用於診斷不同亞型肺癌的基於組織的微-rna方法

2023-11-08 05:08:42 2

專利名稱：用於診斷不同亞型肺癌的基於組織的微-rna方法
技術領域：
本發明涉及已經過證實的miRNA生物標記和相應的方法，以用於可靠地在外科手術和活組織檢查肺組織中組織中不同亞型的肺癌，特別是用於區別不同亞型的肺癌。所述肺癌亞型包括腺癌肺癌、鱗狀細胞肺癌和小細胞肺癌。
背景技術：
肺癌依然是世界上男性和女性癌相關死亡中最常見的原因。據估計在2009年有約1400000新增病例，伴隨平均2. 51%的年增長率(Frost&SulIivan估計)，這些在2009年診斷為肺癌15的患者絕大多數將會死於該疾病(Higgins, M. J. et al. (2009) Expert RevAnticancer Ther 9，1365-1378)。儘管在過去的幾十年中外科技術和聯合治療有了一定的改進，但在美國和歐洲不同分期肺癌患者的總5年存活率僅約15%。 肺癌分類為小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)或非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。主要的(80%)肺癌組織學類型為NSCLC包括腺癌和鱗狀細胞狀細胞癌。吸菸是發生肺癌的最重要風險因子，佔世界範圍內男性肺癌病例中的80%和女性肺癌患者中的50%。肺癌治療依不同的癌亞型而異。對早期NSCLC的治療選擇是外科手術，有40%的總5年存活率。但是，多數患者在診斷時已處於晩期，使得ー線治療僅局限於多藥聯合化療而且預期存活率少於8個月。在靶向治療方面的近期進展要求對非小細胞肺癌(NSCLC) 30更準確地亞型分類。癌血管生成抑制劑可使鱗狀細胞狀細胞癌患者更易於發生異常反應(Lebanoy, D. (2009) J Clin Oncol 27,2030-2037)。小細胞肺癌(SCLC)患者是肺癌中致死性最高的亞型，患者死亡率高於90%。儘管在早中期患者中常觀察到高初始反應率，中位存活率也有約20個月。但外科手術對SCLC的治療幾乎是無效的，化療或化療放療聯合才是治療選擇。除了對不同亞型和不同病因肺癌的不同治療，監測者間的差異和缺乏特異、標準化的檢測也限制了當下對患者實施充分策略化合適治療的能力。對肺癌患者個體的治療決策很快將基於詳細的癌和宿主特徵。用於區分肺癌亞型的特異性分子生物標記是絕對需要的。許多診斷性檢測也受限於一般是基於對單一分子指標的分析，而這種分析可能影響檢測的可信度和/或準確性。此外，單一指標通常並不能對潛伏階段、癌進展等進行詳細預測的。因此，仍然需要發掘可供選擇的分子指標和檢測方式來克服這些局限。解決這ー問題的方法之一可以基於調控性RNA分子，特別是基於由20-25個核酸大小的進化保守的內源性表達的非編碼RNA，該類RNA可介導靶mRNA表達並以此自從其在10年前發現以來被證實參與細胞發育、分化、増殖和凋亡的微RNA(miRNA)(Bartel, D. P. (2004) Cell 116, 281-297, Ambros, V. (2004) Nature 431, 350-355; He, L.et al. (2004)Nat Rev Genet 5,522-531)。而且，由於其在體外非常穩定和在體內的長期存在，miRNA有作為癌生物標記的其他mRNA所沒有的優勢(Lu，J. et al.，(2005) Nature435, 834-838; Lim, L. P. et al. , (2005) Nature 433,769-773)。
miRNA產生於原發轉錄並被RNase III Drosha加工成莖-環狀結構的前體(pre-miRNA)。轉運到細胞質後，另一名為Dicer的RNase III剪切pre-miRNA髮夾的環形成短雙鏈RNA，其中一條鏈以成熟miRNA整合成miRNA-蛋白質複合體(miRNP)。其中的 miRNA 引導 miRNP 到靶 mRNA 發揮功能(Bartel, D. P. (2004) Cell 23，281-292;He, L. andHannon, G. J. (2004)Nat Rev Genet 5,522-531)。根據miRNA與其目標間的互補程度，miRNA可引導不同的調控過程。與miRNA高互補的mRNA通過與RNA幹擾(RNAi)相同的機制被特異性剪切。因此，在這種情況下，miRNA作為短幹擾RNA(SiRNA)發揮功能。靶向與miRNA互補性較弱的mRNA要麼被導向細胞降解途徑或在不影響mRNA水平的狀態下被翻譯抑制。但，miRNA如何抑制靶mRNA的翻譯機制仍有爭議。高通路miRNA定量技術，如miRNA晶片、以實時RT-PCR為基礎的TaqMan miRNA檢測，已被證實為研究全癌基因組整體miRNA譜的有力工具。越來越多的數據顯示miRNA表 達的異常調節與特定類型癌的發生和/或進展相關。例如兩個miRNA，miR-15和miR-16-l被證實位於在慢性淋巴細胞性白血病(CLL)中缺失的遺傳位點，並且在70%的CLL患者中有miRNA基因的缺失或下調。而且，miR-15和miR-16-l的下調在結直腸瘤變中也有發現，而 miRNA let-7 的表達常在肺癌中減少(Michael, M. Z. et al. (2003)Mol Cancer Res
I,882-891 ;Mayr, C. et al. (2007) Science 315,1576-1579)。事實上，根據 miRNA 表達的癌相關性改變和miRNA常位幹與癌相關的遺傳區推測miRNA可是癌抑制基因和癌基因(Esquela-Kerscher, A. and Slack, F. J(2006)Nat Rev Cancer 6, 259-269;Calin, G. A. andCroce, C.M. (2007) J Clin Invest 117, 2059-2066;Blenkiron, C. and Miska1E. A. (2007)Hum Mol Genet 16，R106-R113)。已有描述的人癌中miRNA表達模式凸顯了其可被用於診斷和預後生物標記的潛能。一些研究報導miRNA在肺癌中的表達譜(Johnson, S. M. et al. (2005)Cell 120，635-647 ; Liang, Y. et al. (2008) BMC Med Genomics 1,61; Kumar, M.S. et al. (2008)Proc Natl Acad Sci USA 105, 3903-3908;Miko, E. et al. (2009)Exp Lung Res 35，646-664;Xie, Y et al. (2009)Lung Cancer May 13;Lebanony, D.etal. (2009)J Clin Oncol 27, 2030-2037;Kauppinen, S. et al. (2009)Clin Cancer Res15, 1177-1183;Mascaux, C. et al. (2009) Eur Respir 了33，352-359)。相同地，這些研究都表明特定miRNA與非惡性肺組織相比在惡性組織中有異常表達。