芋螺雙α螺旋抗菌肽、其製備方法及其應用與流程
2024-04-15 17:09:05
芋螺雙
α
螺旋抗菌肽、其製備方法及其應用
技術領域
1.本發明涉及生物醫藥技術領域，具體涉及芋螺雙α螺旋抗菌肽、其製備方法及其應用。
背景技術：
2.芋螺是一種肉食性海洋腹足綱軟體動物，以其美麗的外殼和體內分泌的特殊毒素而聞名。芋螺在世界海洋物種中登記在冊有約1000餘種，它們普遍生活在世界多地的熱帶和亞熱帶潮間帶。芋螺的毒液中可產生數百種芋螺毒素肽，能夠用於捕食包括蠕蟲、蝸牛或魚類在內的各種動物。在過去的幾十年裡，已經發現了超過70000種天然芋螺毒素，廣泛用於藥理學和神經科學研究。由於其化學結構新穎、生物活性強、靶向選擇性高，也是具有吸引力的新藥資源。
3.由於傳統抗生素的濫用，導致細菌耐藥性的問題日益嚴重，尋找新的抗生素變得越來越困難。抗菌肽是宿主防禦肽，其中大多數是陽離子(帶正電荷)和兩親(親水和疏水)α螺旋/β摺疊肽分子。基於膜滲透性，陽離子抗菌肽可以與帶負電的細胞膜結合併相互作用，使細胞膜上電化學電位產生變化，誘導細胞膜損傷使蛋白質等較大分子進行滲透，破壞細胞形態和細胞膜，最終導致細胞死亡。與傳統抗生素相比，這些抗菌肽具有廣泛的抗菌活性，包括抗細菌、抗真菌、抗病毒和抗癌，甚至克服了細菌的耐藥性，是目前最具有潛力替代抗生素的一類生物資源。
4.抗菌肽作為先天性免疫防禦系統的重要組成部分，是抵禦外源性病原體的第一道防線。由於其廣譜抗菌活性、感染後迅速合成、不易產生耐藥性而被廣泛研究。複雜的多組分毒液含有多種生物活性肽，其中也包括抗菌肽，已在蜘蛛、蛇、蠍子和蜜蜂等多種有毒動物中發現，作為治療藥物具有很好的開發前景。
5.儘管迄今為止已經從動物、真菌、植物和細菌中鑑定出超過3000個抗菌肽。在多種能產生毒液的動物中也發現了大量具有生物活性的抗菌肽。來自5種螞蟻的15條毒液短肽序列被報導具有抗菌活性。來自7種蜜蜂的13條毒液短肽序列被報導具有抗體活性。來自9種蛇的10條毒液短肽序列被報導具有抗體活性。來自30餘種蜈蚣中發現了55條具有活性的抗菌肽等。被報導的抗菌肽大部分具有抗細菌活性，部分具有抗真菌或抗其他病原微生物活性。
6.然而，與蠕蟲、蝸牛、魚類等這些動物相比，芋螺體內的抗菌肽的研究很少，目前只有幾條抗菌肽序列被報導，且對這些芋螺抗菌肽的抗菌應用研究更是極為稀少。此前的一項研究報導，一種來自芋螺o1超家族的conotoxin可以抑制結核分枝桿菌的生長。另一種來自芋螺ω-conotoxin的開鏈mviia結構可以抑制真菌的生長。現有技術中，芋螺來源的抗菌肽普遍存在數量少且抗菌種單一的問題，此外，現有的抗菌肽大多數為盲目篩選獲得，例如通過實驗手段直接從生物分離提取，或將獲得的抗菌肽基因序列克隆後導入微生物培養，然後再通過一系列的實驗手段進一步分離純化和鑑定。例如，中國專利文獻cn115232850a公布的海洋生物抗菌肽的製備方法，通過將海洋生物材料凍乾粉碎後，再進行酶解，分離提
取抗菌肽；中國專利文獻cn115057918a公布的美洲鰻鱺新型抗菌肽的體外重組表達及鑑定，從美洲鰻鱺中克隆到殺菌蛋白的抗菌結構域基因，然後構建表達載體，導入大腸桿菌進行表達，然後再進行使用色譜純化柱進行層析純化後進一步鑑定。這些方法不僅實驗流程多，操作繁瑣，而且耗費時間長，效率低下，成本也高，不利於抗菌肽的開發研究及應用。
7.因此，如何快速有效地深入挖掘芋螺多肽的抗菌功能，並獲取更多易獲得的、抗菌種廣泛的芋螺抗菌肽，為取代傳統抗生素治療藥物提供更多選擇，具有重要的研究意義和潛在的市場價值。
