用於蛋白質痕量測定的組合物的製作方法
2023-12-03 12:58:06
專利名稱：用於蛋白質痕量測定的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於在低濃度至痕量情況下，對含有蛋白質的液態樣品(如尿液)中的蛋白質進行檢測或定量的組合物。
判定人體往尿液中是否排洩過多的蛋白質如白蛋白等在臨床上是非常重要的。即使是健康的人，即在腎臟的功能正常的情況下，也有極少量的蛋白質被排出，並且其每天的排洩總量達50到100mg。另外，已知排出的數量在身體鍛鍊之後或依據身體狀況而增加，這被稱之為生理性蛋白尿。根據電泳分析，健康人排到尿液中的蛋白質大約60％來源於血漿，而分子量約為67,000的白蛋白約佔其中的70％到80％。
除了生理性蛋白尿以外，可以將病理性蛋白尿分為腎前性、腎或腎後性類型，而腎類型進一步分為亞型，如源於腎小球、源於腎小管等等。腎前性蛋白尿是由於特定的器官組織功能發生變化或異常而將增加的血液蛋白質排洩至尿中造成的結果，而對這種特定的成分的檢測直接與病理症狀的診斷有關。典型的例子是標記癌症的Bence Jones蛋白質。在腎蛋白尿類型中，以白蛋白等為代表的腎小球蛋白尿是由於腎小球基底膜的濾過功能降低引起的，以β2-微管球蛋白和α1-微管球蛋白為代表的管蛋白是由於腎小管重吸收能力降低引起的，而這二種情況都可以作為了解腎功能降低和腎功能異常程度的良好標記。腎後性蛋白尿是表示以下症狀的一種蛋白尿某種器官如腎盂、輸尿管、膀胱、尿道、前列腺等處的出血、結石、腫瘤等，因而它可用於對上述的典型病症進行診斷。
在眾多的蛋白尿的檢測方法中，使用pH指示劑四溴酚藍(TBPB)的蛋白質誤差法已具有悠久的歷史並且它仍被確認為一種篩選檢驗的方法。TBPB在pH為2到3時顯示出黃顏色，而在pH大於或等於4時顯示為藍色，但在溶液中存在蛋白質的情況下其在pH為3時顯示為藍色。如果將試紙如濾紙等浸泡在TBPB和pH為3的緩衝劑中，利用藍色調的變化取決於尿液中蛋白質如白蛋白等的存在數量這一現象，可以根據色調的變化來讀出蛋白尿的濃度。
但是，一般這種「蛋白質誤差法」不能檢測濃度小於或等於10-15mg/dl的蛋白質。而且，由於該方法是一種試紙方法，因而這種檢測是定性結果，如「-」到「±」到「+。另外，一般可檢測的蛋白質只是白蛋白，而約佔血漿蛋白的40％的球蛋白及上述的Bence Jones蛋白質等不能被檢測出來。
在這種定性測定的方法之外，還有許多已知的用於對蛋白質自身進行定量檢測的方法。在Kingsbury-Clark法中例舉的濁度測定法作為一種主要的常規檢測方法就已沿用了大約20年，但是其缺陷在於與蛋白質誤差法的情況相似，它幾乎不與除了白蛋白以外的蛋白質發生反應。而且，由於這種方法是一種手工方法，檢測耗時耗力。
現在作為一種定量檢測的方法，最為頻繁使用的是如採用鄰苯三酚紅與金屬如鉬等染料絡合物的染料結合法。根據這種方法，不僅可通過手工操作而且可將它用它應用於自動分析儀上而得到高度準確的測定結果。
JP-B-4-53265(這裡所用的術語「JP-B」意思為「受審查的日本專利出版物」)公開了一種測定痕量蛋白質的比色法，這種方法中採用了一種能與鉬形成絡合物並在蛋白質存在的條件下能使其波長發生偏移的染料。該方法的基本原理是已知的如果在被測定的樣品中存在一種能與鉬結合的物質，則該試驗在正常尿液的情況下表現為負值，因而它的吸光率變得比純水的測定值更低。
