切除，則該激素無法產生活性。成熟的人生長激素是單一無糖基化多肽鏈，由191個胺基酸組成，N端和C端均為苯丙氨酸，分子量在 22kDa 左右(ChohHaoLi (1982) Human Growth Hormone 1979一1981.Molecular and CellularBiochemistry,46 :31-41 )。含兩個二硫鍵，由這些半胱氨酸殘基形成的二硫鍵對生長激素生物活性的穩定維持著極其重要的作用。生長素通過介質，間接促進生長期的骨骺軟骨形成，促進骨及軟骨的生長，從而使軀體增高。生長激素對中間代謝及能量代謝也有影響，可促進蛋白質合成，增強對鈉、鉀、鈣、磷、硫等重要元素的攝取與利用，同時通過抑制糖的消耗，加速脂肪分解，使能量來源由糖代謝轉向脂肪代謝。目前在臨床上，已被廣泛地用於兒童生長激素缺乏症、成人生長激素缺乏症、大面積燒傷、短腸綜合症、腸外瘻、急性壞死性胰腺炎、重症感染、擴張性心肌病、呼吸功能衰竭、重症B肝(肝硬化)、腎衰等治療領域，在減肥、美容等領域也在迅速增長。值得一提的是現在科學發現hGH減少才會出現人體的衰老。在人的青春期，hGH的分泌量逐步上升，直到青春期後期，達到高峰，之後逐漸下降，60歲以上的老年人，他的hGH的分泌量不到青春期最高峰值的1/6，分泌水平已經不到青春期的一半，從此以後人體開始顯露衰老跡象。1996年，美國FDA批准HGH為唯一的抗衰老激素治療藥物。hGH能起作用，絕大部分情況下都是通過胰島素樣生長因子(InsiUinGrowthFactor, IGF)介導。人體有很多組織都能合成並分泌IGF，IGF是一種受hGH調節的單鏈多肽，包括IGF1、IGF II等，hGH的大多數效應都是由IGF I介導，而血液中的IGF I主要來源於肝(DauhGHaday ff. H., Rotwein P. (1989) Insulin-like growth factors Iand I1:Peptide，messenger ribonucleic acid and genestructures，serum，and tissueconcentrations. Endocrine Review,10:68—91)。在1920年，科學家就發現了 hGH的存在，最初的來源是提取於動物的垂體，但是臨床試驗發現，在人體中，這種GH是沒有活性的。1956年，科學家李和PapkofT首次從人的垂體中提取出hGH，1958年，美國內分泌學家M. Rabem首次將hGH注射到一個缺乏hGH的小孩體內，治癒了第一例侏儒症，使hGH真正開始了在臨床上的應用。但是從人體中提取的hGH，不僅受到資源限制，同時成本過高，還存在的病毒汙染，美國食品和藥物管理局下令停止生產和銷售這種從人腦中提取的天然的hGH。而如今hGH大多採用基因工程的方法生產。基因工程方法的生產也可分成兩類一類是在原核生物中生產，另一類是在真核細胞中生產。在1979年，Gooddel等就已將化學合成的hGH DNA轉錄入大腸桿菌表達載體的Iac啟動子末端，再將這個質粒轉化大腸桿菌，經過發酵，從表達產物中純化得到Met—rhGH。這是第二代生長激素，也是rhGH的第一代產品。雖然這種hGH的治療效果與天然的hGH無異，但是由於它比天然的hGH N端多一個Met殘基的，使用後，50%-80%的病人會產生抗體，所以N端不帶Met的rhGH的出現就備受期待。直到1985年，191個胺基酸的rhGH終於出現，Gray和他的同事在將rhGH基因連接到大腸桿菌鹼性磷酸酶的信號肽序列之後，使rhGH分泌到大腸桿菌的周質空間，但是產量很低。此時rhGH的發展，進入了第二代，產量成了 rhGH生產研究上的追求。1986年Becker和Hsiun將ompA作為引導序列，rhGH產量可達10—15 u g/mL, 1987年，Chang等人利用STII作為引導序列，在phoA啟動子下，表達的rhGH產量達到了 15 20 yg/mL，產量得到進一步提高，目的基因的表達佔了菌體總蛋白的6% 10%，其定位在細胞周質中，且超過90%在菌體中表達的rhGH被正確的引導和加工。同年，Kato等將hGH基因和細菌的kill gene相聯，hGH的分泌表達量達到20. 5mg/L，其中可
