基於聚乙烯亞胺的生物分子陣列的製作方法

2023-12-03 16:47:46

專利名稱：基於聚乙烯亞胺的生物分子陣列的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物分子陣列，並且更具體地涉及通過覆蓋在基質上的聚乙烯亞胺層排列的具有分開的含生物分子單元的陣列。
背景技術：
在分子生物學和微生物學領域中，長期以來使用含有固定於其上的生物分子的固體支持物是常見的。固定提供各種優點，例如允許大量樣品並且容易測定大量信號系統中所用的標記。例如有很多關於將核酸多聚物與珠粒結合的文獻。
一種這樣的方法是使用鏈黴抗生物素蛋白包被的磁珠，這種磁珠可從例如Dynal of Oslo，Norway商業購買。這些珠粒與末端標記的生物素化的核苷酸接觸。眾所周知生物素與鏈黴抗生物素蛋白以非共價但高度穩定的方式相互作用，這對於許多目的與共價結合功能相同。因此，寡核苷酸可以通過此生物素-鏈黴抗生物素蛋白相互作用固定在珠粒上。
另一方法依賴於碳二亞胺化學法。在此基本方法上有一些變化。例如，正如例如Kremsky，J.N.等，核酸研究152891-2909，1987中所述的，醯肼包被的珠粒通過碳二亞胺催化的偶聯與羧基修飾的寡核苷酸連接。另一在此方法上的變化使用表面覆蓋有羧基的可控制的有孔玻璃或磁性聚苯乙烯珠，羧基與氨基修飾的寡核苷酸反應，如例如Ghosh，S.S.等，核酸研究155353-5372，1987和Lund V.等，核酸研究1610861-10880，1987中所述。
另一方法使用聚乙烯亞胺(PEI)層包裹珠粒。見例如，Wasserman，B.P.等，生物技術和生物工程XXII271-287，1980；Povey，A.C.等，製藥科學雜誌75831-837，1986；Rounds，M.A.J.Chrom.362187-196，1986；Van Ness，J.等，核酸研究193345-3350，1991和PCT國際公開WO94/00600。而且，PEI已用於在大量各種非珠粒固定支持物和表面上固定各種分子包括核酸多聚物。見例如，Schurer，J.W.等，組織化學和細胞化學雜誌25384-387，1977；Alpert，A.J.等，J.Chrom.185375-392，1979；Vanecek，G.等，生物化學年鑑121156-169，1982；El Rassi，Z.等，Chromatographia 199-18，1984；Rounds，M.A.J.Chrom.362187-196，1986；Swann、W.E.等的歐洲專利申請No.0,197,784 A1，1986；D』Souza，S.F.生物技術通訊8643-648，1986；Povey，A.C.等，製藥科學雜誌76201-207，1987；Ngo，T.T.等的美國專利4,753,983，1988；Crane，L.J.等的歐洲專利申請No.0,403,700 A1，1990；Trinh.C.K.Die Angewandte Makromol.Chemie 212167-179，1993；Bruil，A.等，J.Biomed.Mat.Res.271253-1268，1993；PCT國際公開No.WO95/02184。確實，已報導PEI在無固定支持物的情況下結合寡核苷酸。
最近，大量注意力集中在製備平坦固定支持物上的生物分子，特別是多核苷酸的陣列。只是作為例證的以下公開文獻(以及本文引用的參考文獻)提供這些生物分子陣列以及製備這些排列的方法的總體和具體綜述Eggers，M.D.等，DNA測序技術進展卷SPIE 1891113-126，1993；Chetverin，A.B.等，生物/技術121093-1099，1994；Southern，E.M.核酸研究221368-1373，1994；Lipshutz，R.J.等，生物技術19442-447，1995；Schena，M.BioEssays 18427-431，1996；Blanchard，A.P.等，生物傳感器及生物電學11687-690，1996；O』Donnell-Maloney，M.J.等，遺傳分析生物分子工程13151-157，1996；Regalado，A.Start-Up24-30，1996年10月和Stipp，D.財富30-41頁，1997年3月31日。
已發展的關於將生物分子固定到珠粒和其它固定支持物上的專門技術中，很多報導的製備這些陣列的方法已有描述。有些令人驚訝地，至今還沒有使用PEI以陣列模式固定生物分子的報導。最多，作為理論上的可能性，已提出PEI可用於使寡核苷酸與尼龍支持物連接。見例如，PCT國際公開No.WO 95/09248，引用Van Ness，J.等，核酸研究193345-3350，1991。
如此處公開的，本發明人已認識到與製備基於PEI的寡核苷酸陣列相關的問題，並且已解決了這些問題，因此目前基於PEI的陣列已不再是理論上的可能性。而且，與也在此處公開的其它類型陣列相比，本發明的基於PEI的陣列提供各種優點。
發明概述本發明提供一種生物分子陣列，包括包含表面的固體基質；所述表面至少部分覆蓋有一層(聚乙烯亞胺)(PEI)；所述塗層包括多個由第二區環繞並與其鄰接的分開的第一區；所述第一區有生物分子和PEI；並且所述第二區有PEI並且基本上沒有生物分子。
如此處所用的，第一區也稱為點樣區，因為在某種意義上生物分子上樣到第一區內的PEI上。也如此處所用的，第二區也稱為間隔區或鄰接的間隔區，因為實際上間隔區作用為點樣區反應生物分子之間的非反應性間隔。
在另一方面，本發明提供一種製備生物分子陣列的方法。此方法包括提供包含表面的固體基質，其中聚(乙烯亞胺)(PEI)層覆蓋所述表面的至少一部分，所述塗層包括多個由連續的第二區環繞並與其鄰接的分開的第一區；將生物分子上樣到所述的第一區而保持所述的第二區基本上不含生物分子。
參照附圖和下面詳細的描述，本發明的其它方面將變得顯而易見。
附圖描述

圖1A是根據本發明實施方案所述的陣列的俯視平面示意圖。
圖1B是圖1A的陣列的剖面示意圖。
圖2A是用於製備本發明陣列的移液裝置的等軸視圖。
圖2B是根據本發明所述的移液頭的實施方案的放大正面立視圖。
圖3是帶有錐形設計的另一種移液頭的正面立視圖。
圖4A是根據本發明另一實施方案所述的帶有凹槽、錐形設計的移液頭的另一實施方案的正面立視圖。
圖4B是圖4A的移液頭的仰視平面圖。
圖5表示根據本發明製備並用Vector Blue(Vector Laboratories，Burlingame，California)顯色且用CCD相機和顯微鏡拍攝的微點陣列。
圖6表示同時存在於單一陣列單元中的兩種不同寡核苷酸如何根據本發明得到鑑定和部分定量測定。
圖7表示用本發明方法學由機器人製備的陣列的CCD相機圖像，其中點區域直徑約100-150微米，相鄰點與點之間中心到中心的間距為200微米。直徑的標準偏差是約15％。
