用新型腺病毒治療癌症的方法和組合物的製作方法

2023-10-09 21:59:24 1

專利名稱：：用新型腺病毒治療癌症的方法和組合物的製作方法
技術領域：
：概括而言，本發明涉及一種癌症治療。具體而言，本發明涉及一種基於腺病毒的癌症治療。
背景技術：
：在過去的60年中儘管診斷和治療都有進步，但每年與癌症相關的死亡人數仍沒有下降。常規癌症療法(外科手術，放射療法，化學療法)對早期患者的治癒率較高，但許多癌症會復發且大部分晚期癌症患者最終還是死於該疾病。常規癌症療法的局限性不在於它們不能消除腫瘤，而在於消除腫瘤的同時對患者造成過度損傷。正是這種顧慮限制了外科切除手術的使用範圍、放射劑量和照射體積以及化療藥物的劑量和組合使用。若在腫瘤和正常組織之間的反應差異性沒有明顯提高(即治療指數)，則治療效力的改進是沒有臨床價值的。但是，治療癌症的改進方法和新型藥劑已提高了各種癌症患者的存活時間和存活率。例如，改進的手術的和放射療法的程序可更有效地切除局部的腫瘤。然而，手術方法由於例如腫瘤的位置或轉移腫瘤細胞的擴散而受到限制。放射療法也受其它限制放射劑量的因素的限制。具有一定抗輻射性的腫瘤在此劑量下不能被治癒。儘管單一的治療方法如放射療法，化學療法，手術或免疫療法可改善患者的病情，但組合使用這些方法可獲得更好的效果。尤其是，可定向於含有腫瘤的局部區域的放射療法和可提供全身治療模式的化學療法或免疫療法的組合治療對已發生或可能發生疾病擴散是有效的。不幸的是，放射療法的治療效力在腫瘤細胞具有一定抗輻射性時是受限的，因為劑量受到在輻射區域內正常組織的耐受力的限制。因而，需要使癌症腫瘤對放療的作用敏感化以便能更有效地降低患者體內的腫瘤的嚴重性。另外，發展一種能更特異地隔離輻射區域的治療是有效的，從而防止放射治療對健康細胞的影響。在有關方式中，為減少某些化學療法的不需要的效應，使用腺病毒載體以所謂的"化療基因"轉化腫瘤細胞，所述"化療基因"能將無毒性物質或"前體藥物"轉化成有毒的、有治療效果的形式。正在考慮利用幾種涉及基因治療的新方法來改進癌症治療的治療指數。這些方法之一為所謂的"自殺基因療法"，該方法包括轉運和表達非哺乳動物的基因，該基因編碼的酶將無毒性前體藥物轉化成有毒的抗代謝藥。目前正處於臨床試驗評價的兩種"自殺基因"是大腸桿菌的胞嘧啶脫氨酶(CD)和I型單純皰疹病毒的胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-1TK)基因，它們分別賦予5-氟胞嘧啶(5-FC)和9-(l,3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(GCV)的敏感性。這些基因靶向轉移至腫瘤後，前體藥物5-FC和GCV被局部地轉化成可導致大量腫瘤細胞死亡的有效化學治療藥劑(參見下面的參考文獻部分的列表中的參考文獻l(和它所引用的參考文獻))。因而，減輕了與常規化學療法相關的劑量限制性(dose-limiting)全身毒性。之前，已將細菌CD和野生型HSV-1TK基因偶聯以形成一種新型的CD/HSV-1TK融合基因(參見參考文獻部分列表中的參考文獻1)。CD/HSV-1TK融合基因可實現組合使用CD/5-FC和HSV-1TK/GCV自殺基因療法。之前已證明CD/5-FC和HSV-1TK/GCV自殺基因療法可使惡性腫瘤細胞對特定藥劑敏感，重要的是使它們對輻射敏感(參見參考文獻l-9)。使用一種含有原型CD/HSV-1TK融合基因(參考文獻IO)的新型的、溶瘤的和具有複製能力的腺病毒(Ad5-CD/TKr印)，在一些臨床前癌症模型中(參考文獻10-13)和最近在人前列腺癌患者(參考文獻14和15)中己證明了具有複製能力的腺病毒介導的雙自殺基因療法不結合和結合放射療法的安全性和療效。在這些以人前列腺癌為對象的臨床試驗中，當與長達三周的5-FC和GCV(vGCV)前體藥物治療結合，同時不結合(參考文獻14)和結合(參考文獻15)常規劑量(70Gy)的三維適形放射治療(threedimensionalconformalradiationtherapy,3DCRT)時，所述Ad5-CD/TKrep病毒的安全劑量高達1012病毒顆粒(Vp)。而且，這類治療方案已表現出具有臨床效果的跡象(參考文獻14和15)。但是，儘管有這些進步，仍強烈需要包括用於癌症治療的有效方法和組合物的發明。鑑於這些和其它不足開發了本發明。