而且，研究表明ー些miRNA可能與預後相關(Yu，S. L. et al. (2008) Cancer Cell 13，48-57; Raponi, M. et al (2009)Cancer Res69，5776-5783)。因此，這些miRNA可對與惡性轉化和進展相關的細胞過程提供線索。由此，仍然需要(一系列)的診斷指標，尤其是以「表達特徵(signature) 」或「分子印跡」形式能進行快速、可靠和節省花費性鑑定和/或治療表現為或有可能發展為不同類型肺癌的細胞。此外，仍需相應的能同時鑑定和治療有癌表型的靶細胞的方法發明目的和發明概述本發明的目的是提供已經過證實的miRNA生物標記和相應的方法，以用於可靠地在外科手術和活組織檢查肺組織中不同亞型的肺癌，特別是用於區別不同亞型的肺癌。具體來說，通過確定多種核酸分子，肺癌表現為腺癌肺癌、鱗狀細胞癌和小細胞肺癌，每種核酸分子編碼miRNA序列，而所述多種核酸分子中的一種或多種在被分析的靶細胞中與在對照細胞中相比差異表達，而ー種或多種差異表達的核酸分子一起可作為ー種指徵肺癌存在的核酸表達生物標記。更具體地，本發明的目標是提供有效的miRNA生物標記，以用於鑑定一或多種展現出肺癌的哺乳動物靶細胞、和/或區別腺癌肺癌、鱗狀細胞肺癌或小細胞肺癌。另外，本發明的目的還在於提供相應的方法，以用於鑑定ー或多種展現出肺癌的哺乳動物靶細胞、區別不同亞型的肺癌、以及預防或治療此類疾病。這些及其它目的從以下描述將變得清楚，其通過獨立權利要求的主題來達成。本發明的一些優選實施方案則通過從屬權利要求的主題來限定。在第一方面，本發明涉及用於鑑定展現出腺癌肺癌的ー種或多種哺乳動物靶細胞的分子標記的診斷試劑盒，所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子編碼微RNA序列， 其中所述多種核酸分子的一種或多種在靶細胞和在一種或多種對照細胞中差異表達，並且其中所述ー種或多種差異表達的核酸分子一起代表ー種核酸表達生物標記，該生物標記是腺癌肺癌存在的指徵。本文限定的核酸表達生物標記可包括至少四種核酸分子。在具體的實施方案中，所述核酸表達生物標記包括至少ー種編碼miRNA序列的核酸分子，其表達在ー種或多種靶細胞中與ー種或多種正常對照細胞相比被上調；以及包括至少ー種編碼微RNA序列的核酸分子,其表達在ー種或多種祀細胞中與ー種或多種正常對照細胞相比被下調。在優選的實施方案中，所述核酸表達生物標記包括編碼hsa-miR_27a、hsa_miR-29a、hsa_miR-34a 和 hsa-miR-375.的任意一種或多種核酸分子。特別優選地，與所述ー種或多種正常對照細胞相比，在所述ー種或多種靶細胞中hsa-miR-34a 和 hsa-miR-375 表達上調以及編碼 hsa_miR-27a 和 hsa_miR-29a 的任意一種或多種核酸分子的表達被下調。在更優選實施方案中，核酸表達生物標記包括編碼hsa-miR-34a/hsa-miR_27a和hsa-miR-34a/hsa-miR-29a中任一或多個核酸組合。尤其是核酸表達生物標記包括編碼hsa_miR-29a、hsa_miR-27a 和 hsa_miR-34a 的一種核酸組合。第二方面，本發明涉及用於鑑定ー個或多個展現出鱗狀細胞肺癌的哺乳動物靶細胞的分子標記的診斷試劑盒，所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子編碼微RNA序列，其中所述多種核酸分子的一種或多種在靶細胞和在ー種或多種對照細胞中差異表達，並且其中所述ー種或多種差異表達的核酸分子一起代表ー種核酸表達生物標記，該生物標記是鱗狀細胞肺癌存在的指徵。本文所定義的核酸表達生物標記可包含至少四種核酸分子。在優選的實施方案中，核酸表達生物標記包括至少ー種編碼miRNA序列的核酸分子，其表達在ー種或多種靶細胞中與ー種或多種正常對照細胞相比被上調；以及包括至少一種編碼miRNA序列的核酸分子，其表達在ー種或多種靶細胞中與ー種或多種正常對照細胞相比被下調。在更優選的實施方案中，核酸表達生物標記包括編碼hsa-miR-205、hsa_miR-25、hsa-miR-29a和hsa-miR-375的任意一種或多種核酸分子。
尤其優選的是，與所述ー種或多種正常對照細胞相比，在所述ー種或多種靶細胞中hsa-miR-205和hsa-miR-25被上調，而編碼hsa_miR-29a和hsa-miR-375的核酸分子的表達被下調。在更優選的實施方案中，核酸表達生物標記包括編碼hsa-miR-205/hsa-miR-29a, hsa-miR-25/hsa-miR-29a, hsa-miR-205/hsa-miR-375 和 hsa-miR-25/hsa-miR-375的任意ー種或多種核酸組合。尤其是，核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-205、hsa-miR-25 和 hsa_miR-29a 的一種核酸組合。在第三方面，本發明涉及用於鑑定一個或多個展現出小細胞肺癌的哺乳動物靶細胞的分子標記的診斷試劑盒，所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子編碼微RNA序列，其中所述多種核酸分子的一種或多種在靶細胞和在ー種或多種對照細胞中差異表達，並且其中所述ー種或多種差異表達的核酸分子一起代表ー種核酸表達生物標記，該生物標記是小細胞肺癌存在的指徵。
本文所定義的核酸表達生物標記可包含至少五種核酸分子。在優選的實施方案中，核酸表達生物標記包括至少ー種編碼miRNA序列的核酸分子，其表達在ー種或多種靶細胞中與ー種或多種正常對照細胞相比被上調；以及包括至少一種編碼miRNA序列的核酸分子，其表達在ー種或多種靶細胞中與ー種或多種正常對照細胞相比被下調。在更優選實施方案中，核酸表達生物標記包括編碼hsa-miR-25、hsa_miR-27a、hsa_miR-29a、hsa_miR-29b和hsa-miR-375的任意一種或多種核酸分子。尤其優選的是，與所述ー種或多種正常對照細胞相比，在所述ー種或多種靶細胞中 hsa-miR-25 和 hsa-miR-375 被上調，而編碼 hsa-miR-27a、hsa_miR-29a 和 hsa_miR-29b的核酸分子的表達被下調。在更優選的實施方案中，核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-25/hsa-miR-27a、hsa-miR-375/hsa_miR-27a、hsa-miR-25/hsa_miR-29a 和 hsa-miR-375/hsa_miR-29a 的任意ー種或多種核酸組合。尤其是，核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-29a和hsa-miR-375的ー種核酸組合。第四方面，本發明涉及用於將鱗狀細胞肺癌與腺癌肺癌區別開的分子標記的診斷試劑盒，所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子編碼微RNA序列，其中所述多種核酸分子的一種或多種在靶細胞和在一種或多種對照細胞中差異表達，並且其中所述ー種或多種差異表達的核酸分子一起代表ー種核酸表達生物標記，該生物標記是鱗狀細胞肺癌或腺癌肺癌存在的指徵。本文所定義的核酸表達生物標記可包含至少四種核酸分子。