T細胞誘導的組織修復和再生的製作方法

2023-10-29 21:54:52 2

專利名稱：T細胞誘導的組織修復和再生的製作方法
背景技術：
發明領域本發明一般涉及T細胞，特別是活化T細胞用於組織修復和再生中的組合物和方法。
相關領域說明創傷癒合通常是一系列協調的事件，它包括(a)組織破壞並喪失正常組織結構；(b)細胞壞死和出血；止血(血凝塊形成)；(c)裂殖(segmented)和單核炎性細胞浸潤，伴隨血管充血和組織水腫；(d)單核細胞(巨噬細胞)分解血凝塊和破壞細胞和組織；(e)肉芽組織形成(纖維組織形成和血管形成)。這一系列細胞事件已在大量哺乳動物種類中形成的所有組織和器官的創傷中觀察到(Gailet等人，Curr.Opin.Cell.Biol.6717-725，1994)。因此，上述系列細胞事件是所有哺乳動物組織修復的普遍方面。
組織修復和再生的過程是複雜的，並在多水平上受到調節和組織(orchestrated)。通常個別的因子(例如細胞因子、受體、激素等)在此過程中起重要作用，並作為多種治療形式可能的治療方式被測試。但是，由於這種調節的複雜性質，單一因子或受體等，或甚至因子或受體的簡單組合已被證明不足以提供有益效果。因此，本領域需要提供大量參與哺乳動物組織修復和再生複雜過程的不同分子。
附圖簡述

圖1用活化T細胞(XCELLERATETM)療法治療前後患者的CT掃描。
圖2XCELLERATETM治療前和治療3及4個月後患者的CT掃描。
發明祥述在進行本發明之前，對下文中將要使用的某些術語進行定義可有助於理解本發明。
此處使用的術語「刺激」，指的是細胞表面部分連接誘導的初始反應。例如，對於受體，這樣的刺激需要受體連接和後續的信號轉導事件。關於T細胞刺激，這樣的刺激指的是T細胞表面部分連接，在一個實施方案中其隨後誘導信號轉導事件，例如TCR/CD3複合體的結合。而且，刺激事件可活化細胞並上調或下調分子的表達或分泌，例如下調腫瘤生長因子β(TGF-β)。因此，即使沒有直接信號轉導事件，細胞表面部分的連接也可導致細胞骨架結構的重組或細胞表面部分的接合，其中每一個都能增強、修飾，或改變後續的細胞反應。
此處使用的術語「活化」，指的是細胞表面部分充分連接後誘導的可測量的生化或形態、表型，和/或功能改變的細胞狀態。對於T細胞，這樣的活化可以是T細胞被充分刺激後誘導的細胞增殖狀態。T細胞的活化還可誘導細胞因子的產生和/或分泌，並實行調節的或細胞溶解的效應子功能。對於其他細胞，此術語指的是上調或下調特定的物理化學過程。
此處使用的術語「靶細胞」，指的是預期被細胞表面部分連接刺激的任何細胞。
此處使用的「抗體」，包括多克隆和單克隆抗體(mAb)；靈長類化的(例如，人源化的)；鼠的；小鼠-人的；小鼠-靈長類的；和嵌合的；可是完整分子、其片段(例如scFv、Fv、Fd、Fab、Fab』和F(ab)』2片段)，或完整分子和/或片段的多體或聚集體；可自然發生或被製備，例如，通過免疫、合成或基因工程；此處使用的「抗體片段」，指的是衍生自抗體或與抗體相關的片段，它們結合抗原並在一些實施方案中被衍生以呈現促進清除和吸收的結構特徵，例如，通過與半乳糖基結合。這包括，例如，F(ab)、F(ab)』2、scFv、輕鏈可變區(VL)、重鏈可變區(VH)，和其組合。
此處使用的術語「蛋白質」，包括蛋白質、糖蛋白和其他源自細胞的修飾蛋白質，多肽和肽；可是完整分子、其片段，完整分子和/或片段的多聚體或聚集體；可自然發生或被製備，例如，通過合成(包括化學的和/或酶的)或基因工程。
此處使用的術語「因子(agent)」、「配體」，或「與細胞表面部分結合的因子」，指的是與確定的細胞群結合的分子。該因子可與任何細胞表面部分結合，例如受體、抗原決定簇，或出現在靶細胞群上的其他結合位點。該因子可是蛋白質、肽、抗體和抗體片段、融合蛋白質、合成分子，或有機分子(例如，小分子)，等。在本說明書內，針對T細胞刺激，抗體用作這種因子的典型實例。