圖8是用螢光濾鏡在螢光下攝製的顯微照片，顯示從分析溶液轉移的非媒介物成分(在此情況下是螢光微球體)的可重複點樣(通過肉眼觀察測定)。
發明詳述本發明提供一種生物分子陣列。陣列包括包含表面(優選地是平的)的固體基質，其中表面至少部分覆蓋有一層聚(乙烯亞胺)(PEI)。PEI層包括多個由連續第二區環繞並與其鄰接的分開的第一區。第一區有生物分子和PEI，而第二區有PEI並且基本上沒有生物分子，即每2000μm2第二區少於約103個生物分子。
圖1A是根據本發明實施方案所述的生物分子陣列10的俯視平面示意圖，而圖1B是其剖面示意圖。陣列10具有帶平坦表面22的固體基底或支持物基質20，並且陣列10有覆蓋支持物基質20的至少一部分的表層30。表層30優選地由PEI構成，並且底層20優選地由堅固材料製成，PEI與底層20共價結合。PEI層30有多個點樣區32(例如圖1A中所示的12個)位於鄰接間隔區34之中。每個點樣區32是分開的分離的區域，其特徵是生物分子物質40點樣在PEI層上，而間隔區的特徵是PEI層30的剩餘區域。例如，每個點樣區30可以具有從表層30的表面向表層30內伸入中等深度「d」的截短的圓錐形狀。如下面詳細描述的，生物分子40擴散到PEI層30構造中並與PEI層30內的反應性胺位點共價結合。
PEI層30、點樣區32和點樣區32之間的間隔的規格一般根據特定應用變化。PEI層30的厚度「T」例如可以小到PEI分子的單層。另外，PEI層30表面的點樣區一般直徑約10-100μm，而點樣區32之間的中心到中心距離「D」一般在100μm-1,000um之間。在優選實施方案中，點樣區32的表面直徑約50μm，並且點樣區32由約200μM的中心到中心距離D間隔開。固體基質基質優選地是玻璃或矽。然而，基質選擇性地可以是石英、金、合成的有機聚合物如聚乙烯、聚酯薄膜和6，6-尼龍或它們的複合材料。在優選實施方案，基質由分布在平坦表面的加樣孔或其它凹槽構成。基質可以具有非滲透材料的表面形態或者它可以是滲透的如尼龍。基質可以是膜或膠片(例如聚酯薄膜或金)。基本上可以使用任何允許被含有PEI但不含生物分子的區域包圍的含PEI和生物分子的區域形成和保留的固體基質。
用於此目的的固體支持物實例是一般用於電子工業中構建半導體的矽片。這些矽片在一側是高度磨光和反光的並且可容易地使用矽烷化學法用聚乙烯亞胺塗敷。這些矽片在商業上可從諸如WaferNet(San Jose，CA)的公司得到。玻片也可以用反光性塗層塗敷。具有反光性塗層的玻片也可容易地使用矽烷化學法用聚乙烯亞胺塗敷。
聚乙烯亞胺多聚物塗層允許使用商業上可得到的交聯劑(Pierce，Rockford，IL)將寡核苷酸、PCR片段或擴增子、DNA分子或片段或其它含有胺基的生物分子共價結合到固體支持物上。聚乙烯亞胺(PEI)塗敷的載片也具有長保存期穩定性的額外好處。PEI塗層的製備用於將PEI層附著到基質上的化學方法大部分取決於基質的化學特徵。現有技術提供大量可以將PEI附著到固定支持物上的適當化學方法實例。例如當基質是6，6-尼龍時，PEI塗層可以用Van Ness，J等，核酸研究193345-3350，1991和PCT國際公開WO 94/00600中公開的方法塗敷，這兩篇參考文獻在此引用作為參考。當固體支持物是玻璃或矽時，塗敷PEI的適當方法見例如Wasserman，B.P.生物化學和生物工程XXII271-287，1980和D』Souia，S.F.生物技術通訊8643-648，1986。
優選地，PEI塗層與固定支持物共價結合。當固定支持物是玻璃或矽時，PEI塗層可以使用矽烷化學法與基質共價結合。例如，具有反應性甲矽烷氧基末端基團的PEI可從Gelest，Inc(Tullytown，PA)商業購買。可以將這樣的反應性PEI與玻片或矽片接觸，輕微攪拌後，PEI將附著在基質上。選擇性地，可以使用雙功能甲矽烷基化試劑。根據此方法，玻璃或矽基質用雙功能甲矽烷基化試劑處理以提供具反應性表面的基質。然後將PEI與反應性表面接觸並通過雙功能試劑與表面共價結合。
PEI塗層已廣泛用於結合生物分子的領域。由於各種原因，PEI在此情況下非常有效。例如，PEI是高度親水的並且浸潤含有生物分子的水溶液。另外，PEI含有許多氨基，這些氨基可以與生物分子中的酸性基團形成鹽。然而，從PEI接受生物分子水溶液的容易程度可以確切地看到為什麼至今它還未用於製備生物分子陣列。當將生物分子水溶液點樣到PEI層上時，溶液迅速吸入PEI塗層而不是留在分開的區域中。因為溶液吸收，以陣列模式上樣的溶液完全匯合在一起並形成單一反應性區域，這顯然是在生物分子陣列製備中要避免的情況。布列溶液本發明人也公開了如何用PEI塗層製備生物分子陣列。本發明方法使用一種也稱為「布列溶液」的組合物，包含基於組合物總體積約35體積％到約80體積％濃度的增稠劑、生物分子(優選地是0.001μg/mL到10μg/mL濃度範圍的寡核苷酸)和水。令人吃驚地發現在水性寡核苷酸組合物中含有增稠劑時，增稠劑賦予組合物所需的流變學特性，因此使組合物能與此處公開的改進的彈性探頭一起使用，在僅一次從組合物池汲取組合物的情況下將多個均勻的微滴移至有PEI塗層的平坦表面上。
對於液體增稠劑如甘油，濃度為35％V/V到80％V/V。組合物中優選的增稠劑濃度在一定程度上取決於進行排列時的溫度。排列溫度越低，需要使用的增稠劑濃度越低。溫度和粘度控制的組合使得可以在大多數固體支持物(例如玻璃、矽片、尼龍6/6、尼龍膜等)上進行排列。
增稠劑的存在還有其它好處，即允許各種其它低濃度物質與生物分子同時存在。例如，0.001％V/V到1％V/V的去汙劑可存在於布列溶液中。這是有用的，因為PCR緩衝液含有少量的Tween-20或NP-40，並且直接從PCR排列核酸樣品而無須事先純化擴增子通常是有利的。使用增稠劑允許在布列溶液中含有鹽(例如NaCl，KCl或MgCl2)、緩衝液(例如Tris)和/或螯合劑(例如EDTA)。使用增稠劑還有其它好處，即允許交聯劑和/或有機溶劑存在於布列溶液中。正如商業上得到的，交聯劑通常溶解於有機溶劑如DMSO、DMF、NMP、甲醇、乙醇等溶劑中。當使用增稠劑時，常用的有機溶劑可以0.05％到20％(V/V)的水平用於本發明的布列溶液中。
一般來說，增稠劑賦予布列溶液增加的粘度。當布列溶液中達到適當粘度時，點樣的第一滴基本上與例如第100滴大小相同。當布列溶液中使用不適當粘度時，點樣的頭幾滴顯著大於後來點樣的液滴。所需的粘度在純水與純甘油的粘度之間。
本發明的布列溶液可用於將微滴點樣到幾乎任何表面上。因為固體支持物的表面特性對微滴的點樣幾乎沒有影響或沒有影響，所以生物樣品可排列到幾乎任何類型的有塗層表面或有聚合物塗層的固體支持物上。例如，一般的水溶液在用親水性聚合物如聚(賴氨酸)或聚(乙烯亞胺)塗敷的固體支持物上傾向於迅速擴散而這些相同溶液不容易點樣在疏水性表面如矽片上。然而，含有根據本發明所述的增稠劑的布列溶液可用於將均勻的微滴點樣於任何這些基質上。
