一株氣單胞菌及其在降解多環芳烴中的應用
2024-04-16 04:50:05
1.本發明涉及微生物學、生物化學和發酵工程技術領域，特別涉及一株氣單胞菌及其應用。
背景技術：
2.多環芳烴(pahs)具有毒性、遺傳毒性、突變性和致癌性，可對人體可造成多種危害，如對呼吸系統、循環系統、神經系統損傷，對肝臟、腎臟造成損害，被認定為影響人類健康的主要有機汙染物。
3.由於工業煉焦活動，化石能源和城市垃圾等有機物的不完全燃燒，使得多環芳烴在土壤、沉積物和廢水中大量存在。環境中的多環芳烴可以通過多種途徑進入人體，進而危害人類健康，因此對多環芳烴汙染的治理和修復受到人們的普遍關注。微生物修復技術是指通過微生物的作用清除土壤和水體中的汙染物，或是使汙染物無害化的過程。近半個世紀以來，由於具有工程量小、能耗低、成本低、環境友好等特點，微生物修復法被越來越多的人認識並在多環芳烴汙染修復領域得到廣泛的應用。
4.但是，由於多環芳烴疏水性強，性質穩定，且缺乏高效的降解菌，使得微生物修復降解多環芳烴普遍存在效率低，周期長等問題。因此，開展多環芳烴高效降解菌劑的研究，已經成為多環芳烴汙染修復領域的研究熱點。
技術實現要素：
5.本發明目的是提供一株氣單胞菌及其在降解多環芳烴中的應用，該株氣單胞菌對多環芳烴的降解效果高。
6.在本發明的第一方面，提供了一株氣單胞菌(aeromonas sp.bcp-3)，所述氣單胞菌的保藏編號為：cctcc no：m 2022117。
7.在本發明的第二方面，提供了一種發酵菌劑，所述發酵菌劑包括：
8.將所述的氣單胞菌進行發酵獲得的發酵液；
9.或將所述發酵液經噴霧乾燥獲得乾粉菌劑。
10.在本發明的第三方面，提供了所述的氣單胞菌培養方法，所述方法包括：將氣單胞菌(aeromonas sp.bcp-3)或者發酵菌劑加入到培養基中進行培養。
11.所述的培養基為以多環芳烴為唯一碳源的msm液體培養基，其中多環芳烴的濃度為10～400mg/l之間；
12.所述msm培養液的配方為：
13.1l培養液中的成分如下：1.3～2.0g kh2po4、4.5～6.5g k2hpo3·
3h2o、0.5～2.4g nh4cl、0.4～1.0g nacl、100～500mg mgso4、0～100mg mnso4·
h2o、0～100mg feso4·
7h2o、0～100mg cacl2，鹽度維持在0.7～1.2％範圍內。
14.所述msm液體培養基的ph為6.8～7.2。
15.所述培養的溫度為30～35℃。
16.在本發明的第四方面，提供了所述的氣單胞菌在降解多環芳烴中的應用。
17.所述多環芳烴包括：萘、苊、苊烯、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯並[a]蒽、苯並[b]熒蒽、苯並[k]熒蒽、苯並[a]芘、二苯並[a,h]蒽、茚並[1,2,3-c,d]芘和苯並[g,h,i]苝中的一種或多種。
[0018]
所述的應用場景包括：受多環芳烴汙染的土壤和水體。
[0019]
所述的應用方法包括：
[0020]
先將所述的氣單胞菌或者所述的發酵菌劑進行培養，待微生物數量達到107～109cfu/ml時，獲得活化菌液。
[0021]
針對多環芳烴汙染水體：將所述活化菌液按5～20％(v/v)的比例投加到含有多環芳烴汙染物的汙水中，進行生物降解，保證水體溶解氧4.0～7.0mg/l；
[0022]
針對多環芳烴汙染土壤：先將所述活化菌液按5～20％(v/v)的比例投加到權利要求3所述的msm培養液中獲得稀釋後的菌液，後將汙染土壤與所述稀釋後的菌液按1:1～1:3(w/v)的比例混合均勻進行生物降解，保證水體溶解氧4.0～7.0mg/l，攪拌並補充0.5～1.5％體積的表面活性劑以促進多環芳烴的溶解。