在優選的實施方案中，核酸表達生物標記包括至少ー種編碼miRNA序列的核酸分子，其表達在ー種或多種靶細胞中與一種或多種對照細胞相比被上調；以及包括至少ー種編碼miRNA序列的核酸分子，其表達在ー種或多種靶細胞中與一種或多種對照細胞相比被下調。在更優選的實施方案中，核酸表達生物標記包括編碼hsa-miR-205、hsa-miR-25、hsa-miR-27a和hsa-miR-375的任意一種或多種核酸分子。尤其優選的是，與所述ー種或多種對照細胞相比，在所述ー種或多種靶細胞中hsa-miR-205>hsa-miR-25>hsa-miR-27a 被上調，而編碼 hsa-miR-375 的核酸分子的表達被下調。在更優選的實施方案中，核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-205/hsa-miR-375和hsa-miR-25/hsa-miR-375的任意ー種或多種核酸組合。尤其是，核酸表達生物標記包含編碼 hsa-miR-205、hsa-miR-25 和 hsa-miR-375 的一種核酸分子組合。第五方面，本發明涉及用於將小細胞肺癌與腺癌肺癌區別開的分子標記的診斷試劑盒，所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子編碼微RNA序列，其中所述多種核酸分子的一種或多種在靶細胞和在一種或多種對照細胞中差異表達，並且其中所述ー種或多種差異表達的核酸分子一起代表ー種核酸表達生物標記，該生物標記是小細胞肺癌或腺癌肺癌存在的指徵。本文所定義的核酸表達生物標記可包含至少六種核酸分子。在優選的實施方案中，核酸表達生物標記包括至少ー種編碼miRNA序列的核酸分 子，其表達在ー種或多種靶細胞中與一種或多種對照細胞相比被上調；以及包括至少ー種編碼miRNA序列的核酸分子，其表達在ー種或多種靶細胞中與一種或多種對照細胞相比被下調。在更優選的實施方案中，核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-25、hsa_miR-27a、hsa_miR-29a、hsa_miR-29b、hsa_miR-34a 和 hsa-miR-375 的任意一種或多種核酸分子。尤其優選的是，與所述ー種或多種對照細胞相比，在所述ー種或多種靶細胞中hsa-miR-25 和 hsa-miR-375 被上調，而編碼 hsa_miR-27a、hsa_miR-29a、hsa_miR-29b 和hsa-miR-34a的核酸分子的表達被下調。在更優選的實施方案中，核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-25/hsa-miR_27a、hsa-miR-375/hsa_miR-27a、hsa-miR-25/hsa_miR-29a 和 hsa-miR-375/hsa_miR-29a 的任意ー種或多種核酸組合。尤其是，核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-25、hsa-miR-34a和hsa-miR-375的ー種核酸組合。第六方面，本發明涉及用於將小細胞肺癌與鱗狀細胞肺癌區別開的分子標記的診斷試劑盒，所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子編碼微RNA序列，其中所述多種核酸分子的一種或多種在靶細胞和在一種或多種對照細胞中差異表達，並且其中所述ー種或多種差異表達的核酸分子一起代表ー種核酸表達生物標記，該生物標記是小細胞肺癌或鱗狀細胞肺癌存在的指徵。本文所定義的核酸表達生物標記可包括至少六種核酸分子。在優選的實施方案中，核酸表達生物標記包括至少ー種編碼miRNA序列的核酸分子，其表達在ー種或多種靶細胞中與一種或多種對照細胞相比被上調；以及包括至少ー種編碼miRNA序列的核酸分子，其表達在ー種或多種靶細胞中與一種或多種對照細胞相比被下調。在更優選的所述方案中，核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-205、hsa-miR_27a、hsa_miR-29a、hsa_miR-29b、hsa_miR-34a 和 hsa-miR-375 的任意一種或多種核酸分子。尤其優選的是，與所述ー種或多種對照細胞相比，在所述ー種或多種靶細胞中hsa-miR-375 被上調，而編碼 hsa-miR-205、hsa_miR-27a、hsa_miR-29a、hsa_miR-29b 和hsa-miR-34a的核酸分子的表達被下調。
在更優選的實施方案中，核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-375/hsa-miR_27a和hsa-miR-375/hsa-miR-29a的任意ー種或多種核酸組合。尤其是，核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-29b和hsa-miR-375核酸組合。第七方面，本發明涉及用於鑑定展現出腺癌肺癌、鱗狀細胞肺癌或小細胞肺癌的ー種或多種哺乳動物靶細胞的方法，所述方法包括(a)收集患者的活組織檢查或外科手術組織；(b)在載玻片上製備組織切片；(c)將至少ー種編碼微RNA序列的核酸分子生物標記物雜交到載玻片上的切片上；(d)在顯微鏡下或者通過數字病理學方案對miRNA的表達進行定量；
(e)在所述的ー種或多種靶細胞中確定多種核酸分子表達水平，每種核酸分子均編碼微RNA序列；(f)在一種或多種對照細胞中確定所述多種核酸分子的表達水平 '及(g)通過對比在步驟(e)和(f)中所獲得的各自的表達水平，從所述多種核酸分子中鑑定出在靶細胞和對照細胞中差異表達的ー種或多種核酸分子，其中所述ー種或多種差異表達的核酸分子一起代表如本文所定義的核酸表達生物標記，其是腺癌肺癌、鱗狀細胞肺癌或者小細胞肺癌存在的指徵。尤其優選的是，該方法以原位雜交來實現。為了進行定量的確定，使用7個經驗證的miRNA生物標記hsa-miR-205、hsa-miR-25、hsa_miR-27a、hsa_miR-29a、hsa_miR-29b、hsa_miR-34a 和 hsa-miR-375。為了將所獲得的編碼微RNA序列的核酸分子生物標記的表達水平標準化，可優選使用在肺組織中穩定表達的編碼hsa-miR-24核酸表達分子。作為所獲得的編碼miRNA序列的核酸分子生物標記表達水平的陰性對照，可優選使用在肺組織中不表達的編碼hsa-miR-122核酸表達分子。第八方面，本發明涉及預防或治療肺癌的方法，該方法包括(a)通過使用本文所述的方法在ー種或多種靶細胞中鑑定核酸表達生物標記 '及(b)在所述ー種或多種細胞中改變所述核酸表達生物標記所包含的編碼微RNA序列的ー種或多種核酸分子的表達，所述改變以如下的方式進行，即其表達在所述ー種或多種靶細胞中被上調的核酸分子的表達被下調，而其表達在所述ー種或多種靶細胞中被下調的核酸分子的表達被上調。第九方面，本發明涉及用於預防和/或治療肺癌的藥物組合物，所述組合物包含ー種或多種核酸分子，每種核酸分子均編碼序列，所述序列與本文所定義的在所述ー種或多種靶細胞中其表達被上調的核酸分子所編碼的微RNA序列至少部分互補，和/或所述序列對應於本文所定義的在所述ー種或多種靶細胞中其表達被下調的核酸分子所編碼的微RNA序列。最後，第十方面，本發明涉及上述藥物組合物在製備用於預防和/或治療肺癌的藥物中的用途。在隨後的詳細描述中本發明的其他實施方案將會闡明。附圖