以直接分泌到培養基中的rhGH達11. 2mg/L，而滯留在周質空間的約有8. 6mg/L。1989年，HsillIlg等利用細菌素釋放蛋白的表達和外膜蛋白omp的信號肽，進一步提高了 hGH的表達水平，使其分泌至大腸桿菌培養基中的表達水平提高69. 6 u g/mL。除使用大腸肝菌表達系統之外,在原核表達這方面,枯草桿菌表達系統也是一大熱門，比較為大家熟知的是美國的Gencncor和Genentech公司，他們通過詳細的比較幾種啟動子、核糖體結合位點序列、轉錄終止子和宿主菌株，優化組合，最終rhGH表達量可以達到1. 5g/L。原核表達系統之外，越來越多的研究集中於真核表達系統，真核表達系統中使用最多的是酵母表達系統，土耳其的Plnar Callk研究了 PH對畢式酵母表達rhGH的影響，發現在PH為5.0時，產量達到最高值0. 27g/L。除此之外，Johanna利用中國倉鼠卵巢細胞表達系統表達了 rhGH,經過純化獲得了 35. 8iig/ml的蛋白，K. Kadonookuda等人利用杆狀病毒作為表達載體，轉入家蠶幼蟲，使rhGH的表達量達到每毫升的家蠶幼蟲血淋巴中有160 y g蛋白。Lipiiiski D等開發了一種轉基因兔的生產系統，即利用家兔作為最終生產系的乳腺反應器。原理是將hGH基因以及鼠的乳腺表達啟動子相連後，轉入兔的受精卵細胞，人工受精，獲得Fl代雌兔，至其哺乳期，從其乳汁中可以純化出hGH。但是真核表達通常要求技術高、而且表達周期長，產量較原核表達低，而且由於hGH沒有糖鏈，用原核表達也不會存在由於翻譯後無修飾造成對生物活性的影響，因此市場中的大部分rhGH原核表達系統為主,而且以大腸桿菌系統表達佔多數。近年來發現有一些小分子的多肽可以介導外源物質穿過細胞膜，這種小分子多肽被稱之為細胞穿膜肽(cell penetrating peptides, CPP)。許多CPP都是來源於某些直接與宿主細胞相互作用的病毒結構蛋白的蛋白轉導結構域(proteintransductiondomains，PTD)。現在研究最多、應用範圍最廣的細胞穿膜肽來源於人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)的轉錄激活因子(Trans-activating transcriptionalactivator, Tat)。Tat 蛋白中存在3個功能結構域，分別是位於N-端的酸性區，主要起反式激活的功能；位於第22-37位胺基酸之間的DNA結合區，該區域富含半胱氨酸；位於第47-60位胺基酸之間的鹼性區，是主要的蛋白轉導結構域，參與Tat蛋白的細胞內化作用。Tat蛋白共有86個胺基酸，是HIV複製所必需的調節因子。Schwarze發現位於Tat蛋白中第47_57位之間的11個胺基酸YGRKKRRQRRR不僅能夠獨立穿過細胞膜，而且其穿膜效率比全長的Tat蛋白還要高。這段多肽即是TAT穿膜肽。不管是單獨的TAT穿膜肽，或者是攜帶其他大分子物質如蛋白質、寡聚核苷酸或脂質體等，在穿膜時都可以表現出較高的穿膜活性。在攜帶外源物質穿膜時，TAT介導的穿膜似乎與其要攜帶的分子大小無關，100KD的蛋白質、40nm大小的納米顆粒、甚至200nm大小的脂質體都可以經TAT運載入細胞內。而且，以這種方式運輸到細胞內的脂質體甚至可以在進入細胞內Ih後仍然可保持結構的完整性。