[0023]
本發明實施例中的一個或多個技術方案，至少具有如下技術效果或優點：
[0024]
本發明提供的一株氣單胞菌及其應用，由發明人從武漢某焦化廢水處理廠二沉池的活性汙泥中通過馴化培養富集分離等手段篩選出來的，對多環芳烴的降解效果顯著。
[0025]
本發明的氣單胞菌的保藏日期為2022年2月14日，保藏編號為cctcc no：m 2022117。其分類命名為氣單胞菌(aeromonas sp.bcp-3)，保藏單位名稱為中國典型培養物保藏中心，地址為中國湖北省武漢市武漢大學，郵編：430072。
附圖說明
[0026]
為了更清楚地說明本發明實施例中的技術方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作一簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其它的附圖。
[0027]
圖1是氣單胞菌(bcp-3)的菌落形態圖(培養皿直徑9cm)；
[0028]
圖2是氣單胞菌(bcp-3)的系統發育樹；
[0029]
圖3是不同培養溫度下專利氣單胞菌的生長情況及其對多環芳烴的降解效率；
[0030]
圖4是不同培養基初始ph值下專利氣單胞菌的生長情況及其對多環芳烴的降解效率；
[0031]
圖5菌株對模擬條件下複合多環芳烴的降解效率；
[0032]
圖6菌株對實際汙染水體的降解效果；
[0033]
圖7菌株對實際汙染土壤的降解效果。
具體實施方式
[0034]
下文將結合具體實施方式和實施例，具體闡述本發明，本發明的優點和各種效果將由此更加清楚地呈現。本領域技術人員應理解，這些具體實施方式和實施例是用於說明本發明，而非限制本發明。
[0035]
在整個說明書中，除非另有特別說明，本文使用的術語應理解為如本領域中通常所使用的含義。因此，除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域技術人員的一般理解相同的含義。若存在矛盾，本說明書優先。
[0036]
除非另有特別說明，本發明中用到的各種原材料、試劑、儀器和設備等，均可通過市場購買獲得或者可通過現有方法獲得。
[0037]
本技術實施例的技術方案為解決上述技術問題，總體思路如下：
[0038]
本技術發明人從採集於從武漢某焦化廢水處理廠二沉池的活性汙泥中通過馴化培養富集分離等手段篩選出來的一株微生物，發現該菌株具有高效降解多環芳烴的能力，該細菌經菌落形態、生化及16s rrna測序分析，該菌株與氣單胞菌屬(pseudomonas)多個的菌株同源性均在96％以上，結合生理生化特性，初步確定該菌株屬氣單胞菌屬(pseudomonas)，並命名為氣單胞菌菌株(aeromonas sp.bcp-3)。
[0039]
與普通的氣單胞菌相比，本發明的氣單胞菌對多環芳烴的降解效果高，針對305mg/l的模擬多環芳烴溶液，7天可以達到90％的降解效果；針對389.81mg/l的實際多環芳烴汙水，14天可以達到92％的降解效果；針對135.53mg/kg的實際多環芳烴汙染土壤，21天可達到74％的降解效果。
[0040]
下面將結合實施例及實驗數據對本技術的一株氣單胞菌及其應用進行詳細說明。
[0041]
實施例1菌株的定向富集分離與鑑定
[0042]
1、菌株的定向富集分離
[0043]
取武漢某焦化廢水處理廠二沉池的活性汙泥樣品，將採集的50g樣品加入150ml無菌生理鹽水，在30℃、200r/min的搖床條件下，培養1d，靜置1h後，取上清液100ul塗布於芘-msm固體培養基上，置於30℃培養箱，培養24～120h。觀察培養結果，挑選合適的菌株，挑取劃線，重複此過程，直至得到單一菌落。將單一菌在芘-msm液體培養基中培養，待培養基渾濁後加入甘油管中，置於-80℃環境下保存。
