一種高甲醇耐受的畢赤酵母菌株的構建及其應用
2024-04-15 17:53:05
1.本發明屬於生物技術領域，具體涉及一碳資源利用及生產微生物單細胞蛋白應用技術領域，更具體涉及一個與高甲醇耐受且高蛋白的畢赤酵母菌株的構建及其應用。
背景技術：
2.甲醇是一種重要的基礎有機化工原料，也是一種新型清潔能源，其用途十分廣泛。甲醇的製備工藝主要為煤制甲醇、焦爐氣制甲醇及天然氣制甲醇。我國甲醇產能已經超過4500萬噸/年，並呈現繼續增加趨勢，而國內甲醇需求量僅為1000萬噸/年，急需開發甲醇下遊產品。目前，甲醇價格低廉，並且可以作為碳源。利用可以高效利用甲醇等低值碳源菌株，將甲醇轉化為菌體蛋白。該模式中低值碳源來源的菌體蛋白生產成本低，蛋白營養價值高,以菌體蛋白代替傳統的魚粉和豆類等蛋白，將會降低飼料蛋白生產成本，提高飼料營養價值和利用率。
3.巴斯德畢赤酵母（pichia pastoris）具有較高的細胞密度和較低的內源蛋白分泌量，適合在學術或工業水平上分泌重組蛋白。相比與其他一些表達宿主，畢赤酵母具有很強的、甲醇誘導和嚴格調控的醇氧化酶啟動子（aox1），可以高效利用甲醇，在甲醇誘導作用下具有了高蛋白質分泌的能力，更適合表達高水平的外源基因。儘管畢赤酵母可以利用甲醇作為唯一碳源進行呼吸代謝、生物合成及能量利用，但仍然存在高濃度甲醇對細胞毒害和生長限速等問題。
技術實現要素：
4.前期工作中，本發明人利用rna-seq技術分析在不同濃度甲醇中的巴斯德畢赤酵母c1菌株基因表達變化情況，預測巴斯德畢赤酵母細胞壁穩定所需o-糖基化修飾的蛋白基因pas_chr4_0305可能與巴斯德畢赤酵母甲醇耐受有相關性。pas_chr4_0305基因敲除後對巴斯德畢赤酵母c3菌株表達中性纖維素酶的分泌表達有促進作用，為構建巴斯德畢赤酵母外源表達「超級」分泌體系和高效酵母展示體系的構建提供了基礎。同時，pas_chr4_0305基因敲除後，巴斯德畢赤酵母細胞壁對sds和剛果紅等敏感性降低，對甲醇環境的耐受性明顯提升；同時，發現pas_chr4_0305基因敲除後，巴斯德畢赤酵母細胞壁組成發生重排，甲醇菌體乾重和粗蛋白含量均提高20%左右。
5.本發明首先提供與畢赤酵母參與細胞壁穩定性所需的o-糖基化修飾的蛋白，其敲除可以直接影響甲醇代謝、轉化效率、生長以及異源蛋白質的分泌。
6.本發明提供一種高甲醇耐受的畢赤酵母菌株，其中敲除參與細胞壁穩定性所需的o-糖基化基因，或者使其表達能力降低或表達的o-糖基化修飾的蛋白活性降低。
7.具體地，所述基因是pas_chr4_0305。
8.優選地，出發菌株是高產中性纖維素酶畢赤酵母菌株。具體地，出發菌株是保藏號為：cgmcc no. 24324的巴斯德畢赤酵母菌株c1。更優選地，將出發菌株是保藏號為：cgmcc no. 24324的巴斯德畢赤酵母菌株c1的細胞壁中o-糖基化蛋白基因敲除，進而獲得高分泌
量、高甲醇耐受且高菌體蛋白的巴斯德畢赤酵母菌株。
9.在具體實施方式中，通過基因編輯方法定點敲除所述o-糖基化蛋白基因。
10.具體地，通過基因工程方法敲除所述基因，或者使其表達能力降低或表達的蛋白活性降低。
11.本發明還提供所述的畢赤酵母菌株的構建方法獲得的重組菌株在製備菌體蛋白、高附加值（如有機酸、酶）表達宿主的應用。