相反的，沒有與TAT穿膜肽連接的物質在與細胞共同孵育時均不能夠進入細胞 內。TAT穿膜肽的序列中由於有6個精氨酸和2個賴氨酸殘基，因此是帶有高度正電荷的多肽。以不帶電荷的丙氨酸替代其中的任何一個鹼性胺基酸殘基都會使穿膜活性降低，而替代序列中的其他胺基酸殘基時穿膜活性則不會發生改變。這說明TAT穿膜肽所帶的正電荷是其穿膜功能所必需的，因此推測這些正電荷很可能是能夠與真核細胞的細胞膜發生強的靜電作用，從而介導了穿膜過程。對TAT穿膜肽的親和性分析發現，它能夠與許多細胞膜表面的陰離子通過靜電作用強烈地結合，與之結合的細胞表面分子可以是核仁素、蛋白聚糖等。精氨酸豐富的多肽可以穿過細胞膜，而其他胺基酸如賴氨酸、組氨酸等豐富的多肽卻不具有此功能。然而，由精氨酸組成的支鏈聚合物與直鏈聚合物具有同樣的穿膜效率。此外，研究發現TAT穿膜肽不會因為手性結構的改變而影響其穿膜活性，其手性分子與自然結構具有相同的穿膜活性。這說明這種細胞穿膜肽很可能不依賴於特定的結合位點。然而，多肽的長度是影響穿膜效率的重要因素。穿膜效率與精氨酸的個數有關，含有6個或者更多精氨酸的多肽要比含有少於5個精氨酸多肽的穿膜效率高一些，在多肽小於15個胺基酸時，穿膜效率會隨著多肽大小的增加而增強。大於15個胺基酸的多肽雖然也可具有穿膜活性，但其效率卻會明顯減小。儘管對於TAT穿膜肽的穿膜功能研究的比較多，但是到目前為止，關於TAT穿膜肽進入細胞的分子機制還沒有完全研究清楚。早期研究認為是通過直接轉運機制穿過細胞膜，且是不依賴於能量的，但最近的研究也有與這一觀點不同的結果。儘管其進入細胞的機制還沒有完全研究透徹，但TAT穿膜肽的應用已經十分廣泛。hGH作為可以刺激增長的蛋白質激素，現如今已被大量應用於臨床上，治療生長激素缺乏症、大面積燒傷、短腸綜合症等疾病，同時伴隨著1990年7月5日美國威斯康辛醫學院的Daniel Rudman在《新英格蘭醫學雜誌》上發表了他那一篇震驚醫學界的論文——Effects of human growth hormone in men over60 years old,人生長激素在抗衰老方面的作用逐漸被人們關注，人生長激素的市場需求已經變的越來越大，但是無論是其在臨床上的治療，還是抗衰老的應用，都因只能通過注射給藥，方法繁瑣，導致病人的治療極其不便，而且其抗衰老方面的使用也很難普及。將hGH基因和TAT蛋白轉導域序列進行融合，可以使人生長素能夠通過口服給藥方式進行治療，這是一種實際可行的新思路。

發明內容
本發明的目的是在於提供了一種TAT-hGH融合蛋白，其胺基酸序列為SEQID NO. 2所示。該融合蛋白可以促進Jurakat細胞增殖，作用Hep3B細胞後影響其IGFmRNA轉錄水平，同時還可以穿過腸細胞膜而進入血液中，使hGH可以不經注射而直接進入血液中，通過血液在人體內的循環，使其融合蛋白到達不同的組織，增加了 hGH的利用效率，同時也提高了藥效。本發明的目的是在於提供了一種大腸桿菌基因工程菌E. coli Origami B(DE3)pLysS (pET-TAT-hGH)，該菌株的保藏號為CCTCC No. M2012348,該菌株能表達TAT-hGH的
融合蛋白。本發明的另一個目的是在於提供了一種融合蛋白TAT-hGH的製備方法，該方法可應用於大規模的工業生產中，表達量大，操作簡單，成本低。本發明的再一個目的是在於提供一種融合蛋白TAT-hGH具有穿腸功能，在穿腸中的應用。本發明的還有一個目的是在於提供了一種融合蛋白TAT-hGH在促動物生長中的 應用。為了達到上述的目的，本發明採用以下技術方案重組人生長素與穿膜肽融合蛋白TAT-hGH，其為SEQ ID NO. 2所示的胺基酸序列組成的蛋白。本發明還進一步包括編碼上述蛋白的基因，優選其核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。