發明內容本發明包括用於癌症治療的、新型的和改進的方法和組合物，該方法和組合物包括一種能有效殺死哺乳動物癌細胞的新型病毒。該病毒產生一種可將無毒性前體藥物轉化成有效的化療藥劑的新型蛋白。這類化療藥劑局部地產生並幫助病毒殺死癌細胞以及使癌細胞對輻射敏感。臨床前研究證明，無論單獨使用，還是與前體藥物療法和/或放射治療組合使用，所述病毒都能有效殺死各種人癌細胞。本發明包括一種新型的、"第二代"腺病毒(設計為"Ad5-yCD/ww汀KsR39^-ADP")，該病毒相對於之前已公開的原型Ad5-CD/Tkrep病毒具有至少兩種重要改進。Ad5-yCD/m^TKSR39re;-ADP含有一種改進的yCD/m"rTKSR39融合基因，該基因的產物可更有效地將5-FC和GCV前體藥物轉化成它們的活性化療藥劑。此外，Ad5-yCD/m^TKSR39^>ADP表達Ad5ADP蛋白，該蛋白明顯地提高了具有複製能力的腺病毒的溶瘤活性。相對於原型Ad5-CDITKrep病毒，Ad5-yCD/wwfTKSR39^-ADP已被證實在臨床前癌症模型中有更高的病毒溶瘤和化學療法的活性。數據表明了含有Ad5-yCD/mWrTKSR39rep-ADP病毒的本發明在與5-FC和GCV前體藥物治療和放射療法結合使用時表現出低毒性和明顯的抗腫瘤活性。在仔細研究以下的附圖和詳細描述後，本發明的其它方面對於本領域技術人員是顯而易見的。現在將以舉例的方式參照附圖描述本發明，其中圖1是本發明Ad5-yCD/mw/TKsR39r印-ADP病毒的示意圖。圖2是顯示本發明ADP基因的優勢的圖。圖3A和3B是顯示本發明的改進的yCD/m^TKsR39基因的優勢的圖。圖4是顯示本發明ADP基因的優勢的圖。圖5是Ad5-yCD/mwfTKSR39re/-ADP在前列腺內LNCaPC4-2小鼠模型中的開普萊-米耳(Kaplan-Meier)生存曲線圖。具體實施例方式概括而言，本發明包括用於治療癌症的方法和組合物。具體而言，本發明提供了一種當給予前體藥物時能殺死癌細胞並使殘餘的癌細胞對輻射更敏感的治療方法。本發明的實施方式包括一種能產生可將無毒性前體藥物轉化成化療藥劑的蛋白的新型病毒。前體藥物可被局部地生成或與所述治療聯合被給藥。優選地，病毒是一種溶瘤的並具有複製能力的病毒，例如但不限於Ad5-yCD/m"TKSR39w;-ADP。當被給予需要這種治療的患者時，所述腺病毒將至少兩種前體藥物轉化成化療藥劑。這些前體藥物包括但不限於5-氟胞嘧啶(5-FC)和9-(l，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(GCV及其衍生物)。除了能將前體藥物轉化成化療藥劑之外，本發明的實施方式可使細胞對輻射敏感。通過敏化細胞，可採用更低劑量的輻射且不限制輻射的優勢。而且，放射療法會更有效，因為癌細胞對輻射更敏感，而正常細胞不會更敏感，所以減少了癌症治療的副作用。本發明的療法可與其它療法如外科手術，化學療法，激素療法和免疫療法聯合使用。在優選的實施方式中，本發明包括了一種新型的、溶瘤的和具有複製能力的腺病毒(Ad5-yCD/羅fTKsR39^-ADP)，該腺病毒含有酵母胞嘧啶脫氨酶(yCD)/突變的SR39I型單純皰疹病毒的胸腺嘧啶核苷激酶(m""K^9)融合基因和5型腺病毒(Ad5)腺病毒死亡蛋白(ADP)基因。Ad5-yCD/w"/TKSR39re;-ADP在人癌細胞中複製並有效殺死人癌細胞。Ad5-yCD/m^TKSR39^p-ADP可產生一種能將兩種前體藥物5-氟胞嘧啶(5-FC)和9-(l,3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(GCV和GCV衍生物)轉化成有效的化療藥劑的yCD/wwfTKsR39融合蛋白(是指雙自殺基因療法)。yCD/5-FC和HSV-1TKSR39自殺基因療法都顯示出有效的化療活性並使腫瘤細胞對離子輻射敏感。僅通過舉例方式，臨床前研究表明Ad5-yCD/w"rTKSR39re;>ADP病毒單獨地使用或與雙自殺基因療法和/或放射療法聯合使用時可有效殺死各種人癌細胞。在臨床應用中，Ad5-yCD/mw/TKSR39;-ADP病毒可作為單一療法獲得它的病毒介導溶瘤效果，它可與yCD/5-FC和HSV-1Ad5-TKSR39/GCV自殺基因療法聯合使用獲得組合的病毒溶瘤/化療效果，或它可與yCD/5-FC和HSV-1Ad5-TKSR39/GCV自殺基因療法以及放射療法聯合使用(稱為三模型療法)獲得組合的病毒溶瘤/化療/射線敏感效果。在人的癌症治療中，三模型療法可與其它常規癌症療法如外科手術，化學療法，激素療法和免疫療法組合。為進一步開發這種基於基因治療的方法作為癌症療法，開發了一種新型的第二代腺病毒(Ad5-yCD/ww汀KsR39^p-ADP)，該腺病毒相對於原型Ad5-CD/Tkre;病毒具有至少兩種重要改進。Ad5-yCD/m^TKSR39^-ADP含有一種改進的yCD/mz^TK^9融合基因，該基因的產物可更有效地將5-FC和GCV前體藥物轉化成它們的活性化療藥劑。此外，Ad5-yCD/ww/TKSR39^/-ADP表達Ad5ADP蛋白，該蛋白明顯地提高了具有複製能力的腺病毒的溶瘤活性。相對於原型Ad5-CDITK/"印病毒，Ad5-yCD/ww"KSR39/^-ADP己被證實在臨床前癌症模型中有更高的病毒溶瘤和化學療法的活性。通過病毒感染導入本發明的核苷酸，提供了超過其它所列方法的多種優勢。由於病毒感染的特性可獲得更高的效率。而且，病毒高度特異化，並且一般感染特定的細胞類型並在特定的細胞類型中增殖。因而，在體內或組織中培養或細胞混合培養時，病毒的天然特異性可使載體靶向特定的細胞類型。