鑑別可用於治療腫瘤的pten的細胞外形式的製作方法

2023-10-27 07:17:27 4

專利名稱：：鑑別可用於治療腫瘤的pten的細胞外形式的製作方法
技術領域：
：無
背景技術：
：PTEN腫瘤抑制因子(PTENtumorsuppressor)(參見W098/346M，其以全文引用的方式併入本文中)是一種細胞質磷酸酶，其使重要的第二信使磷脂醯肌醇3，4，5_三磷酸脫磷酸(phosphatidylinositol3，4，5-triphosphate)(馬哈馬(Maehama)和迪克森(Dixon)1998)。這一活性下調由Akt的PIP3活化引發的許多致癌信號，包括抗細胞凋亡路徑(apoptoticpattway)、細胞周期進程和增加細胞代謝(蘇黎氏(Sulis)和帕森斯(Parsons)2003)。PTEN在癌症中的作用，從其在許多不同腫瘤類型中經常在遺傳上喪失或功能上喪失，而顯而易見(邦努(Bormeau)和隆基(Longy)2000)。最初發現其在神經膠質癌中缺失，此後又發現與前列腺、乳房、子宮內膜、黑素細胞、腎和肺的腫瘤發生有關。PTEN的生殖系突變也與遺傳性癌症體質綜合症有關，諸如考登氏綜合症(Cowden'sSyndrome)(英格(Eng)2003)。PTEN喪失的小鼠模型已重演其在雜合子小鼠和組織特異性基因剔除者(tissuespecificknockout)中，在許多不同組織類型中作為腫瘤抑制因子的作用(迪克裡斯託凡諾(DiCristofano)，佩塞(Pesce)等人1998；誇比-阿多(Kwabi-Addo)，吉利(Giri)等人2001；佩曲西利(Petrocelli)和斯林克蘭(Slingerland)2001；尤(You)，卡斯特裡隆(Castrillon)等人2002；弗雷澤(Fraser)，朱(Zhu)等人2004)。PTEN蛋白含有N端雙特異性磷酸酶結構域(N-terminaldualspecificityphosphatasedomain)禾口C端C2憐月旨結合結構域(C—terminalC2phospholipidbindingdomain)，隨後為因內部存在磷酸化位點而具有調控重要性的未結構化尾部(李(Lee)，楊(Yang)等人1999；瓦茲奎茲(Vazquez)，拉馬斯瓦米(Ramaswamy)等人2000；託雷斯(Torres)和普裡度(Pulido)2001；瓦茲奎茲(Vazquez)，格羅斯曼(Grossman)等人2001)。PTEN蛋白主要存在於細胞質中，然而，有越來越多的證據證明PTEN存在於細胞核中，這一定位通過NEDD4-1使蛋白質單泛素化(monoubiquitination)進行調控(貝克(Baker)2007；王(Wang)，特羅特曼(Trotman)等人2007)。在起始密碼子(startcodon)AUG處發生翻譯起始之前核糖體對5'UTR進行掃描。儘管核糖體用來決定適當起始密碼子的實際方式仍未完全了解，但mRNA本身與序列存在指示起始前複合物(pre-initiationcomplex)在何處減慢其掃描並開始翻譯的某些性質。已顯示經典「科扎克序列(Kozaksequence)」CCACCAI￡G(其中加下劃線的ATG是起始密碼子(initiationcodon))是最有利於起始的序列情形(sequencecontext)(科扎克(Kozak)1991)。mRNA二級結構也可能通過實際減慢起始前複合物的掃描來促進起始，因為掃描在閱讀前需要解螺旋酶來解開二級結構(科扎克((Kozak))1990)。在某些轉錄物中，翻譯起始可從非AUG密碼子開始進行。這通常僅包含從轉錄物翻譯來的總蛋白質中的較小百分比並且結果是產生N端不同的蛋白質的混合物質。科扎克(Kozak)描述從非AUG密碼子起始翻譯的效率並且發現在活體外GUG和CUG都能夠起始翻譯，但效率低得多(科扎克(Kozak)1989)。進一步研究已顯示，甲硫氨酸的可用性可通過仍不清楚的機制來改變翻譯起始的混亂性，但可能涉及由營養物敏感性激酶(nutrientsensitivekinase)使eIF2磷酸化，eIF2是43S起始前複合物的組分(赫爾希(Hershey)1991；漢納(Hann)1994)。已顯示許多蛋白質從替代性起始密碼子(alternateinitiationcodon)開始翻譯而來。轉錄因子(transcriptionfactor)c_myc具有替代性上遊CUG起始密碼子，當進行翻譯時，其在蛋白質的N端添加14個胺基酸(漢納(Harm)和埃森曼(Eisenman)1984)。已顯示這種替代性同功異型物(alternateisoform)在伯基特氏淋巴瘤(Burkitt『slymphoma)中被選擇性破壞(漢納(Harm)，金(King)等人1988)。在組織培養物中，當甲硫氨酸處於低濃度時，較長形式的myc主要在高細胞密度下轉錄(漢納(Harm)，索羅安布朗(Sloan-Brown)等人1992)。進一步研究已揭示，較長形式的c-myc具有生長抑制性且具有一組與經典c-myc蛋白不同的轉錄目標(漢納(Harm)，迪克特(Dixit)等人1994)。(弗洛基維茲(Florkiewicz)和薩默(Sommer)1989)(普拉茨(Prats)，卡格德(Kaghad)等人1989)。另外，已知蛋白質的實際亞細胞定位可由替代性起始密碼子決定。在小鼠原致癌基因(proto-oncogene)int-2從上遊替代性起始的情況下，CUG密碼子編碼細胞核定位，而AUG密碼子編碼用於定位於分泌路徑(secretorypathway)的信號肽(signalpeptide)(阿科蘭德(Acland)，迪克森(Dixon)等人1990)。類似現象在人類FGF3中被描述，其中從AUG翻譯的蛋白質指定為分泌路徑，而從上遊CUG翻譯的蛋白質定位於細胞核(基弗(Kiefer)，阿科蘭德(Acland)等人1994)。此外，在諸如TEF-I和PRPS-3等一些真核生物蛋白質中，蛋白質完全從CUG密碼子起始(平(Taira)，飯笹(Iizasa)等人1990；肖(Xiao),戴維德森(Davidson)等人1991)。指定為分泌(secretion)的蛋白質通過稱為信號肽的一段疏水性胺基酸靶向內質網(endoplasmicreticulum)(布洛貝爾(Blobel)，沃爾特(Walter)等人1979)。通常存在於蛋白質的N端的信號肽在翻譯時結合信號識別顆粒(signalrecognitionparticle,SRP)且使核糖體暫停並易位到粗糙內質網，在那裡結合SRP受體。一旦核糖體對接，SRP-SRP受體複合物被釋放，翻譯通過kc61易位子(translocon)從新開始穿過ER的內腔。在可溶性蛋白質從Sec易位子釋放蛋白質後，信號肽隨後裂解。在蛋白質跨越細胞薄膜(membrane)的情況下，跨膜螺旋(transmembranehelix)充當ER易位的信號肽。這些蛋白質在高爾基體(golgi)中廣泛地經糖基化修飾並以分泌小泡形式穿梭到質膜(plasmamembrane)(阿爾伯特(Alberts)2002)。已顯示有許多分泌性蛋白質(secretedprotein)對於癌症很重要。舉例而言，已顯示Wnt信號傳導路徑(signalingpathway)在肺癌中會發生改變。Wnt是捲曲蛋白(Frizzled)受體家族的一種分泌性配體(secretedligand)。捲曲蛋白的Wnt活化使散亂蛋白(disheveled)解離β-連環蛋白(β-catenin)降解複合物，其包括APC，從而使β-連環蛋白含量升高並易位到細胞核，在那裡其可相互作用並反式活化(transactivatdTCF轉錄因子。APC中的鈍化突變和連環蛋白中的活化突變已在遺傳性與偶發性結腸癌中被詳細說明。另外，許多細胞外配體拮抗劑(extracellularligandantagonist)(諸如SFRP和Wnt-5a)與Wnt競爭相同的捲曲蛋白受體。兩者都已顯示是腫瘤抑制因子；SFRP基因剔除小鼠發展出淋巴瘤，且已在黑色素瘤中檢測到Wnt-fe的外遺傳沉默(印igeneticsilencing)。所有關於PTEN的公開報導都已指出，蛋白質定位於細胞質或細胞核中。發現許多細胞外蛋白質(磷脂醯肌醇蛋白聚糖(glypican)和多配體蛋白聚糖(syndecan))結合PTEN，分泌路徑中所涉及的許多蛋白質(內質網鈣結合蛋白(reticulocalbin)和鈣腔蛋白(calumenin))也結合PTEN。假設PTEN進入分泌路徑，從而可以進行所述相互作用。事實上，如本文所揭示，存在新穎的差異翻譯的蛋白質，稱為PTEN-long，其含有N端信號肽並且其被細胞外分泌。
發明內容一種包含具有SEQIDNO1中所示序列的連續胺基酸殘基的經分離的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含具有SEQIDNO:5中所示序列的連續胺基酸殘基的其類似物，或其各自的變異體。一種多肽，其包含(i)SEQIDNO1的殘基1至173，或(ii)包含SEQIDNO5的殘基1至173的其類似物，或(iii)SEQIDNO1的殘基22至516。一種藥物組合物，其含有包含連續胺基酸殘基的磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，所述胺基酸殘基具有SEQIDNO=I中所示序列，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含具有SEQIDNO5中所示序列的連續胺基酸殘基的其類似物。一種治療受試者的實體腫瘤的方法，其包含給予所述受試者一定量的包含具有SEQIDNO:1中所示序列的連續胺基酸殘基的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO:1的殘基22至516的其片段，或包含具有SEQIDNO:5中所示序列的連續胺基酸殘基的其類似物，以有效治療受試者的實體腫瘤。一種抑制受試者的實體腫瘤的生長的方法，其包含給予所述受試者一定量的包含具有SEQIDNO:1中所示序列的連續胺基酸殘基的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO:1的殘基22至516的其片段，或包含具有SEQIDNO:5中所示序列的連續胺基酸殘基的其類似物，以有效抑制受試者的實體腫瘤的生長。一種抑制受試者的實體腫瘤中的血管生成的方法，其包含給予所述受試者一定量的包含具有SEQIDNO:1中所示序列的連續胺基酸殘基的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含具有SEQIDNO:5中所示序列的連續胺基酸殘基的其類似物，以有效抑制受試者的實體腫瘤中的血管生成。一種誘導受試者的實體腫瘤中的血管的血管上皮細胞發生細胞凋亡的方法，其包含給予所述受試者一定量的包含具有SEQIDNO:1中所示序列的連續胺基酸殘基的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含具有SEQIDNO:5中所示序列的連續胺基酸殘基的其類似物，以有效誘導受試者的實體腫瘤中的血管的血管上皮細胞發生細胞凋亡。