桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物在預防或治療高尿酸血症和痛風中的應用的製作方法

2023-12-09 07:11:46

專利名稱：桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物在預防或治療高尿酸血症和痛風中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物，具體涉及桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物組分 和在製備預防或治療高尿酸血症和痛風的藥物或保健食品中的新用途，以及以該化合物為活 性成分的用於預防或治療高尿酸血症和痛風的藥物或保健食品組合物。
背景技術：
痛風是由於嘌呤類物質代謝紊亂，產生尿酸過多或尿酸排洩減少，血尿酸濃度持續增高 導致尿酸鹽結晶沉積軟組織所致的一組代謝性疾病。其臨床表現為反覆發作的關節炎，痛風 石形成和關節畸形，嚴重者可導致關節活動障礙，累及腎臟時可引起慢性間質性腎炎和尿酸 性腎石病。尿酸水平升高是痛風的生化基礎，無症狀性高尿酸血症是痛風發生的前期狀態， 痛風必伴有高尿酸血症。近年來，痛風和高尿酸血症的發病率呈上升趨勢，發病年齡呈現低 齡化，給社會帶來巨大的負擔，並且與高血壓、高脂血症、動脈粥樣硬化、肥胖、胰島素抵 抗的發生密切相關，已成為識別代謝症候群的早期標誌。痛風症狀以反覆下肢關節紅腫熱痛 為主，在中醫辨證上多屬溼熱痺範疇。其病機或因先天稟賦不足，或因後天飲食不節，臟腑 功能失調，分清別濁失常，於是溼、熱、瘀、濁諸症隨之產生。
西醫對痛風和高尿酸血症的治療主要有阻止內源性嘌呤合成的藥物(如別嘌呤醇)及促尿 酸排洩(丙磺舒、苯溴馬龍)的藥物。單用別嘌呤醇和丙磺舒均可使血尿酸降低，但毒副作用 大，患者往往不能堅持長期服用以致不易控制病情。
中藥治療痛風、高尿酸血症倍受關注，有分階段論治，也有專方治療，近年來，由於中 醫藥治療痛風療效確切，方法多而毒副反應少，顯示出較大的優勢，而越來越受到人們的關 注。
桑枝(Ramulus mori)是桑科植物桑(Morus alba L.)的一年生乾燥嫩枝，作為民間常用中草 藥，中國藥典記載桑枝具有祛風溼、利關節、行水之功效，適用於風寒溼痺、四肢拘攣、腳 氣浮腫之病症。其所含化學成分種類較多，主要有多糖、黃酮類化合物、香豆素類化合物、 生物鹼，此外還含有揮髮油、胺基酸、有機酸及各種維生素等。另有報導桑枝中含有二苯乙 烯類化合物桑皮苷。雖然桑枝有較好的臨床基礎，但一直沒有找到適當的成分進行質量監控。

發明內容
本發明目的是公開桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物的組分和其在製備預防或治療高尿酸血 症和痛風藥物或保健食品中的應用，以及以該化合物為活性成分的用於預防或治療高尿酸血 症和痛風的藥物或保健食品組合物。本發明的技術解決方案之一公開了桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物的組分，桑枝黃酮和二 苯乙烯類提取物組分為黃酮類化合物重量比含量為30%-70%; 二苯乙烯類化合物重量比含量
為30%隱70%。
本發明的技術解決方案之二提供桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物在製備預防或治療高尿 酸血症和痛風藥物或保健食品中的用途，以及以該化合物為活性成分的用於預防或治療高尿 酸血症和痛風的藥物或保健食品組合物。包括了以本發明所述的桑枝黃酮和二苯乙烯類提取 物，配以常用的藥用輔料(如賦形劑、助溶劑、控釋劑)，製成各種劑型包括口服液、注射 劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、微囊劑，用於製備預防或治療高尿酸血症和痛風藥物或保健食
口
叩o
桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物的製備是桑枝通過水醇法，大孔吸附樹脂柱洗脫得到的
桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物，以Quercetin-3-0-p-D-mannopyranoside為對照品經紫外分光光 度法和HPLC法分別測得黃酮類化合物含量為30X-70。/。；以桑皮苷為對照品經紫外分光光度 法和HPLC法分別測得二苯乙烯類化合物含量為30^-70。/。。
本發明所得桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物的組分可作為臨床製劑原料的質量標準，亦可 作為製劑的質量標準。
本發明用於預防或治療高尿酸血症和痛風的藥物或保健食品組合物，含有預防或治療高
尿酸血症和痛風有效量的桑皮苷化合物為活性成分，以及含有一種或多種藥學上可接受的載
體；用該化合物作為藥效成分來製備預防或治療高尿酸血症和痛風的藥物或保健食品製劑，
可單獨或與製藥可接受的賦形劑等結合，按照常規方法製成口服液、膠囊劑、片劑、顆粒劑
等劑型，優選的是靶向劑型。
本發明的化合物的藥物組合物可用於製備預防或治療高尿酸血症和痛風的藥物。 上文所述藥學上可接受的載體是指藥學領域常規的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑如