還可根據特定受體或配體改進病毒載體以通過受體介導改變靶特異性。還可在載體上添加附加特徵以確保它的安全性和/或增強它的治療效果，這類特徵包括但不限於，例如，可用於負選擇被重組病毒感染的細胞的標記。這種負選擇標記的一個實例是上述的TK基因，該基因賦予對抗生素9-(l，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤的敏感性。因此負選擇是一種控制感染的手段，因為可通過添加抗生素誘導其自殺。這種保護確保了如果例如發生了改變病毒載體或重組序列的突變，也不會發生細胞轉化。在一些實施方式中還包括限制特定細胞類型表達的特徵。這類特徵包括，例如，對所需要的細胞類型特異的啟動子和調控元件。此外，重組病毒載體可用於本發明核苷酸的體內表達，因為它們提供了如橫向感染和靶向特異性的優勢。橫向感染是例如逆轉錄病毒的生命周期中所固有的，它是通過單個被感染細胞產生許多子代病毒顆粒，該病毒顆粒出芽逸出並感染鄰近細胞。結果造成大面積迅速地被感染，而其中的大部分開始都不是被原始病毒顆粒所感染的。這與感染因子僅通過子體後代傳播的豎向型感染相反。還可產生不能橫向傳播的病毒載體。這種特性對於期望將特定基因僅導入局部的一些靶細胞中是有用的。如上所述，病毒是非常特異的感染因子，在很多情況下已進化為可瓦解宿主的防禦機制。通常地，病毒感染特定的細胞類型並在這類細胞中增殖。病毒載體的靶向特異性利用了它的天然特異性以特異地靶向預定細胞類型，從而將重組基因導入被感染的細胞。本發明方法中所用的載體取決於所需的待耙向的細胞類型，本發明方法中所用的載體是本領域技術人員所公知的。例如，在治療乳腺癌時採用對這類上皮細胞特異的載體。同樣地，在治療造血系統的疾病或病狀時，採用對血細胞及它們的前體特異的病毒載體，優選對特定類型的造血細胞特異的病毒載體。可通過多種方式給予重組載體。例如，所述方法可利用病毒載體的靶向特異性從而不需要在病變位點局部給藥。但是，局部給藥可提供更快速更有效的治療。還可通過例如靜脈或皮下注射受試者進行給藥。注射之後，病毒載體將一直循環到以適當的感染靶特異性識別宿主細胞。可替換的給藥方式可以是通過直接局部接種到疾病或病狀的位點，或接種到給上述部位供應營養的血管系統中。局部給藥是有利的，因為不存在稀釋效應，因此只需要更小劑量就可實現在大多數耙細胞中的表達。此外，局部接種可減輕其它給藥形式所要求的靶向必要條件，因為可以採用感染被接種區域的所有細胞的載體。若需要僅在被接種區域的特定亞型的細胞中表達，則可採用對所需亞型的細胞特異的啟動子和調控元件以實現該目標。這種非靶向載體可以是例如病毒載體、病毒基因組、質粒和噬菌粒等。還可採用轉染載體如脂質體將上述的非病毒載體導入被接種區域的受體細胞中。這種轉染載體是本領域技術人員公知的。可按照良好的醫療操作，並考慮患者個體的臨床症狀，給藥的位點和方法，給藥時間安排，患者年齡，性別，體重和執業醫生公知的其它因素來給予本發明化合物並確定其劑量。因而通過本領域公知的這些考慮因素來確定為了達到本發明治療目的的藥物"有效量"。該劑量必須能有效實現改善，所述改善包括但不限於改善存活率或更快速的恢復，或改善或消除症狀和通過本領域技術人員以適當措施所選擇的其它指標。在本發明的實施方式中，本發明的化合物可通過多種方式給藥。應該注意的是，本發明的化合物可作為化合物給藥，並可單獨或作為活性成分與藥學可接受的載體，稀釋劑，佐劑和媒介物組合給藥。該化合物可經口服，皮下或腸胃外包括靜脈內給藥，動脈內給藥，肌肉內給藥，腹膜內給藥，和鼻腔給藥以及鞘內和灌注技術。也可採用化合物的埋植。受治患者是恆溫動物尤其是包括人在內的哺乳動物。藥學可接受的載體，稀釋劑，佐劑和媒介物以及埋植載體通常是指不與本發明活性成分反應的、惰性的、無毒固體或液體填充劑，稀釋劑或包封材料。應該注意的是，治療人的療程一般長於本文中例舉的小鼠或其它實驗動物的療程，其治療時間的長度與疾病發展的程度和藥物效力成比例。劑量可以是在幾天的單劑量或多劑量。通常治療時間的長度與疾病發展的程度和藥物效力及受治患者的物種成比例。以腸胃外的方式給予本發明化合物時，通常將本發明化合物製成單位劑量的可注射劑型(溶液劑，懸浮液劑，乳液劑)。適宜於注射的藥物製劑包括滅菌水溶液或分散體和用於重製無菌注射液或分散體的滅菌粉末。載體可以是溶劑或分散介質，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液態聚乙烯醇等)、它們的適當混合物、和植物油。可通過例如採用包衣如卵磷脂，在分散體中維持所需顆粒大小和採用表面活性劑來保持適當的流動性。還可採用非水媒介物如棉籽油、芝麻油、橄欖油、大豆油、玉米油、葵花油，或花生油和酯如肉豆蔻酸異丙酯作為化合物組合物的溶劑體系。此外，還可添加提高組合物的穩定性、無菌性和等滲性的各種添加劑，包括抗微生物在內的防腐劑、抗氧化劑、螯合劑和緩衝液。通過各種抗細菌劑和抗真菌劑來確保抑制微生物的作用，例如對羥基甲苯酸酯、氯代丁醇、苯酚和山梨酸等。