在排列過程中包括增稠劑如甘油的另一重要好處是質量控制。例如當將甘油用於本文所述的排列方法時，將一小滴液體點樣於固體支持物上。以此處所述的方法中常用的濃度時，此甘油濃度足以防止微滴的蒸發。因此，在化學處理陣列之前可檢查每個排列針頭的每個印跡。觀察微滴的能力實質上增強了對排列過程進行質量控制的能力。這導致排列方法學價值的重要增加。
生物分子可以是核酸多聚物或其類似物如PNA、硫代磷酸酯和膦酸甲酯。核酸指核糖核酸和脫氧核糖核酸。生物分子可包括非天然和/或合成的鹼基。生物分子可以是單鏈或雙鏈核酸多聚物。
優選的生物分子是包括寡核苷酸(多達約100個核苷酸鹼基)和多核苷酸(超過約100個鹼基)的核酸多聚物。優選的核酸多聚物由15到50個核苷酸鹼基形成。另一優選的核酸多聚物有50到1,000個核苷酸鹼基。核酸多聚物可以是PCR產物、PCR引物或核酸雙鏈，在此列出幾個實施例。然而，如下文所述，當核酸含有伯胺時，基本上所有核酸類型可與PEI塗敷的表面共價結合。布列溶液中核酸多聚物的一般濃度為0.001-10μg/mL、優選地0.01-1μg/mL、更優選地0.05-0.5μg/mL。
優選的核酸多聚物為「胺修飾的」，因為它們經修飾在核酸多聚物的5』末端含有伯胺基，優選地在核酸多聚物的伯胺與核酸部分之間有一個或多個亞甲基。6是亞甲基的優選數目。胺修飾的核酸多聚物是優選的，因為它們可通過5』-胺基與固體支持物共價連接。可使用5』-己胺修飾的PCR引物排列PCR產物。可在使用胺烯丙基-dUTP(Sigma，St.Louis，MO)通過切口移位導入胺之後排列核酸雙鏈。用氨基烯丙基-dUTP通過聚合酶如末端轉移酶或用連接酶通過將含胺的短核酸多聚物連接到核酸上可將胺導入核酸中。
優選地，在與PEI塗層接觸之前活化核酸多聚物。通過使胺功能化的核酸多聚物與多功能胺-反應性化學物如三氯三嗪(Trichlorotriazine)混合可方便地實現這一點。當核酸多聚物含有5』-胺基時，5』-胺可與也稱為氰尿醯氯的三氯三嗪反應(Van Ness等，核酸研究.19(2)3345-3350，1991)。優選地，將過量的氰尿醯氯加入核酸多聚物溶液中，其中超過布列溶液中核酸多聚物胺數10-到100-倍摩爾數過量的氰尿醯氯是優選的。在此方法中，大多數以胺終止的核酸多聚物與一分子三氯三嗪反應，因此核酸多聚物變成以二氯三嗪終止。
本發明的有利特徵是含有生物分子的布列溶液即使含有大量的三氯三嗪也可點樣到PEI塗層上。這提供了優於在進行排列之前需要從布列溶液去除偶聯劑的方法的顯著優勢。
當核酸多聚物是雙鏈時，本發明優選的實施方案提供兩條鏈或其中一條鏈含有末端氨基。雙鏈核酸多聚物可通過一個末端氨基結合到PEI塗層上，由此固定此雙鏈多聚物。然而，因為兩條鏈中僅有一條鏈與PEI塗層共價結合，所以另一鏈可在變性和洗滌條件下去除。此方法提供根據本發明實施單鏈核酸多聚物的排列的一種方便方法。雙鏈核酸多聚物可例如作為PCR反應產物得到。
優選地，用常用緩衝液如磷酸鈉、硼酸鈉、碳酸鈉或Tris HCl緩衝布列溶液。布列溶液的優選pH範圍是7到9，其中優選的緩衝液是新鮮製備的pH8.3到pH8.5的硼酸鈉溶液。
為了製備一般的布列溶液，將己胺修飾的核酸多聚物以0.1μg/ml置於0.2M硼酸鈉pH8.3中至50μl總體積。然後加入10μl 15mg/mL的氰尿醯氯溶液，並且讓反應於25℃持續攪拌下進行1小時。加入甘油(GibcoBrl，Grand Island，NY)至56％終濃度。印跡技術生物分子溶液可以通過大量目前用於微細加工的技術的任意一種上樣到PEI塗層上。例如，溶液可以裝入噴黑印跡頭中並從這樣的頭部噴到塗層上。
圖2A是表示用於選擇性地將分離的、可控量生物分子溶液轉移到陣列10的PEI層30上的優選裝置和方法的等軸視圖。在一種實施方案中，裝置帶有與致動器60可操作連接的彈性探頭50和與彈性探頭50相反端連接的移液頭70。彈性探頭50一般包括包住偏置部件54的套殼52和活塞56，活塞有與偏置部件54相鄰接的第一端57和從套殼52中伸出的第二端58。套殼52可以是管狀筒而偏置部件54可以是將活塞56的第二端58從套殼52推出的壓縮彈簧。活塞56的第一端57因此帶有與從套殼52向內放射狀伸出的止動物59咬合的凸肩57a從而限制活塞56相對於套殼52的最大延伸量。適當的彈性探頭50可從Evertt Charles(Pomona，California)，Interconnect Devices Inc.(Kansas City，Kansas)、TestConnections，Inc.，(Upland，California)以及其它製造商得到。
致動器60優選地沿著與陣列10垂直的軸線(箭頭V所示)並在與PEI層30表面平行的平面(箭頭P所示)移動彈性探頭50。因此，致動器60控制彈性探頭50從而將移液頭70浸入含有生物分子流體90的容器80中，將彈性探頭50定位到PEI層30的所需位點上，並且將移液頭70壓至PEI層30的所需位點上。在另一實施方案中，致動器60可能僅僅與至陣列10垂直地移動彈性探頭50，而另一致動器(未顯示)移動陣列10和容器80以將移液頭70定位至容器80或PEI層30的所需位點。致動器60優選地是自動將生物分子溶液移至PEI層30上的機器人或其它計算機控制的操作裝置。此外，可將多個彈性探頭50與一個致動器連接以同時將多個生物分子物質移至PEI層30上。
移液頭70優選地吸取足夠量的生物分子流體90至其表面上以將多個的生物分子物質移至PEI層30上並形成相應的多個點樣區32(圖1A中所示)。圖2B是根據本發明一個實施方案所述的移液頭70的放大正面立視圖。移液頭70優選地具有截短的圓錐形狀，帶有端面72和多個凹槽或溝道74。端面72可以是從假想的交點73凹進的平面，凹進的距離「R」約在0.00001英寸和0.010英寸之間。並且更優選地約在0.001英寸和0.005英寸之間。此外，凹槽74具有以約15°到120°、並且更優選地以約60°到90°的角α向端面72聚集的翼或脊76。
彈性探頭50、致動器60和移液頭70一起運行從而在每次致動器60將移液頭70壓至PEI層30上時，將可控量的生物分子流體移至PEI層30上。致動器60開始將移液頭70浸入生物分子流體90的容器80中以通過毛細作用汲取和容納較大體積的生物分子流體92(圖2B)到移液頭70上。然後致動器60將彈性探頭50定位至PEI層30上。在容器80中取出移液頭70後，一部分移液頭70上的生物分子流體92在移液頭的端面72形成懸掛物94。然後致動器將移液頭70壓至PEI層上以從移液頭70上的生物分子流體部分形成陣列10的單個分開離的點樣區32(圖1A和1B中所示)。致動器60優選地將移液頭70壓至PEI層30上以使移液頭70以指定量的壓力接觸PEI層30。然而，用相同壓力將移液頭70連續壓至PEI層30上是困難的，因為致動器60不能總是以相同高度定位移液頭70並且PEI層70表面可能不一樣平。偏置部件54因此儲存把移液頭70壓到PEI層30上產生的能量，從而允許彈性探頭50在每次移液時以基本上恆定的壓力接觸PEI層30而不論致動器60的行程或PEI層30表面狀態的微小不規則性。
