一種昆蟲特異性多胺類小分子毒素、其純化方法及其應用與流程

2023-10-18 03:50:14 1

本發明涉及生物技術領域，特別地，涉及一種從大腹園蛛毒液中提取的昆蟲特異性多胺類小分子毒素、其純化方法及其應用。

背景技術：

大腹園蛛(araneusventricosus)是一種以昆蟲為食的中型蜘蛛，在分類上隸屬於節肢動物門，蛛形綱，蜘蛛目，圓蛛科，圓蛛屬。大腹園蛛是目前世界上分布最廣的蜘蛛之一，其毒液中存在大量能麻醉或致死昆蟲的毒性成分。探索這些昆蟲特異性毒素分子的結構與功能特點，從中篩選出可能用做神經生物學研究工具試劑和藥物及殺蟲劑的前體分子。

目前，針對大腹園蛛毒液的研究很少，日本kawai等人通過研磨大腹園蛛毒囊得到毒囊提取物，發現大腹園蛛毒囊提取物能抑制龍蝦神經肌肉接頭興奮性突觸後電位，對抑制性突觸後電位沒有影響；此外該毒囊提取物能抑制穀氨酸誘導的突觸後膜去極化，而對天門冬氨酸誘導的突觸後模去極化沒有影響。段志貴等人採用電刺激方法得到純淨的毒液(大腹園蛛毒液)，並對其中的蛋白質成分進行了分析，此外還發現該毒液對昆蟲有選擇性作用，對脊柱動物無明顯毒性。其他未見關於該蜘蛛毒液昆蟲特異性小分子毒素分離純化和功能研究的報導。

因此，設計一種能夠從大腹園蛛的毒液中提取有利於製作神經生物學試劑和藥物以及製作殺蟲劑的毒素具有重要意義。

技術實現要素：

本發明的第一目的在於提供一種從大腹園蛛的毒液中分離純化出來的昆蟲特異性多胺類小分子毒素，。該昆蟲特異性多胺類小分子毒素的相對分子量為622.3971；其分子式為c28h50n10o6，其結構式如下：

經過質譜及核磁共振技術確定該昆蟲特異性多胺類小分子毒素的分子式、結構式和空間結構。經過對資料庫和文獻調研發現，一種來自葉金蛛(argiopelobata)毒液的乙醯多胺類小分子毒素argtx-636比本發明所得昆蟲特異性多胺類小分子毒素(計為avtx-623)多了一個亞甲基，其分子式為c29h52n10o6，其結構式如下：

argtx-636和avtx-623兩者因結構上的差異造成了分子功能上的明顯差異：(1)本發明所得avtx-623能夠特異性地作用於昆蟲鈉離子通道，其對昆蟲鈉通道的作用劑量比argtx-636低十倍；對昆蟲的活體毒性結果表明，avtx-623對昆蟲的半有效麻醉劑量比argtx-636低20倍；(2)對脊椎動物nmda受體活性上，本發明所得avtx-623的作用劑量也比argtx-636稍低；(3)本發明所得avtx-623是一種新的天然分子，其對昆蟲的選擇性活性比已發現的相似分子argtx-636要高得多。

本發明的第二目的在於提供一種上述昆蟲特異性多胺類小分子毒素的純化方法，具體包括以下步驟：

第一步、毒液的超濾，具體是：將電刺激收集到的毒液利用超濾管分離，重複多次，合併濾液，得到含有昆蟲特異性多胺類小分子毒素的非蛋白質小分子毒素混合物；

第二步、非蛋白質小分子毒素混合物的離子交換層析，具體是：將非蛋白質小分子毒素混合物採用強陽離子交換柱進行分離，得到洗脫峰；選擇經生物質普檢測出的目標峰作為反相-高效液相層析的目標峰；