在許多情況下，還需要等滲劑，例如糖和氯化鈉等。可通過使用延遲吸收劑實現可注射藥物製劑的延長吸收，如單硬脂酸鋁和明膠。根據本發明，所用的任何媒介物、稀釋劑或添加劑必需與所述化合物相容。可通過在所需量的適宜溶劑中將本發明操作中所採用的化合物與其它各種所需成分合併來製備無菌的可注射溶液。本發明的藥物製劑可通過含任何相容載體如各種媒介物、佐劑、添加劑和稀釋劑的可注射製劑給予患者；或本發明中所用化合物可通過緩釋的皮下埋植或靶向遞送系統以腸胃外的形式給予患者，所述靶向遞送系統如單克隆抗體、載體遞送、離子滲透、聚合物基質、脂質體和微球體。許多其它的這類埋植、遞送系統和模式都是本領域技術人員公知的。在一個實施方式中，本發明化合物開始可通過靜脈注射給藥使血液中所述化合物的濃度到達適宜水平。然後通過口服劑型來維持患者體內的所述化合物的水平，但是可根據患者症狀和以上說明採用其它給藥形式。給藥量隨受治患者變化而變化。定義除非上下文特別說明或暗示，下列術語和短語的含義如下所述本文所用的術語"基因治療"是指將感興趣的遺傳物質(如:DNA或RNA)轉入宿主以治療或預防遺傳性或獲得性疾病或症狀表型。感興趣的遺傳物質編碼一種產物(如蛋白質、多肽、肽，功能RNA和反義分子(antisense))，該產物是體內所需的。例如，感興趣的遺傳物質可編碼一種具有治療價值的激素、受體、酶、多肽或肽。感興趣的遺傳物質還可編碼自殺基因。通常可參考教科書《基因療法》(genetherapy)(AdvancesinPharmacology40，AcademicPress,1997)。術語"體內基因治療"是指將待轉移的遺傳物質原位導入到受體生物的受體器官的靶細胞中。治療之後，基因改變的靶細胞原位表達轉染的遺傳物質。若宿主基因有缺陷，這種治療還包括原位修復基因。術語"基因表達載體"是指任何能夠將異源核苷酸遞送/轉移至宿主細胞內的載體。表達載體可包括控制靶向的元件，核苷酸以細胞選擇的方式表達和轉錄是本領域公知的。應該注意的是基因的5'UTR和/或3'UTR可能被表達載體的5'UTR和/或3'UTR所取代。因此，如果需要，本文所用的表達載體可以不含有待轉移的實際的基因的5'非翻譯區(5'UTR)和/或3'UTR而僅含有特定的胺基酸編碼區。表達載體可包括控制異源物質轉錄的啟動子，以及可以是能進行選擇性轉錄的組成型或誘導型啟動子。可選擇性地包括為了獲得必要轉錄水平可能需要的增強子。增強子通常是任意的非翻譯的DNA序列，該序列與編碼序列(順式)一起連續作用以改變由啟動子所控制的基本轉錄水平。表達載體還可包括一個選擇性基因。實施例1、Ad5-yCD/w^TKSR39/^-ADP腺病毒的說明在以下參考文獻部分列表中公開了Ad5-yCD/m^TKSR39re/-ADP腺病毒、yCD/w^TKsR39融合基因和ADP基因(SEQIDNOs.l-5)的完整和部分DNA和翻譯的蛋白質序列。將從這類序列的角度介紹以下實施例。實施例中的Ad5-yCD/m^TKSR39^-ADP病毒(序列NO:l)是具有複製能力的5型腺病毒(對於本領域技術人員而言，該病毒的序列是公知的且易於獲得的)，該病毒的序列包括在El區的改進yCD/m^TKSR39融合基因和在E3區的Ad5ADP基因。圖1提供了Ad5-yCDAm^TKSR39"/-ADP的示意圖(在圖1中，"CMV"=人類巨細胞病毒啟動子；"SV40"=猴病毒40多腺苷序列；和"mu，^圖譜單位。)如圖1所示，CMV-yCD/m^TKSR39-SV40表達盒位於El區，取代了缺失的55kDaE1B基因。CMV-ADP-SV40表達盒位於E3區，取代了缺失的E3基因。Ad5-yCD/w^TKSR39r^-ADP在55kDaE1B基因中缺失了1255個鹼基對(bp)(鹼基2271-3524)(參見SEQIDNO:2)。通過本領域技術人員公知的方法，兩個翻譯提前終止密碼子(prematuretranslationstopcodon)被構建到55kDaElB基因中，產生截短的、無功能的並具有78個胺基酸的E1B蛋白。Ad5-yCD/w^TKSR39^/>ADP表達野生型Ad5ElA和19kDaE1B蛋白。插入yCD/m"fTKsR39融合基因(SEQIDNO:4)以取代缺失的55kDaE1B基因。yCD/m"TKSR39融合基因的表達是由人類巨細胞病毒(CMV)啟動子啟動的，並利用了猴病毒40(SV40)多腺苷酸化元件。yCD/m^TKsK39融合基因編碼一個59kDayCD/ww/TKs!U9融合蛋白，該蛋白可以酶的方式將5-氟胞嘧啶(5-FC)轉化成氟尿嘧啶(5-FU)並可將9-(l，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤(GCV)及其衍生物轉化成它們相應的單磷酸鹽(如GCV-MP)。5-FU和GCV-MP的下遊代謝產物是有效的DNA複製的抑制因子並可使正在分裂的細胞死亡。這些下遊代謝產物還是有效的輻射敏化劑，可顯著地增強放射療法的治療效果(參考文獻1-14)。