本發明還包括含有上述基因的載體，以及含有所述基因或所述載體的基因工程菌。本發明優選的一種表達重組人生長素與穿膜肽融合蛋白TAT-hGH的基因工程菌株，該菌株為 E.coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT_hGH)，已於 2012 年 9 月 14 日保藏於中國典型培養物保藏中心(地址武漢市武昌珞珈山郵編430072)，分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia, coli) Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH),保藏號為CCTCCNo. M2012348。其能夠在常規的大腸桿菌培養基中生長，並具有氨苄抗性、卡納抗性、四環素抗性，經過IPTG誘導後能大量表達TAT-hGH蛋白。本發明還提供一種表達所述融合蛋白TAT-hGH的基因工程菌株的構建方法，它包括下列步驟A.人生長素基因的製備合成人生長素基因，將人生長素基因克隆到PMD18-T載體中，挑取單菌落用鹼裂解法小量提取質粒進行酶切鑑定，並進行測序，得到的陽性克隆子即為包含hGH基因的大腸桿菌，用於基因的擴增和保藏。B.融合基因的製備通過重疊延伸PCR的方法將TAT 33bp鹼基連入hGH的5』端構成TAT-hGH，將PCR產物組插入pMD18-T載體，轉化E. coli JM109,挑取單菌落用鹼裂解法小量提取質粒進行酶切鑑定，並進行測序，得到的陽性克隆子即為包含TAT-hGH的大腸桿菌E. coli JM109(pMD-TAT-hGH)，用於基因的擴增和保藏。C.表達載體的構建首先雙酶切重組質粒pMD-TAT-hGH和質粒pET_22b ( + )，膠回收含TAT-hGH基因的片段和開環pET-22b ( + )片段，16°C連接後轉化到感受態E. coliJM109中，所得到的陽性克隆子為包含TAT-hGH的E. coli JM109 (pET-TAT-hGH)。D.基因工程菌的構建和鑑定將質粒pET-TAT-hGH轉化感受態E. coliOrigamiB(DE3)pLysS, PCR鑑定篩選出陽性轉化子，挑取單菌落用鹼裂解法小量提取質粒進行酶切鑑定，並進行測序，陽性克隆為表達TAT-hGH的大腸桿菌基因工程菌株E. coli OrigamiB (DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)。。
本發明還進一步提供所述重組人生長素與穿膜肽融合蛋白TAT-hGH的製備方法，該方法包括以下步驟培養所述的基因工程菌，在能表達所述融合蛋白的條件，其中所述條件包括誘導或非誘導條件下，表達所述的融合蛋白TAT-hGH，然後分離、純化該融合蛋白TAT-hGH。具體地，該方法包括如下步驟A.挑取所述的基因工程菌 E. coli Origami B (DE3)pLysS (pET-TAT-hGH)的單菌落，接種於5ml選擇性LB液體培養基中，370C，250rpm/min振搖培養過夜；B.次日將培養過夜的菌液200iU再接種於20ml 2YT液體培養基中，37 °C，250rpm/min振搖培養至光密度OD 600=0 . 6時，加入IPTG於菌液中，使IPTG終濃度為ImM，37°C，250rpm/min振搖培養4小時；
·