為此，JP-B-4-53265採取措施將反應物中的鉬掩蓋於抑制劑之外，如形成與鉬結合的螯合劑或形成與抑制劑結合的金屬離子，如在試劑組合物中預先使檸檬酸等與鉬結合。
JP-B-6-70632也公開了一種測定痕量蛋白質的比色法，該方法包括採用在蛋白質存在時能與鎢形成絡合物並使其波長發生偏移的多羥基苯基磺酸酞染料和/或多羥基苯基酞染料，和保持組合物酸性pH的緩衝劑。
此外，出版物「鄰苯三酚紅-鉬(VI)絡合物與蛋白質的顏色反應」，Y.Fujita，I.Mori和S.Kitano，分析化學，32，pp.E379-E386(1983)，描述了金屬和染料的篩選試驗的結果，該結果可用作利用蛋白質誤差現象而進行痕量蛋白質測定的方法。該染料為多羥基苯基磺酸酞染料或多羥基苯基酞染料。被篩選的金屬的實施例包括鉬(VI)、鈦(III)、鋁(III)、鐵(III)、鈾(VI)、鋯(IV)、銻(III)、鎢(VI)、鈰(III)、錫(IV)、鋅(II)、鎂(II)、汞(II)、銀(I)和鈣(II)。
本發明的目的在於採用一種新的方法對如尿液等液態樣品中的痕量蛋白質進行檢測和定量。
本發明的這一目的以及此外的目的是通過以下這種組合物實現的該組合物與含有蛋白質的液態樣品接觸時能表現出足夠的顏色的變化以指示該樣品中蛋白質的存在和/或濃度，該組合物包括銦或銦的化合物，和能與銦形成絡合物的染料或色素。
圖1為顯示採用本發明的組合物時，標準蛋白質溶液的連續稀釋物的吸光率的測定結果的曲線圖。
圖2為顯示本發明組合物與先前的方法之間相關性的曲線圖。
圖3為顯示將螯合劑加入到本發明組合物中時的吸光率測定結果的曲線圖。
圖4為顯示在加入螯合劑時本發明的組合物與先前的方法之間的比較的曲線圖。
根據本發明，採用如下的指示劑試劑組合物可以在低濃度到痕量的低水平下對被測樣品溶液中的蛋白質進行測定，該組合物中含有新改進的銦化合物/染料或色素絡合物，因而它能獲得對低濃度蛋白質的充足敏感性從而足以用肉眼判斷顏色色調的變化。具體地說，可以對少量至痕量的蛋白質進行測定，可以定量地測定尿液中0mg/dl到2,000mg/dl，尤其是0mg/dl到約30mg/dl的蛋白質水平。另外，採用本發明的試劑組合物，可以檢測和測定低濃度到痕量水平的尿液蛋白質，如濃度為0mg/dl到約30mg/dl之間，0mg/dl到約5mg/dl之間或約5mg/dl到10mg/dl之間。可以以同樣的方式測定脊髓液中蛋白質的量。
本發明的試劑組合物適於在溼條件如液態反應物下進行測定，也可在幹條件下進行測定，如其中的試劑組合物被均勻地包裹在載體中。用於幹條件的載體的實施例包括可吸水的多孔物質如濾紙、不吸水的物質如由滲透性聚合物製成的膜和水溶性聚合物的捏和物。該試劑組合物被包在載體內，以預定的足以使液態樣品滲透至載體內的濃度均勻地充滿全體。
與JP-B-4-53265的情況不同的是，無需在試劑組合物中預先形成螯合劑以將銦掩蓋於抑制劑之外或形成金屬離子，因為與鉬結合的檸檬酸等不是銦的抑制劑。
本發明利用以下現象多羥基苯基磺酸酞染料或多羥基苯基酞染料如焦兒茶酚紫、鄰苯三酚紅、溴化鄰苯三酚紅、二甲苯酚橙、鄰苯三酚酞和o-羥基對苯二酚等與銦形成絡合物，如此形成的絡合物與蛋白質結合而使波長發生偏移。它們可以單獨或結合使用。本發明得到的組合物可以用作液態系統測定試劑或被加工成簡單的干係統試樣。