簡述圖I :描繪了發明概要第七方面中根據檢測表現為腺癌肺癌、鱗狀細胞肺癌或小細胞肺癌的単一或多靶細胞的本發明用於確定某ー表達生物標記的基本方法步驟的流程圖。尤其是運用原位雜交方法區分不同肺癌亞型。圖2A :說明根據用於檢測表現為腺癌肺癌的單ー或多靶細胞的本發明在第一方面中屬於尤其優選表達生物標記的人miRNA。同時也顯示與正常肺組織相比腺癌肺癌患者中這些miRNA的表達水平和準確性(即上調或下調)。數據表明FFPE外科手術組織中的腺癌肺癌可與正常肺組織可靠地區分。圖2B :逐步描述了本發明第一方面中用於檢測FFPE外科手術組織中展現出腺癌肺癌的一或多個祀細胞對組一(hsa-miR-27a、hsa_miR-29a和hsa_miR-34a)的邏輯回歸分祈。數據表明FFPE外科手術組織中的腺癌肺癌可與正常肺組織(AUC=O. 925)可靠地區分。圖3A :說明根據用於檢測表現為鱗狀細胞肺癌的單ー或多靶細胞的本發明在第二方面中屬於尤其優選表達生物標記的人miRNA。也顯示與正常肺組織相比腺癌肺癌患者中這些miRNA的表達水平和準確性(即上調或下調)。數據表明FFPE外科手術組織中的鱗狀細胞肺癌可與正常肺組織可靠地區分。 圖3B:逐步描述了第二方面中根據用於檢測FFPE外科手術組織中表現為鱗狀細胞肺癌的單ー或多靶細胞的本發明對一組合的(hsa-miR-205、hsa-miR-25和hsa-miR-29a)的邏輯回歸分析。數據表明FFPE外科手術組織中的腺癌肺癌可與正常肺組織(AUC=O. 961)可靠地區分。圖4A :說明根據用於檢測表現為小細胞肺癌的単一或多靶細胞的本發明在第三方面中屬於尤其優選表達生物標記的人miRNA。也顯示與正常肺組織相比小細胞肺癌患者中這些miRNA的表達水平和準確性(即上調或下調)。數據表明FFPE外科手術組織中的小細胞肺癌可與正常肺組織可靠地區分。圖4B :逐步描述了第三方面中根據用於檢測FFPE外科手術組織中表現為小細胞肺癌的單ー或多祀細胞的本發明對一組合的(hsa-miR-29a和hsa-miR-375)的邏輯回歸分祈。數據表明FFPE外科手術組織中的小細胞肺癌可與正常肺組織(AUC=O. 998)可靠地區分。圖5A :說明根據用於鑑別鱗狀細胞肺癌和腺癌肺癌的本發明在第四方面中屬於尤其優選表達生物標記的人miRNA。也顯示與腺癌肺癌患者相比鱗狀細胞肺癌患者中這些miRNA的表達水平和準確性(即上調或下調)。數據表明FFPE外科手術組織中的鱗狀細胞肺癌可與腺癌肺癌可靠地區分。圖5B :逐步描述了第四方面中根據用於鑑別FFPE外科手術組織中鱗狀細胞肺癌可與腺癌肺癌的本發明對一組合的(hsa-miR-205、hsa-miR-25和hsa-miR-375)的邏輯回歸分析。數據表明FFPE外科手術組織中鱗狀細胞肺癌可與腺癌肺癌(AUC=O. 922)可靠地區分。圖6A :說明根據用於鑑別小細胞肺癌和腺癌肺癌的本發明在第五方面中屬於尤其優選表達生物標記的人miRNA。也顯示與腺癌肺癌患者相比小細胞肺癌患者中這些miRNA的表達水平和準確性(即上調或下調)。數據表明FFPE外科手術組織中的小細胞肺癌可與腺癌肺癌可靠地區分。圖6B :逐步描述了第五方面中根據用於鑑別FFPE外科手術組織中小細胞肺癌可與腺癌肺癌的本發明對一組合的(hsa-miR-25、hsa_miR-34a和hsa-miR-375)的邏輯回歸分析。數據表明FFPE外科手術組織中小細胞肺癌可與腺癌肺癌(AUC=O. 991)可靠地區分。圖7A :說明根據用於鑑別小細胞肺癌和鱗狀細胞肺癌的本發明在第六方面中屬於尤其優選表達生物標記的人miRNA。也顯示與鱗狀細胞肺癌患者相比小細胞肺癌患者中這些miRNA的表達水平和準確性(即上調或下調)。數據表明FFPE外科手術組織中的小細胞肺癌可與鱗狀細胞肺癌可靠地區分。圖7B :逐步描述了第六方面中根據用於鑑別FFPE外科手術組織中小細胞肺癌可與鱗狀細胞肺癌的本發明對一組合的(hsa-miR-29b和hsa-miR-375)的邏輯回歸分析。數據表明FFPE外科手術組織中小細胞肺癌可與鱗狀細胞肺癌(AUC=O. 982)可靠地區分。發明詳述本發明是基於肺癌能根據高敏感性和特異性的特定miRNA表達譜進行可靠地診斷和亞型區分，而且在此確定的這些表達生物標記通常包括上和下調兩方面這ー預期之外 的發現。更具體來說，通過分析整體miRNA表達模式和/或單獨miRNA表達水平可以實現對肺癌的早期診斷和亞型區分。以下例證的本發明可以合適地在不存在未在本文中具體揭示的任何一或多個元件、一種或多種限制的條件下實施。本發明將根據特定的實施方案並參照附圖加以描述，但是本發明不受其限制，僅受權利要求書限制。所描述的附圖僅是示意性的，被認為是非限制性的。當術語「包含」被用於本發明說明書和權利要求書中時，其不排除其它元件或步驟。為本發明目的，術語「由…組成」被認為是術語「包含」的優選實施方案。如果在下文中組被限定為包含至少ー定數目的實施方案，這也被理解為掲示了優選地僅由這些實施方案組成的組。當指代単數形式名詞使用不定冠詞或定冠詞例如「ー個」或「ー種」，「所述」時，包括該名詞的複數形式，除非特別指出。術語「大約」在本發明中是指本領域技術人員理解仍能保證目的特徵的技術效果的精確性區間。該術語通常表示偏離指示值的±10%，優選±5%。另外，術語第一、第二、第三、(a)、(b)、(C)等在說明書和權利要求書中用於區分類似的元件，不是描述順序或時間次序必須的。應理解如此應用的術語在合適情況下可互換，並且本發明描述的實施方案能以不同於本文所述或例證的其它順序操作。術語的進ー步定義在以下使用術語時給出。以下術語或定義僅為了理解本發明而提供。這些定義不應被認為具有小於本領域技術人員理解的範圍。本發明的目的是提供已經過證實的miRNA生物標記和相應的方法，以用於可靠地在外科手術和活組織檢查肺組織中不同亞型的肺癌，特別是用於區別不同亞型的肺癌。具體來說，通過確定多種核酸分子，肺癌表現為腺癌肺癌、鱗狀細胞癌和小細胞肺癌，每種核酸分子編碼miRNA序列，而所述多種核酸分子中的一種或多種在被分析的靶細胞中與在對照細胞中相比差異表達，而ー種或多種差異表達的核酸分子一起可作為ー種指徵肺癌存在的核酸表達生物標記。更具體地，本發明的目標是提供有效的miRNA生物標記，以用於鑑定ー或多種展現出肺癌的哺乳動物靶細胞、和/或區別腺癌肺癌、鱗狀細胞肺癌或小細胞肺癌。本文所用術語「癌症」(也稱為「癌(carcinoma) 」)通常指任何類型的惡性贅生物，即與未受影響的(健康)野生型對照細胞相比顯示或具有發生癌症傾向的靶細胞的任何形態學和/或生理學改變(基於遺傳重編程(geneticre-programming))。這種改變的例子可涉及細胞大小和形狀(變大或變小)、細胞增殖(細胞數增加)、細胞分化(生理學狀態變化)、凋亡(程序性細胞死亡)或細胞存活。本文所用術語「肺癌」指肺組織中失控性細胞生長，或肺組織的癌性生長。在此使用術語「肺癌的不同亞型」包括腺癌肺癌、鱗狀細胞肺癌和小細胞肺癌。「腺癌肺癌」或「腺性肺癌」為一類非小細胞肺癌。80%的肺癌為非小細胞肺癌(NSCLC)，其中50%是腺癌。腺癌肺癌發生於肺的周圍區，可在診斷前存在很長時間。是女性中最常見的肺癌類型，在非吸菸者中也常見。「鱗狀細胞肺癌」是一類非小細胞肺癌。約30%NSCLC為鱗狀細胞肺癌。鱗狀細胞肺癌常發生於肺中央部的支氣管(大氣道)。很多人早期即有症狀，常為咯血(咯出血液)。