C.採用柱親和層析法純化獲得融合蛋白TAT-hGH。本發明利用大腸桿菌表達TAT跨膜域和hGH的融合蛋白，意在利用hGH進行疾病治療以及美容駐顏。通過基因工程生產的TAT-hGH融合蛋白可以仍然保持hGH的活性，仍然可以促進Jurkat細胞進行增殖。本發明另一個創新之處在於，將TAT穿膜肽和hGH融合表達，由於TAT穿膜肽可以攜帶外源蛋白穿過細胞膜，因此將TAT-hGH 口服後，該融合蛋白可以穿過腸細胞膜而進入血液中，使hGH可以不經注射而直接進入血液中，通過血液在人體內的循環，使其融合蛋白到達不同的組織，增加了 hGH的利用效率，同時也提高了藥效。TAT穿膜肽目前還沒有直接應用於工業生產，但其獨特的穿膜效率十分具有吸引力。而且本發明公開的基因工程菌株的構建方法可以應用於大規模的工業生產中，表達量大，操作簡單，成本低。本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果(I)本發明製備TAT-hGH融合蛋白可以穿過腸細胞膜而進入血液中，使GH可以不經注射而直接進入血液中，通過血液在人體內的循環，使其融合蛋白到達不同的組織，增加了 hGH的利用效率，同時也提高了藥效。(2) 口服人生長素可以取代注射人生長素，減少病人的痛苦。(3)本發明提供的融合蛋白TAT-hGH的製備方法，該方法可應用於大規模的工業生產中，表達量大，操作簡單，成本低。


圖1為重組表達質粒pET-TAT-hGH的構建過程圖。圖2為重組表達質粒pET-TAT-hGH酶切及PCR鑑定圖。泳道1:D15000DNA Maker ;泳道 2 Xho I 單酶切產物；泳道 3 Xho I 及 Nde I 雙酶切產物；泳道4 hGH PCR產物；泳道5 TAT-hGH PCR產物；泳道6 =DNAMaker III。圖3SDS-PAGE檢測TAT-hGH表達的圖譜。泳道1:蛋白 Marker ;泳道 2 :加入 IPTG 誘導的 E. coli OrigamiB(DE3)/pET-22b (+)菌液；泳道 3 :加入 IPTG 誘導的 E. coli Origami B (DE3) pLysS (pET-TAT-hGH)菌液；泳道4 :加入IPTG誘導的E. coli OrigamiB (DE3) /pET-22b (+)上清；泳道5 :加入IPTG 誘導的 E. coli Origami B(DE3)pLysS(pET-TAT-hGH)菌液上清；泳道 6 :加入 IPTG誘導的 E. coli OrigamiB(DE3)/pET-22b (+)菌液沉澱；泳道 7 :加入 IPTG 誘導的 E. coliOrigami B (DE3) pLysS (pET-TAT-hGH)菌液沉澱。圖4為SDS-PAGE檢測TAT-hGH純化圖譜。泳道1:蛋白 Marker ;泳道 2 :加入 IPTG 誘導的 E. coli Origami B(DE3)pLysS (pET-TAT-hGH)菌液上清；泳道3 :純化的TAT-hGH蛋白。圖5-1為30min時融合蛋白TAT_hGH_GFP和hGH_GFP穿膜結果圖譜。(a)藍光下hGH-GFP作用30min腸組織切片；(b)可見光下hGH_GFP作用30min腸組織切片；(c)藍光下TAT-hGH-GFP作用30min腸組織切片；(d)可見光下TAT_hGH_GFP作用30min腸組織切片。圖5-2為60min時融合蛋白TAT_hGH_GFP和hGH-GFP穿膜結果圖譜。 (a)藍光下hGH-GFP作用30min腸組織切片；(b)可見光下hGH-GFP作用30min腸組織切片；(c)藍光下TAT-hGH-GFP作用30min腸組織切片；(d)可見光下TAT-hGH-GFP作用30min腸組織切片。圖5-3為120min時融合蛋白TAT-hGH-GFP和hGH-GFP穿膜結果圖譜。(a)藍光下hGH-GFP作用30min腸組織切片；(b)可見光下hGH-GFP作用30min腸組織切片；(c)藍光下TAT-hGH-GFP作用30min腸組織切片；(d)可見光下TAT-hGH-GFP作用30min腸組織切片。圖6-1為終濃度500ng/ml TAT-hGH對Ifep3B細胞中IGF I轉錄水平影響圖譜。圖6-2為終濃度5ng/ml TAT-hGH對H印3B細胞中IGF I轉錄水平影響示意圖譜。