一種治療受試者的實體腫瘤的方法，其包含給予所述受試者一定量的表達載體，所述表達載體編碼包含SEQIDN0:1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO:5的其類似物，以在實體腫瘤的細胞中表達有效治療所述受試者的實體腫瘤的量的PTEN-long、PTEN-Iong片段或其類似物。一種包含SEQIDNO1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-long)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO5的其類似物，其用於治療受試者的實體腫瘤，抑制受試者的實體腫瘤生長，誘導受試者的實體腫瘤中的血管上皮細胞發生細胞凋亡，或抑制受試者的實體腫瘤中的血管生成。一種組合物，其包含鍵合非肽試劑(non-p印tideagent)的包含SEQIDNO1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO5的其類似物，所述非肽試劑分別增加PTEN-l0ng、PTEN-l0ng片段或其類似物的血漿半衰期(Plasmahalf-life)。一種經分離的核酸，其編碼包含SEQIDNO1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或編碼包含SEQIDNO=I的殘基22至516的其片段，或編碼包含SEQIDNO5的其類似物。一種表達載體(expressionvector)，其包含編碼包含SEQIDNO1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO5的其類似物的核酸。一種轉化細胞(transformedcell)，其能夠表達包含SEQIDNO1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO5的其類似物，其中所述細胞已將編碼PTEN-Iong或其類似物的重組DNA整合到其基因組中。一種宿主細胞(hostcell)，其能夠表達包含SEQIDNO:1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO=I的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO:5的其類似物，其中所述宿主細胞包含編碼PTEN-Iong或其類似物的質粒。一種方法，其包含混合(1)包含SEQIDNO=I的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO5的其類似物；和(增加PTEN-Iong或其類似物的血漿半衰期的非肽試劑，以使得包含SEQIDNO1的PTEN-Iong或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段或包含SEQIDNO5的其類似物鍵合非肽試劑，所述非肽試劑分別增加PTEN-long、PTEN-long片段或其類似物的血漿半衰期。一種經分離的核酸分子，其由SEQIDNO2或SEQIDNO6核酸序列的具有至少20個核苷酸的片段或在嚴格條件下分別與SEQIDNO:2或SEQIDNO:6核酸序列的互補序列或與SEQIDNO:2或SEQIDNO:6特異性雜交的其互補序列(complement)組成。一種經分離的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段結合(1)包含SEQIDNO=I的胺基酸殘基1-173的PTEN-Iong多肽；或(2)包含SEQIDNO5的其類似物；或(3)具有SEQIDNO:3中所示序列的胺基酸；或(4)包含SEQIDNO1的殘基22至516的PTEN-Iong片段。一種經分離的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段結合PTEN-Iong的構象抗原決定基(conformational印itope)，其中所述PTEN-long包含SEQIDNO:1的殘基1-173中所示的序列，但其中所述抗體不結合PTEN。一種經分離的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段結合PTEN-Iong的抗原決定基，其中所述PTEN-Iong包含SEQIDNO:1的殘基1-173中所示的序列，但其中所述抗體不結合PTEN0一種SEQIDNO:1或SEQIDNO:5的肽片段，所述片段具有抗腫瘤、抗血管生成或抗細胞凋亡活性。圖1.PTEN-Iong構築體(Construct)的圖。顯示形成用來驅動從內源性起始位點(endogenousstartsite)^(alternatestartsite)Jf^PTEN^組合的表達構築體。經典PTEN以黑色顯示，而UTR中的翻譯區以灰色顯示。圖2.智人(Homosapiens)PTENmRNA的圖。PTENmRNA編碼與所示經典ATG起始密碼子同框且位於其上遊的173個胺基酸。翻譯從經典ATG上遊的核苷酸-519處的CTG開始。延長部分顯示為SEQIDNO1的殘基1-173。圖3.PTEN直系同源物的N端的比對(Alignment)。在VectorNTI(英傑公司(Invitrogen))上使用BL0SUM62計分矩陣(scorematrix)比對來自指定物種的PTEN蛋白序列。智人和小家鼠(Musmusculus)(阿斯特裡克斯(asterix))的延長的N端序列使用ORFinder(NCBI)，從公開的mRNA，使用距離經典AUG起始密碼子為-519(智人)和-520(小家鼠)處的CUG替代性起始密碼子翻譯。來自智人的mRNA序列(NM_000314)和來自小家鼠的mRNA序列(NM_008960)。義大利蜂(Apismellifera)序列是從貝勒醫學院蜜蜂基因組if^lj(BaylorCollegeofMedicineHoneyBeeGenomeProject)·|。ffIfHlff-^l(Caenorhabditiselegans)PTENWSSMi^^J(Daf-18)WormbaseT"it(BosTaurus)(XM_613125)和黑猩猩(Pantroglodytes)(XP_521544)是從NCBI下載。圖4.存在PTEN-long的證據。Α)考察具有兩種不同PTEN抗體的不同細胞系。MCFlOA和HEK293是PTEN的野生型。BT549和HCC1937是PTEN缺失型(PTENnull)並且ZR-75-1在PTEN(L136)處具有突變；B)進一步考察具有識別PTEN與PTEN-long兩者的PTEN單克隆抗體的不同細胞系；C)WtES細胞表達大量PTEN-long。PTEN-long對這些細胞中的穩定PTENshRNA表達敏感並且完全不存在於PTEN基因剔除細胞中。pAkt含量在很大程度上與PTEN含量反相關；D)PTENsiRNA使得阻斷HEK293細胞中PTEN和PTEN-long的表達。E)質粒在PTEN缺失型PC3細胞系中的外源性表達。PTENorf僅編碼從起始密碼子AUG開始的ORF(第2泳道)。添加ATR(ATR=替代性翻譯區)使得能夠微弱地翻譯PTEN-long(第3泳道)。上遊起始位點突變為ATG使蛋白質補體完全轉變為PTEN-long(第5和第6泳道)。ATG起始密碼子突變為ATA消除了55kDa條帶(第4和第6泳道)。F)針對由5'ATR編碼的胺基酸所產生且用於HEK293的細胞溶胞物(celllysate)以及過度表達PTENorf或編碼5'ATR的質粒(ATG/ATG)的PTEN缺失型U87細胞系中的抗體。PTEN-Iong可見於僅過度表達5'ATR的細胞中。U87細胞中所觀察到的背景條帶存在於印跡(blot)底部。圖5.信號肽預測。翻譯PTEN5'UTR序列且輸入SignalIP3.O中。使用真核生物信號肽的隱馬爾可夫模型(Hiddenmarkovmodel)進行預測。N區(N-region)表示信號肽的帶正電N端序列。H區是信號肽的疏水性核心。C區是由脯氨酸標記的輕微極性區域，脯氨酸通常破壞疏水性核心的螺旋。裂解概率(cleavageprobability)預示裂解位點釋放信號肽從而允許蛋白質釋放到ER內腔中。(戴貝(Dalbey)和黑金(Heijne)，2002)。預測在位置21處發生裂解。圖6.伴刀豆球蛋白A(ConcanavalinA)捕捉(pulldown)。溶解HEK293細胞且使用伴刀豆球蛋白瓊脂糖捕捉糖基化蛋白質。通過SDS-PAGE分解洗脫液且針對PTEN(6H2.1)進行免疫印跡。相對於輸入量，可在捕捉物中觀察到PTEN-Iong富集。注意到較長PTEN條帶的富集。PTEN具有多個可能的0-糖基化位點(0-glycosylationsite)，但僅具有一個N-糖基化位點。我們在捕捉分析中使用結合糖部分的凝集素伴刀豆球蛋白-Adectinconcanavalin-A)來確定HEK293細胞中PTEN補體的一部分是否被糖基化。我們能夠純化含約50%PTEN-Iong的PTEN混合物，其中ΡΤΕΝ-long相對於正常PTEN大量富集。這說明PTEN-Iong是糖基化的且PTEN的細胞質55kDa形式是糖基化的或ΡΤΕΝ-long在細胞外裂解。圖7.PTEN和PTEN-β結合乙醯肝素(h印aran)。使小鼠肝提取物通過ImlHiTrap乙醯肝素瓊脂糖Ofeparansepharose)(安瑪西亞公司(Amersham))柱。用500mMNaCl洗滌所述柱且用連續柱體積的IMNaCl洗脫蛋白質。通過SDS-PAGE使用PTEN單克隆抗體分析洗脫份(Fraction)中的PTEN。先前已顯示PTEN對於帶高度負電的物質具有親和力，一種造成PTEN偏好高陰離子性PtdIns(3，4，5)P3的性質(達斯(Das)，迪克森(Dixon)等人2003)。因為乙醯肝素是帶最多負電的生物分子之一，所以我們假定乙醯肝素有效介導PTEN與細胞外基質(extracellularmatrix)的結合。使用來自小鼠肝臟的蛋白質提取物，我們發現PTEN以高親和力結合乙醯肝素。此外，從使用IMNaCl從肝素瓊脂糖柱上連續洗脫PTEN也洗脫出PTEN-long。圖8.蛋白酶保護分析。將HEK293細胞再懸浮於遞增濃度的蛋白酶!((proteinaseK)中。將Triton添加到含有最高濃度的蛋白酶K的反應中至最終濃度為0.2%。用PMSF停止反應且在拉姆利緩衝液(laemllibuffer)中製備細胞溶胞物。通過SDS-PAGE在8%聚丙烯醯胺凝膠上解析溶胞物且針對PTEN(6H2.1)、AKT、E-鈣粘素(E-cadherin)進行免疫印跡。PTEN免疫印跡的較大條帶表示PTEN-long。這些數據顯示E-鈣粘素和PTEN-long主要位於細胞表面上。圖9.來自條件培養基的肝素親和純化的PTEN和PTEN-long的高鹽洗脫。可在從條件培養基進行親和純化後從HiTrap肝素(安瑪西亞公司(Amersham))柱洗脫PTEN和PTEN-long。