一種雙向電泳烏賊墨囊全蛋白樣品的製備方法

2023-06-13 17:54:36

專利名稱：一種雙向電泳烏賊墨囊全蛋白樣品的製備方法
技術領域：
本發明涉及雙向電泳蛋白質樣品的製備方法，具體涉及一種雙向電泳烏賊墨囊全 蛋白樣品的製備方法。
背景技術：
蛋白質組分析是研究墨囊中蛋白質的自身變化及周圍環境刺激相應的重要技術 手段，有利於深入了解其對墨囊發育及功能完善的作用，達到控制墨囊發生的目的。要順 利開展墨囊蛋白質組學研究，關鍵技術之一是墨囊組織中蛋白質樣品的製備。公開號為 CN101260146，名稱為一種蘋果屬植物蛋白質雙向電泳方法的發明專利申請，公開了將蘋果 材料在液氮中研碎，加入_20°C預冷的含10%的三氯乙酸和0. 07%的β巰基乙醇的丙酮溶 液中勻漿，-20°C下放置1小時，然後離心，重複6次將沉澱物中加入4倍體積的含有0. 07% 的β巰基乙醇的丙酮溶液，-20°C下放置1小時，離心，最後得到蛋白質樣品，對蛋白質樣品 進行等電聚焦電泳和垂直凝膠電泳的雙向電泳分析。由於烏賊墨囊中雜質成份複雜，如色 素、多糖和核酸等都可幹擾雙向電泳過程，因此目前還沒有製備雙向電泳烏賊墨囊全蛋白 樣品的研究報導，所以未發現烏賊墨囊全蛋白的雙向電泳分析的研究，從而導致烏賊墨囊 相關的蛋白質組研究滯後。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種雙向電泳烏賊墨囊全蛋白樣品的製備方 法，該方法可以有效去除烏賊墨囊中色素、多糖和核酸等幹擾雙向電泳過程的雜質，為烏賊 墨囊全蛋白雙向電泳創造了條件，為烏賊墨囊相關的蛋白質研究打下了基礎。本發明解決上述技術問題所採用的技術方案為一種雙向電泳烏賊墨囊全蛋白樣 品的製備方法，包括下述步驟1)將液氮研磨的墨囊粉末溶於_20°C預冷的含質量百分濃度為10%的三氯乙 酸和0. 02%的二硫蘇糖醇的丙酮溶液中，所述墨囊粉末與所述丙酮溶液的質量體積比為 1 10-20，在-20°C條件下靜置1小時，然後在4°C，IOOOOg條件下離心，得到首次沉澱物；2)上述首次沉澱物用質量濃度為75%的酒精清洗後，在4°C，IOOOOg條件下再次 離心，得到再次沉澱物；3)將上述再次沉澱物在4°C條件下乾燥，然後加入裂解液，所述裂解液含有濃度 為7mo 1 /L的尿素，2mo 1 /L硫脲，40mmo 1 /L三羥甲基氨基甲烷，6mmo 1 /L 二硫蘇糖醇，Immo 1 /L 的苯甲基黃醯氟，lmmol/L的乙二胺四乙酸二鈉，40g/L的3_[3_(膽醯胺丙基)二甲氨基] 丙磺酸內鹽，750ug/L的亮肽素，5ml/L的兩性電解質，所述裂解液與所述墨囊粉末的體積 質量比為2-4 1，在4°C條件下靜置1小時，然後在4°C，10000g條件下離心4小時，收集 上清液得到烏賊墨囊全蛋白粗提液；4)在上述烏賊墨囊全蛋白粗提液中加入水化上樣緩衝液，所述水化上樣緩衝液含 有濃度為7mol/L的尿素，2mol/L硫脲，6mmol/L 二硫蘇糖醇，40g/L的3-[3-(膽醯胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽，5ml/L的兩性電解質，10g/L的溴酚藍，混合均勻得到烏賊墨囊全蛋 白雙向電泳樣品液，其中每300u 1烏賊墨囊全蛋白雙向電泳樣品液中含有300-350ug烏賊
墨囊全蛋白。與現有技術相比，本發明的優點在於一種雙向電泳烏賊墨囊全蛋白樣品的製備方 法，通過丙酮溶液去除色素、多糖和核酸等雜質使墨囊粉末全蛋白沉澱分離，用酒精清洗掉 丙酮，然後用裂解液裂解和提取蛋白，再用水化上樣緩衝液稀釋，得到烏賊墨囊全蛋白雙向 電泳樣品液，且每300ul烏賊墨囊全蛋白雙向電泳樣品液中含有300-350ug烏賊墨囊全蛋 白；該方法可以有效去除烏賊墨囊中色素、多糖和核酸等幹擾雙向電泳過程的雜質，為烏賊 墨囊全蛋白雙向電泳創造了條件，為烏賊墨囊相關的蛋白質研究打下了基礎，且該方法簡 單易行，快速，具有較大的實際應用價值。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。實施例1一種雙向電泳烏賊墨囊全蛋白樣品的製備方法，稱取液氮研磨的墨囊粉末Ig溶 於IOml經-20°c預冷的含質量百分濃度為10%的三氯乙酸和0. 