第三步、反相-高效液相層析，具體是：採用c18反相柱將目標峰進行脫鹽和進一步純化，收集經過生物質普確定的目標峰進行冷凍乾燥，即得昆蟲特異性多胺類小分子毒素。

以上技術方案中優選的，所述第一步中：毒液為大腹園蛛的毒液；所述超濾管中的超濾膜為允許3kda以下的分子通過的半透膜；分離具體為在轉速為8000-12000rpm條件下離心8-10分鐘；重複分離三次合併濾液。

以上技術方案中優選的，所述第二步中：強陽離子交換柱的規格為10mm×250mm，其型號為xb-scx；分離具體是：利用0.1mol/lph6.0磷酸緩衝液上樣，採用含1.2mol/l氯化鈉和0.1mol/lph6.0磷酸緩衝液的混合溶液梯度洗脫，洗脫時的流速2ml/min，檢測波長為280nm。

以上技術方案中優選的，所述第三步中：c18反相柱的規格為10mm×250mm，反相柱的型號為xb-scx；採用洗脫液a和洗脫液b進行線性梯度洗脫，洗脫液a由質量含量為2％的乙腈、質量含量為0.1％的三氟乙酸以及去離子水混合而成；洗脫液b由質量含量為2％的去離子水、質量含量為0.1％的三氟乙酸以及色譜純乙腈混合而成；梯度洗脫；洗脫過程中總流速為2ml/min，檢測波長為280nm。

應用本發明的純化方法，具有以下有益效果：本發明通過超濾、離子交換層析以及反相-高效液相層析三大步驟，能夠從大腹園蛛的毒液中完全純化出純淨的昆蟲特異性多胺類小分子毒素，操作步驟簡單，損失率低，實用性強；本發明將液相層析法引入蜘蛛非蛋白質類多胺類小分子的分離純化前，採用了3kda的超濾膜去除蛋白質類成分，同時極大的減少了樣品的損失，實現了90％以上的得率；通過分子膜超濾、離子交換層析和基於c18柱的rp-hplc的組合分離策略，實現了上述毒素蛋白的分離和純化。

本發明的第三目的提供一種上述昆蟲特異性多胺類小分子毒素的應用，用於製作殺蟲劑和/或用於製作神經生物學試劑和藥物，具體是：用於製作殺蟲劑，主要是由於：本發明所得avtx-623對昆蟲具有劇毒，且能抑制蜚蠊dum神經細胞膜上的電壓敏感鈉離子通道電流；本發明所得avtx-623用於製作神經生物學試劑和藥物，主要是由於：其對大鼠和小鼠均無明顯毒性，且能抑制人穀氨酸受體。

