循環生物標誌物的製作方法
2023-11-05 16:56:52
循環生物標誌物的製作方法
【專利摘要】可評估生物標誌物用於診斷、治療相關或預後方法以鑑定表型(諸如狀況或疾病)或者疾病的階段或進程。可檢測循環生物標誌物並且任選地將其用於生理狀態的分型或確定表型。這些生物標誌物包括核酸、蛋白質以及循環結構，諸如囊泡。可出於診斷、預後或治療診斷目的對生物標誌物進行評估，例如，以選擇針對疾病、狀況、疾病階段以及狀況階段的候選治療方案，並且其還可用於確定效力。有用的循環生物標誌物的實例包括多肽、核酸(例如，DNA、mRNA、微RNA)和囊泡。
【專利說明】循環生物標誌物
交叉引用
[0001]本申請要求於2011年2月24日提交的N0.61/446，313、於2011年6月27日提交的N0.61/501，680、於2011年4月4日提交的N0.61/471，417、於2011年8月15日提交的N0.61/523，763以及於2011年2月22日提交的N0.61/445，273的美國臨時專利申請的權益，所有這些申請均以引用方式全文併入本文。
[0002]本申請為2011年8月18日提交的國際專利申請PCT/US2011/048327的部分繼續申請，該國際專利申請要求於2010年8月18日提交的N0.61/374，951、於2010年9月2日提交的N0.61/379，670、於2010年9月9日提交的N0.61/381，305、於2010年9月15日提交的 N0.61/383，305、於 2010 年 10 月 8 日提交的 N0.61/391，504、於 2010 年 10 月 15 日提交的 N0.61/393，823、於 2010 年 11 月 9 日提交的 N0.61/411，890、於 2010 年 11 月 17 日提交的 N0.61/414，870、於 2010 年 11 月 23 日提交的 N0.61/416，560、於 2010 年 12 月 10 日提交的61/421，851、於2010年12月15日提交的61/423，557、於2010年12月29日提交的N0.61/428，196的美國臨時專利申請的權益，所有這些申請均以引用方式全文併入本文。
[0003]本申請也為2011年3月I日提交的國際專利申請PCT/US2011/026750的部分繼續申請，該國際專利申請為2009年11月12日提交的序列號為12/591,226的美國專利申請的部分繼續申請，該美國專利申請要求於2008年11月12日提交的N0.61/114，045、於2008 年 11 月 12 日提交的 N0.61/114，058、於 2008 年 11 月 13 日提交的 N0.61/114，065、於2009年2月9日提交的N0.61/151，183、於2009年10月2日提交的61/278，049、於2009年10月9日提交的61/250，454、於2009年10月19日提交的N0.61/253，027的美國臨時申請的權益；並且該申請也要求於2010年3月I日提交的N0.61/274，124、於2010年6月22日提交的N0.61/357，517、於2010年7月15日提交的N0.61/364，785的美國臨時申請的權益，所有這些申請均以引用方式全文`併入本文。
[0004]本申請也為2011年4月6日提交的國際專利申請PCT/US2011/031479的部分繼續申請，該國際專利申請要求於2010年4月6日提交的N0.61/321,392、於2010年4月6日提交的N0.61/321，407、於2010年5月6日提交的N0.61/332，174、於2010年5月25日提交的N0.61/348，214、於2010年5月26日提交的N0.61/348，685、於2010年6月11日提交的N0.61/354，125、於2010年6月16日提交的N0.61/355，387、於2010年6月21日提交的N0.61/356，974、於2010年6月22日提交的N0.61/357，517、於2010年7月8日提交的N0.61/362，674、於2010年11月12日提交的N0.61/413，377、於2010年4月9日提交的N0.61/322，690、於2010年5月13日提交的N0.61/334，547、於2010年7月15日提交的N0.61/364，785、於2010年8月2日提交的N0.61/370，088、於2010年9月2日提交的N0.61/379，670、於2010年9月9日提交的N0.61/381，305、於2010年9月15日提交的N0.61/383，305、於 2010 年 10 月 8 日提交的 N0.61/391，504、於 2010 年 10 月 15 日提交的N0.61/393，823、於2010年11月9日提交的N0.61/411，890以及於2010年11月23日提交的N0.61/416，560的美國臨時專利申請的權益，所有這些申請以引用方式全文併入本文。
發明背景[0005]用於諸如癌症的狀況和疾病的生物標誌物包括生物分子，諸如蛋白質、肽、脂質、RNA、DNA和它們的變體與修飾。
[0006]特定生物標誌物(例如DNA、RNA和蛋白質)的鑑定可以提供用於診斷、預後或治療診斷(theranosis)狀況或疾病的生物印記。生物標誌物可在體液中檢測，包括循環DNA、RNA、蛋白質和囊泡。循環生物標誌物包括蛋白質(諸如PSA和CA125)以及核酸(諸如SEPT9DNA和PCA3信使RNA (mRNA))。循環生物標誌物還包括循環囊泡。囊泡是從細胞上脫落的膜包封的結構，並且可見於多種體液中，包括血液、血漿、血清、母乳、腹水、支氣管肺泡灌洗液和尿液。囊泡可作為蛋白質、RNA、DNA、病毒和朊病毒的運送載體而參與細胞之間的通訊。微RNA是調控信使RNA轉錄和降解的短RNA。微RNA已經在體液中發現並且已經觀察到其作為從腫瘤細胞上脫落的囊泡內的組分。對與疾病相關的循環生物標誌物(包括囊泡和/或微RNA)的分析可有助於檢測疾病或其嚴重程度、確定疾病的易感性以及進行治療決策。
[0007]生物樣品中存在的囊泡提供了生物標誌物的來源，例如，所述標誌物存在於囊泡內(囊泡有效負載)或存在於囊泡的表面上。囊泡的特徵(例如尺寸、表面抗原、細胞源的確定、有效負載)還可提供診斷、預後或治療診斷的結果輸出。仍然存在對可用於檢測和治療疾病的生物標誌物進行鑑定的需求。與囊泡相關的微RNA和其它生物標誌物以及囊泡的特徵可提供診斷、預後或治療診斷。
[0008]本發明提供了用於通過檢測作為疾病或疾病進展的指徵的生物標誌物而表徵表型的方法和系統。所述生物標誌物可以是循環生物標誌物,包括囊泡和微RNA。
【發明內容】
[0009]本文公開了用於通過分析囊泡(諸如存在於來自受試者細胞的生物樣品中的囊泡)來表徵表型的方法和組合物。表徵受試者或個體的表型可以包括但不限於疾病或狀況的診斷、疾病或狀況的預後、疾病階段或狀況階段的確定、藥物效力、生理狀況、器官危困或器官排斥、疾病或狀況進展、與疾病或狀況的治療相關關聯性或者特定的生理或生物狀態。
[0010]在一個方面，本發明提供了檢測生物樣品中的一種或多種生物標誌物的方法，包括:a)使生物樣品與設計用於確定該一種或多種生物標誌物的存在或水平的試劑接觸，其中該一種或多種生物標誌物選自圖1-60或表3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、
66、67、69-71、73-85、89-92任一個中的生物標誌物及其組合；和幻鑑定該生物樣品中的該一種或多種生物標誌物，從而檢測該生物樣品中的該一種或多種生物標誌物。
[0011]所述生物樣品可包括生物流體。所述生物流體可包括但不限於外周血、血清、血漿、腹水、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聹、母乳、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper』 s fluid)或射精前液、女性射出液、汗液、糞便物、毛髮、淚液、囊液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、膽汁、間隙液、經血、膿、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、黏膜分泌物、糞便水、胰液、竇腔灌洗液、支氣管肺抽出物、囊胚腔液或臍帶血。例如,所述生物流體可為血液、血液衍生物或血液組成部分,例如血清或血漿。
[0012]在本發明方法的實施方案中，生物樣品包含細胞外微囊泡群體。微囊泡群體可包含具有IOnm至1000nm的直徑的微囊泡。例如，微囊泡群體可包含具有20nm至200nm、50-100nm、100-1000nm、50-200nm、50-80nm、20-50nm 或 50_500nm 的直徑的微囊泡。[0013]在本文方法的一些實施方案中，微囊泡群體在鑑定步驟之前整體地或部分地從生物樣品中分離出來。適當的分離技術包括大小排除色譜法、密度梯度離心、差速離心、納米膜超濾、免疫吸附捕獲、親和選擇、親和純化、親和捕獲、免疫測定、免疫沉澱、微流體分離、流式細胞術或其組合。可使用的其它分離技術在本文中公開或是本領域公知的。
[0014]親和選擇可包括使微囊泡群體與一種或多種結合劑(試劑)接觸。所述一種或多種結合劑可為核酸、DNA分子、RNA分子、抗體、抗體片段、適體、類肽、zDNA、肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、凝集素、肽、樹狀聚體、膜蛋白標記劑、化學化合物或其組合。可使用的其它結合劑在本文中公開或是本領域公知的。
[0015]所述一種或多種結合劑可用來捕獲和/或檢測微囊泡群體。所述一種或多種結合劑可為特異性結合微囊泡例如微囊泡表面標誌物的試劑。該表面標誌物可選自四跨膜蛋白CD9、CD31、CD63、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab_5b、膜聯蛋白 V、MFG-E8、圖 1-60 或表 3-10,12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、67、69-71、73-85、89-92 任一個中的生物標誌物及其組合。
[0016]在一個實施方案中，所述一種或多種結合劑結合至基底，包括但不限於孔、微珠和/或陣列。所述一種或多種結合劑也可攜帶諸如本文所述的或本領域公知的標記，包括但不限於磁標記、突光標記、酶標記、放射性同位素、量子點或其組合。
[0017]在本發明的方法中，所述一種或多種生物標誌物可為任何可以分析的、有用的生物實體。在一些實施方案中，所述一種或多種生物標誌物包含多肽或其功能性片段。在一些實施方案中，所述一種或多種生物標誌物包含微囊泡表面抗原或其功能性片段。在其它實施方案中，所述一種或多種生物標誌物包含核酸或其功能性片段。核酸可以是但不限於在循環中和/或在囊泡內發現的DNA、RNA、mRNA、微RNA或其它小RNA。在一些實施方案中，所述一種或多種生物標誌物包含多種類型的生物實體。例如，所述一種或多種生物標誌物可包含多肽和核酸分子或其任意一種的功能性片段。
[0018]作為一個非限制的實例，本發明的一個實施方案包含使用針對一種或多種微囊泡表面抗原的一種或多種結合劑對微囊泡群體進行的親和選擇，然後對在選定的微囊泡內發現的核酸和/或多肽進行評估。
[0019]在本發明方法的一個實施方案中，所述一種或多種生物標誌物包含四跨膜蛋白，例如，CD9。生物樣品可為已知的或疑似的癌症樣品。癌症可為本文公開的癌症，包括但不限於前列腺癌、肺癌、結腸癌、乳腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌或腎癌。可對CD9進行評估以表徵癌症。
[0020]在本發明方法的另一實施方案中，所述一種或多種生物標誌物選自Gal3、BCA200及其組合。在另一實施方案中，所述一種或多種生物標誌物選自0PN、NCAM及其組合。所述一種或多種標誌物可選自Gal3、BCA200、0PN、NCAM及其組合。所述一種或多種標誌物可選自Gal3和/或BCA200、OPN和/或NCAM及其組合。所述生物樣品可為已知的或疑似的癌症樣品。所述癌症可為本文公開的癌症，包括但不限於乳腺癌。可對所述一種或多種標誌物進行評估以表徵乳腺癌。
[0021]所述一種或多種生物標誌物可選自四跨膜蛋白、⑶45、FasL, CTLA4、⑶31、DLL4、VEGFR2、HIF2a、Tie2、Angl、Mucl、CD147、TMPl、TMP2、MMP7、MMP9 及其組合。所述一種或多種生物標誌物可選自 CD83 和 FasL、CTLA4 和 CD80、CD147 和 TMP1、TMP2 和 MMP9、HIF2a和Angl、VEGFR2和Tie2、CD45和CTL4A、DLL4和CD31及其組合。所述生物樣品可為已知的或疑似的癌症樣品。所述癌症可為本文公開的癌症，包括但不限於乳腺癌。
[0022]所述一種或多種生物標誌物可選自5T4(滋養層)、ADAM10、AGER/RAGE、APC、APP(P -澱粉樣蛋白)、ASPH(A-1O)、B7H3 (CD276)、BACEl、BAI3, BRCAl、BDNF、BIRC2、C1GALT1、CA125 (MUC16)、鈣調蛋白 1、CCL2 (MCP-1)、CD9、CD10、CD 127 (IL7R)、CD174、CD24、CD44、CD63、CD81、CEA、CRMP-2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CYFRA2 UderlinU DLL4、DPP6、E-CAD、EpCaM, EphA2(H-77)、ER(I)ESRl a、ER(2)ESR2 3、Erb B4、Erbb2、erb3 (Erb_B3)PA2G4、FRT (FLTl)、Gal3、GPR30 (G_ 聯結 ERl)、HAPU HER3、HSP-27、HSP70、IC3b、IL8、insig、連接斑珠蛋白、角蛋白 15、KRAS、乳腺珠蛋白、MART 1、MCT2、MFGE8、MMP9、MRP8、Muc 1、MUCl 7、MUC2、NCAM、NG2 (CSPG4)、Ngal、NHE-3, NT5E (CD73)、ODCU OPG, OPN、p53、PARK7、PCSA、卩6?9.5(?八胱5)、？1?(8)、？5八、？5獻、狀6￡、5丁父8?4、存活蛋白、丁卩卩3(分泌的),TIMPU TIMP2,TMEM211、TRAF4(支架)、TRAIL-R2 (死亡受體 5)、TrkB, TsglOl、UNC93a、VEGFA, VEGFR2、YB-U VEGFRU GCDPF-15 (PIP)、BigH3 (TGFbl-誘導的蛋白質)、5HT2B(5_ 羥色胺受體 2B)、BRCA2、BACE1、⑶Hl-鈣黏著蛋白及其組合。生物樣品可為已知的或疑似的癌症樣品。癌症可為本文公開的癌症，包括但不限於乳腺癌。可對所述一種或多種生物標誌物進行評估以表徵乳腺癌。
[0023]在另一實施方案中，所述一種或多種生物標誌物選自AK5.2、ATP6V1B1、CRABPl及其組合。所述一種或多種生物標誌物可選自DST.3、GATA3、KRT81及其組合。所述一種或多種標誌物可選自 AK5.2、ATP6V1B1、CRABPU DST.3、ELF5、GATA3、KRT81、LALBA, 0XTR、RASL10A、SERHL、TFAP2A.1、TFAP2A.3、TFAP2C、VTCNl及其組合。生物樣品可為已知的或疑似的癌症樣品。癌症可為本文公開的癌症，包括但不限於乳腺癌。在一個實施方案中，可對一種或多種標誌物進行評估以表徵原發部位不明癌症是否源自乳腺癌。