12.本發明公開一種參與畢赤酵母細胞壁o-糖基化修飾的蛋白基因（具體是基因pas_chr4_0305）及其應用。對畢赤酵母敲除該蛋白的編碼基因可以直接影響甲醇代謝、轉化效率、生長以及異源蛋白質的分泌。該基因敲除後對畢赤酵母菌株表達中性纖維素酶的分泌表達有促進作用，畢赤酵母細胞壁對sds和剛果紅等敏感性降低，對甲醇環境的耐受性明顯提升；畢赤酵母細胞壁組成發生重排，甲醇菌體乾重和粗蛋白含量均提高20%左右。因此，本發明創製了高分泌量、高甲醇耐受且高菌體蛋白的巴斯德畢赤酵母菌株。
附圖說明
13.圖1：pas_chr4_0305敲除株與對照菌株c3尼羅紅染色後吸光值變化情況。
14.圖2：pas_chr4_0305敲除株與對照菌株c3中性纖維素酶生產比較。
15.圖3：pas_chr4_0305敲除株與對照菌株c3在不同甲醇濃度下耐受性比較。
16.圖4：pas_chr4_0305敲除株與對照菌株c3敏感性比較（a是剛果紅測定菌株敏感性；b是sds測定菌株敏感性）。其中，採用菌株的濃度是10-5
、10-4
、10-3
個孢子/ml。
17.圖5：pas_chr4_0305敲除株與對照菌株c3細胞壁組成變化情況。
18.生物材料保藏信息：本發明用到的巴斯德畢赤酵母菌株(pichia pastoris)c1，其保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為cgmcc，地址是北京市朝陽區北辰西路1號院3號中科院微生物研究所，保藏時間為：2022年1月17日，保藏號為：cgmcc no.24324，分類命名是巴斯德畢赤酵母pichia pastoris。
具體實施方式
19.下面通過具體實施方式對本發明進行闡述，以期更好的理解本發明。但並不構成對本發明的限制。
20.實施例一、甲醇濃度變化直接影響畢赤酵母細胞壁合成關鍵基因的發掘本發明基於巴斯德畢赤酵母菌株(pichia pastoris c1)（保藏號為：cgmcc no. 24324）進行了細胞壁合成關鍵基因的發掘。rna序列數據顯示，當甲醇濃度從0.5%增加到3%時，該菌株有181個基因顯著差異表達，其中115個基因上調，66個基因下調。然而，在這181個差異表達基因中，只有2個基因與細胞壁合成相關，即基因pas_chr4_0305（ncbi reference sequence：xp_002493723.1）（參與細胞壁穩定性所需的o-糖基化修飾的蛋白）和基因pas-chr2_0454（細胞壁的主要外顯子-1,3-β-葡聚糖酶，參與細胞壁β-葡糖組裝）（表1）。
21.表1：通過轉錄組學數據比較發掘的差異表達基因
基因名稱基因描述0.5%甲醇條件下基因表達量3%甲醇條件下基因表達量fc(3%甲醇/0.5%甲醇)差異表達量(3%甲醇/0.5%甲醇)p值pas_chr4_0305細胞壁穩定相關的o-糖基化基因55.68667175.59332.8141.4925796.14e-25pas_chr2_0454參與細胞壁β-1,3葡聚糖合成基因38.0166785.972.0031.0024861.35e-15隨著甲醇濃度的增加，pas_chr4_0305和pas_ chr2_0454基因的表達分別平均上調2.8倍和2倍。因此，響應於甲醇濃度升高的細胞壁增厚可能是這兩個基因上調的直接結果。相反，假設pas_chr4_0305和pas_ chr2_0454基因的缺失可能改變細胞壁結構，導致與細胞壁相關的許多表型和功能的改變。因此，在野生型巴斯德畢赤酵母中敲除這兩個基因。值得注意的是，pas_chr2_0454突變株未在轉化平板上成功篩選，表明pas_ chr2_0454是巴斯德畢赤酵母生長的關鍵基因。這些發現導致了隨後的研究，重點是闡明pas_chr4_0305基因對巴斯德畢赤酵母細胞壁特性和蛋白質分泌的影響。