除了上面所描述的目的、特徵和優點之外，本發明還有其它的目的、特徵和優點。下面將參照附圖，對本發明作進一步詳細的說明。

附圖說明

構成本申請的一部分的附圖用來提供對本發明的進一步理解，本發明的示意性實施例及其說明用於解釋本發明，並不構成對本發明的不當限定。在附圖中：

圖1是實施例1中昆蟲特異性多胺類小分子毒素的離子交換層析圖；

圖2是實施例1中昆蟲特異性多胺類小分子毒素的反相-高效液相層析圖；

圖3是實施例1中昆蟲特異性多胺類小分子毒素的質譜圖；

圖4是實施例1中昆蟲特異性多胺類小分子毒素的核磁共振氫譜圖；

圖5是實施例1中昆蟲特異性多胺類小分子毒素的核磁共振碳譜圖；

圖6是實施例1中昆蟲特異性多胺類小分子毒素的h1-h1耦合譜圖；

圖7是實施例1中昆蟲特異性多胺類小分子毒素的核磁共振dept譜圖；

圖8是實施例1中昆蟲特異性多胺類小分子毒素的核磁共振hmbc譜圖；

圖9是實施例1中昆蟲特異性多胺類小分子毒素的核磁共振hsqc譜圖；

圖10是實施例1中昆蟲特異性多胺類小分子毒素對蜚蠊鈉離子通道的阻斷作用示意圖；

圖11是實施例1中昆蟲特異性多胺類小分子毒素對蜚蠊鈉離子通道的半有效劑量示意圖；

圖12是實施例1中昆蟲特異性多胺類小分子毒素對大鼠drg鈉離子通道的影響示意圖；

圖13是實施例1中昆蟲特異性多胺類小分子毒素對紅頭麗蠅的半有效麻醉劑量示意圖；

圖14是實施例1中昆蟲特異性多胺類小分子毒素對美洲蜚蠊的半有效麻醉劑量示意圖；

圖15是實施例1中昆蟲特異性多胺類小分子毒素對人nmda受體(nr1/nr2b)的抑制作用示意圖；

圖16是實施例1中昆蟲特異性多胺類小分子毒素對人nmda受體的抑制作用的半有效抑制劑量示意圖。

具體實施方式

以下結合附圖對本發明的實施例進行詳細說明，但是本發明可以根據權利要求限定和覆蓋的多種不同方式實施。

實施例1：

一種昆蟲特異性多胺類小分子毒素，所述昆蟲特異性多胺類小分子毒素的相對分子量為622.3971；其分子式為c28h50n10o6，其結構式如下：

上述昆蟲特異性多胺類小分子毒素的純化方法，具體包括以下步驟：

第一步、毒液的超濾，具體是：將電刺激收集到的毒液利用超濾管分離，重複多次，合併濾液，得到含有昆蟲特異性多胺類小分子毒素的非蛋白質小分子毒素混合物。此處，毒液為大腹園蛛的毒液；所述超濾管中的超濾膜為允許3kda以下的分子通過的半透膜；分離具體為在轉速為8000-12000rpm條件下離心8-10分鐘；重複分離三次合併濾液。

第二步、非蛋白質小分子毒素混合物的離子交換層析，具體是：將非蛋白質小分子毒素混合物採用強陽離子交換柱(採用月旭科技(上海)股份有限公司生產的產品)進行分離，得到10個洗脫峰，詳見圖1；選擇經生物質譜檢測出的目標峰作為反相-高效液相層析的目標峰(圖1中標有*的峰)。此處，強陽離子交換柱的規格為10mm×250mm，其型號為xb-scx；分離具體是：利用ph6.0磷酸緩衝液上樣，採用氯化鈉溶液梯度洗脫，氯化鈉溶液洗脫時的流速2ml/min，檢測波長為280nm。

第三步、反相-高效液相層析，具體是：採用c18反相柱(採用月旭科技(上海)股份有限公司生產的產品)將目標峰進行脫鹽和進一步純化，詳見圖2，收集經過生物質譜確定的目標峰(圖2中標有*的峰)進行冷凍乾燥，即得昆蟲特異性多胺類小分子毒素。此處，c18反相柱的規格為10mm×250mm，反相柱的型號為xb-c18；採用洗脫液a和洗脫液b進行線性梯度洗脫，洗脫液a由質量含量為2％的乙腈、質量含量為0.1％的三氟乙酸以及去離子水混合而成；洗脫液b由質量含量為2％的去離子水、質量含量為0.1％的三氟乙酸以及色譜純乙腈混合而成；進行梯度洗脫；洗脫過程中總流速為2.0m/min，檢測波長為280nm。

鑑定本發明所得昆蟲特異性多胺類小分子毒素(avtx-623)的純度和結構，詳情如下：

1、對本發明所得昆蟲特異性多胺類小分子毒素(avtx-623)進行質譜分析，具體是：

利用電噴霧生物質譜(esi-tofq-ii)測定avtx-623的分子量，詳見圖3，從圖3中可以看出avtx-623帶1個正電荷，根據電荷數和質荷比可以計算出avtx-623的分子量為622.3971。同時可以看出，avtx-623中雜質含量極低，為高純品。