[0024]在一些實施方案中，所述一種或多種生物標誌物選自表89中的生物標誌物及其組合。生物樣品可為已知的或疑似的癌症樣品。癌症可為本文公開的癌症，包括但不限於乳腺癌。在一個實施方案中，`對一種或多種標誌物進行評估以表徵乳腺癌。在另一實施方案中，所述一種或多種生物標誌物選自表90中的生物標誌物及其組合。生物樣品可為已知的或疑似的癌症樣品。癌症可為本文公開的癌症，包括但不限於乳腺癌。在一個實施方案中，對一種或多種標誌物進行評價以表徵乳腺癌，例如，原位導管癌(DCIS)。在又一實施方案中，所述一種或多種標誌物選自表91中的生物標誌物及其組合。生物樣品可為已知的或疑似的癌症樣品。癌症可為本文公開的癌症，包括但不限於乳腺癌。在一個實施方案中，對一種或多種標誌物進行評估以表徵乳腺癌，例如，來區分DCIS或非DCIS乳腺癌。
[0025]根據本發明方法評估的一種或多種生物標誌物可選自MS4A1、PRB、DR3及其組合。所述一種或多種生物標誌物也可選自PRB、MACC1及其組合。生物樣品可為已知的或疑似的癌症樣品。癌症可為本文公開的癌症，包括但不限於肺癌。在一個實施方案中，對一種或多種標誌物進行評估以表徵肺癌。
[0026]在本發明方法的另一實施方案中，所述一種或多種生物標誌物選自表92中的生物標誌物及其組合。在又一實施方案中，所述一種或多種生物標誌物包含一種或多種選自 hsa-miR-125a_5p、hsa-miR-650、hsa-miR-194、hsa-miR-1200、hsa—miR-326、hsa_miR-30b*、hsa_miR-19a、hsa_miR-7a*、hsa—miR-708*、hsa_miR-99a、hsa-miR-199b_5p、hsa-miR-543、hsa-miR-7hsa_miR-518c*、hsa-miR-642、hsa-miR-654_3p、hsa-miR-518d_5p、hsa-miR-1266、hsa-miR-154、hsa-miR-662、hsa-miR-523、 hsa-miR-198、 hsa-miR-920、 hsa-miR-885_3p、 hsa_miR-99a*、hsa-miR-337_3p、hsa-miR-363及其組合的微RNA。所述一種或多種生物標記物也可包含miR-497微RNA。生物樣品可為已知的或疑似的癌症樣品。癌症可為本文公開的癌症，包括但不限於肺癌。在一個實施方案中，對一種或多種標誌物進行評估以表徵肺癌。
[0027]在上述方法中，所述一種或多種生物標誌物可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1215、20種或更多種所列的生物標誌物。所述一種或多種生物標誌物可包括所有上述生物標誌物。所述一種或多種生物標誌物可包含任何可測量的生物實體，包括但不限於蛋白質、核酸或其組合。例如，所述一種或多種生物標誌物可以是肽、多肽、蛋白質或其片段。或者，所述一種或多種生物標誌物可以是核酸，如DNA或RNA，包括但不限於mRNA、微RNA或其片段。所述一種或多種生物標誌物也可包含生物實體的組合，例如，至少一種蛋白質和至少一種核酸。
[0028]在本發明方法的一些實施方案中，用針對一種或多種生物標誌物的一種或多種結合劑捕獲微囊泡群體，並用針對生物標誌物的結合劑對其進行檢測，該生物標誌物選自四跨膜蛋白 CD9、CD31、CD63、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab-5b、膜聯蛋白 V、MFG_E8、圖 1-60 或表 3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、67、69-71、73-85、89-92 任一個中的生物標誌物及其組合。例如，所述一種或多種生物標誌物可包括一種或多種上述生物標誌物。
[0029]本發明方法的實施方案進一步包括檢測微囊泡群體內的有效負載(payload)的水平。所檢測的有效負載可以是囊泡內任何可測量的生物實體，包括但不限於一種或多種核酸、肽、蛋白質、脂質、抗原、碳水化合物和/或蛋白聚糖。所檢測的有效負載可包含一種或多種選自上述生物標誌物或圖1-60或表3-10、12-14、22、26、45-50、52、54-57、60-64、
66、67、69-70、74-85、89-92任一個中的生物標誌物及其組合的生物標誌物。核酸生物標誌物可包含一種或多種 DNA、mRNA、微 RNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、siRNA、hnRNA 或 shRNA。例如，核酸可包括一種或多種上述的微RNA，或選自表5-9、30-44、58-59、71和73任一個中的微RNA。核酸標誌物也可包含一種或多種上述的mRNA，或選自圖1_60或表3_10、12-17、19-22、22、26、28-29、45-50、52、54-57、60-64、66、67、69-70、74-85、89-92 任一個中的生物標誌物及其組合。蛋白質生物標誌物可包含一種或多種上述的肽、多肽、蛋白質或其片段，或選自圖 1-60 或表 3-10、12-17、19-22、22、26、28-29、45-50、52、54-57、60-64、66、67、69-70、74-85、89-92任一個中的生物標誌物及其組合。
[0030]本發明的方法可進一步包括針對至少一種另外的生物標誌物分析生物樣品，該另外的生物標誌物選自上述生物標誌物，四跨膜蛋白⑶9、⑶31、⑶63、⑶81、⑶82、⑶37、⑶53、Rab-5b、膜聯蛋白 V、MFG-E8、圖 1-60 或表 3-10、12-14、22、26、45-50、52、54-57、60_64、66、
67、69-70、74-85、89-92任一個中的生物標誌物及其組合。所述一種或多種另外的生物標誌物可用本文包含的或本領域已知的任何有用方法進行檢測。
[0031]如上指出，生物樣品可包含已知的或疑似的癌症樣品。在一些實施方案中，生物樣品包含癌細胞培養物或來自患有或疑似患有該癌症的受試者的樣品。癌症可為本文公開的癌症，包括但不限於急性成淋巴細胞性白血病；急性骨髓性白血病；腎上腺皮質癌；AIDS相關癌症；AIDS相關淋巴瘤；肛門癌；闌尾癌；星形細胞瘤；非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；基底細胞癌；膀胱癌；腦幹膠質瘤；腦腫瘤(包括腦幹膠質瘤、中樞神經系統非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤、中樞神經系統胚胎樣瘤、星形細胞瘤、顱咽管瘤、成室管膜母細胞瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果體實質腫瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤和成松果體細胞瘤)；乳腺癌；支氣管腫瘤；伯基特氏淋巴瘤；原發部位不明癌；類癌瘤；原發部位不明腫瘤；中樞神經系統非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；中樞神經系統胚胎性腫瘤；宮頸癌；兒童期癌症；脊索瘤；慢性淋巴細胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增殖紊亂；結腸癌；結腸直腸癌；顱咽管瘤；皮膚T細胞淋巴瘤；內分泌胰島細胞瘤；子宮內膜癌；成室管膜母細胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感覺神經細胞瘤(esthesioneuroblastoma);尤文氏肉瘤；顱外生殖細胞瘤；性腺外生殖細胞腫瘤；肝外膽管癌；膽囊癌；胃的(胃)癌；胃腸道類癌腫瘤；胃腸道間質細胞瘤；胃腸道間質瘤(GIST);妊娠滋養細胞腫瘤；神經膠質瘤；毛細胞白血病；頭頸癌；心臟癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼內黑色素瘤；胰島細胞瘤；卡波濟氏肉瘤；腎癌；朗格漢斯細胞組織細胞增生症；喉癌；唇癌；肝癌；肺癌；惡性纖維組織細胞瘤骨癌；髓母細胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel細胞癌；Merkel細胞皮膚癌；間皮瘤；隱匿原發性的轉移性鱗狀頸癌；口腔癌；多發性內分泌腫瘤症候群；多發性骨髓瘤；多發性骨髓瘤/漿細胞贅生物；蕈樣肉芽腫；骨髓發育異常症候群；骨髓增生性贅生物；鼻腔癌；鼻咽癌；神經母細胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮膚癌；非小細胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它腦和脊髓腫瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖細胞腫瘤；卵巢低惡性潛在腫瘤；胰腺癌；乳頭狀瘤病；副鼻竇癌；甲狀旁腺癌；盆腔癌；陰莖癌；咽癌；中度分化的松果體實質腫瘤；成松果體細胞瘤；垂體瘤；漿細胞贅生物/多發性骨髓瘤；胸膜肺母細胞瘤；原發性中樞神經系統(CNS)淋巴瘤；原發性肝細胞肝癌；前列腺癌；直腸癌；腎癌；腎細胞(腎)癌；腎細胞癌；呼吸道癌；視網膜母細胞瘤；橫紋肌肉瘤；唾液腺癌症；S6zary症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟組織肉瘤；鱗狀細胞癌；鱗狀頸癌；胃(胃的)癌；幕上原始神經外胚層腫瘤；T細胞淋巴瘤；睪丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲狀腺癌；移行細胞癌；腎盂和輸尿管的移行細胞癌；滋養細胞腫瘤；輸尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉瘤；陰道癌；外陰癌；Waldenstr6m巨球蛋白血症或腎母細胞瘤。
[0032]上述方法可進一步包括將一種或多種生物標誌物的存在或水平與參照進行比較，其中相對於參照改變的存 在或水平為癌症提供了診斷、預後或治療診斷決定。針對癌症的診斷、預後或治療診斷決定可包括癌症或癌症可能性的診斷，癌症的預後，癌症的治療診斷，確定癌症是否對治療處理正作出反應，或確定癌症是否有可能對治療處理有反應。在實施方案中，治療處理選自表10-13或69。參照可來自沒有癌症的生物樣品。參照可來自在一個或多個不同時間點測定的一系列生物樣品。在實施方案中，與參照相比樣品中一種或多種生物標誌物的水平的提高指示樣品中癌症的存在或可能性，或樣品中更晚期癌症的存在或可能性。
[0033]在另一方面，本發明提供了一種試驗，其包括:a)從生物樣品中分離細胞外微囊泡，其中該微囊泡包含一種或多種RNA分子，其中所述一種或多種RNA分子是與上述生物標誌物或圖 1-60 或表 3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、67、69-71、73-85、89-92任一個中的生物標誌物相對應的診斷指示物；b)測定微囊泡中所述一種或多種RNA分子的量；和c)將測定的一種或多種RNA分子的量與一種或多種對照水平進行比較，其中如果細胞外微囊泡中的一種或多種RNA分子的量與一種或多種對照水平相比存在差異，則檢測出癌症。分離步驟可包括本文公開的或本領域已知的方法，例如，大小排除色譜法、密度梯度離心、差速離心、納米膜超濾、免疫吸附捕獲、親和選擇、親和純化、親和捕獲、免疫測定、免疫沉澱、微流體分離、流式細胞術或其組合。在一個實施方案中，親和選擇包括使微囊泡群體與一種或多種結合劑接觸，該結合劑特異性結合選自上述生物標誌物和/或圖1-60或表 3-10、12-17、19-22、22、26、28-29、45-50、52、54-57、60-64、66、67、69-70、74-85、89-92任一個中的生物標誌物及其組合的微囊泡表面標誌物。
[0034] 上述方法可在體外進行。在一個相關方面，本發明提供了一種或多種試劑在實施所述方法中的應用。類似地，本發明提供了包含用來實施所述方法的一種或多種試劑的試劑盒。所述一種或多種試劑可包含針對所述方法中的一種或多種生物標誌物的一種或多種結合劑。所述一種或多種試劑也可以是針對一種或多種生物標誌物的一種或多種結合劑，該生物標誌物選自圖 1-60 或表 3-10、12-14、22、26、45-50、52、54-57、60-64、66、67、69-70、74-85、89-92任一個中的生物標誌物及其組合。在一個實施方案中，所述一種或多種結合劑包含抗體或適體。所述一種或多種結合劑可系留(tethered)於基底上。所述一種或多種結合劑可以是標記的。所述一種或多種結合劑可包含各種形式的多種結合劑，例如，一種或多種結合劑可系留於基底上和單獨的一種或多種標記的結合劑。所述標記可以是本文所述的或本領域已知的任何有用的標記，例如，磁標記、螢光標記、酶標記、放射性同位素或量子點。
[0035]在一個方面，本發明提供了一種分離的囊泡，其包含選自上述方法中列出的生物標誌物及其組合的一種或多種生物標誌物。在一個實施方案中，所述囊泡包含選自圖1-60或表 3-10、12-14、22、26、45-50、52、54-57、60-64、66、67、69-70、74-85、89-92 任一個中的生物標誌物及其組合的一種或多種生物標誌物。
援引併入
[0036]本說明書中提及的所有公開、專利和專利申請均以引用方式併入本文，其引用的程度如同每一份單獨的公開、專利或專利申請均特定地且單獨地表明以引用的方式併入一般。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0037]本發明的新特徵在所附權利要求書中具體闡述。通過參考以下對其中利用了本發明原理的說明性實施方案加以闡述的詳細描述和附圖，將會獲得對本發明的特徵和優勢更好的理解，在附圖中:
[0038]圖l(a)_(g)示出了表格，其列出了按細胞/組織的譜系、組比較和特定的疾病狀態的示例性癌症，以及對這些癌症、分組細胞/組織比較和特定的疾病狀態具有特異性的抗原。此外，所述的抗原可以為生物標誌物。所述的一種或多種生物標誌物可相對於參照而改變，例如，是存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0039]圖2(a)_(f)示出了表格，其列出了按細胞/組織的譜系、組比較和特定的疾病狀態的示例性癌症，以及對這些癌症、組細胞/組織比較和特定的疾病狀態具有特異性的結合劑。