因此上述移液系統提供在每次移液頭70與PEI層30接觸時可移送恆定點樣體積的生物分子流體的裝置。應當理解應將精確、恆定體積的生物分子流體移至每個點樣區的PEI層30上以在PEI層30中維持間隔區34。點樣至點樣區32上的PEI層30中的生物分子流體的量一般憑經驗確定，並且它是移液頭70與PEI層30接觸的時間、生物分子流體90的粘度、移液頭70的構造以及移液頭70與PEI層30之間的壓力的函數。因為偏置部件54在移液頭70與PEI層30之間提供了基本上恆定的壓力，所以影響移至PEI層30的生物分子流體量的首要因素是移液頭70與PEI層30之間接觸的時間。
圖3是根據本發明所述的移液頭170的另一個實施方案的正面立視圖。在此實施方案中，移液頭170具有無凹槽或翼片的截短的錐形狀。因此，移液頭170在其錐形部分的表面容納生物分子流體。雖然移液頭170可用於將生物分子流體移到PEI層30上，但是一般地使用帶凹槽的移液頭是更理想的，因為這樣的移液頭容納更多的生物分子流體。
圖4A是帶有多個凹槽274和翼片276的移液頭270的另一實施方案的正面立視圖，圖4B是其仰視平面圖。移液頭270基本上以與上述移液頭70相同的方式操作，並且因此也提供基本上相同的優點。
上述的移液頭70、170和270代表一些可用於將生物分子流體點樣到PEI層30上的移液頭實例。應當理解可對這些移液頭進行多種改進，包括使用不同形狀的端面設計。例如，根據具體應用，這些移液頭可以具有角錐形、圓柱形、立方形或其它適當形狀。此外，這些凹槽可以具有除了本發明附圖中所示的構造之外的其它構造。因此，移液頭不一定局限於圖2B-4B中說明的那些種類。排列條件和排列後的處理如上所述的布列溶液可直接用於排列過程。也就是說，在排列核酸多聚物的優選實施方案中，在印跡步驟前沒有從未反應的氰尿醯氯中純化活化的核酸多聚物。令人驚奇地發現在排列方法的印跡步驟前不必去除過量的交聯劑。也就是說，在反應混合物中過量的氰尿醯氯不影響或競爭核酸多聚物與有PEI塗層的固體支持物的共價結合。這是因為固體支持物上的胺多於將以任何給定體積(納升到皮升)排列的氰尿醯氯分子的數目。
一般讓活化核酸結合到固體支持物上的反應在20到50℃進行1到20小時。優選地，反應時間是於25℃1小時。
本發明的陣列在進行雜交分析中特別有用。然而，為了進行這種分析，在進行雜交步驟前必須對固體支持物上的胺加帽。這可通過使固體支持物與0.1-2.0M琥珀酸酐反應來實現。優選的反應條件是70％m-pyrol和0.1M硼酸鈉中的1.0M琥珀酸酐。一般使反應進行15分鐘到4小時，其中優選的反應時間是於25℃30分鐘。殘餘的琥珀酸酐用3X水洗加以去除。
然後將固體支持物與在pH 7-9的0.1-10.0M硼酸鈉中含有0.1-5M甘油的溶液一起溫育。該步驟通過轉化為單氯二嗪對任何可以共價結合到PEI表面上的二氯三嗪「加帽」。優選的條件是在pH8.3的0.1M硼酸鈉中的0.2M甘油。然後可以用含有去汙劑的溶液洗固體支持物以去除未結合的物質，例如微量NMP。優選地，將固體支持物在0.01MNaCl、0.05M EDTA和0.1M Tris(pH8.0)中加熱至95℃5分鐘。此加熱步驟去除未共價結合的核酸多聚物如PCR產物。在排列雙鏈核酸的情況中，此步驟也具有將雙鏈變成單鏈形式(變性)的效應。
排列可通過生物素化的探針(例如寡核苷酸、核酸片段、PCR產物等)加以檢測。使核酸生物素化的方法在本領域眾所周知並且由Pierce進行了充分描述(抗生物素蛋白-生物素化學手冊，Pierce化學公司，1992，Rockford Illinois)。探針一般以0.1ng/mL到10μg/ML在包括GuSCN、GuHCl、甲醛等的標準雜交液中使用(參見Van Ness和Chen，核酸研究195143-5151，1991)。
為檢測雜交事件(即生物素的存在)，將固體支持物與鏈黴抗生物素蛋白/辣根過氧化物酶偶聯物一起溫育。這樣的酶偶聯物在商業上可獲自例如Vector Laboratories(Burlingham，CA)。鏈黴抗生物素蛋白以高親和性結合生物素分子從而使辣根過氧化物酶與雜交探針靠近。未結合的鏈黴抗生物素蛋白/辣根過氧化物酶偶聯物用簡單洗滌步驟洗去。然後在過氧化物和適當緩衝液存在的情況下利用沉澱底物檢測過氧化物酶的存在。
對於比色分析基質，點樣於反光性表面如矽片上的藍色酶產物具有與預期相比低許多倍水平的檢測(LLD)。此外，LLD對於不同的有色酶產物有很大不同。如實施例5中所示，每50μM直徑點4-甲氧基-napthol(產生沉澱的藍色產物)的LLD是約1000個分子，而紅色沉澱的物質每50μM直徑點給出約1000倍更高1,000,000個分子的LLD。通過用裝有可見光源和CCD相機(Princeton Instruments，Princeton，NJ)的顯微鏡(如可從Zeiss商業上得到的Axiotech顯微鏡)檢測表面來測定LLD。一次可掃描約10,000μM×10,000μM的圖象。
為了用藍色比色測定方案，表面在酶反應後必須很乾淨並且矽片或載片必須在乾燥狀態下掃描。此外，酸反應必須在對照點飽和之前終止。對於辣根過氧化物酶，這大約是2-5分鐘。
也可以使用鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶(HRP)的化學發光底物或HPP或鹼性磷酸酶的螢光底物。實例包括可獲自Perkin Elmer的鹼性磷酸酶diox底物或可獲自JBL Scientific(Scan Luis Obispo，CA)的AttophosHRP底物。生物分子溶液的自動轉移本發明提供一種將生物分子點樣到固體支持物上的方法，此方法包括以下步驟將彈性探頭端部浸入生物分子溶液中；將所述端部從所述溶液中移出以使生物分子溶液附著在所述端部上；並且使所述生物分子溶液與固體支持物接觸從而將生物分子溶液從所述端部轉移到所述固體支持物上。在優選實施方案中，接觸步驟自動進行，換句話說，是可在x，y和z軸上加以控制的精密自動系統。精密Cartesian自動系統將由與適當馬達、放大器、移動控制器、個人計算機和軟體連接以驅動工作檯的精密線性定位工作檯組成。精密線性定位工作檯可獲自Parker Hannifin公司(Daedel Division，Harrison City，PA)或THK有限公司(日本東京)。馬達、放大器和移動控制器可獲自Parker Hannifin公司(DaedelDivision，Harrison City，PA)或Galil Motion Control有限公司(Mountain View，CA)。軟體將最可能是自定義的並且可用語言如BorlandC++4.5(Borland International Inc.，Scotts Valley，CA)或VisualBasic 4.0(微軟公司，Redmond，WA)編寫。個人計算機可獲自眾多生產商如Dell計算機公司(Austin，TX)。