02%的二硫蘇糖醇的丙酮 溶液中，在-20°C條件下靜置1小時，然後在4°C，IOOOOg條件下離心，得到首次沉澱物；將 上述首次沉澱物用質量濃度為75%的酒精清洗後，在4°C，IOOOOg條件下再次離心，得到再 次沉澱物；將上述再次沉澱物在4°C條件下乾燥，然後加入2ml裂解液，裂解液中含有濃度 為7mol/L的尿素，2mol/L硫脲，40mmol/L三羥甲基氨基甲烷，6mmol/L 二硫蘇糖醇，lmmol/ L的苯甲基黃醯氟，lmmol/L的乙二胺四乙酸二鈉，40g/L的3_[3_(膽醯胺丙基)二甲氨 基]丙磺酸內鹽，750ug/L的亮肽素，5ml/L的兩性電解質，在4°C條件下靜置1小時，然後 在4°C，IOOOOg條件下離心4小時，收集上清液得到烏賊墨囊全蛋白粗提液；在上述烏賊 墨囊全蛋白粗提液中加入水化上樣緩衝液，水化上樣緩衝液中含有濃度為7mol/L的尿素， 2mol/L硫脲，6mmol/L 二硫蘇糖醇，40g/L的3_[3_(膽醯胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽， 5ml/L的兩性電解質，10g/L的溴酚藍，混合均勻得到烏賊墨囊全蛋白雙向電泳樣品液，其 中每300ul烏賊墨囊全蛋白雙向電泳樣品液中含有300-350ug烏賊墨囊全蛋白。實施例2一種雙向電泳烏賊墨囊全蛋白樣品的製備方法，與實施例1基本相同，所不同的 只是-20°C預冷的含質量百分濃度為10%的三氯乙酸和0. 02%的二硫蘇糖醇的丙酮溶液 為20ml，裂解液為4ml。實施例3一種雙向電泳烏賊墨囊全蛋白樣品的製備方法，與實施例1基本相同，所不同的 只是-20°C預冷的含質量百分濃度為10%的三氯乙酸和0. 02%的二硫蘇糖醇的丙酮溶液 為15ml，裂解液為3ml。
權利要求
一種雙向電泳烏賊墨囊全蛋白樣品的製備方法，其特徵在於包括下述步驟1)將液氮研磨的墨囊粉末溶於-20℃預冷的含質量百分濃度為10％的三氯乙酸和0.02％的二硫蘇糖醇的丙酮溶液中，所述墨囊粉末與所述丙酮溶液的質量體積比為1∶10-20，在-20℃條件下靜置1小時，然後在4℃，10000g條件下離心，得到首次沉澱物；2)上述首次沉澱物用質量濃度為75％的酒精清洗後，在4℃，10000g條件下再次離心，得到再次沉澱物；3)將上述再次沉澱物在4℃條件下乾燥，然後加入裂解液，所述裂解液含有濃度為7mol/L的尿素，2mol/L硫脲，40mmol/L三羥甲基氨基甲烷，6mmol/L二硫蘇糖醇，1mmol/L的苯甲基黃醯氟，1mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉，40g/L的3-[3-(膽醯胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽，750ug/L的亮肽素，5ml/L的兩性電解質，所述裂解液與所述墨囊粉末的體積質量比為2-4∶1，在4℃條件下靜置1小時，然後在4℃，10000g條件下離心4小時，收集上清液得到烏賊墨囊全蛋白粗提液；4)在上述烏賊墨囊全蛋白粗提液中加入水化上樣緩衝液，所述水化上樣緩衝液含有濃度為7mol/L的尿素，2mol/L硫脲，6mmol/L二硫蘇糖醇，40g/L的3-[3-(膽醯胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽，10g/L的溴酚藍，5ml/L的兩性電解質，混合均勻得到烏賊墨囊全蛋白雙向電泳樣品液，其中每300ul烏賊墨囊全蛋白雙向電泳樣品液中含有300-350ug烏賊墨囊全蛋白。
全文摘要
本發明公開了一種雙向電泳烏賊墨囊全蛋白樣品的製備方法，通過丙酮溶液去除色素、多糖和核酸等雜質讓墨囊粉末全蛋白沉澱分離，用酒精清洗掉丙酮，然後用裂解液裂解和提取蛋白，再用水化上樣緩衝液稀釋，得到烏賊墨囊全蛋白雙向電泳樣品液，且每300ul烏賊墨囊全蛋白雙向電泳樣品液中含有300-350ug烏賊墨囊全蛋白；該方法可以有效去除烏賊墨囊中色素、多糖和核酸等幹擾雙向電泳過程的雜質，為烏賊墨囊全蛋白雙向電泳創造了條件，為烏賊墨囊相關的蛋白質研究打下了基礎，且該方法簡單易行，快速，具有較大的實際應用價值。
文檔編號C07K14/435GK101886991SQ20101019629
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月10日 優先權日2010年6月10日
發明者宋微微, 母昌考, 王春琳, 詹萍萍 申請人:寧波大學