[0044]
所述芘-msm固體培養基的配方為：
[0045]
在上述msm培養液配方的基礎上，每升溶液額外添加10～15g瓊脂、10～400mg芘。
[0046]
所述芘-msm固體培養基的製作方法為：
[0047]
稱取1～40mg芘，用5ml丙酮溶解，加入至剛滅菌的溫度在50～80℃範圍內的100ml msm培養基中；均勻搖晃，待丙酮揮發後，得到芘濃度為10～400mg/l的msm培養基；趁熱取10～15ml含芘的msm培養基，傾入到無菌培養皿中，待凝固後得到芘-msm固體培養基。
[0048]
所述芘-msm液體培養基的配方為：
[0049]
在上述msm培養液配方的基礎上，每升溶液額外添加10～400mg芘。
[0050]
所述芘-msm液體培養基的製作方法為：
[0051]
以丙酮為溶劑，溶解10～400mg的芘後加入到已經滅菌的一升msm培養基中，待丙酮揮發後即為芘-msm液體培養基。
[0052]
2、菌株的鑑定
[0053]
(1)菌株的菌體及菌落形態特徵
[0054]
將-80℃冰箱中甘油保藏的菌株菌液在冰上解凍，用接種環取一環菌液在lb瓊脂平板上進行劃線，將培養皿倒置於恆溫培養箱中30℃培養24h左右，觀察菌落形態，圖1是氣單胞菌(bcp-3)的菌落形態圖。
[0055]
取lb瓊脂平板上長出的單菌落，進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體形態，結果為革蘭氏陰性菌。
[0056]
(2)遺傳學特徵
[0057]
取該氣單胞菌，於lb液體培養基中擴大培養，取新鮮菌液用細菌基因組提取試劑盒提取其基因組。將提取得到的基因組，用通用引物27f和1492r進行pcr擴增，pcr體系為：2x taq plus pcr master mix 25μl、ddh2o 19μl、通用引物27f 2μl、通用引物1492r 2μl、模板dna 2μl。取pcr擴增得到的產物10μl，於1.5％的瓊脂糖凝膠中電泳檢測，確認有清晰明亮的條帶後將剩餘的pcr產物送測序公司測序，測序結果如seq id no:1所述。
[0058]
將測序結果與blast搜索程序從資料庫(ncbi)中基因序列進行比對分析，並構建系統發育樹(圖2所示)，現菌株與氣單胞菌同源性達到了96％。結合生理生化特性，確定菌株為氣單胞菌屬，並命名為氣單胞菌菌株(aeromonas sp)，並於2022年2月14日於中國典型培養物保藏中心進行保藏，保藏編號為cctcc no：m 2022117。
[0059]
實施例2菌株對多環芳烴的降解條件與降解率的測定
[0060]
1、菌株在不同降解條件下對多環芳烴芳烴的降解效果；
[0061]
(1)不同培養溫度條件下本專利氣單胞菌(bcp-3)對多環芳烴的降解效率；
[0062]
配置msm培養液，121℃滅菌20min，冷卻後加入無菌的芘母液，使其芘濃度為50mg/l(芘-msm液體培養基的製作方法見實施例1)。將已活化的菌株bcp-3分別接入不同培養液中，調整培養溫度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃)、200rpm振蕩培養，2d後測定降解菌生長情況(od600)及芘濃度的降解情況。
[0063]
圖3是不同培養溫度條件下本專利氣單胞菌(bcp-3)的生長情況及其對多環芳烴的降解效率。由圖可以看出，菌株bcp-3可生長的溫度範圍為20～45℃，最適生長溫度為30～35℃。
[0064]