如上所述的彈性探頭製備成裝在任何類型的接受器中，本發明中有用的機器人含有適當大小的接受器以容納彈性探頭。優選的接受器由鎳-銀或青銅製成，然後在堅硬的鎳上鍍金。優選的接受器設計是直徑0.5mm到2.0mm、更優選地1.68毫米的金屬管。將0.5mm到1mm厚、更優選地0.64mm厚的方線彎入金屬管的一端並封閉。每個套殼製備有凹痕和壓環以安全地容納彈性探頭。將探頭插入接受器中，因此探頭管與接受器末端平齊。
為了排列液體的目的，將安裝頭部安裝到機器人上。該頭部具有可在不同印跡應用時拆卸的扣栓。例如，通過取下2個螺絲並用一個設計以容納從384孔板點樣的彈性探頭的扣栓代替一個設計以容納從96孔板點樣的彈性探頭的扣栓可容易地改變扣栓。用精密鑽出的、雙水平的孔與接受器的繞線和彎曲區域適當匹配藉助摩擦力將接受器固定在扣栓上。這種設計使得可以容易地更換損傷或操作不靈的接受器和/或彈性探頭。一旦插入，接受器/彈性探頭組件從扣栓向下伸出25mm，從而允許探針到達裝有待排列樣品液的微量滴定板底部。陣列本發明的生物分子陣列包括包含表面的固體基質，其中表面至少部分覆蓋有一層聚(乙烯亞胺)(PEI)。PEI塗層包括多個由連續第二區環繞並與其鄰接的分開的第一區。第一區有生物分子和PEI，而第二區有PEI並且基本上沒有生物分子。優選地，基質是玻璃板或矽板。然而，如上所述，基質可以是例如石英、金、尼龍-6，6、尼龍或聚苯乙烯以及它們的複合材料。
PEI塗層優選地含有具100-100,000分子量的PEI。雙功能偶聯劑的反應產物可以置於基質表面和PEI塗層之間，其中反應產物與表面和PEI塗層共價結合併將PEI塗層固定在表面上。雙功能偶聯劑包含第一和第二反應性功能基團，其中第一反應性功能集團是例如三(O-C1-C5烷基)矽烷，而第二反應性功能集團是例如環氧化合物、異氰酸酯、異硫氰酸酯和酐基團。優選的雙功能偶聯劑是2-(3，4-環氧環己基)乙基三甲氧矽烷；3，4-環氧丁基三甲氧矽烷；3-異氰酸根丙基三乙氧矽烷；3-(三乙氧甲矽烷基)-2-甲基丙基琥珀酸酐和3-(2，3-環氧丙氧基)丙基三甲氧矽烷。
本發明的陣列首先含有含生物分子的區域，其中每個區域具有約1,000平方微米-約100,000平方微米的面積。在優選的實施方案中，第一區具有約5,000平方微米-約25,000平方微米的面積。
第一區優選地基本上是圓形，圓圈具有約10μm-200μm的平均直徑。不論是否是圓形的，第一區的邊界優選地互相分開(由第二區分開)至少約25μm，然而不大於約1cm(並且優選地不大於約1,000μm)的平均距離。在優選的陣列中，相鄰第一區的邊界由平均約25μm-100μm的間隔分開，其中間隔優選地在整個陣列中一致，並且優選地第一區以如附圖中所示的重複幾何模式定位。在優選的重複幾何模式中，所有相鄰的第一區由大約相等的間隔(約25μm-約100μm)分開。
在優選的陣列中，基質上有10-50個第一區。在另一實施方案中，基質有50-400個第一區。在另一優選實施方案中，基質上有400-800個第一區。
位於第一區的生物分子優選地是核酸多聚物。優選的核酸多聚物是有約15-約50個核苷酸的寡核苷酸。生物分子可以是有約50-約1000個核苷酸的擴增反應產物。
在每個第一區中，生物分子優選地以每2,000μm2第一區105-109個生物分子的平均濃度存在。更優選地，生物分子的平均濃度是每2,000μm2107-109個生物分子。在第二區，生物分子優選地以每2000μm2所述第二區少於103個生物分子的平均濃度存在，更優選地以每2000μm2少於102個生物分子的平均濃度存在。最優選地，第二區不含任何生物分子。
對於許多生物技術應用，本發明有很大的用途，特別是那些涉及利用聚合酶鏈式反應(PCR)，核酸雜交，通過雜交的核酸測序，病毒、細菌或細胞文庫的複製開發大規模診斷篩選方法的方法以及任何其它涉及反覆將溶液排列到固體表面上的方法。
本發明的生物分子陣列可以通過標記的生物分子，例如與可切割的標記共價結合的寡核苷酸來探測。這些標記的生物分子可用於分析方法如寡核苷酸測序和基因表達分析等。標記的生物分子的實例和使用其的分析法描述於美國專利申請Nos.08/786,835；08/786,834和08/787,521(各於1997年1月22日提交)，以及具有申請Nos.08/898,180；08/898,564和08/898,501的三個美國部分繼續專利申請(各於1997年7月22日提交)，以及PCT國際公開Nos.97/27331；97/27325和97/27327中。在此完全引用這6個美國專利申請和3個PCT國際公開的全文作為參考。
此外，本發明的生物分子陣列可以在單元中含有一個以上寡核苷酸序列。在成分中含有一個以上寡核苷酸序列的生物分子陣列及其使用描述於1997年7月22日提交的題為「排列單元內的多功能性及其用途」的美國臨時專利申請No.60/053,436和與其同時提交的類似題目的美國非臨時專利申請No.＿＿＿＿中，在此完全引用二者的全文作為參考。
本發明的生物分子陣列也可用於進行擴增和其它酶反應，如在我們1997年7月22日提交的題為「對核酸陣列進行的擴增和其它酶反應」的美國臨時專利申請No.60/053,428和與其同時提交的類似題目的美國非臨時專利申請No.＿＿＿＿中所述，在此完全引用二者的全文作為參考。
本發明的生物分子陣列可以按照1997年7月22日提交的題為「將溶液排列到固體支持物上的裝置和方法」的美國臨時專利申請No.60/053,435和與其同時提交的類似題目的美國非臨時專利申請No.＿＿＿＿中所述的方法製備，在此完全引用二者的全文作為參考。
如1997年7月22日提交的題為「使數據相關的計算機方法和系統」的美國臨時專利申請No.60/053,429和與其同時提交的類似題目的美國非臨時專利申請No.＿＿＿＿(在此充分引用二者的全文作為參考)中所述的使數據相關的計算機系統和方法可與本文公開的方法和裝置結合使用。
提供以下實施例作為舉例說明而不是限制。實施例實施例1一步法製備有PEI塗層的玻片用0.1N乙酸洗玻片，然後用水衝洗直到從玻片上洗出的水的pH與用於衝洗玻片的水的pH相同。然後使玻片乾燥。
向95∶5的乙醇∶水溶液中加入足夠量的溶於2-丙醇(Gelest，Inc.，Tullytown，PA，目錄號SSP060)中的50％ w/w三甲氧基甲矽烷基丙基-聚乙烯亞胺(600MW)以達到2％ w/w終濃度。攪拌此2％溶液5分鐘後，將玻片浸入溶液中，輕輕攪拌2分鐘，然後取出。為了洗去過多的甲矽烷基化試劑，將玻片浸入乙醇中。然後使玻片空氣乾燥。實施例2一步法製備有PEI塗層的矽片用0.1N乙酸洗矽片(WaferNet，San Jose，CA)，然後用水衝洗直到從矽片上洗出的水的pH與用於衝洗矽片的水的pH相同。然後使矽片乾燥。