[0040]圖3(a)_(b)是列出了示例性乳腺癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自乳腺癌特異性的囊泡且對其進行分析以產生乳腺癌特異性的囊泡生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0041]圖4(a)_(b)是列出了示例性卵巢癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自卵巢癌特異性的囊泡且對其進行分析以產生卵巢癌特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0042]圖5是列出了示例性肺癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自肺癌特異性的囊泡且對其進行分析以產生肺癌特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0043]圖6 (a)-(d)是列出了示例性結腸癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自結腸癌特異性的囊泡且對其進行分析以產生了結腸癌特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0044]圖7是列出了對腺瘤對增生性息肉具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自腺瘤對增生性息肉特異性的囊泡且對其進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0045]圖8是列出了對於炎性腸病(IBD)對正常具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自對炎性腸病相對正常組織具有特異性的囊泡且對其進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0046]圖9(a)_(c)是列出了對於腺瘤相對結腸直腸癌(CRC)具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自對於腺瘤對結腸直腸癌具有特異性的囊泡且對其進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0047]圖10是列出了對於IBD相對CRC具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自對於IBD對CRC具有特異性的囊泡且對其進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0048]圖11 (a)-(b)是列出了對於Dukes CRC B相對Dukes CRC C-D具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自對於Dukes CRC B相對Dukes CRCC-D具有特異性的囊泡且對其進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0049]圖12(a)-(d)是列出了對於低度異型增生的腺瘤對高度異型增生的腺瘤具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自對於低度異型增生的腺瘤對高度異型增生的腺瘤具有特異性的囊泡且對其進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0050]圖13(a)_(b)是列出了對於潰瘍性結腸炎(UC)相對克羅恩病(CD)具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自對於UC相對CD具有特異性的囊泡且對其進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0051]圖14是列出了對於增生性息肉相對正常具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自對於增生性息肉相對正常具有特異性的囊泡且對其進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。 [0052]圖15是列出了對於具有低度異型增生的腺瘤相對正常具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自對於具有低度異型增生的腺瘤相對正常具有特異性的囊泡且對其進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0053]圖16是列出了對於腺瘤相對正常具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自對於腺瘤相對正常具有特異性的囊泡且對其進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0054]圖17是列出了對於CRC相對正常具有特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自對於CRC相對正常具有特異性的囊泡且對其進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0055]圖18是列出了良性前列腺增生特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自良性前列腺增生特異性的囊泡且對其進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0056]圖19 (a)-(c)是列出了示例性前列腺癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自前列腺癌特異性的囊泡且對其進行分析以產生前列腺癌特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0057]圖20(a)_(c)是列出了示例性黑色素瘤生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自黑色素瘤特異性的囊泡且對其進行分析以產生黑色素瘤特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0058]圖21 (a)-(b)是列出了示例性胰腺癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自胰腺癌特異性的囊泡且對其進行分析以產生胰腺癌特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0059]圖22是列出了腦癌特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自腦癌特異性的囊泡且對其進行分析以產生腦癌特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0060]圖23(a)_(b)是列出了示例性銀屑病生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自銀屑病特異性的囊泡且對其進行分析以產生銀屑病特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0061]圖24(a)_(c)是列出了示例性心血管疾病生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自心血管疾病特異性的囊泡且對其進行分析以產生心血管疾病特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0062]圖25是列出了血液惡性腫瘤特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自血液惡性腫瘤特異性的囊泡且對其進行分析以產生血液惡性腫瘤特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0063]圖26(a)_(b)是列出了 B細胞慢性淋巴細胞性白血病特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自B細胞慢性淋巴細胞性白血病特異性的囊泡且對其進行分析以產生B細胞慢性淋巴細胞性白血病特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0064]圖27是列出了 B細胞淋巴瘤及B細胞淋巴瘤-DLBCL特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自B細胞淋巴瘤及B細胞淋巴瘤-DLBCL特異性的囊泡且對其進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
`[0065]圖28是列出了 B細胞淋巴瘤-DLBCL-生發中心樣、B細胞淋巴瘤-DLBCL-活化B細胞樣和B細胞淋巴瘤DLBCL特異性的示例性生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自B細胞淋巴瘤-DLBCL-生發中心樣、B細胞淋巴瘤-DLBCL-活化B細胞樣和B細胞淋巴瘤-DLBCL特異性的囊泡且對其進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0066]圖29是列出了示例性伯基特氏淋巴瘤生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自伯基特氏淋巴瘤特異性的囊泡且對其進行分析以產生伯基特氏淋巴瘤特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0067]圖30(a)_(b)是列出了示例性肝細胞癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自肝細胞癌特異性的囊泡且對其進行分析以產生肝細胞癌特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0068]圖31是列出了示例性宮頸癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自宮頸癌特異性的囊泡且對其進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0069]圖32是列出了示例性子宮內膜癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自子宮內膜癌特異性的囊泡且對其進行分析以產生子宮內膜癌特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。[0070]圖33(a)_(b)是列出了示例性頭頸癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自頭頸癌特異性的囊泡且對其進行分析以產生頭頸癌的特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0071]圖34是列出了示例性炎性腸病(IBD)生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自IBD特異性的囊泡且對其進行分析以產生IBD特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0072]圖35是列出了示例性糖尿病生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自糖尿病特異性的囊泡且對其進行分析以產生糖尿病特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0073]圖36是列出了示例性巴雷特食管(Barrett’s Esophagus)生物標誌物的表格,其中所述的生物標誌物可以來自巴雷特食管特異性的囊泡且對其進行分析以產生巴雷特食管特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0074]圖37是列出了示例性纖維肌痛生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自纖維肌痛特異性的囊泡且對其進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0075]圖38是列出了示例性中風生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自中風特異性的囊泡且對其進行分析以產生中風特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0076]圖39是列出了示例性多發性硬化症(MS)生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自MS特異性的囊泡且對其進行分析以產生MS特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0077]圖40(a)_(b)是列出了示例性帕金森氏病生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自帕金森氏病特異性的囊泡且對其進行分析以產生帕金森氏病特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0078]圖41是列出了示例性風溼病生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自風溼病特異性的囊泡且對其進行分析以產生風溼病特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0079]圖42(a)_(b)是列出了示例性阿爾茨海默氏病生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自阿爾茨海默氏病特異性的囊泡且對其進行分析以產生阿爾茨海默氏病特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0080]圖43是列出了示例性朊病毒疾病生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自朊病毒疾病特異性的囊泡且對其進行分析以產生朊病毒疾病特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0081]圖44是列出了示例性膿毒症生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自膿毒症特異性的囊泡且對其進行分析以產生膿毒症特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0082]圖45是列出了示例性慢性神經病理性疼痛生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自慢性神經病理性疼痛特異性的囊泡且對其進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0083]圖46是列出了示例性周圍神經病理性疼痛生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自周圍神經病理性疼痛特異性的囊泡且對其進行分析。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。`