技術實現要素：
8.為解決上述技術問題，本發明提供一種芋螺雙α螺旋抗菌肽，所述抗菌肽的胺基酸序列為seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4中的一種。
9.進一步地，編碼所述seq id no:1所示的胺基酸序列的核苷酸序列如seq id no:5所示，編碼所述seq id no:2所示的胺基酸序列的核苷酸序列如seq id no:6所示，編碼所述seq id no:3所示的胺基酸序列的核苷酸序列如seq id no:7所示，編碼所述seq id no:4所示的胺基酸序列的核苷酸序列如seq id no:8所示。
10.進一步地，所述抗菌肽包含雙α螺旋結構。
11.進一步地，所述抗菌肽能夠特異性抑制畢氏酵母、畢氏酵母和停乳練球菌、畢氏酵母和大腸桿菌的生長。
12.在本發明的另一個方面，本發明還提供了一種前述的芋螺雙α螺旋抗菌肽的前體蛋白，所述芋螺雙α螺旋抗菌肽前體蛋白的胺基酸序列為seq id no:9、seq id no:10、seq idno:11或seq id no:12中的一種，其中，序列為seq id no:9的芋螺雙α螺旋抗菌肽前體蛋白根據seq id no:5所示的核苷酸序列編碼確定，序列為seq id no:10的芋螺雙α螺旋抗菌肽前體蛋白根據seq id no:6所示的核苷酸序列編碼確定，序列為seq id no:11的芋螺雙α螺旋抗菌肽前體蛋白根據seq id no:7所示的核苷酸序列編碼確定，序列為seq idno:12的芋螺雙α螺旋抗菌肽前體蛋白根據seq id no:8所示的核苷酸序列編碼確定。
13.在本發明的另一個方面，一種芋螺雙α螺旋抗菌肽的製備方法，所述方法用於製備權利要求1-4中任意一項所述的芋螺雙α螺旋抗菌肽，具體步驟如下：
14.1)獲得芋螺多組學數據集，所述多組學數據集包括芋螺基因組、轉錄組和毒液蛋白組數據集；
15.2)採用同源比對的方法，從芋螺多組學數據集中識別抗菌肽前體基因序列；
16.3)基於密碼子編碼規則，將識別的抗菌肽前體基因序列翻譯成芋螺抗菌肽前體蛋白，獲得芋螺抗菌肽前體蛋白的胺基酸序列；
17.4)參照已知抗菌活性的抗菌肽多肽片段，通過理化性質計算和蛋白質三維結構預測，對獲得的芋螺抗菌肽前體蛋白胺基酸序列潛在的成熟活性肽區域進行人工篩選設計，得到芋螺抗菌肽的胺基酸序列；
18.5)通過化學合成方法，根據設計得到的芋螺抗菌肽的胺基酸序列合成多肽；
19.6)將合成的多肽與不同微生物混合培養，鑑定其抑菌效果，從而獲得芋螺抗菌肽。
20.具體地，步驟4)中，所述對獲得的芋螺抗菌肽前體蛋白胺基酸序列潛在的成熟活性肽區域進行人工篩選設計，設計的多肽符合以下條件：
21.a.其為帶有正電荷的陽離子，
22.b.其等電點大於8.0，
23.c.其ctdd和paac值大於0.5，
24.d.其具有雙α螺旋結構，
25.e.其胺基酸序列中半胱氨酸數量少於5個，
26.f.其胺基酸序列長度不超過30個胺基酸。
27.具體地，步驟6)中，將合成的多肽與不同微生物混合培養，所述微生物包括實驗用大腸桿菌、畢赤酵母和停乳鏈球菌。
28.本發明的再一方面，本發明還提供了一種上述技術方案所述的芋螺來源的抗菌肽在製備抗真菌和抗細菌產品中的應用。
29.進一步地，所述真菌為畢赤酵母，所述細菌為停乳鏈球菌和大腸桿菌。
30.進一步地，所述應用至少包括以下應用中的一項：
31.(i)製備抑菌劑；
32.(ⅱ)製備藥物；
33.(ⅲ)製備添加劑。