表達yCD/聽fTKsR39融合蛋白的細胞以及通過觀者效應的鄰近細胞被yCD/5-FC和HSV-1TKSR39/GCV自殺基因療法殺死，並對離子輻射的殺傷效應敏感。Ad5-yCD/mwfTKSR39^>ADP還含有缺失了2.68kb(鹼基28,133-30,181)的E3區，E3區影響抑制宿主免疫反應但不是病毒複製所必需的基因(參見SEQIDNO:3)。Ad5-yCD/w^TKSR39rep-ADP含有Ad5ADP表達盒，該表達盒取代了天然的Ad5E3基因。ADP基因(SEQIDNO:5)的表達是由人類巨細胞病毒(CMV)啟動子啟動的並利用了猴病毒40(SV40)多腺苷酸化元件。產生了一個真正的111.6kDaAd5ADP蛋白，該蛋白可顯著增強具有複製能力的腺病毒的溶瘤活性。Ad5-yCD/mW"KSR39^;>ADP缺乏所有其它已知的Ad5E3基因(gpl9，10.4kDa，14.5kDa禾口14.7kDa基因)。2、Ad5-yCD/m"fTKSR39re;7-ADP腺病毒的構建用於構建Ad5-yCD/mw^TKSR39re/7-ADP的含有腺病毒序列的質粒從Microbix(多倫多，加拿大)獲得。為了構建pCMV-yCD/m^TKSR39表達質粒(左端載體)，通過鏈式聚合酶反應(PCR)以線性化的pET23d:HSVTK^39為模板擴增突變型的SR39HSV-1TK基因(參考文獻16)。以下引物對用於產生wwfTKSR39PCR產物。5'-GATCGGATCCCTCGAGATC2CTAGCATGGCTTCGTACCCCGGC隱3'(SEQIDNO:8)5'-GATCGAATTCTTCCGTGTTTCAGTTAGCCTC-3'(SEQIDNO:9)將得到的1128鹼基對(bp)片段用5am/f/(GGATCC)+￡coR7(GAATTC)消化，在已去除原型CD/HSV-1TK融合基因的pCA14-CDglyTK-ElaElb(參考文獻10)的^^^/+五"7/位點間克隆，產生pCA14-CMV-m^TKSR39-ElaElb。通過PCR以線性化pBAD-ByCD為模板擴增酵母胞嘧啶脫氨酶基因(yCD)基因(參考文獻17)。以下引物對用於產生yCD的PCR產物。5'-GATCCTCGAGCCACCATGGTGACAGGGGGAATG畫3'(SEQIDNO:10)TATCTTC-3'(SEQIDNO:11)將得到的526bp片段用^Tzo/(CTCGAG)+M2e/(GCTAGC)消化，並在pCA14-CMV-wz^TKSR39-ElaElb的屈o/+Mze/位點之間克隆，產生pCA14-CMV-yCD/m^TKSR39-E1aE1b。為製備pBHG10-屍ac/woACMV-ADP(右端載體)，通過PCR擴增ADP基因，並將該基因在pBHGi(KPac/mod的Pac/禾n5Vra/位點之間克隆。pBHG10-戶ac/wod是pBHG10(Microbix;Toronto,Canada)的衍生物，並在E3區含有屍ac/和5Va/位點以方便定向克隆。pBHG10是一種質粒，該質粒包括不含El區的188-1,339鹼基和E3區的28,133-30,818鹼基的整個5型腺病毒基因組。以野生型Ad5DNA為模板，產生含ADP基因的333bp的PCR產物。以下引物對用於產生ADPPCR產物。5'畫GATCGGATCCCCTGCTCCAGAGATGACCGGC陽3，(SEQIDNO:12)5'-GATCAAGCTTGGAATCATGTCTCAMAATC-3'(SEQIDNO:13)將得到的333bp的片段PCR產物用5aw/f/(GGATCC)+歷"必//(AAGCTT)消化，並克隆到用5"附///-歷"^7//消化的pCA14(Microbix;Toronto,Canada)中產生pCA14-ADP。通過PCR利用以下引物對產生完整的CMV-ADP-SV40polyA表達盒。5'-GATCATTTAAATAATTCCCTGGCATTATGCCCAGTA-3'(SEQIDNO:14)5'-GATCTTAATTAATCGATGCTAGACGATCCAGACATG-3'(SEQIDNO:15)在引物5'端的CMV啟動子的上遊引入了限制性酶切位點(ATTTAAAT)，並且在引物3'端的SV40polyA區的下遊引入了屍ac/限制性酶切位點(TTAATTAA)。用5Vva/和Pac/消化PCR產物，並克隆到產生pBGH10-戶ac/wo^CMV-ADP的經5W^-屍ac/消化的pBGH10-屍ac/woc/。為製備Ad5-yCD/mwZTKSR39/^-ADP病毒，將pCA14-CMV-yCD/mW/TKSR39-ElaElb(10pg)通過屍vw/消化而線性化，並將獲得的產物與經C/a/線性化的pBHG10-屍flc/wo&CMV-ADP(30iag)通過CaP04-DNA沉澱法一起共轉染至HEK293細胞(Microbix)中。在7-14天後獲得分離的噬斑，並在HEK293細胞中第二次純化噬斑。