[0084]圖47是列出了示例性精神分裂症生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自精神分裂症特異性的囊泡且對其進行分析以產生精神分裂症特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0085]圖48是列出了示例性雙相型障礙或疾病生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自雙相型障礙特異性的囊泡且對其進行分析以產生雙相型障礙特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0086]圖49是列出了示例性抑鬱症生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自抑鬱症特異性的囊泡且對其進行分析以產生抑鬱症特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0087]圖50是列出了示例性胃腸道間質瘤(GIST)生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自GIST特異性的囊泡且對其進行分析以產生GIST特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。[0088]圖51(a)_(b)是列出了示例性腎細胞癌(RCC)生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自RCC特異性的囊泡且對其進行分析以產生RCC特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0089]圖52是列出了示例性肝硬化生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自肝硬化特異性的囊泡且對其進行分析以產生肝硬化特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0090]圖53是列出了示例性食管癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自食管癌特異性的囊泡且對其進行分析以產生食管癌特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0091]圖54是列出了示例性胃癌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自胃癌特異性的囊泡且對其進行分析以產生胃癌特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0092]圖55是列出了示例性孤獨症生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自孤獨症特異性的囊泡且對其進行分析以產生孤獨症特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0093]圖56是列出了示例性器官排斥反應生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自器官排斥反應特異性 的囊泡且對其進行分析以產生器官排斥反應特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種 生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0094]圖57是列出了示例性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自耐甲氧西林金黃色葡萄球菌特異性的囊泡且對其進行分析以產生耐甲氧西林金黃色葡萄球菌特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0095]圖58是列出了示例性易損斑塊生物標誌物的表格，其中所述的生物標誌物可以來自易損斑塊特異性的囊泡且對其進行分析以產生易損斑塊特異性的生物印記。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0096]圖59(a)_(i)是列出了示例性基因融合的表格，其中所述的基因融合可以來自囊泡或由囊泡進行分析。所述的基因融合可以為生物標誌物，並且可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，或修飾的(例如外遺傳修飾的或翻譯後修飾的)。
[0097]圖60(a)_(b)為基因及其相關miRNA的表格，其中所述的基因(例如該基因的mRNA)、其相關miRNA或者它們的任意組合可以用作可由囊泡分析得到的一種或多種生物標誌物。此外，所述的一種或多種生物標誌物可以為存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的。
[0098]圖61A描述了鑑定包含核酸的生物印記以表徵表型的方法。圖61B描述了鑑定囊泡或囊泡群體的生物印記以表徵表型的方法。
[0099]圖62詳細說明了對囊泡上的蛋白質進行篩選所獲得的結果，所述蛋白質可用作為所述囊泡的生物標誌物。針對所述蛋白質的抗體可用作為結合劑。經鑑定為囊泡的生物標誌物的蛋白質的實例包括Be 1-XL、ERCC1、角蛋白15、⑶81/TAPA-1、⑶9、上皮特異性抗原(ESA)和肥大細胞糜蛋白酶。所述生物標誌物在囊泡中或囊泡上可以是存在或不存在的，表達不足或過表達的，突變的或修飾的，並且可用於表徵狀況。
[0100]圖63詳細描述了通過評估囊泡生物印記而表徵表型的方法。圖63A為塗敷有捕獲抗體的平面基底的簡圖，所述的捕獲抗體捕獲表達所述蛋白質的囊泡。所述捕獲抗體是針對囊泡蛋白質(其對源自病變細胞的囊泡(「疾病囊泡」)具有或不具有特異性)的。所述檢測抗體與捕獲的囊泡結合併提供螢光信號。所述檢測抗體可檢測通常與囊泡相關的抗原，或檢測與細胞源或疾病(如癌症)相關的抗原。圖63B為塗敷有捕獲抗體的珠的簡圖，所述捕獲抗體捕獲表達所述蛋白質的囊泡。所述的捕獲抗體是針對囊泡蛋白質(其對於源自病變細胞的囊泡(「疾病囊泡」)具有或不具有特異性)的。所述檢測抗體與捕獲的囊泡結合併提供螢光信號。所述檢測抗體可檢測通常與囊泡相關的抗原，或檢測與細胞源或疾病(如癌症)相關的抗原。圖63C為篩選方案的實例，其可以通過使用如圖63B中所示的珠以多重方式實施。圖63D示出了捕獲或檢測囊泡以表徵表型的說明性示意圖。圖63E示出了用於評估囊泡有效負載以表徵表型的示意圖。
[0101]圖64為蛋白質表達模式的示意圖。通常，不同的蛋白質並非平均或均一地分布於囊泡的殼上。囊泡特異性的蛋白質通常更為常見，而癌症特異性的蛋白質是較少見的。使用更常見的較低癌症特異性的蛋白質可以更容易地完成囊泡的捕獲，而癌症特異性的蛋白質可以用於檢測階段中。
[0102]圖65詳細說明了可以在本發明的一些示例性實施方案中使用的計算機系統。
[0103]圖66A-B描繪了 EpCam偶聯的珠的掃描電子顯微照片(SEM)，其中所述的珠已經與VcaP囊泡一起孵育。
[0104]圖67詳細說明了使用檢測來自受試者的囊泡的基於珠的方法描述結果的方法。圖67A是對於單個患者，使用在圖63B中所描述的篩選方案的珠數量和信號強度的圖，其中~100個捕獲珠用於每個患者的各捕獲/檢測結合分析。對於給定的患者而言，輸出結果顯示了相對信號強度的所檢測的珠的數量。在給定強度下捕獲的珠的數量為囊泡以怎樣的頻率在所述強度下表達檢測蛋白質的指示。對於給定的珠而言，信號的強度越強，則檢測蛋白質的表達越多。圖67B為通過將正常的患者組合到一條曲線中而將癌症患者組合到另一條曲線中，並使用生物統計分析區分所述曲線而得到的歸一化的圖。對由各個個體得到的數據歸一化以考慮由檢測儀器所讀取的珠的數量的差異，將這些數據加和，然後再次歸一化考慮各群體中不同的樣品數量。
[0105]圖68詳細說明了圖示了前列腺癌的生物印記。圖68 (A)為由使用微球平臺的多重試驗而收集的強度值的柱狀圖，其中珠被CD63抗體功能化，與由患者血漿純化的囊泡孵育，然後用藻紅蛋白(PE)偶聯的EpCam抗體標記。較深的陰影的柱(藍)表示12名正常受試者的群體，而較淺的陰影的柱(綠)得自7名3期前列腺癌患者。圖68(B)是根據圖67所述對圖68 (A)中所示出的各柱狀圖進行歸一化的圖。對於前列腺癌患者樣品和正常樣品兩者，分布為對來自圖68 (A)的微球結果的強度值的高斯擬合。圖68 (C)為圖68 (B)中示出的前列腺癌生物印記之一的實例，即⑶63對⑶63生物印記(上方的圖)，其中⑶63用作檢測劑及捕獲抗體。下方的3個圖示出了在3種前列腺癌細胞系(VCaP、Lncap和22RV1)上的流式細胞分析的結果。水平線上方的點表示捕獲了具有CD63的囊泡(包含B7H3)的珠。垂直線右側的珠表示捕獲了具有CD63的囊泡(具有PSMA)的珠。在線上方和線右側的這些珠具有所有的3種抗原。CD63是與囊泡相關的表面蛋白質，PSMA是與前列腺細胞相關的表面蛋白質，而B7H3是與侵襲性癌症(具體而言為前列腺癌、卵巢癌和非小細胞肺癌)相關的表面蛋白質。所有這3種抗原結合在一起鑑定出來自癌症前列腺細胞的囊泡。大部分表達CD63的前列腺癌囊泡還具有前列腺特異性膜抗原PSMA和B7H3 (參與調節腫瘤細胞遷移和入侵，並且為侵襲性癌症及臨床結果的指示)。圖68 (D)為前列腺癌囊泡的形態。上方的圖示出了使用CD63、CD9和CD81以多種組合進行捕獲和標記的結果。幾乎所有的點都位於右上象限，表明這3種標誌物是高度偶合的。下一列描述了使用B7H3捕獲並使用CD63和PSMA標記細胞系囊泡的結果。VCaP和22RV1都表明，使用B7H3捕獲的大多數囊泡還具有CD63，並且存在兩種群體，即，具有PSMA的群體和不具有PSMA的群體。由於LNcap不具有大量的包含B7H3的囊泡(不存在大量具有CD63的點)，B7H3的存在可以是癌症侵襲性程度的指示。LnCap為早期前列腺癌類似細胞系。
[0106]圖69說明了結腸癌的生物印記。(A)描述了由使用了微球平臺的各種多重試驗而收集的強度值的柱狀圖，其中使用捕獲抗體對珠功能化，將其與從患者血漿純化的囊泡一起孵育，然後用檢測抗體標記。較深的陰影柱(藍)表示來自正常的群體，而較淺的陰影柱(綠)來自結腸癌患者。(B)示出了(A)中所示各柱狀圖的歸一化圖。(C)描述了由多重試驗收集的強度值的柱狀圖，其中被⑶66抗體(捕獲抗體)功能化的珠與由患者血漿純化的囊泡一起孵育，然後用與PE偶聯的EpCam抗體(檢測抗體)標記。紅色的群體來自6名正常的受試者，而綠色群體來自21名結腸癌患者。將由各個體得到的數據歸一化以考慮所檢測的珠數目的差異，將這些數據加在一起，然後再次歸一化以考慮各群體中不同的樣品數目。
[0107]圖70顯示多重檢測劑可以增大信號。(A)當囊泡標記有多種與前列腺特異性PE偶聯的抗體時，中位強度值被繪製為來自VCaP細胞系的純化濃度的函數。各圖的右側列出了以EpCam(左側的圖)或PCSA(右側的圖)捕獲的囊泡以及通過檢測抗體所檢測的多種蛋白質。在這兩種情況下，CD9與CD63的組合均得到了超出背景的最佳信號增加(底部圖描繪增加百分率)。CD9與CD63的組合得到超出背景的大約200%的百分增加。(B)進一步顯示前列腺癌/前列腺囊泡特異性標誌物的復用改善了前列腺癌細胞源的囊泡的檢測。當使用多種前列腺特異性PE偶聯的抗體進行標記時，中位強度值被繪製為來自VCaP細胞系的純化濃度的函數。描繪了以PCSA(左側的圖)和EpCam(右側的圖)捕獲的囊泡。在這兩種情況下，B7H3與PSMA的組合均得到了超出背景的最佳信號增加。
[0108]圖71說明了使用⑶63檢測劑和⑶63捕獲按階段對於結腸癌的結腸癌生物印記。強度柱狀圖得自使用CD63塗敷的珠捕獲的並使用CD63偶聯PE標記的囊泡。在對照組中有6位患者(A)，I期中有4位患者(B)，II期中有5位患者(C)，III期中有8位患者⑶，和IV期中有4位患者(E)。由各個個體得到的數據經歸一化以考慮所檢測的珠數量的變化，將這些數據加在一起，然後再次歸一化以考慮各群體中的不同樣品數(F)。
[0109]圖72說明了使用EpCam檢測劑和CD9捕獲對於按階段的結腸癌的結腸癌生物印記。強度柱狀圖得自使用CD9塗敷的珠捕獲的並使用EPCam標記的囊泡。其中，在對照組(A) ,I期(B)、11期(C)、111期⑶和VI期(E)中都有患者。由各個個體得到的數據以歸一化以考慮所檢測的珠數量的變化，將這些數據加在一起，然後再次歸一化以考慮各群體中的不同樣品數(F)。
[0110]圖73說明了(A)使用針對所列蛋白質的抗體(列出作為檢測和捕獲抗體)檢測前列腺癌的靈敏度、特異性以及置信度水平。⑶63、⑶9和⑶81為一般標誌物，並且EpCam為癌症標誌物。單個結果描繪於(B)中，對於EpCam對CD63而言，以99%的置信度，100%(n=8)的癌症患者樣品不同於廣義正態分布，並且以99%的置信度，77%(n=10)的正常患者樣品不同於廣義正態分布；(C)對於⑶81對⑶63而言，以99%的置信度，90%(n=5)的癌症患者樣品不同於廣義正態分布，以99%的置信度，77%(n=10)的正常患者樣品不同於廣義正態分布；(D)對於⑶63對⑶63而言，以99%的置信度，60%(n=5)的癌症患者樣品不同於廣義正態分布，以99%的置信度，80%(n=10)的正常患者樣品不同於廣義正態分布；(E)對於CD9對⑶63而言，以99%的置信度，90%(n=5)的癌症患者樣品不同於廣義正態分布，以99%的置信度，77%(n=10)的正常患者樣品不同於廣義正態分布。
[0111]圖74說明了(A)使用針對所列蛋白質的抗體(列出作為檢測和捕獲抗體)檢測結腸癌的靈敏度和置信度水平。⑶63和⑶9為一般標誌物，EpCam為癌症標誌物，並且⑶66為結腸標誌物。單個結果描繪於(B)中，對於EpCam對⑶63而言，以99%的置信度，95%(n=20)的癌症患者樣品不同於廣義正態分布，以99%的置信度，100%(n=6)正常患者樣品不同於廣義正態分布；(C)對於EpCam對⑶9而言，以99%的置信度，90%(n=20)的癌症患者樣品不同於廣義正態分布，以99%的置信度，77%(n=6)正常患者樣品不同於廣義正態分布；(D)對於⑶63對⑶63而言，以99%的置信度，60%(n=20)的癌症患者樣品不同於廣義正態分布，以99%的置信度，80%(n=6)的正常患者樣品不同於廣義正態分布；(E)對於CD9對⑶63而言，以99%的置信度，90%(n=20)的癌症患者樣品不同於廣義正態分布，以99%的置信度，77%(n=6)的正常患者樣品不同於廣義正態分布；(F)對於CD66對CD9而言，以99%的置信度，90%(n=20)的癌症患者樣品不同於廣義正態分布，以99%的置信度，77%(n=6)的正常患者樣品不同於廣義正態分布。
[0112]圖75說明了通過評估TMPRSS2-ERG表達使用EpCam對來自血漿的前列腺癌細胞源囊泡的捕獲。(A)將漸變量的VCAP純化囊泡摻入正常血漿中。使用具有EPCAM抗體或其同種型對照的Dynal珠分離囊泡。分離來自囊泡的RNA，並使用qRT-PCR測量TMPRSS2:ERG融合轉錄物的表達。(B)將VcaP純化的囊泡摻入到正常血漿中，然後與塗敷有EpCam或同種型對照抗體的Dynal磁珠一起孵育。由Dynal珠上直接分離RNA。使用來自各樣品的等體積RNA來進行RT-PCR以及隨後的Taqman分析。(C)在使用EpCam和IgG2同種型陰性對照珠捕獲的22RV1囊泡之間SPINKl和GAPDH轉錄物的循環閾值(CT)差異。CT值越高表明轉錄物的表達越低。
[0113]圖76說明了在VCaP前列腺癌細胞源囊泡與正常血漿囊泡之間的前10種差異表達的微RNA。通過超速離心、接著通過RNA分離得到VCAP細胞系囊泡和來自正常血漿的囊泡。使用qRT-PCR分析得到微RNA譜。前列腺癌細胞系源囊泡具有較高水平(較低CT值)的所示微RNA，如在柱狀圖中所描述的。
[0114]圖77描述了使用⑶9珠捕獲的miR-21表達的柱狀圖。將得自前列腺癌患者的Iml血漿、250ng/ml的LNCaP或正常的純化囊泡與⑶9塗敷的Dynal珠孵育。由所述的珠和珠上清液中分離RNA。此外，對一份樣品(#6)不進行捕獲以用於比較。使用qRT-PCR測量miR-21的表達，並比較各樣品的平均CT值。⑶9捕獲改善了前列腺癌樣品中miR-21的檢測。
[0115]圖78描述了使用⑶9珠捕獲的miR-141表達的柱狀圖。本實驗按照圖77實施，其中使用qRT-PCR測量miR-141的表達，而並非miR-21。
[0116]圖79是示出了使用對CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3和EpCam的捕獲劑對從樣品(#126)分離的囊泡檢測生物標誌物CD9、CD81和CD63 (A-D)或B7H3和EpCam(E-H)的圖，所述囊泡使用具有 IOOkDa MWCO 的 500 ill 柱(Mi I lipore, Billerica, MA) (A、E)、具有 150kDa MWCO 的 7ml 柱(Pierce?, Rockford, IL) (B、F)、具有 IOOkDa MWCO 的15ml 柱(Millipore, Billerica, MA) (C、G)或具有 150kDa MWCO 的 20ml 柱( Pierce?,Rockford, IL) (D、H)分離。