對於在銦/染料或色素絡合物中使用的銦化合物沒有具體的限定。但是，這種銦化合物應在水中充分溶解以與上述的多羥基苯基磺酸酞染料或多羥基苯基酞染料形成絡合物。另外，本發明中所用的銦化合物的陽離子優選為基本上不被著色，以避免具有高著色度的陽離子對測定的幹擾。在水中具有充足的溶解度，並用於與多羥基苯基磺酸酞染料或多羥基酞染料形成絡合物的銦化合物包括硫酸銦、氯化銦、溴化銦、硝酸銦和二硫酸銦銨(ammonium indium bissulfate)。它們可單獨或結合使用。
在採用本發明的試劑組合物的液態系統中，銦和能與試劑組合物中的銦形成絡合物的染料或色素的量分別優選為10-400μM和10-250μM，而銦和染料或色素的摩爾比優選為1∶10到1∶1或5∶1到1∶1。另一方面，在干係統中，可以採用上述的用量和摩爾比範圍，但是用量可更高些。
在本發明中可使用任何一種緩衝劑，只要它們能使試劑反應系統保持足以產生指示劑組合物所要求的色調變化的穩定pH，並且能夠基本上消除由於受試的含有蛋白質的樣品的pH波動所引起的色調變化。但是，該緩衝劑的特性隨混合在指示劑組合物中的銦化合物/染料或色素絡合物而變。另一方面，緩衝劑的量取決於各個被測定的樣品的特性。一般來說，試劑組合物中緩衝劑的量約為100mM-500mM。
雖然在該試劑組合物中優選使用緩衝劑，但並不總是需要往該組合物中加入緩衝劑。例如，通過以下方法可以得到緩衝劑的效果首先，製備一種僅由銦或銦的化合物和能與銦形成絡合物的染料或色素組成的組合物，使該試劑組合物與被測定的樣品接觸，然後加入可使反應系統保持在酸性pH的緩衝劑。也就是說，它也包括將緩衝劑預先加入到尿液中的情況和被測定的樣品中已經含有適量的適宜的緩衝劑。
可在本發明中使用的酸性緩衝劑的實施例包括甘氨酸緩衝劑(如甘氨酸/鹽酸)、乳酸鹽、苯二甲酸鹽、琥珀酸鹽、三氯乙酸鹽、磺基水楊酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、氯化鈉/鹽酸、哌嗪-N，N』-雙(2-羥基丙烷)磺酸(POPSO)、N-2-羥基乙基哌嗪-N』-2-乙烷磺酸(HEPES)、3-N-(三羥基甲基)甲氨基-2-羥基丙烷磺酸(TAPSO)和2-((三-(羥基甲基)甲基)氨基)乙烷磺酸(TES)和其它本技術領域中已知並能將pH的值保持在2.0-4.0優選為2.2-2.7的酸性緩衝劑。
本發明的試劑組合物也可以含有一種選擇性組分，如基本上不會改變該銦化合物/染料或色素絡合物的特性和功能的表面活性劑和不幹擾蛋白質測定的緩衝劑。加入表面活性劑(雖然僅限於液態系統試劑溶液條件)除了用來增加與蛋白質發生反應的可能性以外，所加入的表面活性劑具有防止反應室內被著色的效果。該表面活性劑可以為非離子表面活性劑或陰離子表面活性。試劑組合物中表面活性劑的量也可優選為重量的0.001到1％。
非離子表面活性劑的適宜實施例包括三硝基甲苯系列、甲基纖維素、聚乙烯基乙醇和布裡傑系列。陰離子表面活性劑的適宜實施例包括十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉和聚丙烯酸。
同樣的，其它不重要的組分的實施例包括聚合體化合物、增塑劑和用作惰性基質的染料。
此外，JP-B-6-70632描述該試劑中不含有螯合劑，如果含有螯合劑反而會干擾測定。但是，根據本發明的其它重要特性，本發明的組合物即使含有螯合劑仍能平穩地發揮功能。例如，即使該反應物或尿液中不含有具有螯合活性的化合物如甘氨酸緩衝劑、酒石酸、草酸、檸檬酸、亞氨基二乙酸(IDA)等，這些測定仍不會導致不正確的結果。