2、本發明所得昆蟲特異性多胺類小分子毒素(avtx-623)進行核磁共振分析及結構解析，具體是：

①、avtx-623的氫譜和碳譜分析

利用布魯克vns-600核磁共振儀上進行了氫譜分析(詳見圖4)和碳譜分析(詳見圖5)。500mhz和600mhz用來進行1hnmr分析，125mhz和150mhz用來進行13cnmr分析。化學位移(δ)單位為ppm，耦合常數單位為赫茲(hz)。

②、二維核磁共振譜採集及譜圖分析

所有的二維譜圖在相敏感模式下採用時間相遞增法加標準脈衝排序和相循壞的方法採集。溶劑峰抑制採用預飽和的方法獲得。二維核磁共振譜在室溫下記錄，包括cosy譜，利用37和73ms的混合時間，cosy的記錄數據點為t1和t2是512和2048。利用軟體xwinnmr(bruker)進行被操作和觀察。所有的數據被零填充去產生2k和4k實際基質的cosy.傅立葉轉換前，採用具有一個1/2的相漂移的正玄波或正玄波平方窗口功能。

根據esi-msm/z623.4015[m+h]計算出質荷比為623.3988，分子式為c28h51o6n10確定該化合物化學式是：c28h50o6n10，其13c-nmr譜圖(詳見圖5)和dept譜圖(詳見圖7)譜顯示有28個碳信號，包括15個亞甲基碳(δc48.2,46.7,46.0,45.1,41.7,39.0,38.5,37.4,37.1,29.7,27.4,27.0,25.6,24.0,23.6)，5個次甲基碳(δc133.0,108.1,103.8,54.2,52.2)，8個季碳(δc175.5,174.9,173.6,170.6,159.1,158.7,157.3,114.4)，通過1h-nmr譜圖(詳見圖4)、13c-nmr譜圖(詳見圖5)、hsqc譜圖(詳見圖9)和dept譜圖(詳見圖7)等波譜數據對所有的h和c進行了歸屬。

該毒素的核磁共振氫譜圖(詳見圖4)上6.36(1h,d,j＝2.3hz)，6.31(1h,dd,j＝8.2,2.3hz)，6.97(1h,d,j＝8.2hz)，表明存在一個苯環的abx偶合系統，6.36ppm和6.31ppm的存在顯示苯環上存在兩個含氧取代，在碳譜上存在159.1和157.3ppm進一步證明苯環上存在兩個含氧取代。碳譜上170.6，175.5，173.6和174.9ppm為羰基碳信號，結合該化合物存在10個n，提示是醯胺鍵的羰基碳，在氫譜高場區(δ<3.5ppm)和碳譜高場區(δ<50.0ppm)存在多個ch2信號，表明該化合物存在多個ch2碳鏈。碳譜158.7ppm提示存在一個c＝n雙鍵，化合物可能存在一個胍基。綜上所述，該化合物含有一個苯環，並且存在4個醯胺鍵，通過多個ch2碳鏈相連，還有一個胍基。

該化合物1h-nmr(詳見圖6)數據與化合物argtx-636非常相似(參考文獻：martinraditsch,matthiasgeyer,hansrobertkalbitzer.polyaminespidertoxinsandmammaliann-methyl-maspartatereceptorsstructuralbasisforchannelblockingandbindingofargiotoxin636[j].eur.j.biochem.1996,240:416-426.)，表明這兩個化合物有相同的骨架，兩者最大的區別在於化合物1的13c-nmr少了一個脂肪碳信號，並且化合物1分子質量是622，比argtx-636的分子質量636少14，表明化合物1少了一個ch2，在hmbc譜(圖8)中，h-2(δ3.35,3.18)與c-3(δ23.6)相關，h-5(δ2.95,2.89)與c-3(δ23.6)相關，h-3(δ1.58)與c-4(δ27.0)相關，h-7(δ3.00)與c-5(δ48.1)相關，並結合1h-1hcosy譜中，h-2(δ3.35,3.18)與h-3(δ1.58)相關，h-5(δ2.95,2.89)與h-4(δ1.57)相關，確定c2-c5的碳鏈，以及n1和n6之間通過4個ch2相連，確定是n1和n6之間比argtx-636少了一個ch2，其它部分完全相同，綜合1dnmr和2dnmr確定該化合物的結構，即該化合物的分子式為c28h50n10o6，結構式如下：