[0117]圖80 是示出了使用對 CD9、CD63、CD81、PSMA, PCSA, B7H3 和 EpCam 的捕獲劑對從樣品(#342)分離的囊泡的生物標誌物CD9、CD81和CD63 (A-D)或B7H3和EpCam(E-H)進行檢測的圖，所述囊泡使用具有IOOkDa MWCO的500 yl柱(Millipore, Billerica, MA)(A、E)、具有 150kDa MWCO 的 7ml 柱(Pierce?, Rockford, IL) (B、F)、具有 IOOkDa MWCO的 15ml 柱(Millipore, Billerica, MA) (C、G)或具有 150kDa MWCO 的 20ml 柱(Pierce?,Rockford, IL) (D、H)分離。
[0118]圖81是示出了在一種樣品(#126) (A-C)相對另一種樣品(#117) (D-F)的對比中使用對CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA、B7H3和EpCam的捕獲劑對囊泡的生物標誌物CD9、CD81和⑶63或B7H3和EpCam進行檢測的圖，其使用了具有150kDa MWCO的7ml柱(Pierce⑧，Rockford, IL) (A、D)、具有 IOOkDa MWCO 的 15ml 柱(Millipore, Billerica, MA) (B、E)或150kDa MWCO 的 20ml 柱(Pierce?, Rockford, IL) (C、F)。
[0119]圖82是顯示了生物標誌物⑶9、⑶63和⑶81的檢測的圖，其使用了捕獲劑A)⑶9、B)PCSA、OPSMA和D)EpCam。囊泡分離自對照樣品(健康樣品)和前列腺癌樣品，II期前列腺癌(PCa)樣品。與囊泡的超速離心分離相比，通過使用基於柱的過濾分離方法改善了PCa和對照之間的分離。
[0120]圖83描述了分離自患者樣品(#126)的囊泡的各種生物標誌物的檢測水平在使用超速離心與基於過濾器的方法之間的比較，所述基於過濾器的方法使用了具有IOOkDa分子量截止值(MWCO)的500iil柱(Millipore, Billerica, MA)。所述圖描述了 A)超速離心純化的樣品；B)Microcon樣品；C)超速離心純化樣品和IOug Vcap以及D)具有IOugVcap的Microcon樣品。所使用的捕獲劑是CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA, B7H3和EpCam，並且檢測到了 CD9、CD81 和 CD63。
[0121]圖84描述了分離自患者樣品(#342)的囊泡的各種生物標誌物的檢測水平在使用超速離心與基於過濾器的方法之間的比較，所述基於過濾器的方法使用了具有IOOkDaMWCO的500 ill柱(Millipore, Billerica, MA)。所述圖描述了 A)超速離心純化的樣品；B)Microcon樣品；C)超速離心純化樣品和IOug Vcap以及D)具有IOug Vcap的Microcon樣品。所使用的捕獲劑是CD9、CD63、CD81、PSMA、PCSA, B7H3和EpCam，並且檢測到了 CD9、CD81 和 CD63。
[0122]圖85詳細說明了使用MoFlo XDP進行的囊泡分離和鑑定。
[0123]圖86A-86D詳細說明了血漿中囊泡的流式分選。圖86A示出了對前列腺癌患者血漿中PCSA陽性囊泡的檢測和分選。圖86B示出了對正常和前列腺癌患者血漿中⑶45陽性囊泡的檢測和分選。圖86C示出了對正常和乳腺癌患者血漿中⑶45陽性囊泡的檢測和分選。圖86D示出了對正常和前列腺癌患者血漿中DLL4陽性囊泡的檢測和分選。
[0124]圖87是檢測樣品中囊泡的示意圖，其中使用微球平臺評估所希望的囊泡的存在或水平。圖87A是使用基於柱的過濾方法從血漿中分離囊泡的示意圖，其中所述分離的囊泡隨後使用微球平臺進行評估。圖87B是由於諸如超速離心這樣的高速離心而導致囊泡膜壓縮的示意圖。圖87C是使用雷射檢測對結合於微球的囊泡進行檢測的示意圖。
[0125]圖88A詳細說明了囊泡生物印記區分正常前列腺和PCa樣品的能力。癌症標誌物包括EpCam和B7H3。一般囊泡標誌物包括⑶9、⑶81和⑶63。前列腺特異性標誌物包括PCSA。據發現所述測試對於PCa對比正常樣品具有96%的靈敏度和95%的特異性。圖88B在Y軸上示出了正常和前列腺癌患者中圖88A的囊泡標記物的平均螢光強度(MFI)。
[0126]圖89A本發明的囊泡分析對比傳統PCa測試的改善的靈敏度。圖89B詳細說明了本發明的囊泡分析對比傳統PCa測試的改善的特異性。
[0127]圖90詳細說明了使用⑶63對對BPH樣品與正常和PCa樣品的區分。
[0128]圖91詳細說明了囊泡生物印記區分正常前列腺和PCa樣品的能力。癌症標誌物包括EpCam和B7H3。一般囊泡標誌物包括⑶9、⑶81和⑶63。前列腺特異性標誌物包括PCSA。據發現所述測試對於PCa對比正常`和BPH樣品具有98%的靈敏度和84%的特異性。
[0129]圖92詳細說明了用於PCa的本發明囊泡分析對比傳統測試的改善特異性，即使在包括BPH樣品的情況下。
[0130]圖93詳細說明了本發明的囊泡分析對比傳統PCa測試的ROC曲線。
[0131]圖94示出了一般囊泡(如囊泡「MV」 )水平、前列腺特異性MV和具有癌症標誌物的MV的水平之間的相關性。
[0132]圖95詳細說明了在PCa和正常樣品之間顯著不同的囊泡標誌物。
[0133]圖96是A)囊泡前列腺癌分析的示意圖，其產生了決策樹B)、C)、D)以用於確定樣品對於前列腺癌是否為陽性。
[0134]圖97A示出了根據所述決策樹針對前列腺癌的囊泡檢測分析相對於使用提高的PSA水平進行檢測的結果。圖97B示出了根據所述決策樹對933例PCa和非PCa患者樣品的組群進行的針對前列腺癌的囊泡檢測分析的結果。圖97C示出了對應於圖97B中示出的數據的ROC曲線。
[0135]圖98詳細說明了使用聚類分析設定前列腺癌囊泡生物標誌物的MFI閾值。A)149例樣品的原始數據和log轉換數據。所述原始數據在左欄中作圖並且所述轉換數據在右欄中作圖。B)使用log轉換數據作為輸入進行PSMA vs B7H3的聚類分析。圓環(正常)和X(癌症)顯示了發現的兩個聚類。空心大圓環顯示了用作為聚類中心的點。藍線顯示了針對各參數選擇的截止值。C)使用log轉換數據作為輸入進行的PCSA vs B7H3的聚類分析。圓環(正常)和X(癌症)顯示了發現的兩個聚類。空心大圓環顯示了用作聚類中心的點。藍線顯示了針對各參數選擇的截止值。D)使用log轉換數據作為輸入進行的PSMAvsPCSA的聚類分析。圓環和X顯示了發現的兩個聚類。紅色空心大圓環顯示了用作聚類中心的點。藍線示出了針對各參數選擇的截止值。E)將在B-D)中確定的閾值應用於包含313例樣品的更大數據組，並且產生了 92.8%的靈敏度和78.7%的特異性。
[0136]圖99以y軸上示出了評估前列腺癌(癌症)和正常(正常)樣品中的囊泡的平均螢光強度(MFI)。囊泡蛋白生物標誌物在X軸上標示，其從左至右包括⑶9、PSMA, PCSA,CD63、CD81、B7H3、IL-6、OPG-13 (也稱為 0PG)、IL6R、PA2G4、EZH2、RUNX2、SERPINB3 和 EpCam。
[0137]圖100詳細說明了使用抗體陣列進行的BPH相對III期PCa的區分。
[0138]圖101詳細說明了分離自對照和PCa樣品的囊泡中的miR-145水平。
[0139]圖102A-102B詳細說明了分離自對照(非PCa)和前列腺癌樣品的囊泡中的miR-107 (圖102A)和miR-574_3p (圖102B)水平，如在X軸上標明的。使用Taqman分析在分離的囊泡中檢測miR。該圖下方示出了 P值。Y軸示出了檢測到的miR的拷貝數。在圖102B中，將來自各樣品組的兩個離群值樣品排除於分析之外，所述離群值樣品具有遠超樣品偏差的拷貝數。
[0140]圖103A-103D詳細說明了分離自轉移性(Ml)和非轉移性(MO)前列腺癌樣品的囊泡中的 miR-141 (圖 103A)、miR-375 (圖 103B)、miR_200b (圖 103C)和 miR-574_3p (圖103D)的水平。使用Taqman分析檢測分離的囊泡中的miR。
[0141]圖104A-104B詳細說明了使用miR-107和miR141確認來自基於囊泡的前列腺癌診斷分析的假陰性。圖104A詳細說明了使用囊泡中miR的分析以將假陰性轉換成真陽性的示意圖，由此改善了靈敏度。圖104B詳細說明了使用囊泡中miR的分析以將假陽性轉換成為真陰性的示意圖，由此改善特異性。miR-107 (圖104C)和miR-141 (圖104D)的歸一化水平在Y軸上針對所述囊泡診斷分析所得的真陽性(TP)、所述囊泡診斷分析所得的真陰性(TN)、所述囊泡診斷分析所得的假陽性(FP)和所述囊泡診斷分析所得的假陰性(FN)示出。
[0142]圖105A-105F詳細說明了在患有或未患PCa且PSA≤或〈4.0ng/ml的患者中的hsa-miR-432(圖 105A)、hsa_miR-143(圖 105B)、hsa_miR-424(圖 105C)、hsa_miR-204(圖105D)、hsa-miR-581f (圖 105E)和 hsa-miR-451 (圖 105F)升高的柱形圖。使用 Taqman 分析檢測分離的囊泡中的miR。Taqman分析所檢測的miR水平在Y軸上顯示。X軸示出了四個樣品組。從左至右，「對照非」是PSA ^ 4.0的對照患者；「對照是」是PSA〈4.0的對照患者；「患病非」是PSA≤4.0的前列腺癌患者；以及「患病是」是PSA〈4.0的前列腺癌患者。
[0143]圖106詳細說明了在分離自前列腺癌(PCa)和對照的血漿樣品的囊泡中的微RNAmiR-29a 和 miR-145 的水平。
[0144]圖107詳細說明了微珠分析的平板設計布置。
[0145]圖108A-D詳細說明了用於捕獲區分結腸直腸癌(CRC)與正常樣品的囊泡的各種不同捕獲抗體的能力。圖108A說明了 CRC囊泡樣品相對正常樣品的捕獲抗體抗原(X軸)的倍數變化(Y軸)，其根據抗體陣列測定。圖108B與之類似，不同之處在於根據圖例所示，Y軸是CRC和正常樣品中的中位螢光強度。圖108C類似於圖108B，其在另外的樣品組上實施。圖108D示出了使用CD24作為結腸標誌物，TR0P2作為癌症標誌物，並且四跨膜蛋白⑶9、⑶63和⑶81作為一般囊泡標誌物進行的分析。[0146]圖109A-H詳細說明了通過使用TMEM211和/或⑶24檢測囊泡從而在血漿樣品中檢測CRC。圖109A詳細說明了使用生物標誌物TMEM211進行的本發明的囊泡分析的ROC曲線分析。圖109B詳細說明了使用生物標誌物CD24進行的本發明的囊泡分析的ROC曲線分析。圖109C詳細說明了對於正常、患有結腸直腸癌(CRC)的受試者和混淆者的本發明囊泡分析方法的分析。圖109D詳細說明了在後續研究中使用生物標誌物TMEM211針對正常、患有結腸直腸癌(CRC)的受試者和混淆者的囊泡樣品分析。圖109E詳細說明了使用生物標誌物TMEM211進行的本發明囊泡分析的ROC曲線分析。圖109F-109H詳細說明了來自具有擴大的患者組群進行的另外研究的結果。在圖109F中，TMEM211的中位螢光強度(MFI)在X軸上示出，並且⑶24的MFI在Y軸上示出。TMEM211和⑶24單獨地用於區分各種不同類樣品的結果分別在圖109G和圖109H中示出。
[0147]圖110詳細說明了結腸直腸癌(CRC)細胞系對正常囊泡的TaqMan低密度陣列(TLDA)miRNA卡比較。CRC細胞系在圖右側標出。Y軸顯示了 CRC細胞系與正常對照相比表達上的倍數變化。受監測的miRNA在X軸上標出，並且從左至右為miR-548c-5p、miR-362-3p、miR-422a、miR-597、miR-429、miR-200a 和 miR_200b。對於各個 miR，從左至右的柱形對應於細胞系L0V0、HT29、SW260、C0L0205、HCTl 16和RK0。這些miRNA在正常或黑色素瘤細胞中未過表達。
[0148]圖1llA詳細說明了使用miR92和miR491對正常和CRC樣品的區分。圖1llB詳細說明了使用miR92和miR21對正常和CRC樣品的區分。圖1llC詳細說明了使用miR92、miR21、miR9和miR491的復用對正常和CRC樣品的區分。
[0149]圖112詳細說明了結腸直腸癌(CRC)細胞系和患者樣品中的KRAS測序。樣品包含獲自細胞系(B)或從來自所述患者的組織樣品(D)獲得的基因組DNA，或獲自從所述細胞系(A)脫落的或來自所述患者(C)的血漿樣品中囊泡中的RNA有效負載的cDNA。
[0150]圖113詳細說明了通過檢測來自血漿樣品的微囊泡中的TMEM211和MUCl而對CRC的辨別。X軸(MUCl)和 Y軸(TMEM211)對應於所述樣品中被檢測囊泡的中位螢光強度(MFI)。水平和垂直線分別是針對TMEM211和MUCl而檢測CRC的MFI閾值。
[0151]圖114A詳細說明了描述在乳腺癌患者樣品(n=10)或正常對照(即，無乳腺癌)中檢測到的生物標誌物的超出正常值的倍數變化。使用系留於珠上的所標示抗原的抗體捕獲血漿樣品中的囊泡。使用針對四跨膜蛋白⑶9、⑶63和⑶81的標記抗體檢測所捕獲的囊泡。Y軸上的倍數變化是在所述乳腺癌樣品中檢測到的囊泡與正常樣品相比較的中位螢光強度(MFI)的倍數變化。圖114B詳細說明了在源自乳腺癌細胞系MCF7、T47D和MDA的囊泡中檢測到的各種不同生物標誌物的水平。T47D和MDA是轉移性細胞系。
[0152]圖115A詳細說明了來自肺癌樣品的膜囊泡中的各種不同生物標誌物與正常樣品相比較的倍數變化，其使用針對所標出的囊泡抗原的抗體進行檢測。黑色柱是肺癌樣品與正常樣品的比率。白色柱是非肺癌樣品與正常樣品的比率。下劃線標出的數據在圖115B中示出。圖115B說明了使用針對所標示的囊泡抗原的抗體檢測的膜囊泡螢光水平。螢光水平是來自以下樣品的平均值:正常(白色)、非肺癌樣品(灰色)以及分期肺癌樣品(黑色)。圖115C示出了使用EPHA2(i)、CD24(ii)、EGFR(iii)和CEA(iV)在來自肺癌患者和正常對照的樣品中進行的囊泡檢測的中位螢光強度(MFI)。圖11?和圖115E在Y軸上給出了在來自肺癌和正常(非肺癌)受試者的樣品中檢測到的囊泡的平均螢光強度(MFI)。捕獲抗體沿X軸標出。圖115F示出了由CENPH (縱軸)、PRO GRP (最左邊的橫軸)和MMP9 (最右邊的橫軸)組成的三生物標誌物組的三維圖。圖上癌症用空心正方形指示，而正常用實心三角形指示。
[0153]圖116給出了使用所標出的用於檢測囊泡的捕獲抗體以檢測肺癌的決策樹。
[0154]圖117A詳細說明了源自血漿的囊泡中相對於循環腫瘤細胞(CTC)的⑶81標記的囊泡水平比照腫瘤細胞(CTC)。以受到計數的⑶81和CTC測量了對於收集自患者(14例最左側的「CTC」樣品)和正常血漿(4例最右側樣品)的囊泡，對以⑶81和CTC測量的囊泡進行計數。圖117B詳細說明了源自EpCAM+血漿的囊泡中相對於CTC的miR-21拷貝數。示出了患者樣品(15例最左側的「CTC」樣品)和正常樣品(7例最右側的「正常」樣品)。通過來自RNA的miR-21qRT-PCR評估拷貝數，所述RNA提取自源於EpCAM+血漿的囊泡。CTC計數獲自相同樣品。
[0155]圖118A-118C詳細說明了來自乳腺癌患者的血漿中的囊泡水平，其在從所述樣品耗盡CD31+陽性囊泡後使用針對⑶31 (圖118A)、DLL4(118B)和CD9 (圖118C)的抗體進行檢測。
[0156]圖119詳細說明了對在來自正常(非癌症)血漿樣品、乳腺癌(BCa)血漿樣品和前列腺癌(PCa)血漿樣品的囊泡內的組織因子(TF)的檢測。使用系留於微球上的抗組織因子抗體捕獲血漿樣品中的囊泡。使用針對四跨膜蛋白⑶9、⑶63和⑶81的標記抗體檢測所捕獲的囊泡。
[0157]圖120示出了用FITC偶聯的、針對所示囊泡抗原的抗體所標記的囊泡的流式分選。(A)來自結腸直腸癌(CRC)患者和無CRC的正常者的⑶9/⑶63FITC標記的囊泡針對CD31和DLL4水平進行門控(gated)。(B)來自正常者和CRC患者的CD9/CD63FITC標記的囊泡針對TMEM211和DLL4水平進行門控。(C)來自正常者和乳腺癌患者的⑶9FITC標記的囊泡針對⑶31和DLL4水平進行門控`。
