一種功能紅曲中Monacolin類化合物含量的檢測方法
2023-12-08 08:05:51
專利名稱：一種功能紅曲中Monacolin類化合物含量的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種保健食品功效成分檢測方法。
背景技術：
紅曲作為天然色素和食品添加劑廣泛應用於食品工業。1979年遠騰報導從紅麴黴發酵液中分離得到一種具有降血漿膽固醇作用的物質，稱為Monacolin K，並發現其有抑制人體內膽固醇合成的作用。以後的研究證實紅麴黴在其生長後期能產生的一類對動物和人體3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶(HMG-CoA還原酶)有抑制活性的物質，既Monacolin類化合物。它們是一族結構類似物，可分為Monacolin J、K、L、X、M、Dihydromevinolin及Dihydromonacolin L等成分。其中以Monacolin K含量最多。
由於Monacolin類物質抑制膽固醇合成效果顯著，毒副作用小，耐受性好，自發現以來便很快應用於臨床。近年來Monacolin化合物又作為保健食品功效成分應用於一些具有降血脂功能的保健食品而受到廣大消費者的歡迎。為了保證產品質量，對於原料及產品中Monacolin類物質的檢測就顯得十分重要。
自2000年以來本實驗室在《中國食品添加劑》及《食品科學》雜誌上陸續報導了用紫外分光光度計及反相高效液相色譜—紫外檢測器測定紅曲中Monacolin K(又稱Lovastatin)含量的方法。由於紫外檢測器只能得到單一波長下各組分的色譜流出曲線圖，而不能得到隨色譜組分流出的各組分吸收光譜圖；又由於目前許多Monacolin化合物的標準樣品沒有商品出售，因此給分離出的各組分定性帶來困難。故以前對於紅曲中降血脂功能因子的定量測定，實際上只測定Monacolin類化合物中含量最多的Monacolin K，而忽略了紅曲中其它Monacolin類化合物。顯然這對於準確評價紅曲中抑制膽固醇合成的功能因子是有缺陷的。
發明內容
為了解決上述問題，本發明提供一種功能紅曲中Monacolin類化合物含量的檢測方法。本發明是這樣實現的一種功能紅曲中Monacolin類化合物含量的檢測方法，它包括以下步驟1)試樣前處理；2)酸式Monacolin K標準樣品的製備；3)色譜進樣分析；4)圖譜分析和結果計算。
所述的功能紅曲中Monacolin類化合物含量的檢測方法，其具體步驟還可以為1)試樣前處理步驟中包括將紅曲樣品粉碎(≥80目)並充分混合均勻；準確稱取400.0～600.0mg樣品於50ml容量瓶中，加入30ml 75％乙醇(V/V)，搖勻，室溫下超聲20min(工作頻率40KHz)。加75％乙醇至接近刻度，再超聲10min，之後冷卻至室溫，用75％乙醇定容至50ml；用3500轉/分離心10min；取上清液過0.45μm孔徑微孔濾膜，濾液待進樣；2)酸式Monacolin K標準樣品的製備步驟包括稱取Monacolin K(內酯)標準品4mg，以0.2M氫氧化鈉溶液定容至100ml，置50℃條件下超聲轉化1小時，冷卻至室溫後，避光放置3小時後使用；根據轉化後酸式Monacolin K及殘留內酯Monacolin K色譜峰面積計算轉化率；利用製備的酸式Monacolin K，對樣品中酸式Monacolin K進行準確定性及定量；3)色譜進樣分析步驟包括取經微孔濾膜過濾的濾液進入液相色譜儀，所述色譜儀的色譜條件為色譜柱C18柱，4.6×250mm，5μm；柱溫室溫；二極體陣列檢測器200～350nm掃描，238nm處色譜圖處理數據；流動相甲醇∶水∶磷酸＝385∶115∶0.14(V∶V)；流速1.0ml/min；進樣量20μl；4)圖譜分析和結果計算步驟包括在色譜流出曲線圖上找到與標準MonacolinK有相同紫外吸收光譜的組分峰，即為Monacolin類化合物，將這些組分的峰面積相加，與標準Monacolin K色譜峰面積比較，計算樣品中Monacolin類化合物總量；結果的計算公式X=h1c50h2m]]>式中X-式樣中Monacolin類化合物總量，mg/gh1-具有Monacolin類化合物特徵吸收光譜的被分離組分色譜峰面積之和c-標準Monacolin K(內酯型或酸式)溶液濃度，mg/ml50-試樣定容體積，mlh2-Monacolin K(內酯型或酸式)峰面積m-試樣稱取量，g。