「小細胞肺癌」(SCLC)被認為是起源於構成部分支氣管(氣道)上皮(襯附)的神經內分泌細胞。SCLC佔所有肺癌病例的18%。SCLC很具侵襲性。生長很快並通過血流擴散到肝臟、肺、骨和腦。在診斷時很容易在這些器官中發現腫瘤轉移灶。在此所用術語「患者」指至少被懷疑患有肺癌，或某種類型肺癌的人；術語「健康個體」或「正常對照」常指無這種癌表型的健康人。但是，在某些應用中，例如在比較不同類型肺癌時，有其他類型肺癌的個體常被認為是「對照」。在本發明的體外方法中用於檢測的樣品通常應以臨床可接受的方式收集，優選以保護核酸(特別是RNA)或蛋白質的方式收集。待分析的樣品典型地是組織。另外，血液及其它類型樣品也可以使用。本文所用術語「微RNA」(或「miRNA」)是其在本領域的普通含義(綜述參見例如 Bartel, D. P. (2004) Cell 23, 281-292 ；He, L. and Hannon, G. J. (2004) Nat. Rev.Genet. 5，522-531)。因此，「微RNA」是指衍生自基因組基因座的RNA分子，其從可以形成局部RNA前體miRNA結構的轉錄物加工而來。成熟miRNA通常長度為20、21、22、23、24或25個核苷酸，其它數目的核苷酸也可存在，例如18、19、26或27個核苷酸。miRNA編碼序列具有與側翼基因組序列配對的潛力，使成熟miRNA放置在非完全配對的RNA雙鏈體之內(本文也稱作莖-環或髮夾結構或pre-miRNA)，所述雙鏈體作為從更長的前體轉錄物進行miRNA加工的中間體。這一加工典型地通過分別稱為Drosha和Dicer的兩種特異的內切核酸酶的連續作用而發生。Drosha從初級轉錄物(本文也稱作「pri-miRNA」)產生典型地摺疊成髮夾或莖-環結構的miRNA前體(本文也稱作「pre-miRNA」)。從這個miRNA前體，通過Dicer切割miRNA雙鏈體，其在髮夾或莖-環結構的一條臂包含成熟miRNA，在另一條臂包含類似大小的節段(通常稱為miRNA*)。miRNA然後被導向其靶mRNA以發揮其功能，而miRNA*被降解。另外，miRNA典型地衍生自與預測的蛋白質編碼區不同的基因組節段。本文所用術語「miRNA前體」(或「前體miRNA」或「pre-miRNA」 )是指從其加工成熟miRNA的miRNA初級轉錄物的部分。典型地,pre-miRNA摺疊成穩定的髮夾(即雙鏈體)或莖-環結構。髮夾結構典型地長度為50-80個核苷酸，優選60-70個核苷酸(計數miRNA殘基，與miRNA配對的殘基，及任何間插節段，但排除更遠端的序列)。本文所用術語「編碼微RNA序列的核酸分子」是指編碼微RNA (miRNA)的任何核酸分子。因此，該術語不僅指成熟miRNA,也指相應的如上所述的前體miRNA及初級miRNA轉錄物。另外，本發明不限於RNA分子，也包括相應的編碼微RNA的DNA分子，例如通過逆轉錄miRNA序列產生的DNA分子。編碼本發明的微RNA序列的核酸分子典型地編碼單個miRNA序列(即個體miRNA)。但是，也可能這種核酸分子編碼兩個或多個miRNA序列(即兩個或多個miRNA)，例如一個轉錄單位包含在常用調節序列如啟動子或轉錄終止子控制下的兩個或多個miRNA序列。本文所用術語「編碼微RNA序列的 核酸分子」也被理解為包括「有義核酸分子」(即核酸序列(5』 一3』)匹配或相應於所編碼的miRNA(5』 一3』)序列的分子)及「反義核酸分子」(即核酸序列互補於所編碼的miRNA(5』 一 3』)序列或者換句話說匹配所編碼的miRNA序列的反向互補序列(3』 一5』)的分子)。本文所用術語「互補」是指「反義」核酸分子序列與相應的「有義」核酸分子序列(具有互補於反義序列的序列)形成鹼基對、優選Watson-Crick鹼基對的能力。在本發明範圍內，兩個核酸分子(即「有義」和「反義」分子)可以完全互補，即它們不含有任何鹼基錯配和/或額外的或缺失的核苷酸。或者，兩個分子包含一或多個鹼基錯配或者在它們的核苷酸總數上不同(由於添加或缺失導致)。優選地，「互補」核酸分子包含與包含在相應的「有義」核酸分子中的序列顯示完全互補性的至少10個連續核苷酸。因此，包含在本發明的診斷試劑盒中的編碼miRNA序列的多種核酸分子可包括一種或多種「有義核酸分子」和/或一種或多種「反義核酸分子」。有時，診斷試劑盒包括一種或多種「有義核酸分子」(即miRNA序列本身)，所述分子被認為組成了差異表達的miRNA (即分子標記)的全體或至少亞集合，所述差異表達的miRNA是存在或發生特定病症傾向的指徵，本文是肺癌。另一方面，當診斷試劑盒包括一種或多種「反義核酸分子」(即與miRNA序列互補的序列)時，所述分子可包含適合用於檢測和/或定量給定樣品中的一種或多種特定(互補)miRNA序列的探針分子(用於進行雜交測定)和/或寡核苷酸引物(例如用於逆轉錄或PCR應用)。在本發明中定義的多種核酸分子可以包含至少2種、至少10種、至少50種、至少100種、至少200種、至少500種、至少1000種、至少10000種或至少100000種核酸分子，每種分子編碼miRNA序列。本文所用術語「差異表達」是指特定miRNA在靶細胞中的表達水平相比於健康對照細胞或其他疾病類型樣品是改變的，其可以是上調(即在靶細胞中miRNA濃度增加)或下調(即在靶細胞中miRNA濃度降低或消失)。換句話說，核酸分子在靶細胞中被激活至比在對照細胞中更高或更低的水平。在本發明範圍內，核酸分子被認為是差異表達的，如果該核酸分子在靶細胞和對照細胞中的相應表達水平典型地相差至少5%或至少10%，優選地至少20%或至少25%，最優選地至少30%或至少50%。因此，後者的值相應於給定核酸分子在靶細胞中的表達水平相比於野生型對照細胞分別上調至少I. 3倍或至少I. 5倍，或者反之在靶細胞中的表達水平下調至少0. 7倍或至少0. 5倍。本文所用術語「表達水平」是指特定的miRNA序列從其基因組基因座被轉錄的程度，即miRNA在一種或多種被分析細胞中的濃度。如上所述，術語「對照細胞」典型地是指採集於不具有肺癌表型特徵的(健康)個體細胞樣品。但是，在一些應用中，例如當比較顯示不同類型肺癌時，來源於其他類型肺癌的細胞細胞典型地被認為是「對照細胞」。表達水平的確定典型地遵循本領域熟知的已建立的標準程序(參見例如Sambrook, J. et al. (1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual. 2nd Ed., ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ；AusubeI,F. M. et al. (2001)Current Protocols in Molecular Biology. Wiley&Sons, Hoboken, NJ)。確定可以在RNA水平進行，例如使用miRNA特異性探針進行Northern印跡分析,或者在逆轉錄(及克隆)RNA群後例如通過定量PCR或實時PCR技術在DNA水平進行。本文所用術語「確定」包括分析編碼上述miRNA序列的任何核酸分子。但是，由於pri-miRNA及re-mRNA半壽期短,典型地僅測量成熟miRNA的濃度。