此處使用的術語「細胞表面部分」可以指細胞表面受體、抗原決定簇，或出現在靶細胞群上的任何其他結合位點。
此處使用的術語「與細胞表面部分結合的因子」和「細胞表面部分」，應當被看作一組表現特異性結合的互補/反互補的分子，其一般有相對高的親和力(親和力常數，Ka，約106M-1)。
此處使用的「共刺激信號」，指的是與初始信號(例如TCR/CD3的結合)配合導致T細胞增殖和或活化的信號。
此處使用的「分離」，包括將一種成分從其他成分中基本純化的任何方法(例如，通過過濾、親和力、浮力密度或磁吸引)。
此處使用的「表面」，指的是能使因子與之粘附的任何表面，包括並不限於，金屬、玻璃、塑料、共聚物、膠體、脂類、細胞表面等。基本上能保持因子與之結合或粘附的任何表面。此處用作表面的典型實例是微粒，例如小珠。
此處使用的「改善」，定義為使更好；好轉(The American HeritageCollege Dictionary，3rdEdition，Houghton Mifflin Company，2000)。
此處使用的「微粒」，可包括膠體微粒、微球、納米顆粒(nanoparticle)、小珠等。在多種實施方案中，商業上可獲得的表面是有用的，例如小珠或其他微粒(例如，Miltenyi Particles，MiltenyiBiotec，德國；Sepharose beads，Pharmacia Fine Chemicals，瑞典；DYNABEADSTM，Dynal Inc.，New York；PURABEADSTM，PrometicBiosciences；產自Immunicon，Huntingdon Valley，PA的磁珠；產自Bangs Laboratories，Inc.，Fishers，IN的微球)。
此處使用的「順磁微粒」，指的是如以上所定義的微粒，其集中響應磁場。
此處使用的「抗原」，指的是下述任何分子1)能被mAb或其衍生物的「獨特型」部分(抗原結合區)特異識別，並結合的完整分子或其片段；2)包含能被MHC結合的肽序列，對於MHC提呈，可特異地與其相關的T細胞抗原受體連接。
此處使用的術語「動物」或「哺乳動物」，包括所有的哺乳動物，包括人。優選，本發明中的動物是受試人。
此處使用的術語「暴露」，指的是使之非常接靠近或直接接觸的狀態或情況。
此處使用的術語「增殖」，意指通過產生新細胞而生長或繁殖。
此處使用的「創傷位點」，被定義為宿主中的任何部位，其起於手術操作、感染、外傷損傷誘導或造成的組織損傷、組織損害或者一種疾病狀態，包括但不限於，心肌梗塞、心肌缺血、骨壞死(eroded bone)、退化軟骨組織(degenerated cartalagenous tissue)、退化神經組織、灼傷或移植部位。
此處使用的術語「神經營養因子」，指的是能刺激神經組織生長或增殖的化合物。
關於創傷癒合，改善的臨床結果可指更快速的傷口閉合、更少的傷口收縮和/或瘢痕形成。
對於閉塞血管旁路的新生血管形成，「有效治療量」是導致新血管形成的量，新血管至少能傳輸部分正常情況下要通過堵塞血管的血液。
T細胞組合物
T細胞有獨特的生物學和功能。它們在表面上表達和分泌能與其他細胞/組織以特定方式相互作用的一系列重要分子，其能促進或調節這些細胞或組織的分化/去分化/成熟/組織形成和修復活性。特別的，T細胞在不同的活化狀態(並因此表達不同的表面或分泌分子)能導致組織發育、分化或重組和修復，這能改善多種醫療狀態。
T細胞，尤其是活化T細胞，具有很多可能參與哺乳動物組織修復和再生複雜過程中的分子，並滿足本領域提供一系列複雜的調節分子的需要，這些分子為通過調節/控制此過程中其他細胞類型以提供組織生長和/或改造所必需。