22.培養基及工藝：種子培養基及培養條件選擇 ypd 複合培養基為種子培養基:1% 酵母浸粉、2%蛋白腖、2% 葡萄糖、 ph 自然。培養條件：在 250 ml 搖瓶中裝入 50 ml 種子培養基，巴斯德畢赤酵母接種量為 1%，於 30 ℃，200 r/ min 搖床培養 24 h。
23.5l 發酵罐發酵培養基及培養條件選擇巴斯德畢赤酵母5l發酵罐發酵培養基：42 g/l甘油，1.2 g/l kh2po4，18 g/l nh4h2po4，6.5 g/l mgso4·
7h2o。培養條件：5l發酵罐裝液量為3 l，巴斯德畢赤酵母接種量為 1%，培養溫度 30 ℃，ph值 4. 5~ 5. 0，空氣流量 4~8 m
3 / h，甘油按照0.5-1.0 rpm/30min/次補料，維持do≥20%；連續發酵 24 h 後，補料甲醇0.1 rpm/h/次，維持do≥25%。
24.酶活力測定：在50℃、ph值為4.8的條件下，每分鐘從濃度為15 mg/ml的羧甲基纖維素鈉溶液中降解釋放1
µ
mol還原糖所需要的酶量為一個酶活力單位，以u/ ml表示。
25.吸取1.80 ml羧甲基纖維素鈉溶液（ph4.8），加入到刻度試管中，50℃預熱5 min，再加入0.20 ml經過適當稀釋的酶液（已經過50℃預熱5 min），混勻，50℃精確保溫10 min後加入3 ml dns試劑，混勻。沸水浴煮沸5 min，用自來水冷卻至室溫，不定容混勻。以空白樣為對照調儀器零點，在540 nm處測定吸光值。
26.樣品酶活力的計算按下式計算：式中：x— 試樣中的纖維素酶活力， u/ml；a — 酶反應液扣除空白樣的吸光度；k — 標準曲線的斜率；c
o — 標準曲線的截距；m—稱樣量，毫升(ml)；
m — 葡萄糖的摩爾質量m (c6h
12
o6) = 180.2 g/mol；t — 酶解反應時間，min；1000 — 轉化因子，1mol= 1000 mmol；n—試樣的稀釋倍數。
27.實施例二、pas-0305基因的敲除以巴斯德畢赤酵母c1為出發菌株，將特異腐質菌（humicola insolens）的纖維素酶cel45a編碼基因電轉入巴斯德畢赤酵母c1菌株，獲得高產中性纖維素酶的巴斯德畢赤酵母菌株c3。
28.為了驗證pas_chr4_0305基因在畢赤酵母細胞壁合成中作用，本發明將該pas_chr4_0305基因在高產中性纖維素酶的巴斯德畢赤酵母菌株c3中定點敲除，通過ypd平板（g418抗性）篩選陽性轉化子。通過測序確認正確的轉化子進行搖瓶和發酵罐發酵實驗，完成中性纖維素酶活力分析，並收集菌體測定菌體中蛋白含量以及採取掃描電鏡方式觀察其細胞壁通透性有何變化。