本發明可用於根據一般幹試樣製備方法得到的幹類型試樣。例如，可以將可吸水的多孔材料如濾紙與本發明的試劑組合物的含水溶液一起浸泡，將樣品乾燥，然後可選擇將其粘在不滲透水的材料上以用作手柄。
根據本發明的方法，通過顯示充分的顏色變化來指示樣品中蛋白質的存在和/或濃度，從而可以對液態樣品中痕量蛋白質進行定量。
以下通過例舉而不是限定的方式給出本發明的實施例。
實施例1將具有以下配方的試劑溶於純水中而製得含有以下組分的試劑溶液。
溴化鄰苯三酚紅 0.05mM(DOJINDOLABORATORISE)硫酸銦 0.05mM(NAKALAI TESQUE，INC.)琥珀酸鹽緩衝劑 pH2.7(琥珀酸+氫氧化鈉)十二烷基硫酸鈉 0.1％(NAKALAI TESQUE，INC.)
將人體血清白蛋白的濃度調節到200mg/dl作為標準蛋白質溶液。用這種標準溶液製得在圖1的橫坐標上顯示各個濃度的連續稀釋物。將試劑溶液(350μl)加入到5μl的由此製得的各樣品中，並將混合物在37℃下保溫10分鐘，在600nm處測定吸光率。結果如圖1所示。從該圖中可以看出，得到了一個非常良好的標準曲線。
實施例2採用與實施例1相同的步驟對共60份患者的尿樣進行測定。也可以採用先前的方法(鄰苯三酚紅-鉬方法；商業上可購得的試劑)進行測定，審查本發明方法和先前的方法之間的相關性。結果如圖2所示。得到相關係數為0.9946的非常良好的相關性。
實施例3將以下配方的試劑溶於純水中而製得含有以下成分的試劑溶液，將一張濾紙(由Whatman Corp.製造3MMchr)浸泡在試劑溶液中，將其從溶液中取出並在50℃下吹風乾燥10分鐘，接著將如此得到的基片分割成5mm×80mm的紙帶用作幹試紙。
溴化鄰苯三酚紅 0.25mM(NAKALAI TESQUE，INC.)硫酸銦 0.25mM(NAKALAI TESQUE，INC.)琥珀酸鹽緩衝劑 pH2.7(琥珀酸+氫氧化鈉)三硝基甲苯X-100(NAKALAI TESQUE，INC.) 0.5％將表1所示濃度的標準蛋白質溶液(10μl)點樣於如此得到的試紙上，用裸眼觀察30秒後斑點色調的變化。如表1所示，用裸眼足以判定結果表1
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實施例4將以下配方的試劑溶於純水中而製得含有以下成分的試劑溶液。
溴化鄰苯三酚紅 0.05mM(DOJINDO LABORATORISE)硫酸銦 0.05mM(NAKALAI TESQUE，INC.)琥珀酸鹽緩衝劑 pH2.2(琥珀酸+氫氧化鈉)聚丙烯酸0.1％(WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES，LTD.)亞氨基二乙酸(DOJINDO LABORATORISE)、檸檬酸(NAKALAITESQUE，INC.)或酒石酸(NAKALAI TESQUE，INC.) 0.1％將該試劑溶液(350μl)加入到5μl由100mg/dl的人體血清白蛋白加到收集的正常人尿中而得到的尿樣中，將該混合物在37℃下保溫10分鐘並在600nm處測定吸光率。結果如圖3所示。在圖3中，符號「◆」表示收集的正常人體尿樣，而符號「■」表示在收集的正常人體尿樣中加入100mg/dl的人體血清白蛋白而得到的尿樣。從該圖中可以看出，如果試劑中含有螯合劑則不會發生測定波長的波動。