34.進一步地，所述抑菌劑、藥物和添加劑中，均含有濃度為97.5-780μmol/l的胺基酸序列如seq id no:1所示的芋螺雙α螺旋抗菌肽、濃度為9.0-572μmol/l的胺基酸序列如seq idno:2所示的芋螺雙α螺旋抗菌肽、濃度為46-367μmol/l的胺基酸序列如seq id no:3所示的芋螺雙α螺旋抗菌肽或濃度為183-366μmol/l的胺基酸序列如seq id no:4所示的芋螺雙α螺旋抗菌肽。
35.優選地，所述抑菌劑、藥物和添加劑中，當選用胺基酸序列如seq id no:1所示的芋螺雙α螺旋抗菌肽製備抗大腸桿菌的產品時，抗菌肽的濃度優選為97.5μmol/l、195μmol/l、390μmol/l或780μmol/l；
36.當選用胺基酸序列如seq id no:1所示的芋螺雙α螺旋抗菌肽製備抗畢赤酵母的產品時，抗菌肽的濃度優選為24.4μmol/l、48.8μmol/l、195μmol/l、390μmol/l或780μmol/l；
37.當選用胺基酸序列如seq id no:2所示的芋螺雙α螺旋抗菌肽製備抗停乳鏈球菌的產品時，抗菌肽的濃度優選為17.9μmol/l、35.8μmol/l、71.5μmol/l、143μmol/l、286μmol/l或572μmol/l；
38.當選用胺基酸序列如seq id no:2所示的芋螺雙α螺旋抗菌肽製備抗畢赤酵母的產品時，抗菌肽的濃度優選為9.0μmol/l、17.9μmol/l、35.8μmol/l、71.5μmol/l、143μmol/l或286μmol/l；
39.當選用胺基酸序列如seq id no:3所示的芋螺雙α螺旋抗菌肽製備抗畢赤酵母的產品時，抗菌肽的濃度優選為11.5μmol/l、23μmol/l、46μmol/l、92μmol/l、184μmol/l或367μmol/l；
40.當選用胺基酸序列如seq id no:4所示的芋螺雙α螺旋抗菌肽製備抗畢赤酵母的產品時，抗菌肽的濃度優選為183或366μmol/l。
41.與現有技術相比，本發明的有益效果在於：
42.1.本發明從芋螺多組學數據集中挖掘出四種芋螺抗菌肽，並首次發現了其可抗三
種不同真菌和細菌的作用，強調了芋螺多肽的抗菌潛力，其中acipensin_6-1和acipensin_6-2均能抑制真菌畢赤酵母的生長，tcp-1對大腸桿菌和畢赤酵母表現出抑制活性，cbtbeta對停乳鏈球菌和畢赤酵母表現出抑制活性，豐富了芋螺抗菌肽的種類及抑菌種類，並有望將其應用製備具有抗菌活性的產品並代替抗生素用於臨床中真菌或細菌感染的治療，具有良好的應用前景及經濟價值。
43.2.本發明基於多組學的方法，從生物學大數據層面篩選出多條潛在的抗菌肽序列，結合活性模擬預測與體外實驗驗證，能夠快速高效鑑定出具有生物活性的抗菌肽。
44.3.本發明提供的抗菌肽，均具有雙α螺旋結構，雙親性較好，與微生物膜結合的能力較好。
附圖說明
45.圖1為本發明提供的胺基酸序列為seq id no:1-4的抗菌肽的三維結構示意圖；
46.圖2為本發明提供的胺基酸序列為seq id no:1的抗菌肽合成後的高效液相色譜圖；
47.圖3為本發明提供的胺基酸序列為seq id no:1的抗菌肽合成後的質譜圖；
48.圖4為本發明提供的胺基酸序列為seq id no:2的抗菌肽合成後的高效液相色譜圖；
49.圖5為本發明提供的胺基酸序列為seq id no:2的抗菌肽合成後的質譜圖；
50.圖6為本發明提供的胺基酸序列為seq id no:3的抗菌肽合成後的高效液相色譜圖；