[0158]圖121詳細說明了描述正常個體和患有各種癌症的個體的血漿中DLL4捕獲的循環微囊泡(cMV)水平的圖。血漿樣品中的囊泡用系留於微珠上的抗DLL4抗體捕獲。捕獲的囊泡用針對四跨膜蛋白⑶9、⑶63和⑶81的標記的抗體檢測。囊泡的中位螢光強度(MFI)示於Y軸上。樣品組在X軸上示出，從左到右包括:正常對照(「正常」；即，非癌症)、乳腺癌(「乳腺」)、非癌(「肺」)、前列腺癌(「前列腺」)、結腸直腸癌(「結腸直腸」)、腎癌(「腎」)、卵巢癌(「卵巢」)和胰腺癌(「胰腺」)。
[0159]圖122A-C詳細說明了微RNA miR-497在患者血液樣品中區分肺癌和正常(非肺癌)樣品的能力。Y軸示出了在0.1ml樣品中miR-497的拷貝數。在圖122A中，水平線代表1154份拷貝的拷貝數。在圖122B中，水平線代表1356的拷貝數。圖122C是通過檢測循環微囊泡(cMV)中的miR-497水平用於區分非小細胞肺癌和正常血漿樣品的受試者工作特徵(ROC)曲線。數據對應於圖122B。
[0160]圖123A和123B詳細說明了在一組癌症和非癌症樣品中⑶9陽性(⑶9+)囊泡的檢測。Y軸示出了用抗⑶9抗體捕獲的且用針對⑶9、⑶63和⑶81的標記抗體檢測的囊泡的平均螢光強度(MFI)。圖123A示出了所有癌症作為一組與非癌症(正常)的比較。圖123B不出了單獨的癌症與非癌症的比較。
[0161]圖124A-124E詳細說明了使用囊泡表面標誌物檢測區分乳腺癌。圖中示出了通過用所示標誌物檢測囊泡獲得的中位螢光值(MFI)。垂直和水平線代表用以針對每種標誌物分離樣品組(例如分離癌症與非癌症)的MFI截止值。圖124A詳細說明了利用第一組截止值使用Gal3和BCA200在癌症和非癌症患者之間區分乳腺癌。圖124B詳細說明了利用第二組截止值使用Gal3和BCA200在癌症和非癌症患者之間區分乳腺癌。圖124C詳細說明了使用額外的混淆者樣品，利用Gal3和BCA200對乳腺癌的檢測。圖124D詳細說明了使用OPN和NCAM在癌症和混淆患者之間區分乳腺癌。圖124E詳細說明了用於區分乳腺癌的兩步程序。首先，如最左邊的圖所不，利用Gal3和BCA200區分樣品。然後如最右邊的圖所示，用OPN和NCAM評估在被標記為「陽性」的象限中的樣品，以分離假陽性混淆患者。
[0162]圖125A-125C示出了在乳腺癌和健康患者中cMV的FACS篩選的圖。用於cMV染色的標誌物在圖中示出。圖125A示出了使用免疫抑制標誌物⑶45 (y軸)和CTL4A (x軸)的染色。圖125B示出了使用轉移標誌物MMP-7(y軸)和TMP-Ux軸)的染色。圖125C示出了使用血管生成標誌物⑶31 (y軸)和VEGFR2 (x軸)的染色。
[0163]圖126A-126B詳細說明了使用DNA微陣列表達數據對乳腺癌和其它癌症的分類。樣品1-30為乳腺癌樣品。樣品31-60為非乳腺來源的癌症。在圖126A中，利用廣義LASSO回歸將樣品分類。用於建立分類器模型的三種基因轉錄物包括DST.3、GATA3和KRT81。在圖126B中，使用貝葉斯集成(Bayesian Ensemble)法將樣品分類。用於建立該模型的十五種基因轉錄物包括 AK5.2、ATP6V1B1、CRABPU DST.3、ELF5、GATA3、KRT81、LALBA, 0XTR、RASL10A、SERHL, TFAP2A.1、TFAP2A.3、TFAP2C 和 VTCNl。
發明詳述
[0164]本文公開了用於表徵生物樣品(如，來自細胞培養物、生物體或受試者的樣品)的表型的方法和系統。可通過評估一種或多種生物標誌物表徵所述表型。所述生物標誌物可與囊泡或囊泡群體關聯，其為存在的囊泡表面抗原或囊泡有效負載。如本文所使用的，囊泡有效負載包含封裝於囊泡內的實體。囊泡相關的生物標誌物可包含膜結合的和可溶的生物標誌物。所述生物標誌物還可以是循環生物標誌物，諸如在體液中評估的微RNA或蛋白質。除非另行說明，本文中提及囊泡或生物標誌物組分而使用的術語「純化的」或「分離的」指的是這些組分從細胞或生物體中部分的或完全的純化和分離。此外，除非另行說明，所稱的使用結合劑進行的囊泡分離包括將囊泡與所述結合劑結合，無論該結合是否使得所述囊泡與起始材料中的其它生物實體的完全分離。
[0165]通過分析循環生物標誌物(如核酸生物標誌物)而表徵表型的方法描述於圖61A的方案6100A中，其為非限制性說明實例。在第一步驟6101中獲得生物樣品，如體液、組織樣品或細胞培養物。從所述樣品中分離核酸6103。所述核酸可以是DNA或RNA，如微RNA。對這些核酸的評估可提供該表型的生物印記。通過對與目標表型(如疾病對比健康、治療前和治療後)相關的核酸取樣，可測定作為表型的指示的一種或多種核酸標誌物。本發明的各個方面涉及通過評估在所述樣品中存在的一種或多種核酸分子(如微RNA)而確定生物印記6105，其中所述生物印記對應於預定的表型6107。圖61B詳細說明了使用囊泡分離所述核酸分子的方案6100B。在一個實施例中，獲得了生物樣品6102，並且從所述樣品中分離一種或多種囊泡6104，如來自特定細胞源的囊泡和/或與特定疾病狀態相關的囊泡。通過表徵與所述囊泡關聯的表面抗原和/或測定所述囊泡中存在的組分(「有效負載」)的存在或水平而分析所述囊泡6106。除非另行說明，本文所使用的術語「抗原」通常指的是可被結合劑(又稱結合試劑)結合的生物標誌物，無論所述結合劑是抗體、適體、凝集素或用於所述生物標誌物的其它結合劑，並且無論這些生物標誌物是否在宿主中引發免疫應答。囊泡有效負載可以是蛋白質(包括肽和多肽)和/或核酸(如DNA和RNA)。RNA有效負載包括信使RNA(mRNA)和微RNA(本文中亦稱為miRNA或miR)。根據所述囊泡的生物印記表徵表型6108。在本發明的另一個說明性方法中，方案6100A和6100B —起實施以表徵表型。在這樣的方案中，評估了囊泡和核酸(如微RNA)，從而表徵所述表型。
[0166]在一個相關的方面，本文提供了用於發現生物標誌物的方法，其包括評估一個樣品中的囊泡表面標誌物或有效負載標誌物以及將所述標誌物與另一樣品進行比較。在所述樣品之間區分的標誌物可用作本發明的生物標誌物。這些樣品可以來自受試者或受試者組。例如，所述組可以是，例如，對於給定疾病或失調的給定治療的已知響應者和非響應者。發現區分所述已知響應者和非響應者的生物標誌物提供了關於受試者是否可能對治療(諸如治療劑，如藥物或生物製品)有反應的生物印記。
表型
[0167]本文公開了通過分析囊泡(諸如膜囊泡)來表徵個體的表型的產品和方法。表型可以為受試者的任何可觀察的特徵或性狀，例如疾病或狀況、疾病階段或狀況階段、疾病或狀況的易感性、疾病階段或狀況的預後、生理狀態或對治療的反應。表型可以由受試者的基因表達及環境因素的影響以及這二者之間的相互作用引起，以及由對核酸序列的外遺傳修飾引起。
[0168]受試者中的表型可以通過從受試者獲得生物樣品並分析所述樣品中的一種或多種囊泡來表徵。例如，表徵受試者或個體的表型可以包括檢測疾病或狀況(包括症狀前的早期階段檢測)，確定疾病或狀況的預後、診斷或治療診斷，或者確定疾病或狀況的階段或進程。表徵表型還可以包括鑑定針對特定疾病、狀況、疾病階段或狀況階段的適當治療或治療效力、疾病進展的預測和可能性分析，特別是疾病復發、轉移擴散或疾病惡化。表型還可以為狀況或疾病(例如癌症或腫 瘤)的臨床上獨特的類型或亞型。表型的確定還可以為生理狀況的確定、器官危境或器官排斥(例如移植後)的評估。本文所述的產品和方法可以在個體的基礎上評估受試者，其可以提供在治療中的更有效和更經濟的決策的益處。
[0169]在一個方面，本發明涉及囊泡分析以提供預測受試者是否可能對疾病或失調的治療有反應的生物印記。表徵表型包括預測所述受試者的響應者/非響應者狀態，其中響應者對疾病的治療有反應而非響應者對所述治療無反應。可在所述受試者中分析囊泡並與已知對治療有反應或沒有反應的先前受試者的囊泡分析進行比較。如果所述受試者中的囊泡生物印記與已知對所述治療有反應的先前受試者更為接近，則所述受試者可表徵或預測為所述治療的響應者。類似地，如果所述受試者中的囊泡生物印記與已知對所述治療無反應的此前受試者更為接近，則所述受試者可表徵或預測為所述治療的非響應者。所述治療可以針對任意適當的疾病、失調或其它狀況。在與響應者/非響應者狀態相關的囊泡生物印記已知的情況下，所述方法可用於任意疾病情況中。
[0170]本發明所使用的術語「表型」可以指貢獻於囊泡生物印記的任何性狀或特徵，該生物印記使用本發明的方法而鑑定。例如，表型可以是受試者可能對治療有反應的標識，或更廣義地其可為治療診斷基於針對獲自受試者的樣品鑑定的生物印記的診斷、預後或治療診斷確定。[0171]本文所使用的術語「檢測(detect)」(包括其變化，例如，「檢測(detecting)」)可意指確定候選生物標誌物(例如，核酸、多肽或其功能性片段)在一個生物樣品或一系列生物樣品中的存在或水平。在實施方案中，從受試者中獲得一個樣品或多個樣品以便檢測狀況或疾病或檢測狀況或疾病的可能性。關於生物標誌物的術語「功能性片段」可意指生物標誌物的伸展或片段，它是可鑑定的，且可小於整個或完整的序列，但是足以檢測生物標誌物是否存在和/或生物標誌物存在的水平。例如，功能性片段可為可鑑定的多肽片段或核酸分子序列。
[0172]在一些實施方案中，所述的表型包括疾病或狀況如表1中所列的那些。例如，所述的表型可包括腫瘤、贅生物或癌症的存在或發生腫瘤、贅生物或癌症的可能性。通過本文所述的產品或方法檢測或評估的癌症包括但不限於乳腺癌、卵巢癌、肺癌、結腸癌、增生性息肉、腺瘤、結腸直腸癌、高度異型增生(high grade dysplasia)、低度異型增生(low gradedysplasia)、前列腺增生、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、腦癌(例如成膠質細胞瘤)、血液惡性腫瘤、肝細胞癌、宮頸癌、子宮內膜癌、頭頸癌、食管癌、胃腸道間質瘤(GIST)、腎細胞癌(RCC)或胃癌。所述的結腸直腸癌可以為CRC Dukes B或CRC Dukes C-D0所述的血液惡性腫瘤可以為B細胞慢性淋巴細胞性白血病、B細胞淋巴瘤-DLBCUB細胞淋巴瘤-DLBCL-生發中心樣、B細胞淋巴瘤-DLBCL-活化B細胞樣以及伯基特氏淋巴瘤。
[0173]所述表型可以是惡變前狀況，諸如光化性角化病、萎縮性胃炎、白斑病、增殖性紅斑、淋巴瘤樣肉芽腫病、白血病前期、纖維症、宮頸非典型增生、子宮頸非典型增生、著色性幹皮病、巴雷特食管、結腸直腸息肉或有可能發展成為惡性腫瘤的其它異常組織生長或病灶。諸如HIV和HPV的轉化型病毒感染也提供了可根據本發明進行評估的表型。
[0174]通過本發明的方法表徵的癌症可包括但不限於，癌瘤、肉瘤、淋巴瘤或白血病、生殖細胞瘤、胚細胞瘤或其它癌症。癌瘤包括但不限於，上皮贅生物、鱗狀細胞贅生物鱗狀細胞癌、基底細胞贅生物基底細胞癌、移行細胞乳頭狀瘤和癌、腺瘤和腺癌(腺體)、腺瘤、腺癌、革囊胃胰島瘤(linitis plastica insulinoma)、高血糖素瘤、胃泌素瘤、血管活性腸肽瘤、膽管癌、肝細胞癌、囊性腺樣癌、闌尾類癌瘤、泌乳素瘤、大嗜酸粒細胞瘤、許特萊氏細胞腺瘤(hurthle cell a denoma)、腎細胞癌、格拉維茨瘤(grawitz tumor)、多發性內分泌腺瘤、子宮內膜腺瘤、附件和皮膚附件贅生物、粘液表皮樣贅生物、囊性、粘液性和漿液性贅生物、囊腺瘤、腹膜假粘液瘤、導管、小葉和髓質贅生物、腺泡細胞贅生物、複合上皮贅生物、沃辛腫瘤(warthin』 s tumor)、胸腺瘤、特化生殖腺贅生物、性索間質瘤、泡膜細胞瘤、粒膜細胞瘤、卵巢含睪丸母細胞瘤、支持細胞睪丸間質細胞瘤、血管球瘤、副神經節瘤、嗜鉻細胞瘤、血管神經肌瘤、痣與黑色素瘤、黑素細胞痣、惡性黑色素瘤、黑色素瘤、結節性黑色素瘤、發育不良痣、惡性痣性黑色素瘤、淺表擴散性黑色素瘤以及惡性肢端著色斑性黑色素瘤。肉瘤包括但不限於，Askin腫瘤、葡萄狀肉瘤(botryodies)、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、惡性血管內皮細胞瘤、惡性神經鞘瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤,其包括:腺泡狀軟組織肉瘤、血管肉瘤、葉狀囊肉瘤、皮膚纖維肉瘤、硬纖維瘤、促結締組織增生性小圓形細胞瘤、上皮樣肉瘤、骨外軟骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纖維肉瘤、血管外皮細胞瘤、血管肉瘤、卡波濟氏肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、神經纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和滑膜肉瘤。淋巴瘤和白血病包括但不限於，慢性淋巴細胞性白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤、B細胞幼淋巴細胞性白血病、淋巴眾細胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)(諸如胃aldenstrdm巨球蛋白血症)、脾邊緣區淋巴瘤、眾細胞骨髓瘤、眾細胞瘤、單克隆免疫球蛋白沉積病、重鏈病、亦稱為malt淋巴瘤的結外邊緣區B細胞淋巴瘤、結節性邊緣區B細胞淋巴瘤(nmzl)、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、縱隔(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤/白血病、T細胞幼淋巴細胞性白血病、T細胞大顆粒淋巴細胞白血病、侵襲性NK細胞白血病、成人T細胞性白血病/淋巴瘤、結外NK/T細胞淋巴瘤，鼻型、腸病型T細胞淋巴瘤、肝脾T細胞淋巴瘤、母細胞性NK細胞淋巴瘤、蕈樣黴菌病/塞澤裡症候群(sezary syndrome)、原發性皮膚⑶30陽性T細胞淋巴組織增生性疾病、原發性皮膚間變性大細胞淋巴瘤、淋巴瘤樣丘疹病、血管免疫母細胞性T細胞淋巴瘤、外周T細胞淋巴瘤、非指定、間變性大細胞淋巴瘤、典型霍奇金淋巴瘤(結節性硬化、混合細胞性、富淋巴細胞、淋巴細胞耗盡或非耗盡)以及結節性淋巴細胞為主型霍奇金淋巴瘤。生殖細胞腫瘤包括但不限於，生殖細胞瘤、無性細胞瘤、精原細胞瘤、非生殖細胞瘤性生殖細胞瘤、胚胎癌、內胚竇腫瘤、絨毛膜癌、畸胎瘤、多胚瘤和成性腺細胞瘤。胚細胞瘤包括但不限於，腎母細胞瘤、成神經管細胞瘤和視網膜母細胞瘤。其它癌症包括但不限於，唇癌、喉癌、咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲狀腺癌(延髓和乳頭狀甲狀腺癌)、腎癌、腎實質癌、子宮頸癌、子宮體癌、子宮內膜癌、絨毛膜癌、睪丸癌、泌尿系癌、黑色素瘤、腦腫瘤(如膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、腦膜瘤、髓母細胞瘤和外周神經外胚層腫瘤)、膽囊癌、支氣管癌、多發性骨髓瘤、基底細胞癌、畸胎瘤、視網膜母細胞瘤、脈絡膜黑色素瘤、精原細胞瘤、橫紋肌肉瘤、盧頁咽管瘤(craniopharyngeoma)、骨肉瘤、軟骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤、尤文氏肉瘤和漿細胞瘤。
[0175]在進一步的實施方案中，進行分析的癌症可以是肺癌，其包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌(包括小細胞癌(燕麥細胞癌)、小細胞/大細胞混合癌以及複合性小細胞癌)、結腸癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、腦癌、腎癌、卵巢癌、胃癌、皮膚癌、骨癌、胃的癌、乳腺癌、胰腺癌、膠質細胞瘤、膠質母細胞瘤、肝細胞癌、乳頭狀癌腎癌、頭頸部鱗狀細胞癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或實體腫瘤。