針對PTEN尾部(上方)的單克隆抗體與對翻譯到5'ATR中的胺基酸具有特異性的抗體都識別質量為約^kDa的蛋白質條帶。圖10.從人類血清純化PTEN。用蛋白質A/G預清除來自AB血液的人類血清中的抗體並且經肝素瓊脂糖。通過SDS-PAGE解析洗脫液並且針對PTEN進行免疫印跡或僅使用二級抗體(secondary)進行以控制重鏈汙染。圖11A-11C.PTEN-Iong的抗血管生成活性。(A)PTEN-long在發育中的視網膜中的血管和毛細血管的子集中表達。這種表達模式與PTEN的經典形式形成鮮明對比且與PTEN-Iong在誘導這些區域中發生的血管退化中的作用一致。當根據右上方的全視網膜溶胞物的蛋白質印跡(westernblot)，利用高氧(B)誘導這種血管退化過程，並且通過在低氧條件下內皮細胞中的PTEN-Iong喪失(C)誘導這種血管退化過程時，PTEN-Iong的顯著上調使這一相關性得到增強。這些發現表明PTEN-Iong適用作抗血管生成療法，例如治療糖尿病性視網膜病變以及高增生性血管病症。箭頭指示⑶34和PTEN-Iong陽性組織(血管)。圖12.PTEN-Iong的促細胞凋亡活性。如所指示，在用經純化PTEN-long處理M小時的MCF-IOA乳房上皮細胞中誘導細胞凋亡。卡斯蛋白酶3(Caspase3)裂解指示細胞凋亡活性。圖13.用PTEN-long處理小鼠。用PTEN-long或空載體對照(EmptyVectorControl)處理十天後通過測徑器(Caliper)測量所測得的腫瘤尺寸的圖。用含ATG/ATGPTEN-long的pcDNA3.IHisV5載體轉染293細胞。在轉染後48小時製備細胞質溶胞物且流經V5-抗體珠粒並用V5肽洗脫。下方展示V5-珠粒純化洗脫液的蛋白質印跡。最初觀察到PTEN-long可用於治療腫瘤。使用U87膠質母細胞瘤細胞(glioblastomacell)(1百萬個)注入scid小鼠的乳房脂肪墊中來建立異種移植物(Xenograft)。在移植後約兩周開始處理。圖14.用PTEN-long處理小鼠的結果。圖展示用對照和PTEN-long注射液處理14天的小鼠的存活分率(以天計)。圖15.將PTEN(缺乏5『UTR的PTENorf)、PTEN-long和胺基酸305處的G突變為R(其類似於PTENorf中的G129R突變)的PTEN-long的指定構築體轉染到293細胞中。使用來自這些細胞的經純化蛋白質，顯示PTEN-long是活性磷酸酶，而PTEN-longG305R突變體(其在PTEN中為GU9R)使磷酸酶活性降低。圖16.在使用PTEN-long(G305R)突變體的實驗中顯示，磷酸酶活性是PTEN-long活性所必需的。基於PTEN文獻，已知在C2結構域內所作的截短使蛋白質不穩定，並且基於PTEN晶體結構，相信C2結構域與磷酸酶結構域之間的相互作用對於磷酸酶活性至關重要。因此，在C端，PTEN-long活性的最小結構域將需要C2結構域，但不需要尾部。在N端，預測的裂解位點是在胺基酸21處，且因此蛋白質的功能區在這一區域內。就這一點來說，重要的是應注意，當用PTEN或用PTEN-long平行處理U87腫瘤時，PTEN處理未觀察到明顯作用，僅PTEN-long處理有明顯作用。圖17.從經含ATG/ATG-PTENlong的具有His和V5標籤的pcDNA3.1表達載體轉染的293細胞中純化PTEN-long。在Ni+柱洗脫後，在凝膠過濾柱中解析洗脫液。0擬80以藍線顯示。洗脫份7-18中富含PTEN-long。這一實驗的產量為約lmg。箭頭指示PTEN-long和遷移改變的PTEN-long產物。圖18A-18B.(A)LNCaP前列腺癌細胞對PTEN-long經純化蛋白質的劑量反應(DoseResponse)，使用細胞死亡作為讀數(蛋白質是通過ARVYS進行純化)。1X等於每毫升0.33微克。在無生長因子的培養基中處理細胞。M小時後，用無血清培養基洗滌細胞且在拉姆利樣品緩衝液(Laemmlisamplebuffer)中溶解。對於指定蛋白質進行蛋白質印跡。(B)用PTEN-long、PTEN-long(G305I)或模擬對照(Mockcontrol)處理的U87膠質母細胞瘤細胞顯示誘導細胞凋亡，如PARP裂解和絲氨酸473處pAKT信號的下調所指示。這些數據進一步證實PTEN-Iong可誘導細胞凋亡和減少PII/AKT信號傳導。圖19A-19C.如利用測徑器和使用螢光素酶報導基因(luciferasereporter)結合精諾真(xenogen)活動物成像系統所測量，經AKTA純化的PTEN-Iong蛋白能夠在五天時間內減小腫瘤尺寸。每天給與小鼠約0.05mgPTEN-Iong持續五天。將1百萬個U87膠質母細胞瘤細胞注射至由於感染FUW-螢光素酶-neo而表達螢光素酶的乳房脂肪墊中，從而建立異種移植物。在用精諾真成像系統成像前10分鐘，腹膜內給小鼠注射螢光素(Iuciferin)。(A)在處理前(左圖)和處理第五天(右圖)對4隻小鼠進行螢光素酶測量。(B)在處理前和在處理5天期間進行測徑器測量，以cm2計。(C)如圖中所成像的利用精諾真系統檢測到的光子。顯示小組中四隻小鼠的標準誤差。對第O天至第5天檢測到的光子進行學生t檢驗(Studentt-test)。圖20.在獨立實驗中，讓U87腫瘤生長到1.5cm2,隨後用PTEN(orf_403胺基酸；η=5)、PTEN-Iong(G305R；η=5)或野生型PTEN-long(n=4)處理。處理5天後，經PTEN-Iong處理的小鼠的平均發光變化(averagechangeluminescence)顯示顯著減少，但經PTEN或PTEN-long(G305R)處理的小組未減少。發光減少與腫瘤尺寸減小有關。這些數據說明PTEN-long需要5『ATR和磷酸酶活性來起作用。圖21A-21C.經PTEN-long處理的U87異種移植物的分析說明細胞凋亡的活化和PII信號傳導的抑制。如上所述處理腫瘤5天。(A)指定處理5天後收集經PTEN-long野生型和G305R處理的腫瘤並溶解以進行蛋白質印跡分析(westernanalysis)。PTEN-long的野生型蛋白質能夠降低FOXO和AKT磷酸化並活化卡斯蛋白酶-3裂解。(B)將如所指定處理5天的代表性腫瘤固定於福馬林(formalin)中並用石蠟包埋。針對檢測已裂解的卡斯蛋白酶-3(細胞凋亡的標記物)的抗體將切片染色。經PTEN-long處理的細胞的凋亡細胞百分比顯著增加，P=0.0419，學生t檢驗。(C)已裂解卡斯蛋白酶-3染色的代表性影像。圖22A-22B.在用PTEN-long處理5天的相同腫瘤中，血管數目大大減少。指定處理5天後收集經PTEN-long野生型和G305R處理的腫瘤且固定於福馬林中並用石蠟包埋。針對檢測⑶31(作為血管內襯的內皮細胞的標記物)的抗體將切片染色。(A)經PTEN-long處理的細胞的每個視野內的血管數目顯著減少(40X物鏡)，P=0.007579，學生t檢驗。(B)⑶31染色的代表性影像。圖23A-23B.在6個組(每組η=3)中建立U87異種移植物，且通過肌肉內(IM)、腹膜內(IP)、腫瘤內(IT)、皮下(Sc)、靜脈內(IV)注射，用PTEN-long處理四天。(A)如利用測徑器所測量的第O天至第4天的平均腫瘤尺寸變化(CiC)。(B)右側展示精諾真成像的代表性影像。從這一數據，我們可推斷出與未經處理的小鼠相比，所有注射方法都會影響腫瘤生長，並且僅經IM處理的小組顯示退化量顯著較低。圖24A-24C.對來自乳房、腦部和前列腺的6個細胞系進行異種移植實驗(Xenograftexperiment)。上方是對4個乳癌細胞系所繪製的變化圖。(A、B和D)經過指定處理天數，如利用測徑器所測量的腫瘤表面積(cm2)的圖。(C)處理僅M小時後即見到HCT-1143細胞中的變化。在所有四個細胞系中，處理後的腫瘤尺寸明顯減小。圖25.PTEN-Iong結合於細胞。將PTEN-long蛋白添加到在冰上的U87細胞培養基中持續10分鐘，固定，接著針對PTEN-Iong用識別它的抗體進行染色。圖26.邁爾斯分析(MilesAssay)=PTEN-Iong抑制血管滲透性(vascularpermeability)的誘導。這種抑制可通過將經純化蛋白質與PTEN抗體(6H2.1)一起預培育來逆轉。PTEN-Iong能夠抑制VEGF誘導的血管滲透性。這種誘導可通過將PTEN-Iong與針對PTEN產生的抗體一起預培育來恢復，但用對照IgG不能恢復。具體實施例方式一種包含具有SEQIDNO1中所示序列的連續胺基酸殘基的經分離的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含具有SEQIDNO:5中所示序列的連續胺基酸殘基的其類似物，或其各自的變異體。一種多肽，其包含(i)SEQIDNO1的殘基1至173，或(ii)包含SEQIDNO5的殘基1至173的其類似物，或(iii)SEQIDNO1的殘基22至516。一種藥物組合物，其含有包含連續胺基酸殘基的磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，所述連續胺基酸殘基具有SEQIDNO=I中所示序列，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含具有SEQIDNO:5中所示序列的連續胺基酸殘基的其類似物。一種治療受試者的實體腫瘤的方法，其包含給予所述受試者一定量的包含具有SEQIDNO:1中所示序列的連續胺基酸殘基的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含具有SEQIDNO:5中所示序列的連續胺基酸殘基的其類似物，以有效治療受試者的實體腫瘤。一種抑制受試者的實體腫瘤的生長的方法，其包含給予所述受試者一定量的包含具有SEQIDNO:1中所示序列的連續胺基酸殘基的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO:1的殘基22至516的其片段，或包含具有SEQIDNO:5中所示序列的連續胺基酸殘基的其類似物，以有效抑制受試者的實體腫瘤的生長。一種抑制受試者的實體腫瘤中的血管生成的方法，其包含給予所述受試者一定量的包含具有SEQIDNO:1中所示序列的連續胺基酸殘基的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO:1的殘基22至516的其片段，或包含具有SEQIDNO:5中所示序列的連續胺基酸殘基的其類似物，以有效抑制受試者的實體腫瘤中的血管生成。一種誘導受試者的實體腫瘤中的血管的血管上皮細胞發生細胞凋亡的方法，其包含給予所述受試者一定量的包含具有SEQIDNO:1中所示序列的連續胺基酸殘基的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含具有SEQIDNO:5中所示序列的連續胺基酸殘基的其類似物，以有效誘導受試者的實體腫瘤中的血管的血管上皮細胞發生細胞凋亡。在本文所述方法的一實施例中，腫瘤是癌性腫瘤。