實施例5將以下製劑的反應物溶於純水中而製得含有以下成分的試劑溶液。
溴化鄰苯三酚紅 0.05mM(DOJINDO LABORATORISE)硫酸銦 0.05mM(NAKALAI TESQUE，INC.)琥珀酸鹽緩衝劑 pH2.7(琥珀酸+氫氧化鈉)聚丙烯酸 0.1％(WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES，LTD.)在將100mg/dl的人體血清白蛋白加入到收集的正常人體尿液中而製得的尿樣中加入作為螯合劑的0.50或200mg/dl的檸檬酸或酒石酸而製得樣品。將該試劑溶液(350μl)加入到5μl的如此製得的各樣品中，將該混合物在37℃下保溫10分鐘並在600nm處測定吸光率。同樣按以前方法(鄰苯三酚紅法)進行測定，結果如圖4所示。在圖4中，符號「■」表示用本發明方法測定的樣品，而符號「□」表示採用先前的方法測定的樣品。如果樣品中含有螯合劑，則採用先前的方法時發生測定值的波動，而採用本發明的組合物時不發生波動。
已經詳細地並採用參照具體實施例的方式對本發明進行了描述，但是對於本領域技術人員來說，顯然在不違反本發明的實質和範圍的情況下，還可以對本發明作多種的改變或改進。
前述的申請，於1998年12月25日提交的日本專利申請Hei10-378426，在此全部引入作為參考。
權利要求
1.一種與含有蛋白質的液態樣品接觸時能表現出足夠的顏色的變化以指示樣品中蛋白質的存在和/或濃度的組合物，該組合物包含銦或銦的化合物，和能與銦形成絡合物的染料或色素。
2.根據權利要求1的組合物，其中，樣品含有用於將該組合物維持在酸性pH下的緩衝劑。
3.根據權利要求1的組合物，其中，該組合物含有用於將該組合物維持在酸性pH下的緩衝劑。
4.根據權利要求1的組合物，其中，染料或色素為選自多羥基苯基磺酸酞染料和多羥基苯基酞染料中的至少一種。
5.根據權利要求1的組合物，其中，染料或色素為選自焦兒茶酚紫、鄰苯三酚紅、溴化鄰苯三酚紅、二甲苯酚橙、鄰苯三酚酞和o-羥基對苯二酚酞中的至少一種。
6.根據權利要求1的組合物，其中，緩衝劑為選自乳酸鹽、苯二甲酸鹽、琥珀酸鹽、三氯乙酸鹽、磺基水楊酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、氯化鈉/鹽酸、甘氨酸/鹽酸、哌嗪-N，N』-雙(2-羥基丙烷)磺酸(POPSO)、N-2-羥基乙基哌嗪-N』-2-乙烷磺酸(HEPES)、3-N-(三羥基甲基)甲氨基-2-羥基丙烷磺酸(TAPSO)和2-((三-(羥基甲基)甲基)氨基)乙烷磺酸(TES)中的至少一種。
7.根據權利要求1的組合物，該組合物進一步包含表面活性劑。
8.根據權利要求1的組合物，其中，樣品為尿液。
9.根據權利要求1的組合物，其中，銦的化合物為選自硫酸銦、氯化銦、溴化銦、硝酸銦和二硫酸銦銨中的至少一種。
10.一種用於對樣品中的蛋白質進行檢測和定量的方法，該方法包括使樣品與權利要求1的組合物接觸。
全文摘要
一種與含有蛋白質的液態樣品接觸時能表現出足夠的顏色的變化以指示該樣品中蛋白質的存在和/或濃度的組合物,該組合物包括:銦或銦的化合物,和能與銦形成絡合物的染料或色素。
文檔編號G01N33/68GK1261668SQ9912296
公開日2000年8月2日 申請日期1999年12月24日 優先權日1998年12月25日
發明者小坂秀子 申請人:株式會社京都第一科學