向95∶5的乙醇∶水溶液中加入足夠量的溶於2-丙醇(Gelest，Inc.，Tullytown，PA，目錄號SSP060)中的50％ w/w三甲氧基甲矽烷基丙基-聚乙烯亞胺(600MW)以達到2％ w/w終濃度。攪拌此2％溶液5分鐘後，將矽片浸入溶液中，輕輕攪拌2分鐘，然後取出。為了洗去過多的甲矽烷基化試劑，將矽片浸入乙醇中。然後使矽片空氣乾燥。實施例3一步法製備有PEI塗層的玻片用0.1N乙酸洗玻片，然後用水衝洗直到從玻片上洗出的水的pH與用於衝洗玻片的水的pH相同。然後使玻片乾燥。
向95∶5的乙醇∶水溶液中加入足夠量的親電子甲矽烷基化試劑，同時攪拌以達到2％ w/w終濃度。親電子甲矽烷基化試劑是2-(3，4-環氧環己基)乙基三甲氧矽烷(Gelest，Inc.，Catalog No.SIE4670.0)，3，4-環氧丁基三甲氧矽烷(Gelest，Inc.，Catalog No.SIE4665.0)或3-異氰酸根丙基三乙氧矽烷(Gelest，Inc.，Catalog No.SII6454.0)之一。攪拌此2％溶液5分鐘後，將玻片浸入溶液中，輕輕攪拌2分鐘，然後取出。為了洗去過多的甲矽烷基化試劑，將玻片浸入乙醇中。
通過用1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)稀釋30％聚乙烯亞胺(Polysciences，Warrington，PA)水溶液來製備70,000分子量聚乙烯亞胺的3％(w/v)溶液。將處理的玻片浸入3％溶液中並輕輕攪拌24小時。為了去除玻片上過多的PEI，將玻片浸入NMP中(2X)，然後浸入同時含有0.09MNaCl、50mM TrispH7.6和25mM DETA的0.1％十二烷基磺酸鈉水溶液中(2X)，然後浸入水中(2X)，並且最後浸入乙醇中(1X)。然後使玻片空氣乾燥。實施例4一步法製備有PEI塗層的矽片按照實施例3中所述用0.1N乙酸洗矽片(WaferNet，San Jose，CA)，然後也按照實施例3中所述用甲矽烷基化試劑和PEI處理。實施例5從商業彈性探頭製備點樣頭XP54P彈性探頭購自Osby-Barton〔Everett Charles(Pomona，CA)的分公司〕。將探頭「端部向下」對著超細的金剛磨石(DMT Inc.，Miami Lattes，FL)並以輕輕的壓力在磨石上橫移約0.5cm距離。通過顯微鏡觀察到由此從點樣頭的末端去掉約0.005英寸(0.001到0.01英寸)的金屬。然後通過在皮帶上摩擦端部將點樣頭末端磨光。然後用水洗端部。在開始使用前或使用之間，將點樣頭乾燥保存或於-20℃保存在50％甘油中。實施例6用改進的彈性探頭裝配排列裝置將實施例5中製備的端部安裝到布列頭部中，布列頭部裝在可在x，y和z軸上控制的精密自動系統上。精密Cartesian自動系統將由與適當馬達、放大器、移動控制器、個人計算機和軟體連接以驅動工作檯的線性定位工作檯組成。精密線性定位工作檯可獲自Parker Hannifin公司(Daedel Division，Harrison City，PA)或THK有限公司(日本東京)。馬達、放大器和移動控制器可獲自Parker Hannifin公司(Daedel Division，Harrison City，PA)或Galil Motion Control有限公司(Mountain View，CA)。實施例7用親水性表面促進液體汲取、液體轉移和微滴點樣按照實施例5將彈性探頭端部浸於100mM 1，4-二硫蘇糖醇和0.1M的硼酸鈉溶液中60分鐘。二硫蘇糖醇將通過硫醇-金配位與金表面反應以製備金親水性表面(表面基本上羥化)。實施例8反應性寡核苷酸的製備將75μl 5』-己胺-GTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG-3』(0.5μg/μl)溶液與5μl 20mg/ml的氰尿醯氯和20μl 1M的硼酸鈉在室溫反應30分鐘。實施例9寡核苷酸的布列溶液製備由12.5μL pH8.3的1M硼酸鈉(新鮮製備或從-20℃儲液凍融)、50μl 0.1μg/μL的5』己胺寡核苷酸(5』己胺-GTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG-3』)、7.5μL乙腈中的15mg/mL氰尿醯氯組成的布列溶液。將此混合物在室溫下溫育30到60分鐘。然後向溶液加入155μL 80％甘油並將所得溶液充分混合。在某些情況下，向溶液加入15μL 10％的NP-40或10％的Tween 20或10％的Triton X-100(Rohm和Hass，費城)。當排列基質由尼龍或硝酸纖維素膜組成時，向布列溶液加入25μL 5M的NaCl。實施例10PCR擴增子的布列溶液當排列PCR擴增子時，在完成熱循環步驟後將2.5μL pH8.3的1M硼酸鈉(新鮮製備或從-20℃儲液凍融)、50μl 0.1μg/μL的5』己胺寡核苷酸(5』己胺-GTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG-3』)、7.5μL乙腈中的15mg/mL氰尿醯氯加入含有PCR內容物的PCR管中。將此混合物在室溫下溫育30到60分鐘。然後向溶液加入155μL 80％甘油並將得到的溶液充分混合。在某些情況下，向溶液加入15μL 10％的NP-40或10％的Tween 20或10％的Triton X-100。當排列基質由尼龍或硝酸纖維素膜組成時，向布列溶液加入25μL 5M的NaCl。實施例11排列寡核苷酸的製備按照實施例6將實施例5的改進的彈性探頭安裝在自動移液裝置中，並且按照實施例7處理彈性探頭端部。將端部浸入實施例9的布列溶液中5毫米2秒種。然後機器人用帶有溶液的端部以12×6網格在有聚乙烯亞胺(PEI)塗層的矽片上印跡72個微點，矽片根據實施例2、4中的任一項製備或由將會根據合同製備有PEI塗層的基質的Cell Associates(Houston，Texas)等提供。產生的點直徑約100-150微米，相鄰點之間中心到中心的間距是200微米。實施例12活性PEI位點的封閉為了封閉排列上未反應的PEI位點，用100mg/mL 100％ NMP中的琥珀酸酐處理實施例11的陣列15分鐘。實施例13未反應的氰尿醯氯位點的封閉為了封閉排列上未反應的氰尿醯氯位點，用0.1M 0.01M Tris中的甘油處理實施例12的陣列15分鐘，然後用Tens(0.1MNaCl，0.1％ SDS，0.01MTris，5 mM EDTA)洗4次。實施例14雜交方法使實施例13的陣列中的固定寡核苷酸與其生物素化的互補產物(5』-生物素-TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3』)在37℃雜交20分鐘，用6X Tens、2 X OHS