在本文所述方法的一實施例中，癌性腫瘤是受試者的神經膠質細胞、前列腺、卵巢、子宮、子宮內膜、乳房、黑素細胞、腎、肺、結腸、頭部、頸部或胰臟的腫瘤。在本文所述方法的一實施例中，癌性腫瘤是由PTEN或由PII路徑(PI3KpattiWay)活化或呈PTEN陰性。在本文所述方法的一實施例中，PTEN-Iong或其類似物或PTEN-long片段通過直接引入實體腫瘤中來給予受試者。在本文所述方法的一實施例中，PTEN-Iong或其類似物或PTEN-Iong片段是注射至實體腫瘤中。在本文所述方法的一實施例中，PTEN-Iong或其類似物或PTEN-Iong片段是通過導管直接引入實體腫瘤中。在本文所述方法的一實施例中，PTEN-Iong或其類似物或PTEN-Iong片段是通過直接引入供應實體腫瘤的血管中來給予受試者。在本文所述方法的一實施例中，PTEN-Iong或其類似物或PTEN-Iong片段是注射至供應實體腫瘤的血管中。在本文所述方法的一實施例中，PTEN-Iong或其類似物或PTEN-Iong片段是通過導管直接引入供應實體腫瘤的血管中。在本文所述方法的一實施例中，PTEN-Iong或其類似物或PTEN-Iong片段是靜脈內給予受試者。在本文所述方法的一實施例中，PTEN-Iong或其類似物或PTEN-Iong片段是皮下給予受試者。一種治療受試者的實體腫瘤的方法，其包含給予所述受試者一定量的表達載體，所述表達載體編碼包含SEQIDN0:1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO:5的其類似物，以在實體腫瘤的細胞中表達有效治療所述受試者的實體腫瘤的量的PTEN-long、PTEN-Iong片段或其類似物。一種包含SEQIDNO1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO5的其類似物，其用於治療受試者的實體腫瘤，抑制受試者的實體腫瘤的生長，誘導受試者的實體腫瘤的血管上皮細胞發生細胞凋亡，或抑制受試者的實體腫瘤中的血管生成。在用於本文所述用途的化合物的一實施例中，腫瘤是癌性腫瘤。在本文所述方法的一實施例中，癌性腫瘤是神經膠質癌、前列腺癌、乳癌、子宮內膜癌、黑素細胞癌、腎癌或肺癌腫瘤。在用於本文所述用途的化合物的一實施例中，癌性腫瘤是由PTEN或由PII路徑活化或呈PTEN陰性。一種組合物，其包含鍵合非肽試劑的包含SEQIDNO1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO5的其類似物，所述非肽藥劑分別增加PTEN-long、PTEN-long片段或其類似物的血漿半衰期。在一實施例中，本文所述組合物進一步包含藥物載劑。在本文所述組合物的一實施例中，增加血漿半衰期的非肽試劑是聚乙二醇(PEG)。在所述組合物的一實施例中，PEG鍵合PTEN-long、PTEN-long片段或其類似物的C端或N端。在所述組合物的一實施例中，增加血漿半衰期的非肽試劑是氯甲酸-9-芴基甲酯(Fmoc)或(7-磺酸基)-9-芴基甲氧羰基。一種經分離的核酸，其編碼包含SEQIDNO1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-long)，或編碼包含SEQIDNO=I的殘基22至516的其片段，或編碼包含SEQIDNO5的其類似物。在一實施例中，核酸包含具有SEQIDNO2或SEQIDNO6中所示序列的連續核苷酸。在一實施例中，核酸包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:6中所示序列的連續核苷酸殘基503至2243。在一實施例中，核酸包含具有SEQIDNO:3或SEQIDNO:7中所示序列的連續核苷酸。在一實施例中，核酸包含SEQIDNO:3或SEQIDNO:7中所示序列的連續核苷酸殘基503至2243。在一實施例中，核酸是RNA。在一實施例中，核酸是DNA。在一實施例中，核酸是cDNA。一種表達載體，其包含核酸，所述核酸編碼包含SEQIDNO:1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO5的其類似物。一種轉化細胞，其能夠表達包含SEQIDNO1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO5的其類似物，其中所述細胞已將編碼PTEN-Iong或其類似物的重組DNA整合到其基因組中。一種宿主細胞，其能夠表達包含SEQIDNO1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO5的其類似物，其中所述宿主細胞包含編碼PTEN-Iong或其類似物的質粒。在一實施例中，宿主細胞是細菌細胞。在一實施例中，宿主細胞是哺乳動物細胞。一種方法，其包含混合(1)包含SEQIDNO=I的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO5的其類似物；和(增加PTEN-Iong或其類似物的血漿半衰期的非肽試劑，以使得包含SEQIDNO1的PTEN-Iong或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段或包含SEQIDNO5的其類似物鍵合非肽試劑，所述非肽試劑分別增加所述PTEN-long、PTEN-Iong片段或其類似物的血漿半衰期。一種經分離的核酸分子，其由SEQIDNO2或SEQIDNO6核酸序列的具有至少20個核苷酸的片段或在嚴格條件下與SEQIDNO2或SEQIDNO6的核酸序列的互補序列或與SEQIDNO:2SEQIDNO:6特異性雜交的其互補序列組成。一種經分離的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段結合(1)包含SEQIDNO=I的胺基酸殘基1-173的PTEN-Iong多肽；或⑵包含SEQIDNO5的其類似物；或⑶具有SEQIDNO:3中所示序列的胺基酸；或(4)包含SEQIDNO:1的殘基22至516的PTEN-Iong片段。在一實施例中，抗體是單克隆抗體(monoclonalantibody)。在一實施例中，抗體是抗體片段。在一實施例中，抗體片段是Fab、Fab'、F(ab')2或？￥片段。在一實施例中，抗體片段是單鏈抗體(single-chainantibody)0在一實施例中，抗體是人源化抗體(humanizedantibody)。一種經分離的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段結合PTEN-Iong的構象抗原決定基(conformational印itope)，其中所述PTEN-long包含SEQIDNO:1的殘基1-173中所示的序列，但其中抗體不結合PTEN。在一實施例中，抗體結合包含SEQIDNO1的殘基153-173中的任一者的抗原決定基(epitope)。一種經分離的抗體或其片段，其中所述抗體或其片段結合PTEN-long的抗原決定基，其中所述PTEN-Iong包含SEQIDNO:1的殘基1-173中所示的序列，但其中抗體不結合PTEN。在一實施例中，抗體結合SEQIDNO1的殘基153-173或其一部分。一種SEQIDNO:1或SEQIDNO:5的肽片段，所述片段具有抗腫瘤、抗血管生成或抗細胞凋亡活性。在一實施例中，肽包含5-10個、10-20個、20-30個或30-40個胺基酸。在一實施例中，肽包含SEQIDNO1或SEQIDNO5的胺基酸1_173。在一實施例中，肽包含SEQIDNO:1的連續胺基酸殘基22至516。在一實施例中，肽不包含SEQIDNO:1或SEQIDNO5的連續胺基酸殘基174至576。如本文中所使用，物質的「防治有效(prophylacticallyeffective)」量是有效預防或延遲給予所述物質的受試者的特定病理學病狀(givenpathologicalcondition)發作的量。如本文中所使用，物質的「治療有效(therapeuticallyeffective)」量是有效治療、改善或減輕罹患特定病理學病狀且給予所述物質的受試者的特定病理學病狀的症狀或病因的量。在一實施例中，治療或防治有效量為每次給藥每位受試者約Img試劑至每次給藥每位受試者約Ig試劑。在另一實施例中，治療或防治有效量為每位受試者約IOmg試劑至每位受試者500mg試劑。在另一實施例中，治療或防治有效量為每位受試者約50mg試劑至每位受試者200mg試劑。在另一實施例中，治療或防治有效量為每位受試者約IOOmg試劑。在另一實施例中，治療或防治有效量是選自每位受試者50mg試劑、每位受試者IOOmg試劑、每位受試者150mg試劑、每位受試者200mg試劑、每位受試者250mg試劑、每位受試者300mg試劑、每位受試者400mg試劑和每位受試者500mg試劑。「給予(Administering)」試劑可使用所屬領域的技術人員已知的各種方法和傳遞系統(deliverysystem)中的任一者來實施或進行。給予可為例如靜脈內、經口、經鼻、腹膜內、通過腦脊液、通過植入物、經黏膜、經皮、肌肉內、血管內、動脈內、冠狀動脈內、心肌內或皮下。術語「PTEN-long類似物(PTEN-longanalogue)，，涵蓋具有一個或一個以上經修飾胺基酸，但保留與SEQIDNO:1的至少90%序列相似性，且如通過下文所述的活體內(invivo)研究所測量保留或改善抑制腫瘤生長的活性的多肽。明確排除PTEN本身(即由僅SEQIDNO1的殘基174-576定義的多肽)。術語「PTEN-long變異體(PTEN-longvariant)」涵蓋在PTEN-long的N端或C端或兩者具有一個或一個以上其它胺基酸(通常具有少於5個其它胺基酸)且如通過下文所述的活體內研究所測量保留或者改善抑制腫瘤生長的活性的多肽。術語「PTEN-long類似物變異體(PTEN-longanaloguevariant)」涵蓋在PTEN-long類似物(即SEQIDNO:5)的N端或C端或兩者具有一個或一個以上其它胺基酸(通常具有少於5個其它胺基酸)且如通過下文所述的活體內研究所測量保留或者改善抑制腫瘤生長的活性的多肽。本文中提及PTEN-long類似物的所有實施例在加以必要的變更下都適用於PTEN-long變異體。PTEN-long有時另外稱為PTEN-beta、PTEN-β、PTEN_S。用於PTEN-long、PTEN-long類似物、PTEN-long變異體、ΡΤΕΝ-long類似物變異體或其各自的接合物(conjugate)的可注射藥物傳遞系統包括溶液、懸浮液、凝膠、微球體和聚合可注射液(polymericinjectable)，且可包含賦形劑，諸如溶解性改變劑(solubility-alteringagent)(例如乙醇、丙二醇和蔗糖)和聚合物(例如聚辛醯基丙酮(polycaprylactone)和PLGA類)。可植入系統(Implantablesystem)包括棒狀物和盤狀物，且可含有賦形劑，諸如非限制性實例PLGA和聚辛醯基丙酮。用於本發明的組合物和化合物的口服傳遞系統(Oraldeliverysystem)包括片劑和膠囊。