功能紅曲發酵產物含有各種Monacolin類化合物，以內酯型和酸式Monacolin K為主。在脫水乾燥處理的過程中，酸式Monacolin K逐漸轉變為內酯型。由於它們都有生理活性，所以測定Monacolin化合物總量更有意義。
二極體陣列檢測器能夠給出所有被分離組分色譜流出即時紫外吸收光譜，因此在色譜流出曲線圖上可以清楚地看那些與Monacolin K有相同紫外吸收光譜的Monacolin類化合物被分離的情況。如果有標準物質，對它們一一定性、定量十分方便。例如由於酸式Monacolin K不穩定，因此目前沒有標準物質出售。利用本方法提供的條件能夠很方便地將標準內酯型Monacolin K轉化為酸式。用轉化後的標準樣品進樣，就能夠準確對樣品中的酸式Monacolin K定性和定量。
把那些與Monacolin K有相同紫外吸收光譜的Monacolin類化合物組分的峰面積相加，用標準內酯型Monacolin K對它們定量就能夠得到樣品中Monacolin類化合物的總量。儘管不同的Monacolin化合物對檢測器的響應可能有差異，得到的結果會有一些誤差，但是在目前缺乏Monacolin類化合物標準物的情況下，這一方法還是行之有效的。又由於樣品中各種Monacolin類化合物以內酯型和酸式Monacolin K為主，內酯型Monacolin K有商品出售，本方法又解決了酸式Monacolin K標準樣品的製備問題，而其他Monacolin類化合物含量很少，所以採用本方法測定功能紅曲樣品中Monacolin化合物總量有較高的準確度。
如果樣品中有效成分含量過低，可將提取離心後的上清液用減壓濃縮法適當濃縮，但結果需要按濃縮後的準確體積計算。
下面結合附圖對本發明作進一步的說明。
圖1為Monacolin K(內酯式)Monacolin K acid(開環酸式)標準色譜2為某紅曲樣品色譜3為Monacolink標準曲線具體實施方式
一種功能紅曲中Monacolin類化合物含量的檢測1.材料1.1試劑1.1甲醇 色譜純1.2無水乙醇 分析純1.3磷酸 分析純1.4氫氧化鈉 分析純1.5Monacolin K準儲備液 準確稱取Monacolin K(內酯型)標準品40.0mg，以流動相定容100ml。此溶液濃度為400μg/ml。
1.6Monacolin K標準工作液 準確量取Monacolin K標準儲備液1ml，以流動相定容10ml。此溶液濃度為40μg/ml。
1.2儀器設備1.2.1高效液相色譜儀(Waters 600E)1.2.2二極體陣列檢測器(Photodiode Array Detecter，Waters 2996)1.2.3低速離心機(上海手術器械廠，80-2)1.2.4超純水系統(美國PALL)1.2.5超聲波清洗器(崑山超聲儀器有限公司，KQ-100)1.2.6精密分析天平(Mettler AE-100)2.方法2.1試樣處理將功能紅曲樣品粉碎(≥80目)並充分混合均勻。準確稱取400.0～600.0mg樣品於50ml容量瓶中，加入30ml 75％乙醇(V/V)，搖勻，室溫下超聲20min(工作頻率40KHz)。加75％乙醇至接近刻度，再超聲10min，之後冷卻至室溫，用75％乙醇定容至50ml。用3500轉/分離心10min。取上清液過0.45μm孔徑微孔濾膜，濾液待進樣。
2.2酸式Monacolin K標準品的製備稱取Monacolin K(內酯)標準品4mg，以0.2M氫氧化鈉溶液定容至100ml，置50℃條件下超聲轉化1小時，冷卻至室溫後，避光放置3小時後使用。根據轉化後酸式Monacolin K及殘留內酯Monacolin K色譜峰面積計算轉化率。利用製備的酸式Monacolin K，對樣品中酸式Monacolin K進行準確定性及定量。