51.圖7為本發明提供的胺基酸序列為seq id no:3的抗菌肽合成後的質譜圖；
52.圖8為本發明提供的胺基酸序列為seq id no:4的抗菌肽合成後的高效液相色譜圖；
53.圖9為本發明提供的胺基酸序列為seq id no:4的抗菌肽合成後的質譜圖；
54.圖10為本發明提供的胺基酸序列為seq id no:1的抗菌肽抑制大腸桿菌和畢赤酵母生長的活性檢驗效果圖；
55.圖11為本發明提供的胺基酸序列為seq id no:2的抗菌肽抑制停乳鏈球菌和畢赤酵母生長的活性檢驗效果圖；
56.圖12本發明提供的胺基酸序列為seq id no:3的抗菌肽抑制畢赤酵母生長的活性檢驗效果圖；
57.圖13本發明提供的胺基酸序列為seq id no:4的抗菌肽抑制畢赤酵母生長的活性檢驗效果圖。
58.技術術語
59.本發明的胺基酸全長序列中所用到的簡寫符號為本領域技術人員通用的縮寫符號，具體而言，r為精氨酸(arg)，l為亮氨酸(leu)，g為甘氨酸(gly)，n為天冬醯胺(asn)，c為半胱氨酸(cys)，t為蘇氨酸(thr)，v為纈氨酸(val)，m為甲硫氨酸(met)，a為丙氨酸(ala)，k為賴氨酸(lys)，f為苯丙氨酸(phe)，s為絲氨酸(ser)，p為脯氨酸(pro)，e為穀氨酸(glu)，i為異亮氨酸(ile)，q為穀氨醯胺(gln)，w為色氨酸(trp)。
具體實施方式
60.下面將對本發明的技術方案進行清楚、完整的描述，顯然，所描述的實施例是本發明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。以下實施例中所使用的材料、儀器和試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例中所使用的技術手段，如無特殊說明，均為本領域技術人員所熟知的常規手段。
61.本發明所選擇的中國桶形芋螺(conus betulinus)，採自海南省三亞市。
62.本發明採用同源比對的方法，從桶形芋螺的多組學數據中識別抗菌肽前體基因編碼序列。以公共抗菌肽資料庫apd3中的蛋白序列為參考序列，獲得四條桶形芋螺的抗菌肽前體基因核酸序列。
63.本發明利用四條桶形芋螺的抗菌肽前體基因核酸序列，參照具有已知抗菌活性的抗菌肽多肽片段，通過理化性質計算和蛋白質三維結構預測進行潛在成熟活性肽區域的設計。化學合成四條多肽序列，然後進行多肽的抗菌活性驗證實驗。經鑑定發現，本發明提供的四種多肽可被視為四種新型抗菌肽。
64.下述實施例中，胺基酸序列為seq id no:1的抗菌肽編號為tcp-1，胺基酸序列為seq id no:2的抗菌肽編號為cbtbeta，胺基酸序列為seq id no:3的抗菌肽編號為acipensin_6-1，胺基酸序列為seq id no:4的抗菌肽編號為acipensin_6-2，在此統一說明，具體實施例中不再贅述。
65.實施例一抗菌肽的前體基因dna序列和前體蛋白序列的獲取
66.按照如下步驟進行芋螺雙α螺旋抗菌肽的製備：
67.1)獲得芋螺多組學數據集，所述多組學數據集包括芋螺基因組、轉錄組和毒液蛋白組數據集；
68.2)採用同源比對的方法，從芋螺多組學數據集中識別抗菌肽前體基因序列；
69.3)基於密碼子編碼規則，將識別的抗菌肽前體基因序列翻譯成芋螺抗菌肽前體蛋白，獲得芋螺抗菌肽前體蛋白的胺基酸序列；
70.4)參照已知抗菌活性的抗菌肽多肽片段，通過理化性質計算和蛋白質三維結構預測，對獲得的芋螺抗菌肽前體蛋白胺基酸序列潛在的成熟活性肽區域進行人工篩選設計，得到芋螺抗菌肽的胺基酸序列；