這些系統可含有賦形劑，諸如粘合劑(例如羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、其它纖維素物質和澱粉)、稀釋劑(例如乳糖和其它糖、澱粉、磷酸二鈣和纖維素物質)、崩解劑(例如澱粉聚合物和纖維素物質)和潤滑劑(例如硬脂酸鹽和滑石粉)。用於本發明的組合物和化合物的經黏膜傳遞系統("Transmucosaldeliverysystem)包括貼片、片齊、栓齊、子宮託、凝膠和乳膏，且可含有賦形劑，諸如增溶劑和增強劑(例如丙二醇、膽汁鹽和胺基酸)和其它媒劑(例如聚乙二醇、脂肪酸酯和衍生物，以及親水性聚合物，諸如羥丙基甲基纖維素和透明質酸)。用於本發明的組合物和化合物的經皮傳遞系統(Dermaldeliverysystem)包括例如水性和非水性凝膠、乳膏、多重乳液、微乳液、脂質體、軟膏、水性和非水性溶液、洗齊、氣霧劑、烴類基質和散劑，且可含有賦形劑，諸如增溶劑、滲透增強劑(例如脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和胺基酸)和親水性聚合物(例如聚卡波非(polycarbophil)和聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone))。在一實施例中，醫藥學上可接受的載劑是脂質體或經皮增強劑。用於本發明的組合物和化合物的可復原傳遞系統(reconstitutabledeliverysystem)的溶液、懸浮液和散劑包括媒劑，諸如懸浮劑(例如樹膠、三仙膠(Zanthans)^f維素和糖)、保溼劑(例如山梨糖醇)、增溶劑(例如乙醇、水、PEG和丙二醇)、表面活性劑(例如月桂基硫酸鈉、斯盤(Spans)、吐溫(Tweens)和十六烷基吡啶)、防腐劑和抗氧化劑(例如對羥基苯甲酸酯(paraben)、維生素E和C以及抗壞血酸)、抗結塊劑、塗布劑和螯合劑(例如EDTA)。如本文中所使用，「5'ATR」是如下文實驗部分中所述的5'替代性翻譯區。如本文中所使用，「藥物載劑(pharmaceuticalcarrier)」是用於向動物或人類傳遞本發明化合物或組合物的醫藥學上可接受的溶劑、懸浮劑或媒劑。載劑可為液體、氣霧劑、凝膠或固體且根據所考慮的計劃給藥方式進行選擇。「非肽試劑」的意思是任何化學實體，包括(但不限於)糖酸聚合物(glycomer)、聚合物、小分子(即基於烴的分子或分子量小於1000的有機分子)、脂質、脂質體。非肽試劑的實例包括(但不限於)PEG、Fmoc和FMS。如本文中所使用，「實體腫瘤」包括癌性和非癌性實體腫瘤。癌性實體腫瘤包括(但不限於)膽道癌；腦癌，包括膠質母細胞瘤和神經管母細胞瘤(medulloblastoma)；乳腺癌；子宮頸癌；絨膜癌；結腸癌；子宮內膜癌；食道癌；胃癌；上皮內贅生物(intra印ithelialneoplasm)，包括鮑溫氏病(Bowen'sdisease)和佩吉特氏病(Paget'sdisease)；肝癌；肺癌；淋巴瘤，包括霍奇金氏病(Hodgkin'sdisease)和淋巴細胞性淋巴瘤；神經母細胞瘤；口腔癌，包括鱗狀細胞癌；卵巢癌，包括由上皮細胞、基質細胞、生殖細胞和間葉細胞引起的卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；結腸直腸癌；肉瘤，包括平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、纖維肉瘤和骨肉瘤；皮膚癌，包括黑色素瘤、卡堡氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、基底細胞癌(kisocellularcancer)和鱗狀細胞癌；睪丸癌，包括胚細胞腫瘤(精原細胞瘤、非精原細胞瘤[畸胎瘤、絨膜癌])、基質腫瘤和生殖細胞腫瘤；甲狀腺癌，包括甲狀腺腺癌和髓樣癌；和腎癌，包括腺癌和威爾姆氏瘤(Wilmstumor)，但不包括非實體組織腫瘤，諸如白血病和其它血液學贅生物，包括急性淋巴細胞和骨髓性白血病；多發性骨髓瘤；AIDS相關白血病和成人T細胞白血病淋巴瘤。序列表的SEQIDNO1是全長PTEN-long蛋白序列。SEQIDNO1的胺基酸殘基1至173表示PTEN-Iong中由5'ATRmRNA序列編碼的新穎殘基(參見以下SEQIDNO2的描述)。PTEN的經典起始甲硫氨酸是SEQIDNO=I的胺基酸殘基174。SEQIDNO2是全長PTEN-longmRNA序列。PTEN-Iong的5'ATR序列開始於SEQIDNO2的核苷酸513(非經典CUG起始密碼子)且終止於SEQIDNO2的核苷酸1031。5'ATR與開始於SEQIDNO:2的核苷酸1032處的經典AUG起始密碼子且終止於SEQIDNO:2的核苷酸2243的PTEN開放閱讀框(openreadingframe)同框。因此，PTEN-long開放閱讀框從SEQIDNO2的核苷酸513延伸到SEQIDNO2的核苷酸2243且導致PTEN的N端增加173個胺基酸。所述蛋白質被稱為PTEN-long。SEQIDNO3是對應於全長PTEN-longmRNA序列的cDNA。SEQIDNO4是包含SEQIDNO1的胺基酸殘基153至173的PTEN-long蛋白序列的肽。這一獨特肽代表不存在於PTEN中的來源於PTEN-long的獨特抗原決定基。SEQIDNO5是全長PTEN-long類似物蛋白質序列。PTEN-long的胺基酸殘基1在類似物中從Leu變為Met以增加蛋白質產量。SEQIDNO6是經修飾的全長PTEN-long類似物mRNA序列。PTEN-long類似物的5『ATR序列開始於SEQIDNO6的核苷酸513(經工程改造的AUG起始密碼子)且終止於SEQIDNO6的核苷酸1031。SEQIDNO7是對應於經修飾的全長PTEN-long類似物mRNA序列的經修飾的cDNA。當說明書中給出範圍時，應了解所述範圍包括所述範圍內的所有整數和0.1單位，和其任何子範圍。舉例來說，77%至90%的範圍包括77.0%、77.1%、77.2%、77.3%、77.4%,77.5%,77.6%,77.7%,77.8%,77.9%,80.0%,80.1%,80.2%,80.3%,80.4%,80.5%,80.6%,80.7%,80.8%,80.9%和90.0%，以及範圍80%至81.5%等。本文所述的各種要素的所有組合都在本發明的範圍內。本發明將通過參考隨後的實驗詳情獲得充分了解，但所屬領域的技術人員將容易了解，所詳述的具體實驗僅說明本發明，本發明將在下文隨後的權利要求書中更全面地描述。實驗詳情PTEN腫瘤抑制因子是癌症中最常改變的基因之一。其充當磷脂醯肌醇3，4，5_三磷酸的脂質磷酸酶，而磷脂醯肌醇3，4，5_三磷酸又抑制來自磷脂醯肌醇3-激酶(PI3K)和Akt的致癌信號傳導。對PTENmRNA進行的檢查揭示770bp的5'非翻譯區(UTR)與PTEN開放閱讀框(ORF)同框。在這一UTRORF中，在弱科扎克(Kozak)序列中在經典AUG起始密碼子上遊的513個鹼基對處存在替代性CUG起始密碼子。雖然經典PTENORF的表達產生遷移到約^kDa的蛋白質，但含有5'UTR的PTENcDNA的表達能夠產生稱為PTEN-Iong的70kDa第二蛋白質。起始位點的突變表明55kDaPTEN是從經典起始密碼子開始的翻譯產生，而PTEN-Iong是從上遊替代性起始位點起始。使用不同PTEN抗體進行的免疫印跡說明PTEN-Iong在多種細胞系中的內源性存在。在小鼠ES細胞中進行的阻斷基因表達和基因剔除研究證實這種較大蛋白質實際上是PTEN。所添加的N端蛋白質序列編碼信號肽和裂解位點，表明PTEN-Iong進入分泌路徑。PTEN-Iong優先結合凝集素伴刀豆球蛋白A，這說明其被糖基化。此外，可通過親和純化，使用針對PTEN的抗體以及硫酸乙醯肝素從條件培養基純化PTEN-long。在活體內蛋白酶保護分析中PTEN-Iong也對降解敏感，而正常PTEN不會，這表明PTEN-Iong定位於細胞膜外部。試劑、細胞系和抗體-蛋白酶K和伴刀豆球蛋白-A是購自西格馬公司(Sigma)(密蘇裡州聖路易斯(St.Louis,MO))。肝素瓊脂糖和HiTrap肝素HP柱是購自安瑪西亞公司(Amersham)(新澤西州皮斯卡塔(Piscataway，NJ))。針對PTEN的抗體是購自賽信通公司(CellSignaling)(麻薩諸塞州丹弗斯(DanversMA))和卡斯卡特公司(Cascade)(麻薩諸塞州東溫切斯特(WinchesterMA))。Akt抗體是獲自賽信通公司(CellSignaling)(麻薩諸塞州丹弗斯(DanversMA))且E鈣粘素抗體(Ecadheinantibody)是獲自阿普斯德特密理博(UpstateMillipore)(麻薩諸塞州比爾裡卡(Billerica,Ma))。通過依姆德實驗室(ZymedLaboratories)(加利福尼亞州南舊金山(SouthSanFransisco，CA))得到的針對PTEN的新穎翻譯中所見的抗原決定基PRHQQLLPSLSSFFFSHRLPD(SEQIDNO3)的經親和純化的多克隆抗體。二級抗體是購自皮爾斯公司(Pierce)(美國伊利諾斯州羅克福德(Rockford,IL))。HEK293,ZR-75-1、SKBR-3、MDAMB-361、BT549和PC3是獲自美國模式培養物保藏中心(ATCC)(維吉尼亞州馬納薩斯(Manassas，VA))且根據所提供的指南進行培養。質粒和構築體-如先前所報導，通過將PTENcDNA(以U90351保藏於NCBI)克隆到pCEP4(英傑公司)的NotI位點中來產生編碼PTEN的完整開放閱讀框和5'非翻譯區的PCEP4-PTEN(李(Li)，辛普森(Simpson)等人1998)。進一步通過在用於克隆的原始NotI限制性位點(restrictionsite)的上遊連接銜接子(adaptor)編碼序列來在這一質粒上延長5'UTR0銜接子編碼位於經典起始位點的-513的第一可能替代性CTG起始密碼子上遊的至多10個鹼基對。假定替代性起始位點(putativealternatestartsite)突變為ATG的銜接子也可用於產生將有效地表達長形式的第二組表達構築體。此外，經典起始密碼子突變誘發為ATA也發生了，產生總共4種不同構築體(圖5.1)。也將這4種變異以及原始PTEN的開放閱讀框亞克隆到MSCV(克隆技術公司(Clontech)，加利福尼亞州芒廷維尤(Mountainview，CA))反轉錄病毒載體(retrovirusvector)中以通過感染進行穩定表達。蛋白酶保護分析-將HEK293細胞收集於無胰蛋白酶的冰冷PBS中且將5XIO5個細胞等分試樣與0.5μg/ml至10μg/ml遞增濃度的蛋白酶K一起培育30分鐘。包括使用0.1%Triton的對照以驗證蛋白酶K降解指定蛋白質的能力。用5mMPMSF停止反應。在2X拉姆利樣品緩衝液(125nMTris(pH6.8)、20%甘油、0.05%溴酚藍、4%SDS、10%2-巰基乙醇)中溶解細胞且針對PTEN、Akt和E鈣粘素進行免疫印跡。