一般地，由誘導活化的細胞表面部分連接而產生本發明的活化T細胞。通過活化T細胞群並用結合輔助(accessory)分子的配體刺激T細胞表面的輔助分子而產生活化T細胞，其描述於例如，標題為共刺激和細胞濃度的美國專利申請(申請於2002年4月26號)，和美國專利申請08/253,694；08/435,816；08/592,711；09/183,055；09/350,202；和09/252,150，和專利6,352,694；5,858,358；和5,883,223，此處全部引用作為參考。
T細胞可從多種來源獲得，包括外周血單核細胞、骨髓、胸腺、組織活檢、腫瘤、淋巴結組織、消化道相關淋巴組織、黏膜相關淋巴組織、脾組織，或其他任何淋巴組織和腫瘤。T細胞可從T細胞系和自體的或同種異體的來源獲得。T細胞還可從異種來源獲得，例如，小鼠、大鼠、非人靈長類和豬。
優選，通過單採血液成分術或白細胞分離法從個體循環血中分離細胞。單採血液成分術產物通常包含淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞，其他有核白細胞、紅細胞，和血小板。在一個實施方案中，通過單採血液成分術或白細胞分離法收集的細胞可洗滌以去除血漿成分，並為了後續的處理步驟將細胞置於適當的緩衝液或培養基中。在本發明一個實施方案中，細胞用磷酸鹽緩衝液(PBS)洗滌。在另外的實施方案中，洗滌液可缺少鈣和可缺少鎂或如不缺少所有的二價離子，也可缺少很多二價離子。作為那些本領域普通的技術人員容易理解洗滌步驟可通過本領域熟知的方法完成，例如根據製造商的建議使用半自動化的「極限沉降」(flow-through)離心(例如，the Cobe 2991 cell processor，Baxter)。洗滌之後，細胞可用多種生物相容的緩衝液重懸，例如，無Ca++/Mg++的PBS。另外，可去除單採血液成分術樣品中不需要的成分並將細胞重懸於培養基中。
在另一實施方案中，如前所述，通過溶解紅細胞、分離和保存單核細胞或者例如，通過PERCOLLTM梯度離心而從外周血淋巴細胞中分離T細胞。T細胞的特異亞群，例如CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+T細胞，可通過正或負選擇技術進一步分離。例如CD3+、CD28+T細胞可用CD3/CD28綴合的磁珠進行正選擇(例如，DYNABEADSM-450 CD3/CD28 T Cell Expander)。在本發明的一個方面，用針對負選擇的細胞表面獨特標誌的抗體組合而完成通過負選擇富集T細胞群。優選的方法是通過使用單克隆抗體混合物的負磁性免疫粘附或流式細胞術進行細胞分選和/或選擇，其中單克隆抗體針對負選擇細胞上的細胞表面標誌。例如，通過負選擇富集CD4+細胞，單克隆抗體混合物一般包括抗CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR，和CD8的抗體。
因此，在一個實施方案中，本發明使用的順磁微粒的大小足夠被吞噬單核細胞吞噬，其隨後通過磁性分離去除。在某些實施方案中，順磁微粒是可商業得到的小珠，例如，那些由Dynal AS生產的商品名為DynabeadsTM的小珠。這裡可作實例的DynabeadsTM是M-280、M-450和M-500。一方面，用「無關」蛋白質(例如，血清蛋白質或抗體)包被順磁微粒去除其他非特異細胞。無關蛋白質和抗體包括那些不能特異地靶向欲擴增的T細胞的蛋白質和抗體或其片段。在某些實施方案中，無關小珠包括用綿羊抗小鼠抗體、山羊抗小鼠抗體和人血清白蛋白包被的小珠。
刺激用T細胞的另一種製備方法是在洗滌步驟後冷凍細胞，它不需要單核細胞去除步驟。希望不被理論束縛，冷凍和後續的融化步驟通過去除細胞群中的粒細胞和一定程度的單核細胞而提供更單一的產物。在去除血漿和血小板的洗滌步驟後，細胞可懸浮在冷凍液中。許多本領域已知的冷凍液和參數在本發明中是有用的，一種方法涉及使用含20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他適合的細胞冷凍介質。然後其用介質1∶1稀釋以使DMSO和HSA的終濃度分別為10％和4％。然後細胞以每分鐘1°的速度冷凍到-80℃並貯存在液氮貯存罐的汽相。可使用其他控制冷凍方法以及不加控制的在-20℃或液氮中立即冷凍的方法。