29.在本實施例中，選用crispr-cas9基因編輯系統來實現對巴斯德畢赤酵母c3編碼細胞壁穩定性所需的o-糖基化蛋白基因pas_chr4_0305的無痕敲除。crispr-cas9系統通過小嚮導rna (small guide rna，sgrna) 的靶向序列定位至含有前間隔序列鄰近基序 (protospacer adjacent motif，pam) 序列的特定位點，引導 cas9蛋白切割 dna 形成雙鏈斷裂缺口，再依靠同源重組 (hr) 或者非同源末端連接 (nhej) 修復的方式進行連接，從而引發基因編輯。首先，設計pas_chr4_0305的grna，構建敲除質粒ppicz-cas9-gpas_chr4_0305，以及設計及構建供體dna：pas_chr4_0305-donor。其次，同時轉化ppicz-cas9-gpas_chr4_0305和pas_chr4_0305-donor到巴斯德畢赤酵母c3菌株中，塗布ypdz（ypd+博來黴素）平板。最後，挑取平板上的克隆進行菌落 pcr以及基因測序驗證，後在ypd 培養基中進行傳代，丟掉質粒後保菌，至此完成pas_chr4_0305基因的敲除，菌株命名為巴斯德畢赤酵母c4（或稱為
△
pas-0305）。
30.實施例三、pas_chr4_0305基因敲除後的巴斯德畢赤酵母c4細胞壁通透性的改變為了驗證巴斯德畢赤酵母pas_chr4_0305敲除後，對巴斯德畢赤酵母細胞壁通透性的影響。使用螢光光譜測量了尼羅紅的全井累積，巴斯德畢赤酵母c4菌株與比基因未敲除的c3菌株在相同條件下更易於進行尼羅紅染色。從圖1中結果顯示， pas_chr4_0305基因敲除後，巴斯德畢赤酵母c4菌株吸光值明顯比c3菌株高，說明pas_chr4_0305基因敲除後，巴斯德畢赤酵母細胞壁通透性的確增強。
31.由於巴斯德畢赤酵母c3菌株是高產中性纖維素酶菌株，通過5l發酵罐發酵培養後，從圖2可知，結果顯示巴斯德畢赤酵母c4菌株比巴斯德畢赤酵母c3菌株胞外蛋白分泌量提升22.54%，酶活力也隨之提高20%左右（其中，巴斯德畢赤酵母c3是表達單一纖維素酶基因的工程菌，同一個基因在相同的底盤菌中，酶的比酶活力（iu/mg）是固定值，所以胞外酶活力與胞外酶的分泌量是成正比的）。該結果與尼羅紅染色結果一致，都證實了pas_chr4_0305基因敲除後，巴斯德畢赤酵母細胞壁通透性的確增強。該關鍵基因的發現，為構建畢赤酵母外源表達「超級」分泌體系提供新的思路。
32.實施例四、pas_chr4_0305基因敲除後的巴斯德畢赤酵母c4甲醇耐受性的改變為了研究巴斯德畢赤酵母中pas_chr4_0305敲除後對甲醇的耐受性是否變化，讓對照巴斯德畢赤酵母菌株c3與敲除菌株c4分別在1.5%、2%、2.5%、3% 的不同甲醇濃度下培養，培養24小時後測量其od值，結果如圖3所示。結果表明，敲除pas_chr4_0305基因後，敲除
菌株c4在2%、2.5%、3.5%的甲醇濃度下對甲醇的耐受力均比對照組高，3.5%濃度下高出兩倍，說明pas-0305基因敲除可以有效增強巴斯德畢赤酵母對甲醇的耐受性。
33.實施例五、pas_chr4_0305基因敲除後的巴斯德畢赤酵母c4細胞壁敏感性分析巴斯德畢赤酵母細胞壁敏感性分析採用sds，剛果紅兩種材料。sds敏感性分析採用的是在ypd固體培養基+1m山梨醇+終濃度為10 μg/ml或者20 μg/ml或者50 μg/ml sds。剛果紅敏感性分析採用的是在ypd固體培養基+1m山梨醇+終濃度為10 μg/ml或者20 μg/ml或者50 μg/ml 的剛果紅。