從小鼠肝臟純化PTEN-將來自C57BL6小鼠的肝臟於液氮中速凍，磨碎，並再懸浮於TNN緩衝液(50mMTris(pH7.4)、150mMNaCl、0.5%NP_40、5mMEDTA、3%甘油、ImMDTT,IX哺乳動物蛋白酶混合物抑制劑(MammalianProteaseCocktailhhibitor)[西格馬公司(Sigma)])中。用研缽使懸浮液均質化且在4度下在40，000RPM下離心1小時。依次用0.45微米和0.22微米過濾器過濾上清液。用TNN使丙烯葡聚糖凝膠200尺寸排除柱(安瑪西亞公司(Amersham))預平衡且以0.3ml/hr的速率施加樣品，隨後施加緩衝液。收集2ml洗脫份且匯集低分子量樣品並施加於預平衡的HiTrap肝素HP柱(安瑪西亞公司(Amersham))上。用3柱體積的TNN洗滌所述柱且逐步用3倍柱體積的0.3M、0.5M和IMNaClTNN溶液洗脫蛋白質。以0.5ml增量收集洗脫份且針對PTEN進行免疫印跡。從培養基純化PTEN肝素-使HEK293細胞在15cm培養皿中的10%FBSDMEM中生長到融合狀態(confluency)。將細胞與15ml無FBS的DMEM—起培育過夜。收集20個培養板的培養基且通過0.45微米過濾器過濾。使用AktaPrime(安瑪西亞生物科技公司(AmershamBioscience)),在4°C下，使用4ml/min的流速，用DMEM使Iml肝素HP柱平衡。隨後使條件培養基以lml/min通過柱。用10體積的BC20(K200mMNaCl、50mMTTris(pH7.4)UmMEDTA、0.2%TritonX-100)洗滌柱。用5mlIMNaCl以lml/min以Iml洗脫份洗脫蛋白質。通過觀Onm下的OD測定各洗脫份的蛋白質濃度。用20%三氯乙酸使各洗脫份的一半沉澱，用冷丙酮洗滌，在真空下乾燥。用20iLl拉姆利溶解緩衝液復原蛋白質且使用針對PTEN和PTEN-Iong的抗體進行免疫印跡。從血清純化PTEN-來自AB血漿的人類血清是獲自西格馬公司(Sigma)。通過0.45微米過濾器過濾Iml血清且使用蛋白質A/G瓊脂糖預清除抗體持續培育1小時。將肝素-瓊脂糖Ofeparin-agarose)與經過預清除的血清連同瓊脂糖對照一起培育過夜且第二天用BC150(150mMNaCl、25mMTris(pH7.4)、1%NP_40、0.25%脫氧膽酸鈉、ImMEDTA)洗滌。用拉姆利樣品緩衝液洗脫蛋白質且針對PTEN進行免疫印跡或出於重鏈汙染僅針對二級抗體進行。伴刀豆球蛋白A捕捉-在亞融合狀態下用BC500(500mMNaCl、20mMTris(pH7.4)U%TritonX-IOOUmMMnCl2UmMCaCl2UX蛋白酶抑制劑混合物)溶解HEK293細胞。離心細胞溶胞物並過濾。在4°C下用20微升伴刀豆球蛋白A瓊脂糖(西格馬公司(Sigma))捕捉1小時。用BC500洗滌樹脂且用拉姆利樣品緩衝液洗脫蛋白質。結果PTENmRNA具有上遊替代性起始位點保藏於NCBI的PTENmRNA(李(Li)和孫(Sun)1997；斯特克(Steck)，佩斯豪思(Pershouse)等人1997)含有廣泛的5'UTR05'UTR區中的約770bp連續序列與起始密碼子同框。在這一區域內不編碼甲硫氨酸；然而，從距離經典起始密碼子的-519處開始存在數個替代性起始CUG密碼子。根據scansite(scansite.mit.edu)和prosite(www.ebi.ac.uk/ppsearch)，這一序列的翻譯揭示無可鑑別的結構域。這整個區域的翻譯將向PTEN添加173個胺基酸，從而使其分子質量增加到約70千道爾頓(kilodaltons)(圖2和SEQIDNO:1)。其它PTEN直系同源物的比對揭示智人UTR的翻譯序列可在來自各種物種的PTEN的開放閱讀框中發現。黑猩猩、黃牛、義大利蜂和秀麗隱杆線蟲都含有與智人5'UTR的翻譯產物同源的蛋白質序列(圖3)。此外，智人5'UTR和小家鼠PTEN5'UTR的比對顯示廣泛核苷酸同源性(未圖示)。522個鹼基對的小家鼠5'UTR與經典起始密碼子同框翻譯且揭示與智人5'UTR的翻譯相比高度同源的蛋白質序列(圖5.3)。5'UTR的同源性和其它物種的翻譯蛋白質中來源於智人5'UTR的胺基酸序列的實際存在表明這一序列的進化重要性。PTENmRNA可從替代性上遊位點起始翻譯。PTENORF的過度表達產生55kDa的單一蛋白質條帶。包括5'UTR可產生約70kDa的第二較大蛋白質條帶。PTEN免疫印跡中的較大蛋白質條帶也內源性存在於許多細胞系中且可利用不同單克隆抗體進行檢測(圖4)。這一較大蛋白質條帶也存在於小鼠野生型ES細胞中而不存在於PTEN基因剔除小鼠ES細胞中，並且在穩定表達PTENshRNA的小鼠ES克隆中減少(圖4)。使用siRNA阻斷HEK293細胞中的人類PTEN蛋白的基因表達也會引起70kDa蛋白質的基因表達阻斷。編碼PTEN的ORF的質粒在PTEN缺失型PC3細胞系中的表達導致產生55kDa蛋白質。當也編碼5'UTR的質粒過度表達時，產生70kDa蛋白質。上遊假定起始密碼子從CTG突變為ATG(圖1，「ATG/ATG」)主要使免疫印跡圖案(immunoblotpattern)轉變成70kDa形式(圖4)。通過突變誘發也證實55kDa條帶來源於ATG起始密碼子(圖4「CTG/ATA」)。因此，5'UTR足以起始較長形式的PTEN的翻譯。因此，5'UTR稱為5'ATR(替代性翻譯區(AlternatelylranslatedRegion))且所檢測到的較大蛋白質稱為「PTEN-long」。針對從5'ATR翻譯的胺基酸產生的經親和純化的多克隆抗體並且用其證實在過度表達研究中重組PTEN-Iong的產生以及在HEK293細胞中內源性形式的產生(圖4)。從HEK293細胞的全細胞溶胞物免疫印跡和PC3細胞中的過度表達研究來看，似乎存在多種形式的PTEN-long，此指出存在可能的翻譯後修飾、未記錄的拼接形式或甚至5'ATR中的替代性起始密碼子。PTEN-long編碼N端信號肽PTEN-long的N端序列含有一長串丙氨酸，其可能指示跨膜序列(transmembranesequence)或信號肽。使用SignalIP3.O分析翻譯序列(translatedsequence)以高概率度(>95%)預測所述序列含有信號肽(圖幻。信號肽特徵性地包含鹼性胺基酸，隨後為疏水性段(hydrophobicstretch)。假定疏水性跨膜螺旋被脯氨酸破壞並且隨後為略帶極性的序列。也預測所述序列被裂解，表明蛋白質應釋放到ER內腔中。PTEN經糖基化分泌性和細胞外蛋白質的標誌之一是在高爾基體(golgiapparatus)中添加複合糖部分，這一過程稱為糖基化。可通過N-糖基化將糖添加到共同序列N-X-S/T(X不能為脯氨酸)中的天冬醯胺上(古浦塔(Gupta)和布魯納克(Brimak)2002)；絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的羥基也可以是所謂0-糖基化的目標(居樂紐斯(Julenius)，莫爾格德(Molgaard)等人2005)。PTEN具有多個0-糖基化位點，但僅具有一個N-糖基化位點。在捕捉分析中使用凝集素伴刀豆球蛋白-A(結合糖部分)來確定HEK293細胞中的PTEN補體的一部分是否經糖基化。從這些細胞純化到含約50%PTEN-long的PTEN混合物(圖6)。這說明PTEN-long經糖基化而且PTEN的細胞質55kDa形式經糖基化或PTEN-long在細胞外裂解。PTEN-long結合乙醯肝素且在細胞表面上發現PTEN結合多種蛋白聚糖(proteoglycan)，諸如多配體蛋白聚糖(syndecan)和磷脂醯肌醇蛋白聚糖(glypican)，這些蛋白聚糖被發現連接於細胞膜外層(outerleafletofthemembrane)。這些蛋白聚糖是肝素化程度最高的細胞外分子中的兩者(波萊羅(Blero)，張(Siang)等人2005)。先前已顯示PTEN對於帶高度負電的物質具有親和力，PTEN的這一性質造成其偏好高陰離子性PIP3(達斯(Das)，迪克森(Dixon)等人2003)。因為乙醯肝素是帶最多負電的生物分子之一，所以有可能乙醯肝素可介導PTEN與細胞外基質的結合。使用來自小鼠肝臟的蛋白質提取物，發現PTEN以高親和力結合乙醯肝素。此外，使用IMNaCl從肝素瓊脂糖柱上連續洗脫PTEN也洗脫得到PTEN-Iong(圖7)。粘附於細胞膜外表面的PTEN-Iong應對蛋白酶降解敏感。在蛋白酶保護分析中，將活細胞與蛋白酶一起培育且因為脂質膜對於蛋白酶來說不能透過從而用以保護所有細胞內蛋白質，所以僅細胞外蛋白質降解。通過與PBS—起輕微攪拌而從貼壁培養物移出HEK293細胞且與遞增濃度的蛋白酶K一起懸浮。用PMSF停止反應且用拉姆利緩衝液溶解細胞。PTEN-Iong對用蛋白酶K以及E-鈣粘素(其為已知細胞外蛋白質)處理顯示敏感性(圖8)。另一方面，PTEN顯示適當蛋白酶敏感性，此表明一定部分的55kDa物質也在細胞外(因為其經糖基化)或在使細胞質PTEN暴露於蛋白酶K的分析期間發生一些細胞溶解。包括使用細胞膜透過性Triton的對照以證明如果PTEN暴露於蛋白酶K，那麼其可降解。這是否是PTEN的本來形式或是遷移到55kDa並保留PTEN抗體的C端抗原決定基的PTEN-Iong的裂解形式還有待觀察。這一數據表明PTEN-Iong位於細胞表面上。可溶性PTEN-Iong分泌到培養基中。PTEN-Iong存在於細胞表面上並不排除蛋白質的一部分可溶並釋放到細胞環境中的可能性。使用肝素瓊脂糖從HEK293細胞的無血清條件培養基中親和純化PTEN-long。柱洗脫揭示培養基中存在遷移到50kDa分子量的PTEN(圖9)。使用PTEN-Iong特異性抗體進行的免疫印跡揭示了相同的50kDa物質，表明這種蛋白質保留從替代性起始位點翻譯而來的序列和來自PTEN單克隆抗體的C端抗原決定基的序列。這強烈地暗示觀察到是55kDa的PTEN部分事實上是被裂解的來源於上遊起始密碼子的翻譯產物。進一步通過在經ATG/ATG構築體轉染的HEK293細胞中過度表達ΡΤΕΝ-long來證實PTEN分泌到培養基中。使用這些細胞產生無血清條件培養基過夜並且使用PTEN單克隆抗體6H2.1使PTEN從Iml培養基中免疫沉澱。成功地從培養基中使較大PTEN條帶以及較小55kDa條帶免疫沉澱。因為蛋白質過度表達，所以可能不能進行蛋白質的適當加工，這導致分泌完整尺寸的70kDaPTEN0PTEN在人類血清中發現。生理分泌性物質的最佳來源之一是血清。使用肝素瓊脂糖從人類血清中親和純化PTEN。離心人類血清且過濾，去除微粒物質。隨後用BC150按15稀釋並用蛋白質A/G廣泛地預清除以去除IgG。將血清與少量肝素瓊脂糖一起分批培育。用拉姆利緩衝液洗脫肝素瓊脂糖並且針對PTEN對洗脫液進行印跡反應和僅針對二級抗體進行以消除重鏈汙染。PTEN和PTEN-Iong都在人類血清中發現(圖10)。PTEN-Iong的抗血管生成活性PTEN-Iong的抗血管生成作用通過以下進行證明(1)PTEN-long通常在發育中的小鼠視網膜中弱表達，但在經歷退化(involution)/細胞死亡的新生的生長血管中可見高水平表達(圖11)d2)PTEN-long在腫瘤內的細胞凋亡血管中發現。