由誘導活化的細胞表面部分連接而產生本發明的活化T細胞。通過活化T細胞群並用結合輔助分子的配體刺激T細胞表面的輔助分子而產生活化T細胞，其描述於例如標題為共刺激和細胞濃度的美國專利申請(申請於2002年4月26號)，專利申請08/253,694；08/435,816；08/592,711；09/183,055；09/350,202；和09/252,150，和專利6,352,694；5,858,358；和5,883,223，此處全部引用作為參考。
一般地，T細胞活化可通過細胞表面部分的連接完成，例如刺激T細胞受體(TCR)/CD3複合體或CD2表面蛋白質。商業上提供許多抗人CD3的單克隆抗體，可作實例的是，BC3克隆(XR-CD3；FredHutchinson Cancer Research Center，Seattle，WA)、OKT3，從American Type Culture Collection獲得的雜交瘤細胞中製備，和單克隆抗體G19-4。同樣地，抗CD2抗體的刺激形式是已知的和可獲得的。用抗CD2抗體通過CD2的刺激一般至少用兩種不同的抗CD2抗體的組合完成。抗CD2抗體的刺激組合已有描述，包括以下T11.3抗體與T11.1或T11.2抗體組合(Meuer等人，Cell 36897-906，1984)，和9.6抗體(其與T11.1識別同樣的表位)與9-1抗體組合(Yang等人，J.Immunol.1371097-1100，1986)。也可使用與上述任何抗體結合同樣表位的其他抗體。其他抗體或抗體組合，可用標準技術製備和鑑定。還可通過與抗原、肽、蛋白質、肽-MHC四聚體(參見Altman等人，Science 1996年10月4號；274(5284)94-6)、超抗原(例如，葡萄球菌腸毒素A(SEA)、葡萄球菌腸毒素B(SEB)、中毒性休克綜合症毒素1(TSST-1))、內毒素的接觸完成刺激，或通過與多種促分裂原，包括但不限於，植物凝集素(PHA)、乙酸肉豆蔻佛波醇(phorbolmyristate acetate)(PMA)和離子黴素、脂多糖(LPS)、T細胞促分裂原，和IL-2的接觸完成刺激。
為進一步活化T細胞群，用與輔助分子結合的配體刺激T細胞表面的共刺激或輔助分子，例如CD28。因此，本領域的一個普通技術人員應認識到，能交聯CD28分子的任何因子，包括抗CD28的抗體或其片段或CD28的天然配體可用於刺激T細胞。作為例子用於本發明的抗CD28的抗體或其片段包括單克隆抗體9.3(IgG2a)(Bristol-MyersSquibb，Princeton，NJ)、單克隆抗體KOLT-2(IgG1)、15E8(IgG1)、248.23.2(IgM)、克隆B-T3(XR-CD28；Diaclone，Besancon，法國)和EX5.3D10(IgG2a)(ATCC HB11373)。作為例子的天然配體包括B7家族蛋白質，例如B7-1(CD80)和B7-2(CD86)(Freedman等人，J.Immunol.1373260-3267，1987；Freeman等人，J.Immunol.1432714-2722，1989；Freeman等人，J.Exp.Med.174625-631，1991；Freeman等人，Science 262909-911，1993；Azuma等人，Nature36676-79，1993；Freeman等人，J.Exp.Med.1782185-2192，1993)。
另外，根據本發明還可使用，無論是天然的還是由化學或重組技術合成的天然配體的結合同源物。其他因子可包括天然的和合成的配體。因子可包括，但不限於，其他抗體或其片段、肽、多肽、生長因子、細胞因子、趨化因子、糖肽、可溶性受體、類固醇、激素、促分裂原(例如PHA)或其他超抗原。