71.5)通過化學合成方法，根據設計得到的芋螺抗菌肽的胺基酸序列合成多肽；
72.6)將合成的多肽與不同微生物混合培養，鑑定其抑菌效果，從而獲得芋螺抗菌肽。
73.具體實施方式為：
74.1.多組學數據集準備
75.本實施例中多組學數據集包括桶形芋螺的基因組、轉錄組和毒液蛋白組數據集。
76.其中，基因組數據集的ncbi登錄號為：gca_016801955.1。
77.轉錄組數據集包括5個樣本的轉錄組數據，分別為：big：體長10釐米大個體芋螺的毒管；middle：體長8.7釐米中等個體芋螺的毒管；small：體長6釐米小個體芋螺的毒管；bulb：上述中等個體芋螺的毒囊；normalized：上述中等個體芋螺毒管的均一化數據集。轉錄組數據集的ncbi sra資料庫登陸號為：srs1009725至srs1009729。
78.毒液蛋白質數據集的pride資料庫登錄號為：pxd014892。
79.使用transdecoder軟體預測每個轉錄本的蛋白質編碼區域，基因的轉錄水平採用fpkm值進行計算。所有來自基因組和轉錄組的蛋白質編碼序列翻譯成胺基酸，建立桶形芋螺的綜合蛋白質集。
80.2.從多組學數據集中篩選抗菌肽前體基因dna序列
81.以公共抗菌肽資料庫apd3中2927條已驗證的抗菌肽作為參考序列。
82.首先利用桶形芋螺基因組注釋的基因，使用blast軟體包中的makeblastdb建立一個用於序列比對的索引庫，命令為makeblastdb-dbtype nucl-parse_seqids-in conus.gene.cds。然後通過使用blast軟體中的tblastn算法(e值小於1e-5)從基因組中預測潛在的amp前體基因，保留比對率大於50％的序列，命令為tblastn-query apdeu.fa-db conus.gene.cds-outfmt 6-evalue 1e-5-out apdeu.fa.m8。接著登陸windows可視化軟體ampml軟體(2021，china，2021sr0424886，https://github.com/flystar233/ampml)上傳潛在的amp前體基因文件，選擇ctdd和paac模塊，對保留的序列中包含潛在抗菌肽蛋白序列的區段進行活性預測，並篩選出ctdd和paac模型中大於0.5的比對序列。
83.利用同樣的比對方法，對五個轉錄組的轉錄本數據集進行抗菌肽前體基因的預測。
84.隨後，以基因組和轉錄組數據集中共有的抗菌肽前體蛋白為參考序列，建立索引庫。使用blastp軟體將蛋白組數據對比到該索引庫，獲得三種組學數據集的最終共有抗菌肽序列集，其中比對長度大於50％、比對率大於80％的序列為可靠序列。
85.最後，從基因組、轉錄組和蛋白組數據集中獲得了四條潛在的抗菌肽前體基因的dna序列，如seq id no:5-8所示。利用轉錄規則，將上述抗菌肽前體基因翻譯為相應的前體蛋白序列，如seq id no:9-12所示。
86.實施例二桶形芋螺抗菌肽活性結構預測
87.根據實施例一中從多組學數據集中鑑定出的四個抗菌肽前體蛋白序列，參照公共抗菌肽資料庫apd3中已知的抗菌肽多肽序列進行潛在成熟活性肽區域的設計，如seq id no:1-4所示。
88.利用protparam工具對抗菌肽的理化性狀進行預測，包括分子量、等電點、淨電荷值和親水性平均值，如下表1所示：
89.表1：桶形芋螺四種含雙α螺旋結構的抗菌肽的理化性狀預測
[0090][0091]