具體實施例方式本實驗所涉及的分子生物學方法為常規方法，為本領域人員所熟悉。本發明中未詳細闡述的請參見《分子克隆實驗指南》J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾等主編。實施例1重組質粒pMD-TAT-hGH的構建和鑑定1. PCR根據hGH的序列(GenBank:V00520.1)以及TAT PTD中11個胺基酸的鹼基序列設計引物，引物設計如下上遊引物1:5'-AAACGTCGTCAGCGTCGTCGITTCCCAACCAITCCC-3'上遊引物2 5' -GAATCCCATATGTATGGCCGTAAGAA-3' (劃線處為 Nde I 酶切位點)下遊引物1:5' -TTACTCGAGGAAGCCACAGCTGCCCT-3' (劃線處為 XhoI 酶切位點)以上引物由英俊公司合成。分3次PCR合成TAT-hGH 以pMD18T_hGH質粒(Generay公司合成)為模板，上遊引物I，下遊引物I，退火溫度55°C，做PCR擴增目的片段hGH，電泳並作回收；以上一步回收產物為模板，上遊引物2，下遊引物1，退火溫度51°C做PCR，電泳並作回收，即得到TAT-hGH基因片段。50 U I體系採用如下條件進行PCR反應
權利要求
1.一種人生長素與穿膜肽的融合蛋白TAT-hGH，其胺基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2.一種分離的DNA分子，其特徵在於該DNA分子編碼權利要求1所述的融合蛋白TAT-hGH。
3.根據權利要求2所述的所述的DNA分子，其特徵在於所述的DNA分子的核酸序列如 SEQ ID No.1 所示。
4.一種載體，其特徵在於包含權利要求2或3所述的DNA分子。
5.—種宿主細胞，其特徵在於包含權利要求4所述的載體。
6.重組基因工程菌株萬·Origami B (DE3) pLysS (pET-TAT-hGH)，該菌株的保藏號為CCTCC No. M2012348。
7.—種產生權利要求1所述的融合蛋白TAT-hGH的方法，其特徵在於該方法包括以下步驟培養權利要求5所述的宿主細胞或權利要求6所述的基因工程菌，在能表達所述融合蛋白的條件，其中所述條件包括誘導或非誘導條件下，表達所述的融合蛋白TAT-hGH，然後分離、純化該融合蛋白TAT-hGH。
8.權利要求1所述融合蛋白TAT-hGH在促細胞增殖中的應用。
9.權利要求1所述融合蛋白TAT-hGH在促動物生長中的應用。
10.權利要求1所述融合蛋白TAT-hGH在穿腸中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種人生長素與穿膜肽TAT的融合蛋白TAT-hGH及其製備方法和應用，編碼該融合蛋白TAT-hGH的DNA序列，含該DNA序列的載體，含該載體的宿主細胞，用基因工程製備該融合蛋白TAT-hGH的方法。融合蛋白TAT-hGH具有促Jurkat細胞增殖活性，以及影響下遊因子IGFⅠ轉錄水平的功能。同時，融合蛋白TAT-hGH具有穿腸功能。本發明融合蛋白TAT-hGH可以口服，通過穿過腸細胞膜而進入血液中，通過血液循環到達不同的組織，增加了hGH的利用效率，同時也提高了藥效。此外本發明製備方法可應用於大規模的工業生產中，表達量大，操作簡單，成本低。
文檔編號C12P21/02GK102993309SQ20121039848
公開日2013年3月27日 申請日期2012年10月18日 優先權日2012年10月18日
發明者徐進平, 孟小林, 王健, 倪雅雯 申請人:武漢大學