此外，用從轉染細胞部分純化的PTEN-Iong處理上皮細胞，抑制細胞遷移並且誘導細胞凋亡(圖12)。在培養物中的U87、HUVEC內皮細胞或293細胞中，經純化的PTEN-Iong也會誘導與細胞凋亡活化相關的細胞死亡，如通過卡斯蛋白酶-3裂解所測量。PTEN-Iong的活體內抗腫瘤和抗血管生成活性圖13顯示用PTEN-Iong處理小鼠(A)。給小鼠(n=5)注射膠質母細胞瘤細胞系U87以在乳房脂肪墊的2個部位(左和右)形成異種移植物。腫瘤移植後，直接給一個腫瘤注射PTEN-Iong且對側腫瘤不注射(w/PTEN-long)。也給一組5隻小鼠的對照組注射(空載體)來源於用空載體轉染的細胞的模擬純化蛋白質的製劑。對側腫瘤再次不注射(w/空載體)。在第1-11天和第13-14天處理小鼠。在指定日期用測徑器測量最大直徑(cm)。當腫瘤體積達到彡Icm時，處死小鼠。(B)通過將PTEN-Iong表達載體轉染到293細胞中，並且使用V5親和樹脂進行部分純化，隨後用V5肽洗脫來製備蛋白質。圖14展示用對照和PTEN-Iong注射液處理14天的小鼠的存活分率(以天計)。視網膜染色對p7鼠類視網膜中的PTEN-Iong和血管的染色揭示PTEN-long選擇性染色，在鼠類視網膜血管發育的時刻，開始退化的玻璃樣血管。針對PTEN-Iong的抗體是針對抗原決定基N-PRHQQLLPSLSSFFFSHRLPD-C(SEQIDNO:3)。使用BSl-凝集素(BSl-Iectin)進行血管染色。純化在一種純化PTEN-Iong的方法中，用ATG/ATGPTEN-Iong轉染293細胞且使細胞溶胞物通過Ni+親和柱。始終使用Ni+柱，在AKTA純化器上，使用咪唑洗脫緩衝液來純化PTEN-long。腫瘤退化注射之前經PTEN(orf403個胺基酸)或PTEN-long轉染的U87細胞的異種移植物。注射後7天，與PTEN過度表達組(n=4中的4個)相比，在PTEN-long過度表達組中乳房血管減少。這表明PTEN-long可影響腫瘤環境。討論在細胞溶胞物和組織的PTEN免疫印跡中整齊地觀察到第二較大蛋白質條帶。證實較大條帶是PTEN的證據包括用不同PTEN單克隆抗體檢測到較大蛋白質條帶；當用針對PTEN的siRNA處理細胞或剔除小鼠的PTEN基因座(locus)時，不存在較大蛋白質。觀察到大於700個鹼基對的PTEN的5'UTR與PTEN的經典起始密碼子同框。此外，在PTEN上遊的522個鹼基對處存在CUG密碼子，如果其翻譯，那麼可解釋PTEN免疫印跡中的較大蛋白質條帶的尺寸。儘管其與強的科扎克序列(Kozaksequence)無關，但其保留_1胞嘧啶和+1鳥苷序列。當翻譯並添加到PTENORF上時，應形成約70kDa的蛋白質，其為所觀察到的較大PTEN條帶的分子質量。這一序列的翻譯存在於許多PTEN直系同源物的實際編碼序列中。小鼠5'UTR也被檢查，因為觀察到小鼠組織溶胞物中具有類似條帶。小鼠5'UTR核苷酸序列與智人5'UTR高度同源並且類似地與起始密碼子同框。兩個可能替代性起始密碼子存在於-522和-516處且這一序列從那些位點的翻譯揭示胺基酸序列與智人序列90%+同源。這種假定蛋白質的保守性是顯著的並且表明了這一序列的進化重要性。為了較好地描述這一序列，將其改名為PTEN的5'ATR或替代性翻譯區以描述其可能進行翻譯。如下構築質粒其中，PTEN的開放閱讀框與5'ATR—起克隆並且單獨將這一重組PTEN的表達與產生403個胺基酸的經典開放閱讀框進行比較。與產生遷移到55kDa的單一條帶的僅含有PTEN的經典ORF的表達質粒(expressionplasmid)相比，包括5'ATR可產生遷移到約70kDa的第二較高PTEN蛋白條帶。較大蛋白質僅佔所翻譯總蛋白質的一小部分；然而，假定起始位點突變為ATG使得蛋白質比率轉向主要為較大形式。從5'ATR得到的蛋白質序列的保守性表明了其超出了進化產物。N端含有一段脂肪族胺基酸，預測其為跨膜序列。使用ftOsite和Signal3.OIP預測PTEN-long的N端是信號肽，緊接於其後是蛋白酶裂解位點(proteasecleavagesite)。使用活體內蛋白酶保護分析測試PTEN-long是否定位於細胞的細胞外表面上。PTEN-Iong顯示隨細胞外蛋白酶的量增加而逐漸降解，而PTEN則不會，這表明至少一些PTEN-long在細胞外且至少部分連接於細胞膜外層。這是暗示活性脂質磷酸酶位於細胞膜外層上的最引人產生興趣的結果。先前在PTEN蛋白複合物中鑑別出外細胞膜結合型蛋白聚糖、磷脂醯肌醇蛋白聚糖和多配體蛋白聚糖的兩個家族。PTEN存在於細胞表面上並不排除可溶性分泌性PTEN的可能性。多配體蛋白聚糖和磷脂醯肌醇蛋白聚糖是肝素化程度最高的蛋白聚糖中的兩者。乙醯肝素是帶高度負電的葡糖胺聚糖且已顯示PTEN對於陰離子具有親和力，這部分解釋了選擇帶高度負電的PIP3作為其底物的原因。從小鼠肝臟純化PTEN的優化實驗揭示PTEN和PTEN-long都可以使用肝素瓊脂糖柱進行純化。此外，使用肝素瓊脂糖柱，從HEK293細胞的無血清條件培養基純化得到約50kDa的蛋白質。經純化的蛋白質被對PTEN具有特異性的單克隆抗體和針對PTEN-long中存在的獨特胺基酸殘基的多克隆抗體識別。先前PTEN-long抗體僅識別約70kDa的蛋白質條帶。兩種抗體都可以識別一個條帶的觀察結果表明可能正在發生蛋白水解加工(proteolyticprocessing)，並且通過免疫印跡觀察到的蛋白質是PTEN中保留兩種抗體的抗原決定基的片段。PTEN和PTEN-long也都可以使用肝素親和純化從人類血清純化。在過去10年，已積累了設想PTEN序列的大量文獻。本文證明存在新穎形式的PTEN,其從替代性位點翻譯並且分泌到外層以及細胞外間隙中。活體內結果顯示PTEN-long是新穎抗腫瘤化合物，其通常存在於人類血清中並且具有抗血管生成和促細胞凋亡性質。參考文獻P.阿科蘭德(Acland，P.)，M.迪克森(M.Dixon)等人(1990).「通過選擇起始密碼子來決定int-2腫瘤蛋白的亞細胞命運(Subcellularfateoftheint-2oncoproteinisdeterminedbychoiceofinitiationcodon).，，自然(Nature)343(6259):662_5。B.阿爾伯特(Alberts,B.)(2002).細胞分子生物學(Molecularbiologyofthecell).紐約加蘭科學出版社(NewYork,GarlandScience)。S.J.貝克(Baker,S.J.)(2007)·"PTEN進入細胞核時代(PTENentersthenuclearage).」細胞(Cell)128(1):25_8。D.波萊羅(Blero,D.)，J.張等人(J.Zhang)(2005)."SHIP2缺陷型小鼠胚胎纖維母細胞中的磷脂醯肌醇3，4，5_三磷酸調節(Phosphatidylinositol3,4,5-trisphosphatemodulationinSHIP2-deficientmouseembryonicfibroblasts)·，，歐洲生物化學雜誌(FebsJ)272(10)-.2512-22.G.布洛貝爾(Blobel，G.)，P.沃爾特(P.Walter)等人(1979).「蛋白質易位穿過細Ifili細Ifiilf號11禾口1"(Translocationofproteinsacrossmembranes:thesignalhypothesisandbeyond).」實驗生物學協會論文集(SympSocExpBiol)33:9_36。D.邦努(Bonneau，D.)和M.隆基(M.Longy)(2000).「人類PTEN基因的突變(MutationsofthehumanPTENgene).，，人類突變(HumMutat)16(2):109_22。Α.迪克裡斯託凡諾(DiCristofano,A.),B.佩塞(B.Pesce)等人(1998)."Pten是胚胎發育和腫瘤抑制必不可少的(Ptenisessentialforembryonicdevelopmentandtumoursuppression).，，自然-遺傳學(NatGenet)19(4):348_55。C.英格(Eng,C.)(2003)."PTEN一種基因，多種綜合症(PTEN:onegene,manysyndromes).」人類突變(HumMutat)22(3)183-98。R.Ζ.弗洛基維茲(Florkiewicz,R.Ζ.)和Α·薩默(A.Sommer)(1989).「人類基本纖維母細胞生長因子基因編碼四種多肽三種從非AUG密碼子起始翻譯(Humanbasicfibroblastgrowthfactorgeneencodesfourpolypeptidesthreeinitiatetranslationfromnon-AUGcodons).」美國科學院院刊(ProcNatlAcadSciUSA)86(11):3978-81οΜ.M.弗雷澤(Fraser,Μ·Μ·)，X.朱(Χ.Zhu)等人(2004)."Pten喪失在活體內弓I起月巴大禾口星形細胞增殖增力口(Ptenlosscauseshypertrophyandincreasedproliferationofastrocytesinvivo).」癌症石if究(CancerRes)64(21):7773_9。R.古浦塔(Gupta,R.)和S.布魯納克(S.Brunak)(2002).「在人類蛋白質組中預測糖基化和與蛋白質功能的相關性(Predictionofglycosylationacrossthehumanproteomeandthecorrelationtoproteinfunction).，，生物信息亞洲論文集(PacSympBiocomput):310_22。S.R.漢納(Hann，S.R.)(1994).「非AUG起始的原致癌基因的調控和功能(Regulationandfunctionofnon-AUG-initiatedproto-oncogenes)·，，生物化學(Biochimie)76(9):880_6。S.R.漢納(Hann,S.R.)，Μ.迪克特(M.Dixit)等人(1994).「替代性起始的c-Myc蛋白通過非經典DNA結合位點差異性調控轉錄(Thealternativelyinitiatedc-MycproteinsdifferentiallyregulatetranscriptionthroughanoncanonicalDNA-bindingsite).」遺傳和發育(GenesDev)8(20):2441_52。S.R.漢納(Hann,S.R.)和R.N.埃森曼(R.N.Eisenman)(1984)·「由人類c-myc致癌基因編碼的蛋白質在贅生性細胞中差異表達(Proteinsencodedbythehumanc-myconcogene!differentialexpressioninneoplasticcells)·，，分子與細胞生物學(MolCellBiol)4(ll):2486_97。S.R.漢納(Hann,S.R.)