將來自於兩次純化噬斑的病毒用於感染HEK293細胞以產生病毒粗懸浮物，然後經CsCl梯度純化腺病毒。3、含有ADP基因的Ad5-yCD/m^TKSR39rep-ADP在體外的優勢以5x104細胞/孔的濃度將人類DU145前列腺癌細胞種到24孔板中，用梯度濃度的Ad5-CD/TKrep(第1行)和Ad5-yCDA"/TKSR39rep-ADP病毒(第2行)進行感染。5天後，固定細胞並以結晶紫染色。結果(如圖2所示，"Vp"=病毒顆粒)清楚地表明了含有Ad5ADP基因並表達ADP蛋白的具有複製能力的腺病毒(即Ad5-yCD/m^TKsR39r印-ADP)具有比缺乏ADP的腺病毒明顯更高的溶瘤活性。換言之，Ad5ADP基因的存在明顯增強了具有複製能力的腺病毒的溶瘤活性。這些結果表明了含有ADP基因的Ad5-yCD/w^TKSR39rep-ADP在體外的優勢。4、含有yCD/mw/TK犯39基因的Ad5-yCD/m^TKSR3ADP在體外的優formulaseeoriginaldocumentpage16LNCaPC4-2細胞被模擬感染(第1和5行)，或用感染複數(MOI)值為10的Ad5陽CD/Tkrep(第2禾卩6行)，Ad5-yCD/mz^TKSR39re/-ADP(第3和7行)，Ad5-yCD/mwfTKsR39^;-hNIS(第4和8行)進行感染。72小時後，以["C]-胞嘧啶(第1-4行)和卩H]-5-FC(第4-8行)為底物檢測細胞的CD活性。結果如圖3A所示[(胞嘧啶(靠下的左箭頭)、尿嘧啶(靠上的左箭頭)、5-FC(靠上的右箭頭)和5-FU(靠下的右箭頭)]。如圖3A所示，與表達包含在原型Ad5-CD/Tkre/病毒中的CD/HSV-1TK融合基因的病毒相比，表達改進yCD/w"rrKSR39^基因的重組腺病毒(如Ad5-yCD/w^TKSR3ADP)表現出比更強的將5-FC轉化成5-FU的能力，但不能將胞嘧啶轉化成尿嘧啶。B、細胞病理效應試驗將細胞(106細胞，在60mm培養皿)模擬感染或用MOI值為3的Ad5-CD/Tkre;或Ad5-yCD/m^TKsR39^-ADP進行感染。第二天，將細胞重新種植到(24孔板)含多種濃度(pg/ml)的5-FC(第3-7和15-19孔，從左到右，從上到下)或GCV(第8-12和20-24孔，從左到右，從上到下)的培養液中。9天後用結晶紫染色細胞。結果(如圖3B所示)證明當與5-FC前體藥物治療組合使用時，與表達包含在原型Ad5-CD/Tkr印病毒中的CD/HSV-1TK融合基因的病毒相比，表達改進的yCD/m"汀Kre;基因的重組腺病毒(如Ad5-yCD/w^TKSR39w/-ADP)導致更多的細胞死亡。圖3A和3B的結果一起顯示了包含在Ad5-yCD/m"TKSR39/^-ADP中的yCD/TKSR39基因在體外的優勢。該實施例的結果還證明了yCD/5-FC和HSV-1TKSR39/GCV自殺基因療法可用於增強Ad5-yCD/mw"KsR,印-ADP病毒本身的治療效果。Ad5-yCD/m^TKSR39^p-ADP含有一種新型的yCD/w"rTKSR39融合基因，該基因的產物與由原型Ad5-CD/Tkrep病毒產生的CD/HSV-1TK融合蛋白相比具有改進的催化活性。表達改進yCDAm^TKsK39融和蛋白的重組腺病毒表現出比表達原型CD/HSV-1TK融合蛋白的病毒更強的將5-FC轉化成5-FU的能力，將GCV轉化成GCV-MP的能力也可能增強。因而，可獨立和聯合使用yCD/5-FC禾口HSV-1TKSR39/GCV自殺基因療法以增強Ad5-yCD/m"/TKSR39^7-ADP病毒的腫瘤破壞效果。5、含有ADP基因的Ad5-yCD/w^TKSR3ADP在體內的優勢在第0、2和4天將101Gvp的Ad5-CD/Tkr印或Ad5-CD/TKr印-ADP注射入肌肉內(腿)的C33A腫瘤(150-200mm3)(圖4中的箭頭)。在第5-11天給予5-FC(500毫克/千克/天)和GCV(30毫克/千克/天)(圖4中的陰影條)。每隔一天監測腫瘤體積。預定終點是500mm3。存活定義為動物在第90天沒有腫瘤(治癒)或腫瘤〈500mm3。結果(如圖4和下表1所示)顯示了在體內對腫瘤細胞的更強破壞，從而證明了含有ADP基因的Ad5-yCD/m"rrKSR39re;-ADP的優勢。換言之，Ad5ADP基因的存在明顯增強了具有複製能力的腺病毒在體內或體外的溶瘤活性。tableseeoriginaldocumentpage18'半數存活時間按天數算。'Ad5-CD/TKr印-ADP對Ad5-CD/TKrc;:Ad5-CD/TKr印-ADP+5-FC+GCV對Ad5-CD/TKr印+5-FC+GCV6、Ad5-yCD/wWTKSR39re/>ADP在小鼠模型體內的效力在第0天將約109vp的Ad5-yCD/m"fTKSR39re,ADP注射入患有前列腺內LNCaPC4-2腫瘤(大小為約25-50mm"的雄性重症聯合免疫缺陷(SCID)小鼠(圖5中的箭頭)。在第3-9天給予5-FC(500毫克/千克/天)和GCV(30毫克/千克/天)(圖5中的陰影條)。