[0176]在實施方案中，所述癌症包括急性成淋巴細胞性白血病；急性骨髓性白血病；腎上腺皮質癌；AIDS相關癌症；AIDS相關淋巴瘤；肛門癌；闌尾癌；星形細胞瘤；非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；基底細胞癌；膀胱癌；腦幹膠質瘤；腦腫瘤(包括腦幹膠質瘤、中樞神經系統非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤、中樞神經系統胚胎樣瘤、星形細胞瘤、顱咽管瘤、成室管膜母細胞瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果體實質腫瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤和成松果體細胞瘤)；乳腺癌；支氣管腫瘤；伯基特氏淋巴瘤；原發部位不明癌；類癌瘤；原發部位不明腫瘤；中樞神經系統非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；中樞神經系統胚胎性腫瘤；宮頸癌；兒童期癌症；脊索瘤；慢性淋巴細胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增殖紊亂；結腸癌；結腸直腸癌；顱咽管瘤；皮膚T細胞淋巴瘤；內分泌胰島細胞瘤；子宮內膜癌；成室管膜母細胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感覺神經細胞瘤(esthesioneuroblastoma);尤文氏肉瘤；頡外生殖細胞瘤；性腺外生殖細胞腫瘤；肝外膽管癌；膽囊癌；胃的(胃)癌；胃腸道類癌腫瘤；胃腸道間質細胞瘤；胃腸道間質瘤(GIST)；妊娠滋養細胞腫瘤；神經膠質瘤；毛細胞白血病；頭頸癌；心臟癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼內黑色素瘤；胰島細胞瘤；卡波濟氏肉瘤；腎癌；朗格漢斯細胞組織細胞增生症；喉癌；唇癌；肝癌；惡性纖維組織細胞瘤骨癌；髓母細胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel細胞癌；Merkel細胞皮膚癌；間皮瘤；隱匿原發性的轉移性鱗狀頸癌；口腔癌；多發性內分泌腫瘤症候群；多發性骨髓瘤；多發性骨髓瘤/漿細胞贅生物；蕈樣肉芽腫；骨髓發育異常症候群；骨髓增生性贅生物；鼻腔癌；鼻咽癌；神經母細胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮膚癌；非小細胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它腦和脊髓腫瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖細胞腫瘤；卵巢低惡性潛在腫瘤；胰腺癌；乳頭狀瘤病；副鼻竇癌；甲狀旁腺癌；盆腔癌；陰莖癌；咽癌；中度分化的松果體實質腫瘤；成松果體細胞瘤；垂體瘤；漿細胞贅生物/多發性骨髓瘤；胸膜肺母細胞瘤；原發性中樞神經系統(CNS)淋巴瘤；原發性肝細胞肝癌；前列腺癌；直腸癌；腎癌；腎細胞(腎)癌；腎細胞癌；呼吸道癌；視網膜母細胞瘤；橫紋肌肉瘤；唾液腺癌症；S6zary症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟組織肉瘤；鱗狀細胞癌；鱗狀頸癌?』胃(胃的)癌；幕上原始神經外胚層腫瘤；T細胞淋巴瘤；睪丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲狀腺癌；移行細胞癌；腎盂和輸尿管的移行細胞癌；滋養細胞腫瘤；輸尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉瘤；陰道癌；外陰癌；Waldenstr6m臣球蛋白血症或腎母細胞瘤。本發明的方法可用於表徵這些及其它癌症。因此，對表型的表徵可提供本文公開的癌症之一的診斷、預後和治療診斷。
[0177]所述的表型還可以為炎性疾病、免疫疾病或自身免疫疾病。例如，所述的疾病可以為炎性腸病(IBD)、克羅恩氏病(⑶)、潰瘍性結腸炎(UC)、盆腔炎症、脈管炎、銀屑病、糖尿病、自身免疫性肝炎、多發性硬化症、重症肌無力、I型糖尿病、類風溼性關節炎、牛皮癬、系統性紅斑狼瘡(SLE)、橋本甲狀腺炎、格雷夫斯病、強直性脊柱炎、Sjogrens病、CREST症候群、硬皮病、風溼病、器官排斥反應、原發性硬化性膽管炎或膿毒症。
[0178]所述的表型還可以包括心血管疾病，例如動脈粥樣硬化、充血性心力衰竭、易損斑塊、中風或局部缺血。所述的心血管疾病或狀況可以為高血壓、狹窄症、血管阻塞或血栓形成事件。
[0179]所述的表型還可以包括神經疾病，例如多發性硬化症(MS)、帕金森氏病(PD)、阿爾茲海默氏病(AD)、精神分裂症、雙相型障礙、抑鬱症、孤獨症、朊病毒病、皮克病、痴呆、亨廷頓病(HD)、唐氏症候群、腦血管 疾病、Rasmussen腦炎、病毒性腦膜炎、神經精神性系統性紅斑狼瘡(NPSLE)、肌萎縮性脊髓側索硬化症、克雅氏病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、傳染性海綿狀腦病、缺血再灌注損傷(例如中風)、腦外傷、微生物感染或慢性疲勞症候群。所述的表型還可以為諸如纖維肌痛、慢性神經病理性疼痛或周圍神經病理性疼痛的狀況。
[0180]所述的表型還可以包括感染性疾病，例如細菌、病毒或酵母菌感染。例如，所述的疾病或狀況可以為惠普爾氏病、朊病毒病、肝硬化、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、HIV、肝炎、梅毒、腦膜炎、瘧疾、結核病或流行性感冒。可以評估囊泡中的病毒蛋白質(例如HIV或HCV樣顆粒)從而表徵病毒狀況。
[0181]所述的表型還可以包括圍產期或妊娠相關的狀況(例如先兆性子癇或早產)、代謝疾病或狀況(例如與鐵代謝有關的代謝疾病或狀況)。例如，可以測定在囊泡中的鐵調素(hepcidin)從而表徵鐵缺乏。所述的代謝疾病或狀況還可以為糖尿病、炎症或圍產期狀況。
[0182]本發明的方法可用於表徵這些疾病或失調以及可通過生物標誌物評估的其它疾病或失調。因此，對表型的表徵可提供對本文公開的疾病或失調之一的診斷、預後和治療診斷。
受試者[0183]可通過分析從受試者獲得的生物樣品中的一種或多種囊泡(如多種囊泡)來確定受試者的一種或多種表型。受試者或患者可以包括但不限於哺乳動物，例如牛、鳥、犬、馬、貓、綿羊、豬或靈長動物(包括人及非人靈長動物)。受試者還可以包括:由於瀕危而變得重要的哺乳動物，例如西伯利亞虎；或者具有經濟意義的動物(例如用於人消費的農場飼養動物)，或對人類而言具有社會意義的動物(例如作為寵物或在動物園中飼養的動物)。此類動物的實例包括但不限於:食肉動物，例如貓和狗；豬，包括畜養豬、食用豬和野豬；反芻動物或有蹄類動物，例如牛、公牛、綿羊、長頸鹿、鹿、山羊、野牛、駱駝或馬。此外，還包括瀕危的或在動物園中飼養的鳥；以及禽類，更特別的是家養的禽類，即，家禽，例如火雞和雞、鴨、鵝、珍珠雞。還包括家養的豬和馬(包括賽馬)。此外，與商業活動有關的任何動物種類也都被包括在內，例如與農業、水產業和其它活動有關的動物，所述行業中為了經濟生產率和/或食物鏈的安全，疾病監測、診斷和療法的選擇是常規措施。
[0184]所述的受試者可以患有此前存在的疾病或狀況，例如癌症。或者，所述的受試者可以並未患任何已知的此前存在的狀況。所述的受試者還可以對現有或過去的治療是非反應性的，例如對癌症的治療是非反應性的。
樣品
[0185]得自所述受試者的生物樣品可以為任何體液。例如，所述的生物樣品可以為外周血、血清、血漿、腹水、尿、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聹、母乳、支氣管肺泡灌洗液、精液(包括前列腺液)、考珀液或射精前液、女性射出液、汗液、糞便物、毛髮、淚液、囊液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、膽汁、間隙液、經血、膿液、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、黏膜分泌物、糞便水、胰液、竇腔灌洗液、支氣管肺抽吸液或其它灌洗液。生物樣品還可以包括囊胚腔、臍帶血或母體循環血(其可以為胎兒來源或母體來源的)。所述的生物樣品還可以為組織樣品或活體組織，從中可獲得囊泡和其它循環生物標誌物。例如，可以培養得自樣品的細胞，並且從所述培養物中分離囊泡(例如參見實施例1)。在各個實施方案中，可由這些生物樣品直接評估本發明公開的生物標誌物或更特別地生物印記(如，對核酸或多肽生物標誌物或其功能性片段的存在或水平的鑑定)，其使用各種方法，諸如，從血液、血漿、血清或任意前述生物樣品中提取核酸分子，使用蛋白質或抗體陣列鑑定多肽(或功能性片段)生物標誌物，以及本領域中已知用於鑑定與評估核酸和多肽分子的其它陣列、測序、PCR和蛋白質組技術。
[0186]表1列出了疾病、狀況或生物學狀態的說明性實例，以及可以對其中的囊泡進行分析的生物樣品的相應列表。
表1:用於分析與各種疾病、狀況或生物學狀態相關的循環生物標誌物的生物樣品的
實例
【權利要求】
1.一種檢測生物樣品中的一種或多種生物標誌物的方法，其包括: (a)使生物樣品與設計用於確定所述一種或多種生物標誌物的存在或水平的試劑接觸，其中所述一種或多種生物標誌物選自圖1-60或表3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、67、69-71、73-85、89-92任一個中的生物標誌物及其組合；及 (b)鑑定所述生物樣品中的所述一種或多種生物標誌物，從而檢測所述生物樣品中的所述一種或多種生物標誌物。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述生物樣品包括生物流體。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述生物流體包含外周血、血清、血漿、腹水、尿液、腦脊液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聹、母乳、支氣管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液或射精前液、女性射出液、汗液、糞便物、毛髮、淚液、囊液、胸膜液和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、膽汁、間隙液、經血、膿、皮脂、嘔吐物、陰道分泌物、黏膜分泌物、糞便水、胰液、竇腔灌洗液、支氣管肺抽出物、囊胚腔液或臍帶血。
4.如權利要求2所述的方法，其中所述生物流體包含血液或血液衍生物。
5.如任一前述權利要求所述的方法，其中所述生物樣品包含細胞外微囊泡群體。
6.如權利要求5所述的方法，其中所述微囊泡群體包含具有IOnm至1000nm的直徑的微囊泡。
7.如權利要求5所述 的方法，其中所述微囊泡群體包含具有20nm至200nm的直徑的微囊泡。
8.如權利要求5所述的方法，其中在所述鑑定步驟之前將所述微囊泡群體從所述生物樣品中分離出來。
9.如權利要求8所述的方法，其中所述分離包括大小排阻色譜法、密度梯度離心、差速離心、納米膜超濾、免疫吸附捕獲、親和選擇、親和純化、親和捕獲、免疫測定、免疫沉澱、微流體分離、流式細胞術或其組合。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述親和選擇包括使所述微囊泡群體與一種或多種結合劑接觸。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述一種或多種結合劑包含核酸、DNA分子、RNA分子、抗體、抗體片段、適體、類肽、zDNA、肽核酸(PM)、鎖定核酸(LNA)、凝集素、肽、樹狀聚體、膜蛋白標記劑、化學化合物或其組合。
12.如權利要求10所述的方法，其中所述一種或多種結合劑用於捕獲和/或檢測所述微囊泡群體。
13.如權利要求10所述的方法，其中所述一種或多種結合劑特異性地結合選自四跨膜蛋白、CD9、CD31、CD63、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab_5b、膜聯蛋白 V、MFG_E8、圖 1-60 或表3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、67、69-71、73-85、89-92 任一個中的生物標誌物及其組合的微囊泡表面標誌物。
14.如權利要求12所述的方法，其中所述一種或多種結合劑結合至基底。
15.如權利要求13所述的方法，其中所述基底包括孔、微珠和/或陣列。
16.如權利要求12所述的方法，其中一種或多種結合劑具有標記。
17.如權利要求16所述的方法，其中所述標記選自磁標記、螢光標記、酶標記、放射性同位素、量子點或其組合。
18.如任一前述權利要求所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物包含多肽或其功能性片段。
19.如任一前述權利要求所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物包含微囊泡表面抗原或其功能性片段。
20.如權利要求1-17中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物包含核酸或其功能性片段。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述核酸包含mRNA。
22.如權利要求20所述的方法，其中所述核酸包含微RNA。
23.如任一前述權利要求所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物包含多肽和核酸分子，或其功能性片段。
24.如權利要求18-21或23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物包含 CD9。
25.如權利要求18-21或23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自Gal3、BCA200及其組合。
26.如權利要求18-21或23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自OPN、NCAM及其組合。
27. 如權利要求18-21或23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自 Gal3、BCA200、OPN, NCAM 及其組合。
28.如權利要求18-21或23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自Gal3和/或BCA200、OPN和/或NCAM及其組合。
29.如權利要求18-21或23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自四跨膜蛋白、CD45、FasL, CTLA4、CD31、DLL4、VEGFR2、HIF2a、Tie2、Angl、Mucl、CD147、TMP1、TMP2、MMP7、MMP9 及其組合。
30.如權利要求18-21或23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自 CD83 和 FasL, CTLA4 和 CD80、CD 147 和 TIMPU TIMP2 和 MMP9、HIF2a 和 AngU VEGFR2 和Tie2、CD45 和 CTL4A、DLL4 和 CD31 及其組合。