在具體的實施方案中，在給定樣品的若干獨立測量(例如兩個、三個、五個或十個測量)和/或在一群靶細胞或對照細胞內的若干測量中獲得的表達水平的標準值被用於分析。標準值可以用本領域已知的任何方法獲得。例如，平均值±2SD(標準差)或平均值 ±3SD的範圍可被用作標準值。所獲得的一種或多種靶細胞和一種或多種對照細胞的表達水平之間的差異可以標準化(或歸一化，normalize)至進一步的對照核酸例如管家基因的表達水平，管家基因的表達水平已知不根據細胞的疾病狀態而不同。舉例的管家基因包括￠-肌動蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Pl等。在優選的實施方案中，對照核酸是已知在細胞的不同非癌和癌(前)狀態中穩定表達的另一種miRNA。但是，代替在任何實驗中確定一種或多種對照細胞的表達水平，也可以基於實驗證據和/或現有技術數據定義針對特定細胞表型(即疾病狀態)的一或多個截斷值。在這種情況中，一種或多種靶細胞的相應表達水平可以用用於標準化的穩定表達的對照miRNA確定。如果計算的「標準化」的表達水平高於相應定義的截斷值，則這一發現是基因表達上調的指徵。反之，如果計算的「標準化」的表達水平低於相應定義的截斷值，則這一發現是基因表達下調的指徵。在本發明中，術語「診斷肺癌和/或區分不同肺癌亞型」也指預測和可能性分析(意為「診斷」)。在此描述的生物標記和方法意欲用於與包括治療性幹預、診斷標準如疾病分期已經疾病監測和監視在內的治療模式方面的臨床決策。根據本發明，可提供對一對象狀況檢測的中段結果。這種中段結果可連同其他信息輔助醫生、護士、或其他行醫者對患該疾病的個體進行診斷。另外，該發明可被用作對細胞樣品進行癌性改變檢測，並給醫生提供用以診斷的有利信息。再次，本發明可用於不同肺癌亞型的鑑別診斷。在本發明中，所鑑定的一種或多種差異表達的核酸分子一起代表一種核酸表達生物標記，該核酸表達特徵是在靶細胞中存在肺癌的指徵。本文所用術語「表達生物標記」是指一組核酸分子(例如miRNA)，其中各個核酸分子的表達水平在肺癌患者來源的細胞和正常對照細胞之間不同。本文中，核酸表達生物標記也指一組標記並代表最低數目的(不同)核酸分子，每種核酸分子編碼能鑑定一個體的表型狀態的miRNA序列。在第一方面，本發明涉及用於鑑定展現出腺癌肺癌的一種或多種哺乳動物靶細胞的分子標記的診斷試劑盒，所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子編碼微RNA序列，其中所述多種核酸分子的一種或多種在靶細胞和在一種或多種對照細胞中差異表達，並且其中所述一種或多種差異表達的核酸分子一起代表一種核酸表達生物標記，該生物標記是腺癌肺癌存在的指徵。本文限定的核酸表達生物標記可包括至少四種核酸分子。在更優選的實施方案中，核酸表達特徵(signature)包括一個或多個編碼hsa-miR-27a(SEQ ID NO:3)、hsa_miR-29a(SEQ ID NO:4)、hsa_miR-34a(SEQ ID NO:6)和hsa-miR-375 (SEQ ID NO:7)的核酸分子。尤其優選的是，與一種或多種對照細胞相比，在一種或多種靶細胞中hsa-miR-34a(SEQ ID NO: 6)和 hsa-miR-375 (SEQ ID NO:7)被上調，而編碼(SEQ ID NO: 3)和hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4)的任意一種或多種核酸分子的表達被下調。在更優選的實施方案中，核酸表達生物標記包含任意一種或多種編碼hsa-miR-34a(SEQ ID NO:6)/hsa_miR-27a (SEQ ID NO :3)和 hsa_miR-34a (SEQ IDN0:6)/hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4)的核酸組合。尤其是核酸表達生物標記包含編碼 hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4)、hsa_miR-27a(SEQ ID NO:3)和 hsa_miR-34a (SEQ ID NO:6)的一種核酸分子組合。為了標準化獲得的編碼miRNA序列的核酸分子生物標記，可優選使用在肺組織中穩定表達的編碼hsa-miR-24(SEQ ID N0:8)核酸表達分子。作為獲得的編碼miRNA序列的核酸分子生物標記表達水平的陰性對照，可優選使用在肺組織中不表達的編碼hsa-miR-122(SEQ ID NO:9)核酸表達分子。上述涉及的miRNA核酸序列列於表I。表I
miRNA序列(5』 一 3』)
生物標記
hsa—miR—27auucacaguggcuaaguuccgc
hsa—miR—29auagcaccaucugaaaucgguua
hsa—miR—34auggcagugucuuagcugguugu
hsa-miR-375uuuguucguucggcucgcguga
hsa—miR—24uggcucaguucagcaggaacag
hsa—miR—122uggagugugacaaugguguuug在此公開的所有miRNA序列均已經保存在miRBase資料庫中(http://microrna.sanger.ac.uk/ ; 也參見 Griffiths-Jones S. et al. (2008) Nucl. AcidsRes. 36, D154-D158)。
在此使用的術語「至少一種核酸」可為核酸分子多形性的任何亞群，S卩任一、任二、任三、任四、任五、任六、任七、任八、任九、任十以此類推的核酸分子，每一核酸分子編碼一包含於在此確定的核酸表達生物標記的miRNA序列。在第二方面，本發明涉及用於鑑定展現出鱗狀細胞肺癌的一或多個哺乳動物靶細胞的分子標記的診斷試劑盒，所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子編碼微RNA序列，其中所述多種核酸分子的一種或多種在靶細胞和在一種或多種對照細胞中差異表達，並且其中所述一種或多種差異表達的核酸分子一起代表核酸表達生物標記，該生物標記是存在鱗狀細胞肺癌的指徵。本文限定的核酸表達生物標記可包括至少四種核酸分子。在更優選的實施方案中，核酸表達生物標記包含一個或多個編碼hsa-miR-205 (SEQ ID NO: I)、hsa-miR-25 (SEQ ID NO: 2)、hsa_miR-29a (SEQ ID NO:4)和hsa-miR-375 (SEQ ID NO :7)的核酸分子。 尤其優選的是，與一種或多種對照細胞相比，在一種或多種靶細胞中hsa-miR-205 (SEQ ID NO: I)、hsa-miR-25 (SEQ ID NO: 2)被上調而編碼 hsa_miR-29a (SEQID NO:4)和hsa-miR-375 (SEQ ID NO:7)的任意一種或多種核酸分子的表達被下調。在更進一步優選方案中，核酸表達生物標記包含任意一或多種編碼hsa-miR-205(SEQ ID NO:I)/hsa_miR-29a(SEQ ID NO:4)、hsa-miR-25(SEQ ID NO:2)/hsa-miR-29a (SEQ ID NO:4)、hsa-miR-205(SEQ ID NO:I)/hsa-miR-375(SEQ IDNO: 7)、hsa-miR-25 (SEQ ID NO: 2)/hsa-miR-375 (SEQ ID NO:7)的核酸組合。尤其是核酸表達生物標記包含編碼 hsa-miR-205 (SEQ ID NO: I)、hsa-miR-25 (SEQ ID NO:2)和hsa-miR-29a(SEQ ID NO:4)的一種核酸組合。為了標準化獲得的編碼miRNA序列的核酸分子生物標記，可優選使用在肺組織中穩定表達的編碼hsa-miR-24(SEQ ID N0:8)核酸表達分子。作為獲得的編碼miRNA序列的核酸分子生物標記表達水平的陰性對照，可優選使用在肺組織中不表達的編碼hsa-miR-122(SEQ ID NO:9)核酸表達分子。上述涉及的miRNA核酸序列列於表2。表權利要求