2.3色譜條件色譜柱C18柱4.6×250mm 5μm柱溫室溫二極體陣列檢測器200～350nm掃描，238nm處色譜圖處理數據流動相甲醇∶水∶磷酸＝385∶115∶0.14(V∶V)流速1.0ml/min進樣量20μl2.4圖譜分析取處理好的試樣提取液20μl進樣，經二極體陣列檢測器檢測得到圖譜後，以標準Monacolin K(內酯及酸型)保留時間及Monacolin類化合物特徵吸收光譜定性。以238nm波長下的色譜圖為定量依據，將樣品中Monacolin組分峰面積之和與標準Monacolin K(內酯或酸式)色譜峰面積比較定量。
2.5結果的計算公式X=h1c50h2m]]>式中X-式樣中Monacolin類化合物總量，mg/gh1-具有Monacolin類化合物特徵吸收光譜的被分離組分色譜峰面積之和。
c-標準Monacolin K(內酯型或酸式)溶液濃度，mg/ml50-試樣定容體積，mlh2-Monacolin K(內酯型或酸式)峰面積m-試樣稱取量，g3.實驗結果3.1色譜分離效果考察試驗在上述實驗條件下標準Monacolin K(內酯及酸型)分離情況如圖1所示，某紅曲樣品Monacolin類化合物分離情況如圖2所示。
從圖1可以看到，在上述試驗條件下，內酯型Monacolin K與開環酸式Monacolin K得到良好分離。
從圖2可以看到，在上述試驗條件下，紅曲樣品中的各種Monacolin化合物得到良好分離。二極體陣列檢測器給出了所有被分離組分色譜流出即時紫外吸收光譜。將這些光譜中具有Monacolin化合物特徵(230，238，246nm波長處各有一個吸收峰，以238nm處為最大)的圖譜挑出來，在色譜流出曲線圖中這些特徵光譜所對應的色譜峰即為各Monacolin化合物。
3.2線性關係及最低檢測限的考察試驗配置濃度為0.1、1、10、30、75、150、300μg/ml Monacolin K(內酯型)標準溶液，在上述色譜條件下進樣測定，以峰面積對濃度作標準曲線，結果如圖3所示。其線性回歸方程及相關係數分別為Y＝66084x-16840，R2＝0.9999。表明在這一濃度下線性關係良好。
當Monacolin K濃度為0.1μg/ml時，在色譜流出曲線圖上能夠看到MonacolinK的色譜峰略高於2倍噪聲，因此本方法的最低檢出量為0.1μg/ml(2ng)。根據此標準曲線可知本方法的最佳線性範圍為0.1～300μg/ml。
3.3方法平行性精密度試驗將同一均勻樣品分為5份，從前處理步驟開始平行進行實驗，5份樣品測定結果見表1。
表1 平行性精密度測定結果
結果表明該方法具有良好的平行性精密度。
3.4方法重複性精密度試驗同一均勻樣品在同樣實驗條件下從樣品前處理開始每天測定一次。連續測量5天，其結果見表2。
表2 重複性精密度測定結果
結果表明該方法重複性精密度良好。
3.5方法回收率試驗精確稱取樣品10份，其中5份各加入標準Monacolin K。從樣品前處理開始測定10份樣品中Monacolin K含量。結果如下表3 方法回收率測定結果
表3表明此方法具有良好的準確度。
3.6 5種樣品中Monacolin化合物含量的測定各取5種紅曲樣品，以上述檢測方法測定其中Monacolin化合物含量，結果如下表4 樣品中Monacolin化合物含量測定結果
從表4可以看出，本方法在實際應用中能夠取得良好的結果。
4.討論4.1功能紅曲發酵產物含有各種Monacolin類化合物，以內酯型和酸式Monacolin K為主，二極體陣列檢測器能夠給出所有被分離組分色譜流出即時紫外吸收光譜，本方法能夠在色譜流出曲線圖上清楚地反映出那些與Monacolin K有相同紫外吸收光譜的Monacolin類化合物被分離的情況(見圖2)。
4.2內酯型Monacolin K有商品出售。由於酸式Monacolin K不穩定，因此目前沒有標準物質出售。利用本方法提供的條件能夠很方便地將標準內酯型Monacolin K轉化為酸式。用轉化後酸式及內酯型Monacolin K色譜峰面積之比，就能夠準確得到轉化率，並能夠準確對樣品中的內酯型及酸式Monacolin K定量。