洗。
雜交後，將矽片浸入0.5μg/ml鹼性磷酸酶鏈黴抗生物素蛋白中15分鐘，用2X Tens、4X TWS(0.1M NaCl，0.1％Tween20，0.05M Tris)洗。然後用Vector Blue(Vector Laboratories，Burlingame，Califor-nia)(按照試劑盒方法)使微點顯色並用CCD相機和顯微鏡照相。圖5顯示產生的圖象。實施例15單一陣列單元內的多個寡核苷酸濃度均為0.5μl/μl的2種模板寡核苷酸(寡核苷酸#1＝5』己胺-TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3』，寡核苷酸#2＝5』己胺-ACTACTGATCAGGCGCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3』)分別與20μl 1M硼酸鈉中的5μl 20mg/ml氰尿醯氯於室溫反應30分鐘(總反應體積＝100μl)。從這兩個反應製備由56％甘油和這兩種寡核苷酸的稀釋組合組成的布列溶液(見表1)。將8個點樣頭各浸入8種布列溶液中5毫米2秒鐘。然後機器人在聚乙烯亞胺(PEI)塗敷的矽片上用帶有溶液的端部印跡2套8個各含有72個微點的12×6網格。每個網格代表單一的布列溶液。產生的點直徑約100-150微米，相鄰點之間中心到中心的間距是200微米。
排列後，矽片上未反應的PEI位點用100mg/mL 100％N-甲基吡咯烷酮中的琥珀酸酐封閉15分鐘，水洗3X。未反應的氰尿醯氯位點用0.01M Tris中的0.1M甘油封閉15分鐘，Tens(0.1M NaCl，0.i％SDS，0.01M Tris，5 mM EDTA)洗4X。然後進行兩種雜交。
在第一種雜交中，將一套8種排列的寡核苷酸組合與互補於寡核苷酸#`1的生物素化寡核苷酸(5』-生物素-TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3』)雜交。在第二種雜交中，將另一套8種排列的寡核苷酸組合與互補於寡核苷酸#`2的生物素化寡核苷酸(5』-生物素-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCGCGCCTGATCAGTAGT-3』)雜交。雜交於37℃在Hybriwell SealingCovers(Research Products International Corporation，Mount Prospect，Illinois)下同時進行20分鐘，用6X Tens、2 X OHS(0.06M Tris，2mMEDTA)、5 X Denhardt’s溶液、6X SSC(3M NaCl，0.3M檸檬酸鈉，pH7.0)、3.68mM N-月桂醯肌氨酸、0.005％NP-40洗。
雜交後，將矽片浸入0.5μg/ml辣根過氧化物酶鏈黴抗生物素蛋白中15分鐘，用2X Tens、4X TWS(0.1M NaCl，0.1％Tween 20，0.05M Tris)洗。然後用0.4mg/ml的4-甲氧基-1-napthol(0.02％過氧化氫，12％甲醇，PBS)使微點顯色，最後水洗3X。
與寡核苷酸#1的互補產物雜交的混合寡核苷酸系列對於含有最高濃度寡核苷酸#1的網格表現最強的顏色強度而對於含有最低濃度寡核苷酸#1的網格表現最低的顏色強度。而且，與寡核苷酸#2的互補產物雜交的混合寡核苷酸系列對於含有最高濃度寡核苷酸#2的網格表現最強的顏色強度而對於含有最低濃度寡核苷酸#2的網格表現最低的顏色強度(見圖6)。
表1<

>實施例16測定單元大小的一致性製備由56％甘油和44％用藍色食物染料染色的水組成的布列溶液。將點樣頭浸入布列溶液中5毫米2秒鐘。然後機器人用帶有甘油的端部以12×6網格在矽片上印跡72個微點。產生的點直徑約100-150微米，相鄰點之間中心到中心的間距是200微米。圖7顯示機器人產生的網格的CCD相機相片。點直徑的標準偏差約為15％。實施例17測定排列方法內的可重複性製備由56％甘油、0.01M Tris pH7.2、5mm EDTA、0.01％肌氨醯和1％V/V Fluoresbrite Plain 0.5μM微球體(2.5％Solids-latex)(Polysciences，Warrington，PA)組成的布列溶液。將點樣針頭浸入溶液中5毫米5秒鐘並且然後用於在玻片上印跡多個微點。然後用螢光濾鏡在螢光下進行顯微攝影。圖8顯示每個微點(陣列單元)螢光微球體的高度重複性點樣(通過肉眼觀察測定)。實施例18測定每單元核酸多聚物的濃度將與點樣的寡核苷酸互補的寡核苷酸(5』-德克薩斯紅-CAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATGAC)與3M硫氰酸胍(GcSCN)、0.01M TrispH7.5、5mM EDTA和0.1％肌氨醯中的陣列雜交。體積足以覆蓋固體支持物〔對於玻片(1×3英寸)為1mL〕。德克薩斯紅寡核苷酸的濃度為5μg/ml，並且反應在室溫進行。使雜交進行30分鐘。然後用Tens洗玻片(5X)。然後用1mL洗脫緩衝液(0.005M Tris pH7.6，0.0005M EDTA，0.01％肌氨醯)覆蓋玻片並加熱到95℃ 2分鐘。從玻片上汲取溶液並將其置於黑色微量滴定板中。在黑色微量滴定板中測定螢光。從溫育管汲取溶液(200μL)並將其置於黑色微量滴定板中(Dynatek Laboratories，Chantilly，VA)。然後用Fluoroskan II螢光計(Flow Laboratories，McLean，VA)直接對平板讀數，對於螢光素用495nm的激發波長並且在520nm處監測發射光，對於德克薩斯紅用591nm的激發波長並且在612nm處監測發射光，並且麗絲胺或TAMRA用570nm的激發波長並且在590nm處監測發射光。洗脫的寡核苷酸的量通過用測得的螢光量〔3.84個相對螢光單位(rfu)〕除以德克薩斯紅寡核苷酸的比活(每μg寡核苷酸6.9rfu)加以測定。因此測得陣列中的每單元中存在108個寡核苷酸。
從前述應當理解，雖然在此為了舉例說明的目的描述了本發明的具體實施例，但在不偏離本發明精神和範圍的情況下可進行各種修飾。因此，除了所附的權利要求外，本發明不受其它限制。
權利要求
1.一種生物分子陣列，包括包含表面的固體基質；所述表面至少部分覆蓋有一層聚(乙烯亞胺)(PEI)；所述塗層包括多個由第二區環繞並與其鄰接的分開的第一區；所述第一區有生物分子和PEI；並且所述第二區有PEI並且基本上沒有生物分子。
2.權利要求1的陣列，其中所述基質是玻璃板。
3.權利要求1的陣列，其中所述基質是矽片。
4.權利要求1的陣列，其中所述基質包含選自玻璃、石英、矽、金、尼龍-6，6、尼龍和聚苯乙烯的物質。
5.權利要求1的陣列，其中所述PEI具有100-100,000的分子量。