為確保多肽具有抗菌活性的可能性較高，設計的多肽均符合以下條件：a.多肽為帶有正電荷的陽離子；b.等電點大於8.0；c.ctdd和paac值大於0.5；d.具有雙α螺旋結構；e.序列中半胱氨酸數量少於5個；f.序列長度不超過30個胺基酸。
[0092]
然後，利用適合短肽三維結構構建的軟體pep-fold3，進行構建上述四種多肽的三維結構，如圖1所示。基於三維模型的構建，四條合成的抗菌肽均含雙α螺旋結構。
[0093]
實施例三桶形芋螺抗菌肽的活性檢驗
[0094]
1.化學合成：
[0095]
採用標準胺基酸多肽固相合成方法合成其全序列，由上海吉爾生化有限公司定製完成。合成的多肽產物使用高效液相色譜系統(hplc)進行純化，然後以1ml/min乙腈梯度進行洗脫。如圖2、4、6和8所示，hplc-ms/ms測定的tcp-1、cbtbeta、acipensin_6-1和acipensin_6-2多肽粉末純度均在95％以上，如圖3、5、7和9所示，合成的線性肽分子量分別為2562.91、3497.95、2727.17和2731.2道爾頓(da)。最後將其保存於-80℃無菌去離子水中。
[0096]
2.活性檢驗：
[0097]
1)將合成的多肽(每個2mg)溶解在磷酸鹽緩衝液(pbs)中進行多次梯度稀釋，配製多個濃度待用。
[0098]
2)培養實驗用大腸桿菌、藤黃微球菌、停乳鏈球菌和畢赤酵母備用。
[0099]
3)每株菌培養至對數生長期後離心，pbs洗脫3次。
[0100]
4)所有微生物均重懸於pbs緩衝液(104cfu/ml)中。
[0101]
5)取10μl檢測菌懸液和10μl pbs多肽溶液樣本於200μl管中混合，37℃靜置培養2小時。pbs緩衝液作為空白對照。
[0102]
在抑菌試驗中，將混合物轉移至96孔酶標板孔中，每個孔包含200μl的lb培養基。將所有的酶標板孔置於37℃微生物培養箱中進行培養。每半小時測量一次od600值，總共20小時(細菌)或48小時(真菌)，用於繪製檢測微生物的生長曲線。每個多肽設置三個平行孔，實驗至少重複兩次，以獲得可靠的結果。
[0103]
所有數據均使用spss(statistical package for social sciences)和graphpad prism軟體進行統計，以均數
±
標準差(n＝3)表示。採用配對樣本t檢驗和多重比較的方法，檢驗各組間差異的顯著性。
[0104]
經鑑定發現，四種多肽對多種微生物表現出了抑制作用，抗菌活性結果如下表2所示：
[0105]
表2：桶形芋螺四種含雙α螺旋結構的抗菌肽的抗菌活性
[0106][0107]
註：「*」代表具有抗菌活性，「n」代表不具有抗菌活性
[0108]
如圖10-13所示，四種多肽均能抑制真菌畢赤酵母的生長。此外，兩種抗真菌的抗菌肽(cbtbeta和tcp-1)對不同細菌的生長也有抑制作用。cbtbeta能抑制革蘭氏陽性菌停乳鏈球菌，在572μm時達到最佳抑菌效果。tcp-1對革蘭氏陰性菌大腸桿菌具有顯著的抑菌能力，最小抑菌濃度為97.5μm。因此，本發明提供的芋螺來源的抗菌肽具有普遍的抗真菌能
力，同時具有特異性抑制革蘭氏陽性或陰性細菌的能力。
[0109]
綜上所述，上述各實施例僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限定本發明的保護範圍，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，皆應包含在本發明的保護範圍內。