4.3採用二極體陣列檢測器能夠對所有被分離組分進行色譜流出即時紫外吸收光譜掃描。因此，本方法除了採用Monacolin K的保留時間定性之外，可以同時利用Monacolin K的特徵吸收光譜定性。這就使得該方法的定性分析比以往紫外檢測器只能利用保留時間定性更加可靠。
4.4Monacolin類化合物都有類似Monacolin K的生理活性，把這些組分的峰面積相加，用標準內酯型Monacolin K對它們定量就能夠得出樣品中Monacolin類化合物的總量，儘管由於檢測器響應的問題，會有一些誤差，但是在目前缺乏Monacolin類化合物標準物質的情況下，這一方法還是行之有效的。又由於樣品中各種Monacolin類化合物以內酯型和酸式Monacolin K為主(見圖2)，利用本方法可以對這兩種化合物準確定量，而其他Monacolin化合物含量很少，所以採用本方法測定功能紅曲樣品中Monacolin化合物總量有較高的準確度。
權利要求
1.一種功能紅曲中Monacolin類化合物含量的檢測方法，它包括以下步驟1)試樣前處理；2)酸式Monacolin K標準樣品的製備；3)色譜進樣分析；4)圖譜分析和結果計算。
2.根據權利要求1所述的功能紅曲中Monacolin類化合物含量的檢測方法，其特徵在於1)試樣前處理步驟中包括將紅曲樣品粉碎(≥80目)並充分混合均勻；準確稱取400.0～600.0mg樣品於50ml容量瓶中，加入30ml 75％乙醇(V/V)，搖勻，室溫下超聲20min(工作頻率40KHz)。加75％乙醇至接近刻度，再超聲10min，之後冷卻至室溫，用75％乙醇定容至50ml；用3500轉/分離心10min；取上清液過0.45μm孔徑微孔濾膜，濾液待進樣；2)酸式Monacolin K標準樣品的製備步驟包括稱取Monacolin K(內酯)標準品4mg，以0.2M氫氧化鈉溶液定容至100ml，置50℃條件下超聲轉化1小時，冷卻至室溫後，避光放置3小時後使用；根據轉化後酸式Monacolin K及殘留內酯Monacolin K色譜峰面積計算轉化率；利用製備的酸式Monacolin K，對樣品中酸式Monacolin K進行準確定性及定量；3)色譜進樣分析步驟包括取經微孔濾膜過濾的濾液進入液相色譜儀，所述色譜儀的色譜條件為色譜柱C18柱，4.6×250mm，5μm；柱溫室溫；二極體陣列檢測器200～350nm掃描，238nm處色譜圖處理數據；流動相甲醇∶水∶磷酸＝385∶115∶0.14(V∶V)；流速1.0ml/min；進樣量20μl；4)圖譜分析和結果計算步驟包括在色譜流出曲線圖上找到與標準MonacolinK有相同紫外吸收光譜的組分峰，即為Monacolin類化合物，將這些組分的峰面積相加，與標準Monacolin K色譜峰面積比較，計算樣品中Monacolin類化合物總量；結果的計算公式X=h1c50h2m]]>式中X-式樣中Monacolin類化合物總量，mg/gh1-具有Monacolin類化合物特徵吸收光譜的被分離組分色譜峰面積之和c-標準Monacolin K(內酯型或酸式)溶液濃度，mg/ml50-試樣定容體積，mlh2-Monacolin K(內酯型或酸式)峰面積m-試樣稱取量，g。
全文摘要
本發明涉及一種功能紅曲Monacolin類化合物含量的檢測方法，它包括以下步驟1)試樣前處理；2)酸式Monacolin K標準樣品的製備；3)色譜進樣分析；4)圖譜分析和結果計算。本發明是通過高效液相色譜儀將功能紅曲提取液中各Monacolin類化合物良好地分離，用二極體陣列檢測器檢測出各Monacolin類化合物的紫外吸收光譜，最後用外標法根據保留時間及紫外吸收光譜圖進行定性，用峰面積定量。本發明能夠在缺乏Monacolin化合物標準樣品的情況下，通過檢測樣品中Monacolin類化合物共有的特徵紫外吸收光譜，檢測出樣品中Monacolin類化合物的總含量。該方法具有良好的準確度、精密度、線性關係，對功能紅曲樣品進行檢測能夠取得良好結果。
文檔編號G06F19/00GK1869681SQ20061008680
公開日2006年11月29日 申請日期2006年6月16日 優先權日2006年6月16日
發明者文鏡, 常平 申請人:北京聯合大學應用文理學院保健食品功能檢測中心