1.用於鑑定展現出肺癌的一種或多種哺乳動物靶細胞的分子標記的診斷試劑盒，所述試劑盒包含多種核酸分子，每種核酸分子均編碼微RNA序列， 其中所述多種核酸分子的一種或多種在所述靶細胞中和在一種或多種對照細胞中差異表達，並且其中所述一種或多種差異表達的核酸分子一起代表核酸表達特徵，所述特徵是肺癌，和/或不同亞型肺癌存在的指徵， 其中不同的肺癌由腺癌肺癌、鱗狀細胞肺癌或者小細胞肺癌所組成。
2.權利要求I的試劑盒，其中所述肺癌是腺癌肺癌。
3.權利要求I或2的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記可包含至少四種核酸分子。
4.權利要求1-3的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一種或多種靶細胞中與在一種或多種正常對照細胞中相比被上調；及包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一種或多種靶細胞中與在一種或多種正常對照細胞中相比被下調。
5.權利要求1-4任一項的試劑盒,其中所述核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-27a、hsa_miR-29a、hsa_miR-34a及hsa-miR-375的任意一種或多種核酸分子。
6.權利要求5的試劑盒，其中在所述一種或多種靶細胞中與在所述一種或多種正常對照細胞中相比，hsa-miR-34a和hsa-miR-375的表達被上調，而編碼hsa_miR-27a和hsa-miR-29a的任意一種或多種核酸分子的表達被下調。
7.權利要求5的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-34a/hsa-miR-27a及hsa-miR-34a/hsa-miR-29a的任意一種或多種核酸組合。特別是，所述核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR_29a、hsa_miR-27a及hsa_miR-34a的一種核酸組合。
8.權利要求I的試劑盒，其中所述肺癌是鱗狀細胞肺癌。
9.權利要求I或8的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記可包含至少四種核酸分子。
10.權利要求I或8-9的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一種或多種靶細胞中與在一種或多種正常對照細胞中相比被上調；及包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一種或多種靶細胞中與在一種或多種正常對照細胞中相比被下調。
11.權利要求I或8-10任一項的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記包含編碼sa-miR-205、hsa-miR-25、hsa_miR-29a 和 hsa-miR-375 的任意一種或多種核酸分子。
12.權利要求11的試劑盒，其中在所述一種或多種靶細胞中與在所述一種或多種正常對照細胞中相比，hsa-miR-205和hsaiiR-25的表達被上調，而編碼hsa_miR-29a和hsa-miR-375的任意一種或多種核酸分子的表達被下調。
13.權利要求11的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-205/hsa_miR-29a、hsa-miR-25/hsa_miR-29a、hsa-miR-205/hsa_miR-375、hsa-miR-25/hsa-miR-375的任意一種或多種核酸組合。特別是，所述核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-205、hsa-miR-25 及 hsa_miR-29a 的一種核酸組合。
14.權利I的試劑盒，其中所述肺癌是小細胞肺癌。
15.權利要求I或14的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記可包含至少五種核酸分子。
16.權利要求I或14-15的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一種或多種靶細胞中與在一種或多種正常對照細胞中相比被上調；及包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一種或多種靶細胞中與在一種或多種正常對照細胞中相比被下調。
17.權利要求I或14-16任一項的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-25、hsa_miR-27a、hsa_miR-29a、hsa_miR-29b 及 hsa-miR-375 的任意一種或多種核酸分子。
18.權利要求17的試劑盒，其中在所述一種或多種靶細胞中與在所述一種或多種正常對照細胞中相比，hsa-miR-25和hsa-miR-375的表達被上調，而編碼hsa_miR-27a、hsa-miR-29a和hsa_miR-29b的任意一種或多種核酸分子的表達被下調。
19.權利要求17的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-25/hsa_miR-27a、hsa-miR-375/hsa_miR-27a、hsa-miR-25/hsa_miR-29a 和 hsa-miR-375/hsa-miR-29a的任意一種或多種核酸組合。特別是，所述核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-29a 和 hsa-miR-375 的一種核酸組合。
20.權利要求1-19的試劑盒，進一步用於將鱗狀細胞肺癌與腺癌肺癌區別開。
21.權利要求I或20的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記可包含至少四種核酸分子。
22.權利要求I或20-21的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一種或多種靶細胞中與在一種或多種對照細胞中相比被上調；及包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一種或多種靶細胞中與在一種或多種對照細胞中相比被下調。