，Μ.W.金(Μ.W.King)等人(1988)·「在c-myc外顯子1中的非AUG翻譯起始產生N端不同的蛋白質，其合成在伯基特氏淋巴瘤中被破壞(Anon-AUGtranslationalinitiationinc-mycexon1generatesanN-terminallydistinctproteinwhosesynthesisisdisruptedinBurkitt'slymphomas)·，，細胞(Cell)52(2):185_95。S.R.漢納(Hann,S.R.)，K.索羅安布朗(K.Sloan-Brown)等人(1992).「在高細胞密度下由甲硫氨酸去除引起的非AUG起始的c-myc1蛋白的翻譯活化(Translationalactivationofthenon-AUG—initiatedc-myc1proteinathighcelldensitiesduetomethioninedeprivation).」遺傳和發育(GenesDev)6(7):1229-40。J.W.赫爾希(Hershey，J.W.)(1991).「哺乳動物細胞中的翻譯控制(Translationalcontrolinmammaliancells).」生物化學年評(AnnuRevBiochem)60717-55。K.居樂紐斯(Julenius，K.)，Α.莫爾格德(A.Molgaard)等人(2005).「哺乳動物粘蛋白型0-糖基化位點的預測、保守性分析和結構表徵(Prediction，conservationanalysis,andstructuralcharacterizationofmammalianmucin-type0-glycosylationsites).」糖生物學(Glycobiology)15(2):153_64。P.基弗(Kiefer,P.)，P.阿科蘭德(P.Acland)等人(1994).「細胞核定位與分泌信號之間的競爭決定單一CUG起始形式的FGF3的亞細胞命運(CompetitionbetweennuclearlocalizationandsecretorysignalsdeterminesthesubcellularfateofasingleCUG-initiatedformofFGF3).」歐洲分子生物學組織期刊(EmboJ)13(17)4126-36。Μ.科扎克(Kozak，Μ.)(1989).「在無真核細胞的翻譯系統中非AUG密碼子的鄰近序列效應禾口無效起始(Contexteffectsand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所述受試者。19.一種治療受試者的實體腫瘤的方法，其特徵在於，包含給予所述受試者一定量的表達載體，所述表達載體編碼包含SEQIDNO:1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO:1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO:5的其類似物，以在所述實體腫瘤的細胞中表達有效治療所述受試者的所述實體腫瘤的量的PTEN-long,PTEN-Iong片段或所述其類似物。20.—種包含SEQIDNO:1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO5的其類似物，其用於治療受試者的實體腫瘤，抑制受試者的實體腫瘤的生長，誘導受試者的實體腫瘤中的血管上皮細胞發生細胞凋亡，或抑制受試者的實體腫瘤中的血管生成。21.根據權利要求20所述的PTEN-Iong或其片段或所述其類似物，其特徵在於，所述腫瘤是癌性腫瘤。22.根據權利要求21所述的PTEN-Iong或其片段或其類似物，其特徵在於，所述癌性腫瘤是神經膠質癌、前列腺癌、乳房癌、子宮內膜癌、黑素細胞癌、腎癌或肺癌腫瘤。23.根據權利要求21所述的PTEN-Iong或其片段或所述其類似物，其特徵在於，所述癌性腫瘤由PTEN或由PII路徑活化或呈PTEN陰性。24.一種組合物，其特徵在於，包含鍵合非肽試劑的包含SEQIDNO:1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO:5的其類似物，所述非肽試劑分別增加所述PTEN-long、PTEN-Iong片段或所述其類似物的血漿半衰期。25.根據權利要求M所述的組合物，其特徵在於，進一步包含藥物載劑。26.根據權利要求M所述的組合物，其特徵在於，增加所述血漿半衰期的所述非肽試劑是聚乙二醇(PEG)。27.根據權利要求沈所述的組合物，其特徵在於，所述PEG鍵合所述PTEN-long、PTEN-long片段或所述其類似物的C端或N端。28.根據權利要求M所述的組合物，其特徵在於，增加所述血漿半衰期的所述非肽試劑是氯甲酸-9-芴基甲酯(Fmoc)或(7-磺酸基)-9-芴基甲氧羰基。29.一種經分離的核酸，其特徵在於，編碼包含SEQIDNO:1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-long)，或編碼包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或編碼包含SEQIDNO5的其類似物。30.根據權利要求四所述的核酸，其特徵在於，所述核酸包含具有SEQIDNO:2或SEQIDNO6中所示序列的連續核苷酸。31.根據權利要求30所述的核酸，其特徵在於，所述核酸包含SEQIDNO:2或SEQIDNO6中所示序列的連續核苷酸殘基503至2243。32.根據權利要求四所述的核酸，其特徵在於，所述核酸包含具有SEQIDNO:3或SEQIDNO7中所示序列的連續核苷酸。33.根據權利要求32所述的核酸，其特徵在於，所述核酸包含SEQIDNO:3或SEQIDNO7中所示序列的連續核苷酸殘基503至2243。34.根據權利要求四所述的核酸，其特徵在於，所述核酸是RNA。35.根據權利要求33所述的核酸，其特徵在於，所述核酸是DNA。36.根據權利要求35所述的核酸，其特徵在於，所述核酸是cDNA。37.一種表達載體，其特徵在於，包含一種核酸，所述核酸編碼包含SEQIDN0:1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO5的其類似物。38.一種轉化細胞，其能夠表達包含SEQIDNO:1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO5的其類似物，其特徵在於，所述細胞已將編碼PTEN-Iong或其類似物的重組DNA整合到其基因組中。39.一種宿主細胞，其能夠表達包含SEQIDNO:1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO5的其類似物，其特徵在於，所述宿主細胞包含編碼PTEN-Iong或其類似物的質粒。40.根據權利要求39所述的宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞是細菌細胞。41.根據權利要求39所述的宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞是哺乳動物細胞。42.一種方法，其特徵在於，包含混合(1)包含SEQIDNO1的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(PTEN-Iong)，或包含SEQIDNO1的殘基22至516的其片段，或包含SEQIDNO5的其類似物；和(增加PTEN-Iong或所述其類似物的血漿半衰期的非肽試劑，以使得包含SEQIDNO:1的PTEN-Iong或包含SEQIDNO1的殘基22至516的所述其片段或包含SEQIDNO:5的所述其類似物鍵合所述非肽試劑，所述非肽試劑分別增加所述PTEN-long,PTEN-Iong片段或所述其類似物的所述血漿半衰期。43.一種經分離的核酸分子，其特徵在於，由SEQIDNO:2或SEQIDNO:6核酸序列的具有至少20個核苷酸的片段或在嚴格條件下分別與SEQIDNO2或SEQIDNO6的所述核酸序列的互補序列或與SEQIDNO:2或SEQIDNO:6特異性雜交的其互補序列組成。44.一種經分離的抗體或其片段，其特徵在於，所述抗體或其片段結合(1)包含SEQIDNO1的胺基酸殘基1-173的PTEN-Iong多肽；或⑵包含SEQIDNO5的其類似物；或(3)具有SEQIDNO3中所示序列的胺基酸；或(4)包含SEQIDNO1的殘基22至516的PTEN-Iong片段。45.根據權利要求44所述的經分離的抗體，其特徵在於，所述抗體是單克隆抗體。46.根據權利要求44所述的經分離的抗體，其特徵在於，所述抗體是抗體片段。47.根據權利要求46所述的抗體片段，其特徵在於，所述抗體片段是Fab、Fab'、F(ab')2或？￥片段。48.根據權利要求47所述的抗體，其特徵在於，所述抗體片段是單鏈抗體。49.根據權利要求44所述的抗體，其特徵在於，所述抗體是人源化抗體。50.一種經分離的抗體或其片段，其特徵在於，所述抗體或其片段結合PTEN-Iong的構象抗原決定基，所述PTEN-Iong包含SEQIDNO:1的殘基1-173中所示的序列，但所述抗體不結合PTEN051.根據權利要求50所述的抗體，其特徵在於，所述抗體結合由任一SEQIDNO:1的殘基153-173構成的抗原決定基。52.一種經分離的抗體或其片段，其特徵在於，所述抗體或其片段結合PTEN-Iong的抗原決定基，所述PTEN-Iong包含SEQIDNO=I的殘基1-173中所示的序列，但所述抗體不結合PTEN。53.根據權利要求52所述的抗體，其特徵在於，所述抗體結合SEQIDNO:1的殘基153-173或其一部分。54.一種SEQIDNO:1或SEQIDNO:5的肽片段，其特徵在於，所述片段具有抗腫瘤、抗血管生成或抗細胞凋亡活性。55.根據權利要求M所述的肽，其特徵在於，所述肽包含5-10個、10-20個、20-30個或30-40個胺基酸。56.根據權利要求M所述的肽，其特徵在於，所述肽包含SEQIDNO1或SEQIDNO5的胺基酸1-173。57.根據權利要求M所述的肽，其特徵在於，包含SEQIDNO:1的連續胺基酸殘基22至516。58.根據權利要求M或57所述的肽，其特徵在於，不包含SEQIDNO:1或SEQIDNO:5的連續胺基酸殘基174至576。全文摘要本發明提供一種包含SEQIDNO1的經分離的人類磷酸酶和張力蛋白同源物長多肽(phosphataseandtensinhomologlongpolypeptide，PTEN-long)、其片段和類似物，編碼所述多肽的核酸和包含所述多肽的組合物。本發明提供使用PTEN-long、其片段和類似物抑制實體腫瘤中的血管生成、治療實體腫瘤和抑制實體腫瘤生長的方法。文檔編號A61K38/00GK102387810SQ201080016333公開日2012年3月21日申請日期2010年2月17日優先權日2009年2月17日發明者雷蒙·帕森斯申請人:紐約哥倫比亞大學理事會