6.權利要求1的陣列，其中雙功能偶聯劑的反應產物位於所述表面和所述PEI塗層之間，所述反應產物與所述表面和所述PEI塗層共價結合。
7.權利要求6的陣列，其中所述雙功能偶聯劑包含第一和第二反應性功能基團，所述第一反應性功能集團是三(O-C1-C5烷基)矽烷而所述第二反應性功能集團選自環氧化合物、異氰酸酯、異硫氰酸酯和酐。
8.權利要求7的陣列，其中所述雙功能偶聯劑選自2-(3，4-環氧環己基)乙基三甲氧矽烷；3，4-環氧丁基三甲氧矽烷；3-異氰酸根丙基三乙氧矽烷；3-(三乙氧甲矽烷基)-2-甲基丙基琥珀酸酐和3-(2，3-環氧丙氧基)丙基三甲氧矽烷。
9.權利要求1的陣列，其中每個所述第一區具有約1,000μm2-100,000μm2的面積。
10.權利要求1的陣列，其中所述面積是約5,000μm2-約25,000μm2。
11.權利要求1的陣列，其中每個所述第一區是基本上圓形的。
12.權利要求11的陣列，其中所述第一區有10μm-200μm的平均直徑。
13.權利要求1的陣列，其中所述第一區互相之間由至少約25μm的平均間隔分開。
14.權利要求1的陣列，其中相鄰的所述第一區由不大於約1cm的平均間隔分開。
15.權利要求1的陣列，其中相鄶的所述第一區由不大於1,000μm的平均間隔分開。
16.權利要求1的陣列，其中相鄰的所述第一區由約25μm-100μm的平均間隔分開。
17.權利要求1的陣列，其中所述第一區以重複幾何模式定位。
18.權利要求17的陣列，其中所述第一區互相間隔大約相等的距離。
19.權利要求18的陣列，其中所述距離是約25μm-約100μm。
20.權利要求17的陣列，其中所述模式包括圓形的第一區，所述圓形的第一區有約100-約1,000μm的平均直徑。
21.權利要求1的陣列，有10-50個第一區。
22.權利要求1的陣列，有50-400個第一區。
23.權利要求1的陣列，有400-800個第一區。
24.權利要求1的陣列，其中所述生物分子選自包括核酸多聚物的群體。
25.權利要求24的陣列，其中所述生物分子是有約15-約50個核苷酸的寡核苷酸。
26.權利要求24的陣列，其中所述擴增反應產物是有約50-約1,000個核苷酸的核酸多聚物。
27.權利要求1的陣列，其中所述生物分子以每2,000μm2第一區105-109個生物分子的平均濃度存在於第一區中。
28.權利要求27的陣列，其中所述平均濃度是每2,000μm2107-109個生物分子。
29.權利要求1的陣列，其中所述生物分子以每2000μm2所述第二區少於103個生物分子的平均濃度存在於第二區中。
30.一種製備生物分子陣列的方法。此方法包括提供包含表面的固體基質，其中聚(乙烯亞胺)(PEI)層覆蓋所述表面的至少一部分，所述塗層包括多個由連續的第二區環繞並與其鄰接的分開的第一區；將生物分子上樣到所述的第一區而保持所述的第二區基本上不含生物分子。
31.權利要求30的方法，其中所述基質是玻璃板。
32.權利要求30的方法，其中所述基質是矽片。
33.權利要求30的方法，其中所述基質包含選自玻璃、石英、矽、金、尼龍-6，6、尼龍和聚苯乙烯的物質。
34.權利要求30的方法，其中所述PEI具有100-100,000的分子量。
35.權利要求30的方法，其中雙功能偶聯劑的反應產物位於所述表面和所述PEI塗層之間，所述反應產物與所述表面和所述PEI塗層共價結合。
36.權利要求35的方法，其中所述雙功能偶聯劑包含第一和第二反應性功能基團，所述第一反應性功能集團是三(O-C1-C5烷基)矽烷而所述第二反應性功能集團選自環氧化合物、異氰酸酯、異硫氰酸酯和酐。
37.權利要求36的方法，其中所述雙功能偶聯劑選自2-(3，4-環氧環己基)乙基三甲氧矽烷；3，4-環氧丁基三甲氧矽烷；3-異氰酸根丙基三乙氧矽烷；3-(三乙氧甲矽烷基)-2-甲基丙基琥珀酸酐和3-(2，3-環氧丙氧基)丙基三甲氧矽烷。
38.權利要求30的方法，其中每個所述第一區具有約1,000μm2-100,000μm2的面積。
39.權利要求30的方法，其中所述面積是約5,000μm2-約25,000μm2。
40.權利要求30的方法，其中每個所述第一區是基本上圓形的。
41.權利要求40的方法，其中所述第一區有10μm-200μm的平均直徑。
42.權利要求30的方法，其中所述第一區互相之間由至少約25μm的平均間隔分開。
43.權利要求30的方法，其中相鄰的所述第一區由不大於約1cm的平均間隔分開。
44.權利要求30的方法，其中相鄰的所述第一區由不大於1,000μm的平均間隔分開。
45.權利要求30的方法，其中相鄰的所述第一區由約25μm-100μm的平均間隔分開。
46.權利要求30的方法，其中所述第一區以重複幾何模式定位。
47.權利要求46的方法，其中所述第一區互相間隔大約相等的距離。
48.權利要求47的方法，其中所述距離是約25μm-約100μm。
49.權利要求46的方法，其中所述模式包括圓形的第一區，所述圓形的第一區有約100-約1,000μm的平均直徑。
50.權利要求30的方法，有10-50個第一區。
51.權利要求30的方法，有50-400個第一區。
52.權利要求30的方法，有400-800個第一區。
53.權利要求30的方法，其中所述生物分子是核酸多聚物。
54.權利要求53的方法，其中所述生物分子是有約15-約50個核苷酸的寡核苷酸。
55.權利要求53的方法，其中所述擴增反應產物是有約50-約1,000個核苷酸的核酸多聚物。
56.權利要求30的方法，其中所述生物分子以每2,000μm2第一區105-109個生物分子的平均濃度存在於第一區中。
57.權利要求56的方法，其中所述平均濃度是每2,000μm2107-109個生物分子。
58.權利要求30的方法，其中所述生物分子以每2000μm2所述第二區少於103個生物分子的平均濃度存在於第二區中。
59.權利要求30的方法，其中所述上樣生物分子包括將核酸多聚物轉移到彈性探頭端部上。
60.權利要求30的方法，其中所述樣生物分子包括將核酸多聚物從噴黑印跡頭中噴出。
全文摘要
本發明提供一種生物分子陣列,由包含表面的固體基質構成,其中表面至少部分覆蓋有一層聚(乙烯亞胺)(PEI),並且PEI層分為多個由連續第二區環繞並與其鄰接的分開的第一區。第一區有生物分子和PEI,而第二區有PEI並且基本上沒有生物分子。陣列可以通過包括以下步驟的方法製備:提供包含表面的固體基質,其中聚(乙烯亞胺)(PEI)層覆蓋所述表面的至少一部分,所述塗層包括多個由連續的第二區環繞並與其鄰接的分開的第一區;將生物分子上樣到第一區而保持第二區基本上不含生物分子。
文檔編號G01N37/00GK1265049SQ98807480
公開日2000年8月30日 申請日期1998年7月21日 優先權日1997年7月22日
發明者J·范尼斯, J·C·塔伯恩, K·莫伊尼漢 申請人:拉普吉恩公司