(2)不同培養基初始ph值條件下本發明的氣單胞菌(bcp-3)對多環芳烴的降解效率。
[0065]
在msm培養液的基礎上調整ph(5、6、7、8、9、10)，121℃滅菌20min，冷卻後加入無菌的芘母液，使其芘濃度為50mg/l(芘-msm液體培養基的製作方法見實施例1)。將已活化的菌株bcp-3分別接入不同ph的培養液中，30℃、200rpm振蕩培養，2d後測定降解菌生長情況(od600)及芘濃度的降解情況。
[0066]
圖4是不同培養基初始ph值條件下本專利氣單胞菌(bcp-3)的生長情況及其對多環芳烴的降解效率。由圖可以看出，菌株bcp-3可生長的ph範圍為5～9，最適生長ph為7。
[0067]
2、菌株對模擬條件下複合多環芳烴的降解
[0068]
菌種活化：為了方便比較本發明所發現的氣單胞菌(bcp-3)在降解多環芳烴應用方面的獨特性與優越性，通過上海保藏生物技術中心購得一株維氏氣單胞菌(保藏編號atcc35622，為方便表述，後文簡稱網購氣單胞菌)進行相同實驗分析。將氣單胞菌bcp-3與網購氣單胞菌分別在獨立的培養體系中活化擴培，其中氣單胞菌bcp-3在以多環芳烴為唯一碳源的msm液體培養基中進行擴培(培養基成分和培養條件見上述說明書)，網購的某氣單胞菌在lb培養基中培養。待兩菌種的總活菌數分別達到107～109cfu/ml時，保存備用。
[0069]
模擬多環芳烴溶液的製備：配置msm培養液，121℃滅菌20min，冷卻後加入無菌的pahs母液，使其中各pahs濃度分別為：100mg/l nap、50mg/l phe、50mg/l ant、25mg/l fla、
25mg/l byr、25mg/l baa、25mg/l bbf、2.5mg/l bap以及2.5mg/l dbaha。溶液的初始pahs總濃度為305mg/l，初始ph為7。
[0070]
實驗及測試條件：實驗在250ml錐形瓶中進行，反應總體系200ml，設置空白對照組(添加20ml的培養液和180ml的模擬多環芳烴溶液)、網購氣單胞菌對照組(添加20ml活化後的網購氣單胞菌和180ml的模擬多環芳烴溶液)和氣單胞菌bcp-3實驗組(添加20ml活化後的氣單胞菌bcp-3和180ml的模擬多環芳烴溶液)。每組三個平行，置於搖床中，在30℃、200rpm條件下，避光振蕩培養21天，間歇性曝氣使得溶解氧維持在4.0-7.0mg/l的範圍內。並於0、1、3、7、14、21天分別取樣，用國標法(hj 478-2009)測試體系中殘留pahs的濃度。
[0071]
實驗結果：各pahs組分降解效果如附圖5所示，為了方便對比實驗組和對照組的降解效果，將7天各pahs組分的降解率匯總如下表1。
[0072]
表1針對模擬複合多環芳烴本發明菌株的7天降解效果比較(mg/l)
[0073][0074]
由圖5和表1可知，針對模擬條件下305mg/l的複合pahs溶液，本發明的氣單胞菌bcp-3與網購的氣單胞菌相比降解效果顯著，7天即達到90％的降解率並趨於穩定，21天時達到96％的降解率。
[0075]
實施例3菌株在降解實際汙染水體和土壤中多環芳烴的應用
[0076]
1、菌株對實際汙染水體中多環芳烴的降解
[0077]
菌種活化：按照實施例2的方式準備氣單胞菌bcp-3和網購氣單胞菌，保存備用。
[0078]
實際汙水：汙水來源為武漢某焦化廢水處理廠調節池池水，經國標法(hj 478-2009)測試分析發現，該汙水初始16種pahs總濃度為389.81mg/l，各pahs成分含量見下表2。
[0079]