每周測定血清中的前列腺特異性抗原(PSA)。預定終點是PSA-500ng/ml。結果(如圖5和下表2所示)顯示了在小鼠模型中利用本發明的Ad5-yCD/WWfTKSR39^/-ADP提高了半數存活時間和/或腫瘤治癒率。表2.Ad5-yCD/ww/TKSR39^-ADP在LNCaPC4-2腫瘤模型中的結果tableseeoriginaldocumentpage19lAd5-yCD/wM,TKSR39^>ADP對PBS;bAd5-yCD/w^TKSR39w/-ADP+5-FC+GCV對PBS。7.利用yCD/5-FC和HSV-1TKSR39/GCV使人類癌細胞對輻射敏感如發明人之前的實驗所示(參見參考文獻1-14)，yCD/5-FC和HSV-1TKSR39/GCV自殺基因可用於使人類癌細胞對輻射敏感。Ad5-yCD/wM/TKSR39^-ADP含有一個新型的yCD/m^TKsR39融合基因，該基因的產物的催化活性與由原型Ad5-CD/Tkr印病毒產生的CD/HSV-1TK融合蛋白相比有所改進。之前的研究證明了CD/5-FC和HSV-1TKSR39/GCV自殺基因可使人類癌細胞對離子輻射敏感。因而，由於Ad5-yCD/m^TKSR39"p-ADP表達的是改進的yCD/m^TK犯39融合蛋白，它在體內可導致更強的癌細胞輻射敏化作用。在整個本申請中，不同參考文獻標註以不同的文獻標號。下文提供了帶有完整引用出處的參考文獻列表。這些參考文獻的全文被引入本申請作為參考以更充分地描述本發明所屬領域的現狀。儘管通過前述的優選和可選擇的實施方式和實施例詳細展示和描述本發明時，本領域技術人員可以理解的是本文所描述的發明的實施方式的各種替換形式也可被用於實施本發明，且不偏離下列權利要求所定義的本發明的實質和範圍。這就意味著由下列權利要求限定本發明的範圍，並且所述權利要求書範圍內的方法和組合物，以及與它們等同的方法和組合物都在權利要求書的保護範圍之內。本發明的說明書應理解為包括本文所述的所有新穎的和非顯而易見的元素的組合，該申請或後續申請的權利要求包括這類元素任何新穎和非顯而易見的組合。前述的實施方式是例證性的，並且沒有單個特徵或元素對於本申請或後續申請所要求的所有可能的組合是必不可少的。對於使用了"一種"或"第一"其等效形式的權利要求，應理解為這些權利要求包括了一種或多種這類元素的組合，既不必需也不排除兩種或多種這類元素。參考文獻列表1.Rogulski,K.R.,Kim,J.H.,Kim,S.H.,andFreytag,S.O.GliomacellstransducedwithanE.co//CD/HSV-1TKfusiongeneexhibitenhancedmetabolicsuicideandradiosensitivity.Gewe772er"8:73-85,1997.2.Kim，J.H.,Kim，S.H.，Brown，S丄.，andFreytag,S.O.Selectiveenhancementbyanantiviralagentoftheradiation-inducedcellkillingofhumangliomacellstransducedwithHSV-tkgene.Ca"ceri^y.，54:6003-6056,1994.3.Kim，J.H.，Kim,S.H.，Kolozsvary,A.,Brown,S丄.，Kim，O.B.，andFreytag,S.O.Selectiveenhancementofradiationresponseofherpessimplexvirusthymidinekinasetransduced9Lgliosarcomacellsz>vzYroandv/vobyantiviralagents,/"f./i<3(i/a/.Oco/.5Zo/.P/yAS.,33:861-868,1995.4.Khil，M.,Kim，J.H.，Mullen,C.A.，Kim，S.H.，andFreytag，S.O,Radiosensitization'by5-fluorocytosineofhumancolorectalcarcinomacellsinculturetransducedwithcytosinedeaminasegene.C"".Ca"cer2:53-57，1996.5.Kim，S.H.，Kim，J.H.，Kolozsvary,A.，Brown,S丄.，andFreytag,S.O.Preferentialradiosensitizationof9LgliomacellstransducedwithHSV-TKgenebyacyclovir.J.7Vewraowco/"33:189-194,1997.6.Gable,M.，Kim，J.H.,Kolozsvary,A.，Khil，M.,andFreytag,S.O.Selectivez'wWvoradiosensitizationby5-fluorocytosineofhumancolorectalcarcinomacellstransducedwiththe五.co//cytosinedeaminasegene./"A/0腳/.