水等，填充劑如澱粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；
溼潤劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進劑如季銨化合物；表面活性劑
如十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、聚乙二
醇等。另外還可以組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。
本發明化合物可以組合物的形式通過口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式施用於需
要這種治療的患者。用於口服時，可將其製成常規的固體製劑如片劑、顆粒劑、膠囊劑等，
製成液體製劑如水或油懸浮劑或其它液體製劑如糖漿、酏劑等；用於腸胃外給藥時，可將其
製成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。優選的形式是片劑、膠囊劑、栓劑、鼻噴霧劑和注
射劑，特別優選在腸道的特定部位釋放的製劑。本發明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學領域的常規生產方法製備。例如使活性成分 與一種或多種載體混合，然後將其製成所需的劑型。
本發明化合物的使用量可根據用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療疾病的類型和嚴重 程度等變化，確定其閂劑量，可以一次或多次施用。
本發明的優點是，提供了降尿酸作用的桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物，用於製備預防或 治療高尿酸血症和痛風藥物或保健食品，以及以該化合物為活性成分的用於預防或治療高尿 酸血症和痛風的藥物或保健食品組合物。與針對痛風和高尿酸血症的發明比較，本發明提供 的桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物藥效成分明確(黃酮類化合物含量為30%-70%和二苯乙烯類 化合物含量為30。%-70%)，降尿酸作用顯著，可以作為質量標準，方便可靠，為其臨床應用 提供過了科學依據。
為更好的理解木發明的實質，下面用桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物的提取分離、藥理實 驗及結果來說明其在製備預防或治療高尿酸血症和痛風藥物或保健食品中的應用。


圖1為ER對小鼠高尿酸血症血清尿酸水平的影響結果圖2為ER對小鼠肝臟尿酸水平的影響結果圖3為ER對小鼠高尿酸血症肝臟XOD的影響結果圖4為肝臟XOD蛋白水平結果圖5為腎臟URAT1蛋白水平結果圖6為肝臟XOD mRNA水平結果圖7為腎臟URAT1 mRNA水平結果圖。
具體實施例方式
實施例l:
桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物的製備
(1) 取千燥桑枝，熱回流二次，每次加7倍60%乙醇，每次2小時，合併提取液，濾過， 濾液經減壓濃縮至每ml藥液含有0.5g藥材，放冷，過濾，棄去藥渣。
(2) 取濾液，按流速為l一BV/h上已預處理好的HPD-600型大孔吸附樹脂柱，以2—6倍 量柱床體積的蒸餾水洗脫，流速為l-4BV/h,棄去水洗脫液，再以2—6倍量柱床體積的60% 乙醇按l一BV/h的速度洗脫，收集洗脫液，回收乙醇並濃縮至稠膏，減壓乾燥，得幹浸膏。
(3) 以桑皮苷為對照品，按照藥典法測定桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物中二苯乙烯類化合 物含量30%-70。/。。
(4) 以Quercetin-3-0-p-D-mannopyranoside為對照品，按照藥典法測定桑枝黃酮和二苯乙
5烯類提取物中黃酮類化合物含量為30%-70%。 實施例2
桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物對高尿酸血症和.lH常小鼠的影響
氧嗪酸鉀鹽是一種尿酸酶抑制劑，可誘導抑制尿酸分解，增加體內血清尿酸水平，造成 高尿酸血症動物模型，國際上普遍用其評價藥物的抗高尿酸血症和痛風作用。本發明亦採用 高尿酸血症模型動物驗證藥物的降尿酸療效，療效可靠，效果顯著。
1. 實驗動物昆明種小鼠，體重24士2g，雄性。
2. 藥物配製桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物(ER)(黃酮類化合物含量為30%-70%和二苯 乙烯類化合物含量為30%-70%)、別嘌呤醇分散於生理鹽水中，用於灌胃給藥，給藥劑量 分別為低劑量300 mg/kg、高劑量為600 mg/kg， Apu=5 mg/kg。
3. 實驗材料HPD — 600型大孔吸附樹脂，Trizol Reagment(Invigen)，氯仿，異丙醇，無水 乙醇，DEPC， M-MLV反轉錄酶，PCR試劑盒，RIPA裂解液，尿酸試劑盒，肌酐i式劑盒。
4. 實驗儀器高速冷凍離心機，高速勻漿機，Bio-radio-rad垂直電泳槽，MBI-PCR儀、水平 電泳槽等.