實驗條件：實驗在250ml錐形瓶中進行，反應總體系200ml，設置空白對照組(添加20ml的培養液和180ml的實際汙水)、網購氣單胞菌對照組(添加20ml活化後的網購氣單胞菌和180ml的實際汙水)和氣單胞菌bcp-3實驗組(添加20ml活化後的氣單胞菌bcp-3和180ml的實際汙水)。每組三個平行，置於搖床中，在30℃、200rpm條件下，避光振蕩培養21天，間歇性曝氣使得溶解氧維持在4.0-7.0mg/l的範圍內。並於0、1、3、7、14、21天分別取樣，用國標法(hj 478-2009)測試體系中殘留pahs的濃度。
[0080]
實驗結果：實際汙水中pahs降解效果如附圖6，為了方便對比實驗組和對照組的降
解效果，將14天各pahs組分的降解率匯總如下表2。
[0081]
表2菌株對實際汙水中16種pahs的14天降解效果比較(mg/l)
[0082][0083][0084]
由圖6和表2可知，針對389.81mg/l的實際汙水，本發明的氣單胞菌bcp-3與網購的氣單胞菌相比降解效果顯著，14天可達到92％的降解率並趨於穩定，21天時達到96％的降解率。
[0085]
2、菌株對實際汙染土壤中多環芳烴的降解
[0086]
菌種活化：按照實施例2的方式準備氣單胞菌bcp-3和網購氣單胞菌，保存備用。
[0087]
實際土壤：土壤來源為徐州某廢棄焦化廠場地用土，於陰涼處自然風乾，研磨，過10目篩，除去樹枝等雜質後，保存備用。經過國標法(hj 805-2016)測試分析發現，該土壤中16種pahs的初始總濃度為135.53mg/kg，各pahs成分含量見下表3。
[0088]
實驗條件：實驗在250ml錐形瓶中進行，將汙染土壤與培養液(稀釋後的菌液，參照具體實施方案)按1:3(w/v)的比例混合，設置空白對照組(添加50g多環芳烴實際汙染土壤和150ml無菌培養液)、網購氣單胞菌對照組(添加50g多環芳烴實際汙染土壤、15ml的活化後的網購氣單胞菌和135ml培養液)和氣單胞菌bcp-3實驗組(添加50g多環芳烴實際汙染土壤、15ml活化後的氣單胞菌bcp-3和135ml培養液)。每組三個平行，置於搖床中，在30℃、200rpm條件下，避光振蕩培養21天，間歇性曝氣使得溶解氧維持在4.0-7.0mg/l的範圍內，補充1％體積的表面活性劑(tween80)以促進多環芳烴的溶解。並於0、1、3、7、14、21天分別取樣，用國標法(hj 805-2016)測試體系中殘留pahs的濃度。
[0089]
實驗結果：實際土壤中pahs降解效果如附圖7，為了方便對比實驗組和對照組的降解效果，將第21天各pahs組分含量匯總如下表3。
[0090]
表3菌株對實際汙染土壤中16種pahs的21天降解效果比較(mg/kg)
[0091][0092][0093]
由圖7和表3可知，針對135.53mg/kg的實際汙染土壤，本發明的氣單胞菌bcp-3與網購的氣單胞菌相比降解效果顯著，21天可達到74％的降解率。
[0094]
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
[0095]
最後，還需要說明的是，術語「包括」、「包含」或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設備所固有的要素。
[0096]
儘管已描述了本發明的優選實施例，但本領域內的技術人員一旦得知了基本創造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優選實施例以及落入本發明範圍的所有變更和修改。
[0097]
顯然，本領域的技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和範圍。這樣，倘若本發明的這些修改和變型屬於本發明權利要求及其等同技術的範圍之內，則本發明也意圖包含這些改動和變型在內。