3、分析本發明所得昆蟲特異性多胺類小分子毒素(avtx-623)的功能，具體是：

①avtx-623對昆蟲的麻醉和致死作用，詳情如下：

經膜片鉗分析，毒素avtx-623在濃度為10μmol/l時能完全阻斷蜚蠊的鈉離子通道(詳見圖10)，通過不同濃度的avtx-623對蜚蠊鈉離子通道的作用分析，得出了毒素avtx-623對昆蟲dum細胞鈉通道的半有效濃度。其中半有效溶度為0.84±0.04μmol/l(詳見圖11)。毒素avtx-623在濃度100μmol/l時對大鼠鈉離子通道沒有表現出明顯的影響(詳見圖12，圖12中的對照為直接加水的實驗)。研究結果表明，avtx-623能在10μmol/l濃度下完全阻斷昆蟲的鈉離子通道，而在高達100μmol/l濃度下對脊椎動物鈉離子通道沒有明顯作用(詳見圖12)，表現出很強的選擇性。對昆蟲的毒理實驗顯示，avtx-623對紅頭麗蠅(c.vicina)的麻醉作用的半有效劑量為4.9±0.6μg/g(詳見圖13)，而對美洲蜚蠊(蟑螂)的麻醉作用的半有效劑量為3.5±0.5μg/g(詳見圖14)。這些研究結果提示，毒素分子avtx-623可以成為一種新型的綠色農藥先導分子。而在高達100mg/kg的腹腔注射劑量下，對小鼠沒有表現出明顯的毒性。

②avtx-623對人體穀氨酸受體(nmdar1/nmdar2b)通道的作用，詳情如下：

經膜片鉗分析，毒素avtx-623在濃度為100nmol/l時能抑制75％的人穀氨酸受體(nmdar1/nmdar2b)通道(詳見圖15)，通過不同濃度的avtx-623對人的穀氨酸受體通道的作用分析，得出了毒素avtx-623對人體穀氨酸受體(nmdar1/nmdar2b)通道的半有效濃度為8.7±1.3nmol/l(詳見圖16)。而這種受體通道與癲癇、抑鬱症和老年痴呆等疾病直接相關。

③avtx-623與結構最相近的argtx-636相比較：

現有的argtx-636主要作用於非脊椎動物和脊椎動物的穀氨酸受體，對不同亞型的受體抑制濃度在0.1μmol/l到3μmol/l範圍中。未見這些乙醯多胺類小分子對昆蟲鈉離子通道有選擇性作用的報導。

本發明所得avtx-623對昆蟲鈉離子通道的阻斷活性較強，半有效劑量低於1μmol/l，而100倍濃度的argtx-636隻能阻斷昆蟲鈉離子通道的20％。此外，10倍濃度的argtx-636人的nmda受體(nr1/nr2b)的抑制作用還不能達到avtx-623的作用強度。

綜上所述，本發明所得昆蟲特異性多胺類小分子毒素對昆蟲具有劇毒，且能抑制蜚蠊dum神經細胞膜上的電壓敏感鈉離子通道電流，用於製作殺蟲劑(如用作綠色農藥研發先導分子的可能性)；本發明所得昆蟲特異性多胺類小分子毒素對大鼠和小鼠均無明顯毒性，且能抑制人穀氨酸受體(avtx-623對穀氨酸受體亞型nmda受體的極高親和力)，用於製作神經生物學試劑和藥物(如有可能作為一種抗癲癇、腦年痴呆、帕金森和抑鬱症的先導分子)。

以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，對於本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。