5. 實驗模型高尿酸血症模型。
6. 模型的建立動物適應環境l周后，灌胃給予氧嗪酸鉀鹽250 mg/kg;對照給予等體積生 理鹽水，造模周期7天。
7. 給藥造模期間同時給藥，在給了'氧嗪酸鉀鹽造模Z生理鹽水對照lh後，分組灌胃給予桑 枝黃酮和二苯乙烯類提取物(ER)兩個劑量300m^kg、600 mg/kg,別嘌呤醇(Apu)5 mg/kg，
對照組給予生理鹽水。
8. 小鼠處死及組織的保存小鼠灌胃給予桑皮苷/生理鹽水後lh處死，取血、尿液，冰臺上 分離肝臟、腎臟組織，組織經液氮冷凍後保存於-8(TC，待測。
9. 蛋白質印跡法(Western-bkrtting):提取小鼠肝臟、腎臟組織刷狀緣膜蛋白，提取蛋白經12 %的SDS-PAGE膠電泳分離後，PVDF轉膜，封閉液封閉1小時後加入mURATl抗體(根 據NCBI資料庫mliRATl蛋白序列製備，使用濃度為1:4000)4"C孵育過夜，二抗U:4000) 室溫搖床孵臺l小時，HRP-ECL發光，暗室曝光顯影。膠片掃描後對圖片灰度分析。
11. 逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR):鼠組織(肝臟或腎臟)O.lg加入lml的Trizol Reagent (Invitrogen)，按照試劑盒的要求提取RNA， RNA逆轉錄到cDNA模板，根據NCBI數據 庫mURATl基因設計引物，進行mURATl目的基因擴增。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳後 UV成像，對圖片進行灰度分析。
12. 實驗結果(1) ER對小鼠高尿酸血症血清尿酸水平的影響，結果見圖l。
+++P<0.001, ++P<0.01， +P< 0.05與空白組比較;***P <0.001，**P< 0.01， *P< 0.05與模型
組比較
(2) ER對小鼠肝臟尿酸水平的影響，結果見圖2。 +++P<0.001， ++P<0.01, +P< 0.05與空白組比較;***P <0.001,**P< 0,01, *P< 0.05與模型
組比較
(3) ER對小鼠高尿酸血症肝臟XOD的影響，結果見圖3。
+++P < 0.001, ++P < 0.01, +P < 0.05與空白組比較;***P < 0.001,**P < 0.01, *P < 0.05與模型
組比較
(4) 蛋白質印跡法Western-blotting
a. 肝臟XOD蛋白水平，結果見圖4。
b. 腎臟URAT1蛋白水平，結果見圖5。
+++P < 0.001, ++P < 0.01， +P < 0.05與空白組比較;***P < 0.001，**P < 0.01, *P < 0.05與模型
組比較
(5) 逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)
a. 肝臟XODmRNA水平，結果見圖6。
b. 腎臟URAT1 mRNA水平，結果見圖7。
+++P<0.001， ++P<0.01， +P<0.05與空白組比較;***P <0.001，**P< 0.01, *P< 0.05與模型
組比較
結果小結桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物可顯著降低高尿酸血症模型下動物血清尿酸水 平、肝臟尿酸水平，而對正常動物血清尿酸水平和肝臟尿酸水平無顯著影響，表明桑枝黃酮 和二苯乙烯類提取物可安全有效地治療和預防高尿酸血症和痛風。桑枝黃酮和二苯乙烯類提
取物能顯著抑制模型小鼠肝臟黃嘌呤氧化酶(XOD)的活性及其mRNA和蛋白表達、腎臟 mURATl mRNA和蛋白表達，表明桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物的降尿酸作用與其抑制XOD 活性和尿酸重新吸收轉運子mURATl mRNA和蛋白表達有關，以降低高尿酸血症動物尿酸合 成和增加排洩，達到降尿酸作用。
權利要求
1. 桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物，包括桑枝黃酮和二苯乙烯類化合物，其特徵在於，所述的桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物中黃酮類化合物重量比含量為30％-70％，二苯乙烯類化合物重量比含量30％-70％。
2. 權利要求1所述的桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物在製備預防或治療高尿酸血症和痛風的 藥物或保健食品中的應用。
3. 用於預防或治療高尿酸血症和痛風的藥物或保健食品組合物，其中含有預防或治療高尿酸 血症和痛風有效量的權利要求1化合物和藥學上可接受的載體；用該化合物作為藥效成分 來製備預防或治療卨尿酸血症和痛風的藥物或保健食品製劑，可單獨或與製藥可接受的賦 形劑等結合，按照常規方法製成口服液、膠囊劑、片劑、顆粒劑、靶向製劑等劑型。
全文摘要
本發明公開了桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物的組分和新用途。動物試驗結果表明桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物對高尿酸血症模型動物血中尿酸有顯著的降低作用，而對正常動物正常水平血中尿酸無顯著抑制作用，具有很好的安全性。利用桑枝黃酮和二苯乙烯類提取物配以相關輔料，用常規的製劑方法可製成預防或治療高尿酸血症和痛風的藥物或保健食品，以及以該化合物為活性成分的用於預防或治療高尿酸血症和痛風的藥物或保健食品組合物，療效穩定，安全可靠。
文檔編號A61P19/00GK101502526SQ20091009583
公開日2009年8月12日 申請日期2009年2月12日 優先權日2009年2月12日
發明者孔令東, 憲 張, 星 王, 王彩萍, 胡季強, 胡林水, 珺 鄭, 黃正標 申請人:浙江康恩貝製藥股份有限公司;南京大學