31.如權利要求18-21或23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自 5T4 (滋養層)、ADAMlO, AGER/RAGE、APC、APP ( P -澱粉樣蛋白)、ASPH (A-10)、B7H3(CD276)、BACEl、BAI3, BRCAl、BDNF、BIRC2、C1GALT1、CA125(MUC16)、鈣調蛋白 1、CCL2 (MCP-1)、CD9、CD 10、CD 127 (IL7R)、CD 174、CD24、CD44、CD63、CD81、CEA、CRMP-2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CYFRA21、derlinl、DLL4、DPP6、E-CAD, EpCaM、EphA2 (H-77)、ER⑴ ESRl a、ER(2)ESR2 3、Erb B4、Erbb2、erb3 (Erb_B3) PA2G4、FRT (FLTl)、Gal3、GPR30 (G 偶聯 ERl)、HAPU HER3、HSP-27、HSP70、IC3b、IL8、insig、連接斑珠蛋白、角蛋白 15、KRAS、乳腺珠蛋白、MART1、MCT2、MFGE8、MMP9、MRP8、Mucl、MUC17、MUC2、NCAM、NG2 (CSPG4)、Ngal、NHE-3、NT5E(CD73)、ODCl、OPG, OPN、p53、PARK7、PCSA, PGP9.5 (PARK5)、PR ⑶、PSA、PSMA, RAGE、STXBP4、存活蛋白、TFF3(分泌的)、TMP1、TMP2、TMEM211、TRAF4 (支架)、TRAIL-R2 (死亡受體 5)、TrkB、Tsgl01、UNC93a、VEGF A、VEGFR2、YB-1、VEGFR1、GCDPF-15 (PIP)、BigH3(TGFbl誘導的蛋白質)、5HT2B (5-羥色胺受體2B)、BRCA2、BACE1、⑶Hl-鈣黏著蛋白及其組合。
32.如權利要求18-21或23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自 AK5.2、ATP6V1B1、CRABPl 及其組合。
33.如權利要求18-21或23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自 DST.3、GATA3、KRT81 及其組合。
34.如權利要求18-21或23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自 AK5.2、ATP6V1B1、CRABPl、DST.3、ELF5、GATA3、KRT81、LALBA, OXTR、RASL10A、SERHL,TFAP2A.1、TFAP2A.3、TFAP2C、VTCNl 及其組合。
35.如權利要求18-21或23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自表89中的生物標誌物及其組合。
36.如權利要求18-21或23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自表90中的生物標誌物及其組合。
37.如權利要求18-21或23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自表91中的生物標誌物及其組合。
38.如權利要求18-21或23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自MS4A1、PRB、DR3及其組合。
39.如權利要求18-21或23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自PRB、MACCl及其組合。
40.如權利要求18-21或23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物選自表92中的生物標誌物及其組合。
41.如權利要求20或22-`23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物包含選自 hsa-miR-125a_5p、hsa-miR-650、hsa-miR-194、hsa-miR-1200、hsa—miR-326、hsa_miR-30b*、hsa_miR-19a、hsa_miR-7a*、hsa—miR-708*、hsa_miR-99a、hsa-miR-199b_5p、 hsa-miR-543、 hsa_miR-7i*、 hsa_miR-518c*、 hsa-miR-642、hsa-miR-654_3p、 hsa-miR-518d_5p、 hsa-miR-1266、 hsa-miR-154、 hsa-miR-662、hsa-miR-523、 hsa-miR-198、 hsa-miR-920、 hsa-miR-885_3p、 hsa_miR-99a*、hsa-miR-337-3p、hsa-miR-363 及其組合的一種或多種微 RNA。
42.如權利要求20或22-23中任一項所述的方法，其中所述一種或多種生物標誌物包含 miR-497 微 RNA。
43.如權利要求19所述的方法，其中所述微囊泡群體用針對所述一種或多種生物標誌物的一種或多種結合劑捕獲並用針對選自下組的生物標誌物的結合劑進行檢測:四跨膜蛋白、CD9、CD31、CD63、CD81、CD82、CD37、CD53、Rab_5b、膜聯蛋白 V、MFG_E8、圖 1-60 或表3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、67、69-71、73-85、89-92 任一個中的生物標誌物及其組合。
44.如權利要求5所述的方法，進一步包括檢測所述微囊泡群體內的有效負載的水平。
45.如權利要44所述的方法，其中所述檢測的有效負載包含一種或多種核酸、肽、蛋白質、脂質、抗原、碳水化合物和/或蛋白聚糖。
46.如權利要求44所述的方法，其中所述檢測的有效負載包含選自權利要求24-42中任一項中的生物標誌物及其組合的一種或多種生物標誌物。
47.如權利要求44所述的方法，其中所述檢測的有效負載包含選自圖1-60或表3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、67、69-71、73-85、89-92 任一個中的生物標誌物及其組合的一種或多種生物標誌物。
48.如權利要求45所述的方法，其中所述核酸包含一種或多種DNA、mRNA、微RNA、snoRNA、snRNA、rRNA、tRNA、si RNA、hnRNA 或 shRNA。
49.如權利要求45所述的方法，其中所述核酸包含選自表5-9、30-44、58-59、71和73任一個中的微RNA的一種或多種微RNA。
50.如權利要求45所述的方法，其中所述蛋白質包含選自圖1-60或表3-10、12-17、19-22、22、26、28-29、45-50、52、54-57、60-64、66、67、69-70、74-85、89-92 任一個中的生物標誌物及其組合的一種或多種肽、多肽、蛋白質或其片段。
51.如權利要求45所述的方法，其中所述核酸包含選自圖1-60或表3-10、12-17、19-22、22、26、28-29、45-50、52、54-57、60-64、66、67、69-70、74-85、89-92 任一個中的生物標誌物及其組合的一種或多種mRNA。
52.如任一前述權利要求所述的方法，進一步包括針對至少一種另外的生物標誌物分析所述生物樣品，該生物標誌物選自四跨膜蛋白、⑶9、⑶31、⑶63、⑶81、⑶82、⑶37、⑶53、Rab-5b、膜聯蛋白 V、MFG-E8、圖 1-60 或表 3-10、12-17、19_20、22、26、28-50、52、54_64、66、67、69-71、73-85、89-92任一個中的生物標誌物及其組合。
53.如任一前述權利要求所述的方法，其中所述生物樣品包含已知的或疑似的癌症樣品。
54.如權利要求53所述的方法，其中所述生物樣品包含癌細胞培養物或來自患有或疑似患有所述癌症的受試者的樣品。
55.如權利要求53所述的方法，進一步包括將所檢測的微囊泡群體的存在或水平與參照進行比較，其中相對於所述參照改變的存在或水平為所述癌症提供了診斷、預後或治療診斷決定。
56.如權利要求54所述的方法，其中針對所述癌症的診斷、預後或治療診斷決定包括癌症或癌症可能性的診斷，癌症的預後，癌症的治療診斷，確定所述癌症是否對治療處理正作出反應，或確定所述癌症是否有可能對治療處理有反應。
57.如權利要求56所述的方法，其中所述治療處理選自表10、11-13或69。
58.如權利要求55所述的方法，其中所述參照來自沒有所述癌症的生物樣品。
59.如權利要求58所述的方法，其中與所述參照相比所述樣品中一種或多種生物標誌物水平的提高指示所述樣品中癌症的存在或可能性，或所述樣品中更晚期癌症的存在或可能性。
60.如權利要求55所述的方法，其中所述參照來自在一個或多個不同時間點測定的一系列生物樣品。
61.如權利要求53所述的方法，其中所述癌症包括急性成淋巴細胞性白血病；急性骨髓性白血病；腎上腺皮質癌；AIDS相關癌症；AIDS相關淋巴瘤；肛門癌；闌尾癌；星形細胞瘤；非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；基底細胞癌；膀胱癌；腦幹膠質瘤；腦腫瘤(包括腦幹膠質瘤、中樞神經系統非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤、中樞神經系統胚胎樣瘤、星形細胞瘤、顱咽管瘤、成室管膜母細胞瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、髓上皮瘤、中度分化的松果體實質腫瘤、幕上原始神經外胚層腫瘤和成松果體細胞瘤)；乳腺癌；支氣管腫瘤；伯基特氏淋巴瘤；原發部位不明癌；類癌瘤；原發部位不明腫瘤；中樞神經系統非典型畸胎樣瘤/橫紋肌樣瘤；中樞神經系統胚胎性腫瘤；宮頸癌；兒童期癌症；脊索瘤；慢性淋巴細胞性白血病；慢性骨髓性白血病；慢性骨髓增殖紊亂；結腸癌；結腸直腸癌；顱咽管瘤；皮膚T細胞淋巴瘤；內分泌胰島細胞瘤；子宮內膜癌；成室管膜母細胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感覺神經細胞瘤；尤文氏肉瘤；顱外生殖細胞瘤；性腺外生殖細胞腫瘤；肝外膽管癌；膽囊癌；胃的(胃)癌；胃腸道類癌腫瘤；胃腸道間質細胞瘤；胃腸道間質瘤(GIST);妊娠滋養細胞腫瘤；神經膠質瘤；毛細胞白血病；頭頸癌；心臟癌；霍奇金淋巴瘤；喉咽癌；眼內黑色素瘤；胰島細胞瘤；卡波濟氏肉瘤；腎癌；朗格漢斯細胞組織細胞增生症；喉癌；唇癌；肝癌；肺癌；惡性纖維組織細胞瘤骨癌；髓母細胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；Merkel細胞癌；Merkel細胞皮膚癌；間皮瘤；隱匿原發性的轉移性鱗狀頸癌；口腔癌；多發性內分泌腫瘤症候群；多發性骨髓瘤；多發性骨髓瘤/漿細胞贅生物；蕈樣肉芽腫；骨髓發育異常症候群；骨髓增生性贅生物；鼻腔癌；鼻咽癌；神經母細胞瘤；非霍奇金淋巴瘤；非黑色素瘤皮膚癌；非小細胞肺癌；口癌；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤；其它腦和脊髓腫瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖細胞腫瘤；卵巢低惡性潛在腫瘤；胰腺癌；乳頭狀瘤病；副鼻竇癌；甲狀旁腺癌；盆腔癌；陰莖癌；咽癌；中度分化的松果體實質腫瘤；成松果體細胞瘤；垂體瘤；漿細胞贅生物/多發性骨髓瘤；胸膜肺母細胞瘤；原發性中樞神經系統(CNS)淋巴瘤；原發性肝細胞肝癌；前列腺癌；直腸癌；腎癌；腎細胞(腎)癌；腎細胞癌；呼吸道癌；視網膜母細胞瘤；橫紋肌肉瘤；唾液腺癌症；S6zary症候群；小細胞肺癌；小腸癌；軟組織肉瘤；鱗狀細胞癌；鱗狀頸癌?』胃(胃的)癌；幕上原始神經外胚層腫瘤；T細胞淋巴瘤；睪丸癌；咽喉癌；胸腺癌；胸腺瘤；甲狀腺癌；移行細胞癌；腎盂和輸尿管的移行細胞癌；滋養細胞腫瘤；輸尿管癌；尿道癌；子宮癌；子宮肉瘤；陰道癌；外陰癌；Waldenstr6m巨球蛋白血症或腎母細胞瘤。
62.如從屬於權利要求24-37中任意一項的權利要求53所述的方法,其中所述癌症包括乳腺癌。
63.如從屬於權利要求36-37中任意一項的權利要求53所述的方法,其中所述癌症包括原位導管癌(DCIS)。
64.如從屬於權利要求 24和38-42中任意一項的權利要求53所述的方法，其中所述癌症包括肺癌。
65.如任一前述權利要求所述的方法，其中所述方法在體外進行。
66.—種或多種試劑在實施任一前述權利要求的方法中的用途。
67.—種試驗,其包括: (a)從生物樣品中分離細胞外微囊泡，其中所述微囊泡包含一種或多種RNA分子，其中所述一種或多種 RNA 分子是與圖 1-60 或表 3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、67、69-71、73-85、89-92任一個中的生物標誌物相對應的診斷指示物； (b)測定所述微囊泡中的一種或多種RNA分子的量；和 (c)將所述測定的一種或多種RNA分子的量與一種或多種對照水平進行比較，其中如果所述細胞外微囊泡中的所述一種或多種RNA分子的量與所述一種或多種對照水平相比存在差異，則檢測出癌症。
68.如權利要求67所述的試驗，其中所述分離包括大小排阻色譜法、密度梯度離心、差速離心、納米膜超濾、免疫吸附捕獲、親和選擇、親和純化、親和捕獲、免疫測定、免疫沉澱、微流體分離、流式細胞術或其組合。
69.如權利要求68所述的試驗，其中所述親和選擇包括使所述微囊泡群體與一種或多種結合劑接觸，該結合劑特異性結合選自圖1-60或表3-10、12-17、19-22、22、26、28-29、45-50、52、54-57、60-64、66、67、69-70、74-85、89-92任一個中的生物標誌物及其組合的微囊泡表面標誌物。
70.一種試劑盒，其包含一種或多種用於實施權利要求1-65中任一項的方法的試劑。
71.如權利要求70所述的試劑盒或如權利要求66所述的用途，其中所述一種或多種試劑包含針對所述一種或多種生物標誌物的一種或多種結合劑。
72.如權利要求70所述的試劑盒或如權利要求66所述的用途，其中所述一種或多種試劑包含針對一種或多種生物標誌物的一種或多種結合劑，該生物標誌物選自圖1-60或表3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、67、69-71、73-85、89-92 任一個中的生物標誌物及其組合。
73.如權利要求71或72所述的試劑盒或用途，其中所述一種或多種結合劑包含抗體或適體。
74.如權利要求71或72所述的試劑盒或用途，其中所述一種或多種結合劑系留於基底上。
75.如權利要求71或72所述的試劑盒或用途，其中所述一種或多種結合劑是標記的。
76.如權利要求75所述的方法，其中所述標記包含磁標記、螢光標記、酶標記、放射性同位素或量子點。
77.一種分離的囊泡 ，其包含選自權利要求24-42任一項中所列的生物標誌物及其組合的一種或多種生物標誌物。
78.如權利要求77所述的分離的囊泡，其中所述囊泡包含一種或多種另外的生物標誌物，該另外的生物標誌物選自圖 1-60 或表 3-10、12-17、19-20、22、26、28-50、52、54-64、66、，67、69-71、73-85、89-92任一個中的生物標誌物及其組合。
【文檔編號】C12Q1/68GK103492590SQ201280019718
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年2月17日 優先權日:2011年2月22日
【發明者】大衛·斯佩茲勒, 丹尼爾·A·霍爾特曼, 特蕾西·波洛斯基, 安德裡亞·塔斯納託 申請人:卡裡斯生命科學盧森堡控股有限責任公司