編.41:883-887，1998.7.Rogulski，K,R.，Zhang,K.,Kolozsvary,A.,Kim，J.H.,andFreytag,S.O.Pronouncedantitumoreffectsandtumorradiosensitizationofdoublesuicidegenetherapy.C/f".C騰erL，3:2081-2088,1997.8.Kim,J.H.,Kolozsvary,A.,Rogulski,K.R.,Khil,M.,andFreytag,S.O.Selectiveradiosensitizationof9Lglioma,inthebraintransducedwithdoublesuicidefusiongene.C朋.</5We"Mw.4:364-369，1998.9.Xie,Y.，Gilbert,J.D.，Kim，J.H.，andFreytag，S.O.Efficacyofadenovims-mediatedCD/5-FCandHSV-1TK/GCVsuicidegenetherapiesconcomitantwithp53genetherapy.C7/w.C朋cer5:4224-4232,1999.10.Freytag，S.O.,Rogulski,K.R.，Paielli,D丄.，Gilbert,J.D.，andKim，J.H.Anovelthree-prongedapproachtoselectivelykillcancercells:concomitantviral，doublesuicidegene,andradiotherapy.Gewe77zer"9:1323-1333，1998.11.Rogulski，K.R.,Wing，M.,Paielll，D丄.，Gilbert,J.D.，Kim,J.H.,andFreytag,S.O.Doublesuicidegenetherapyaugmentstheantitumoractivityofareplication-competentlyticadenovirusthroughenhancedcytotoxicityandradiosensitization.//iwm.(7e"eT7zeK,11:67-76，2000.12.Paielli,D丄.，Wing，M.，Rogulski,K.R.,Gilbert,J.D.,Kolozsvary，A.，Kim,J.H.,Hughes,J.V"Schnell,M.，Thompson,T,，andFreytagS.O.Evaluationofthebiodistribution,toxicity,andpotentialofgermlinetransmissionofareplication-competenthumanadenovirusfollowingintraprostaticadministrationinthemouse.Mo/ecw/ar77zer.1:263-274，2000.13.Freytag，S.O.，Paielli,D.，Wing,M.，Rogulski,K.,B匿n，S.，Kolozsvary,A.,Seely,J.,Barton,K.，Dragovic，A.,andKim，J.H.Efficacyandtoxicityofreplication-competentadenovims-mediateddoublesuicidegenetherapyincombination'withradiationtherapyinanorthotopicmouseprostatecancermodel.7W/欲O腳Z歷o/.戶—.，54:873-886,2002.14.Freytag,S.O.，KM，M.，Strieker,H.,Peabody，J.，Me謹，M.，DePeralta-Venturina,M.,Nafziger，D.，Pegg,J.，Paielli,D.,Brown,S.,Barton,K.，Lu,M.,Aguilar-Cordova,E.,andKim,J.H.PhaseIstudyofreplication-competentadenovims-mediateddoublesuicidegenetherapyforthetreatmentoflocallyrecurrentprostatecancer.Ca"cerie&，62:4968-4976,2002.15.Freytag,S.O.，Strieker,H.,Peabody，J.,Menon,M.，DePeralta-Venturina,M,，Pegg,J.，Paiellii,D.,Brown，S.,Lu,M.，andKim，J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