34.將對照巴斯德畢赤酵母菌株c3與巴斯德畢赤酵母菌株c4均按照相同的孢子數，分別選取10-5
、10-4
、10-3
個孢子/ml點種在相應平板上，放置30℃培養。培養24 h後，結果如圖4所示（a是剛果紅測定菌株敏感性；b是sds測定菌株敏感性）。結果表明，敲除pas_chr4_0305後，巴斯德畢赤酵母細胞壁對sds、剛果紅敏感性均有所降低，對環境耐受性有所提高。
35.實施例六、pas_chr4_0305基因敲除後的巴斯德畢赤酵母菌體中含量變化（1）粗蛋白測定：
①
收集菌體；
②
用ddh2o洗滌菌體3次除去固體鹽；
③
處理好的菌體在專用催化劑存在的情況下，通過熱催化高溫氧化反應進行消解反應：通過這種途徑，即便是非常穩定、複雜的含氮的化合物都可以在一定數量上被消解；樣品直接進入填充的反應管中高溫區，在這個區域中樣品在載氣流中發生高溫催化和氧化反應生成no；經高溫分解的氣體在一個旋管冷凝器中冷卻，然後冷卻水在接下來的tic冷凝管中與測定氣體分離，在進一步的乾燥並除去腐蝕性氣體之後，no測定用氣體通過cld檢測器；氮氧化物的濃度每秒被測定幾次，可以得到信號隨時間變化的峰圖；
④
峰面積與測定溶液中氮的濃度成比例；
⑤
通過使用先前確定的標準曲線可以計算樣品中含氮的含量；
⑥
在測定出總氮量後，菌體中粗蛋白質含量的計算公式如下: 蛋白質(g/100g)=總氮量(g/100g)
×
6.25。
36.（2）通過250ml搖瓶及5l發酵罐發酵誘導測總氮結果如表2所示。結果表明：搖瓶和發酵罐不同發酵規模下，敲除pas_chr4_0305基因後，巴斯德畢赤酵母菌體中粗蛋白含量均提高18.7-20.7%左右，菌體乾重也提升18.6-21.4%。
37.表2：pas_chr4_0305敲除株與對照巴斯德畢赤酵母菌株c3在不同發酵規模條件下菌體乾重和粗蛋白含量變化情況（2）菌體組成分析：將對照巴斯德畢赤酵母菌株c3與巴斯德畢赤酵母菌株c4菌體收集後，取大約1 g(菌體乾重)的樣品，加入5 ml 72%(w/w)的硫酸在30 ℃下處理2.5 h，然後用玻璃攪拌棒每
15分鐘攪拌一次。用181.7 ml水稀釋，然後在121 ℃高壓滅菌1 h。高壓滅菌冷卻後立即以10,000
×
g離心20 min，以去除固體顆粒。上清液過0.22微米的過濾器。在aminex hpx-87h色譜柱（bio-rad，hercμles，ca，usa）上，使用帶有折射率檢測器（shimadzu，shimadzu）的高效液相色譜（高效液相色譜法，島津，日本，京都）測定葡萄糖、甘露糖和n-乙醯基-d-葡萄糖胺濃度。柱溫度為60 ℃，流動相為5 mm h2so4，流速為0.6 ml/min。根據計算葡聚糖和甘露聚糖的濃度，將葡萄糖含量轉化為β-1,3葡聚糖含量，甘露糖含量轉化為甘露聚糖含量和n-乙醯基-d-葡萄糖胺含量轉化為幾丁質的含量。其計算公式為：β-1,3葡聚糖含量=葡萄糖濃度*0.9/總乾重；甘露聚糖含量=甘露糖濃度*0.88/總乾重；幾丁質含量=n-乙醯基-d-葡萄糖胺*0.9/總乾重。從圖5顯示的結果可以看出，pas_chr4_0305基因敲除後，巴斯德畢赤酵母細胞壁組成有所改變，幾丁質相對含量減少9.2%，β-1,3葡聚糖相對含量提升了12.1%，甘露聚糖相對含量增加2.4%，變化不太明顯，說明pas_chr4_0305基因敲除後，巴斯德畢赤酵母細胞壁組成發生重排。