23.權利要求I或20-22任一項的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-205、hsa-miR-25、hsa_miR-27a 及 hsa-miR-375 的任意一種或多種核酸分子。
24.權利要求23的試劑盒，其中在所述一種或多種靶細胞中與在所述一種或多種對照細胞中相比，hsa-miR-205、hsa-miR-25 和 hsa_miR-27a 的表達被上調，而編碼 hsa-miR-375的一種核酸分子的表達被下調。
25.權利要求23的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-205/hsa-miR-375和hsa-miR-25/hsa_miR-375的任意一種或多種核酸組合。特別是，所述核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-205、hsa-miR-25和hsa-miR-375的一種核酸組合。
26.權利要求1-19的試劑盒，進一步用於將小細胞肺癌與腺癌肺癌區別開。
27.權利要求I或26的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記可包含至少六種核酸分子。
28.權利要求I或26-27的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一種或多種靶細胞中與在一種或多種對照細胞中相比被上調；及包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一種或多種靶細胞中與在一種或多種對照細胞中相比被下調。
29.權利要求I或26-28任一項的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-25、hsa_miR-27a、hsa_miR-29a、hsa_miR-29b、hsa_miR-34a 及 hsa-miR-375 的任意一種或多種核酸分子。
30.權利要求29的試劑盒，其中在所述一種或多種靶細胞中與在所述一種或多種對照細胞中相比，hsa-miR-25和hsa-miR-375的表達被上調，而編碼hsa_miR-27a、hsaniR-29a、hsaniR-29b和hsaniR-34a的任意一種或多種核酸分子的表達被下調。
31.權利要求I或26-30的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-25/hsa_miR-27a、hsa-miR-375/hsa_miR-27a、hsa-miR-25/hsa_miR-29a 和 hsa-miR-375/hsa-miR-29a的任意一種或多種核酸組合。特別是，所述核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-25、hsa_miR-34a 和 hsa-miR-375 的一種核酸組合。
32.權利要求1-19的試劑盒，進一步用於將小細胞肺癌與鱗狀細胞肺癌區別開。
33.權利要求32的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記可包含至少六種核酸分子。
34.權利要求I或32-33的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一種或多種靶細胞中與在一種或多種對照細胞中相比被上調；及包含至少一種編碼微RNA序列的核酸分子，其表達在一種或多種靶細胞中與在一種或多種對照細胞中相比被下調。
35.權利要求I或32-34任一項的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-205、hsa-miR-27a、hsa-miR-29a、hsa-miR-29b、hsa-miR-34a 及 hsa-miR-375 的任意一種或多種核酸分子。
36.權利要求35的試劑盒，其中在所述一種或多種靶細胞中與在一種或多種對照細胞中相比，hsa-miR-375 的表達被上調，而編碼 hsa-miR-205、hsa_miR-27a、hsa_miR-29a、hsa-miR-29b和hsa_miR-34a的任意一種或多種核酸分子的表達被下調。
37.權利要求35的試劑盒，其中所述核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR-375/hsa-miR-27a和hsa-miR-375/hsa_miR-29a的任意一種或多種核酸組合。特別是，所述核酸表達生物標記包含編碼hsa-miR_29b和hsa-miR-375的一種核酸組合。
38.用於鑑定展現出腺癌肺癌、鱗狀細胞肺癌或小細胞肺癌的一種或多種哺乳動物靶細胞的方法，所述方法包括 (a)收集患者的活組織檢查或外科手術組織； (b)在載玻片上製備組織切片； (c)將至少一種編碼微RNA序列的核酸分子生物標記物雜交到載玻片上的切片上； (d)在顯微鏡下或者通過數字病理學方案對miRNA的表達進行定量； (e)在所述的一種或多種靶細胞中確定多種核酸分子表達水平，每種核酸分子均編碼微RNA序列； (f)在一種或多種對照細胞中確定所述多種核酸分子的表達水平；及 (g)通過對比在步驟(e)和(f)中所獲得的各自的表達水平，從所述多種核酸分子中鑑定出在靶細胞和對照細胞中差異表達的一種或多種核酸分子，其中所述一種或多種差異表達的核酸分子一起代表如本文所定義的核酸表達生物標記，其是腺癌肺癌、鱗狀細胞肺癌或者小細胞肺癌存在的指徵。
39.權利要求38的方法，進一步用於區別選自腺癌肺癌、鱗狀細胞肺癌及小細胞肺癌的肺癌。
40.在一種或多種哺乳動物靶細胞中預防或治療肺癌的方法，所述方法包括 (a)通過使用權利要求53-54的方法在一種或多種靶細胞中鑑定核酸表達特徵；及 (b)在所述一種或多種細胞中改變所述核酸表達特徵所包含的編碼微RNA序列的一種或多種核酸分子的表達，所述改變以如下的方式進行，即其表達在所述一種或多種靶細胞中被上調的核酸分子的表達被下調，而其表達在所述一種或多種靶細胞中被下調的核酸分子的表達被上調。
41.用於在一種或多種哺乳動物靶細胞中預防和/或治療肺癌的藥物組合物，所述組合物包含一種或多種核酸分子，每種核酸分子均編碼序列， 所述序列與如1-55任一項所定義的在所述一種或多種靶細胞中其表達被上調的核酸分子所編碼的微RNA序列至少部分互補,和/或所述序列對應於如權利要求1-40任一項所定義的在所述一種或多種靶細胞中其表達被下調的核酸分子所編碼的微RNA序列。
42.權利要求41的藥物組合物在製備預防和/或治療肺癌的藥物中的用途。
全文摘要
本發明提供了用於鑑定展現出肺癌的一種或多種哺乳動物靶細胞的診斷試劑盒，所述試劑盒包含多種核酸分子，其中所述核酸分子在靶細胞中和在對照細胞中差異表達。本發明還提供了通過使用所述核酸分子來鑑定展現出肺癌的一種或多種哺乳動物靶細胞的方法，以及同於預防或治療肺癌的方法和藥物組合物。
文檔編號A61K31/7105GK102770561SQ201080064794
公開日2012年11月7日 申請日期2010年12月24日 優先權日2009年12月24日
發明者盧韶華, 吳瑩, 朱虹光, 李健, 黃威 申請人:復旦大學