T細胞初始刺激信號和共刺激信號可由不同的方法提供。例如，提供每一種信號的因子可在溶液中或與表面偶連。當偶連到表面上時，因子可與同一表面(即，「順式」結構)或與分離的表面(即，「反式」結構)偶連。另外，一種因子可偶連到表面上而其他因子在溶液中。在一個實施方案中，提供共刺激信號的因子結合到細胞表面上，提供初始活化信號的因子在溶液中或與表面偶連。在某些實施方案中，兩種因子都在溶液中。在另一實施方案中，因子可是溶解的形式，然後交聯到表面上，例如表達FC受體或抗體或其他與該因子結合的結合因子的細胞。在優選的實施方案中，這兩種因子固定在小珠上，或在同一小珠上，即「順式」，或在分離的小珠上，即「反式」。舉例來說，提供初始活化信號的因子是抗CD3的抗體，提供共刺激信號的因子是抗CD28的抗體；兩種因子以等同的分子數量固定在同一小珠上。在一個實施方案中，使用每一種抗體以1∶1的比例結合到小珠上用於CD4+T細胞擴增和生長。在本發明的某些方面，結合到小珠上的抗CD3∶CD28抗體使用的比例與使用1∶1的比例觀察到的擴增相比可觀察到T細胞擴增的提高。在一個特定的實施方案中，與使用1∶1的比例觀察到的擴增相比觀察到約從0.5到約3倍的提高。在一個實方案例中，結合到小珠上的CD3∶CD28抗體的比例範圍從100∶1到1∶100及二者之間所有的整數值。在本發明的一個方面，結合到微粒上的抗CD28的抗體比抗CD3的抗體多，即CD3∶CD28的比例小於1。在本發明的某些實施方案中，結合到小珠上的抗CD28的抗體與抗CD3的抗體的比例大於2∶1。在一個特定的實施方案中，使用結合到小珠上的CD3∶CD28抗體的比例為1∶100。在另一實施方案中，使用結合到小珠上的CD3∶CD28抗體的比例為1∶75。在另一實施方案中，使用結合到小珠上的CD3∶CD28抗體的比例為1∶50。在另一實施方案中，使用結合到小珠上的CD3∶CD28抗體的比例為1∶30。在一個優選的實施方案中，使用結合到小珠上的CD3∶CD28抗體的比例為1∶10。在另一實施方案中，使用結合到小珠上的CD3∶CD28抗體的比例為1∶3。在再一實施方案中，使用結合到小珠上的CD3∶CD28抗體的比例為3∶1。
為刺激T細胞和其他靶細胞，微粒與細胞的比例可使用從1∶500到500∶1及二者之間的任何整數值。作為本領域普通的技術人員容易理解，微粒與細胞的比例取決於微粒相對靶細胞的大小。例如，小尺寸的小珠只能結合幾個細胞，而更大的小珠可結合許多細胞。在某些實施方案中細胞與微粒的比例範圍從1∶100到100∶1及二者之間的任何整數值，並在另一實施方案中，包括1∶9到9∶1及二者之間任何整數值的比例，也可用於刺激T細胞。如上所述，可以改變引起T細胞刺激的抗CD3和抗CD28偶聯的小珠微粒與T細胞的比值，但一些優選的比值至少包括1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1到6∶1，其中一個優選的比例是至少21∶1小珠微粒每T細胞。在一個實施方案中，使用的微粒與細胞的比例為1∶1或更小。在另一實施方案中，微粒與細胞的比例隨刺激天數而變。例如，在一個實施方案中，微粒與細胞的比例在第一天為1∶1-10∶1，然後每天或隔天加入另外的微粒直到10天，最後的比例為1∶1-1∶10(基於添加當天的細胞計數)。在一個特定的實施方案中，在刺激的第一天微粒與細胞的比例為1∶1，並在刺激的第三和第五天調整到1∶5。在另一實施例中，根據刺激第一天的最終比例為1∶1，每天或隔天添加微粒，第三和第五天的比例為1∶5。在另一實施方案中，在刺激的第一天微粒與細胞的比例為2∶1，並在刺激的第三和第五天調整到1∶10。在另一實施方案中，根據刺激第一天的最終比例為1∶1，每天或隔天添加微粒，第三和第五天的比例為1∶10。本領域的一名技術人員應當理解其他多種比例適合在本發明中使用。特別的，比例將根據微粒大小和細胞的大小及類型改變。
使用某些方法學可在初始活化和刺激後，約12到約14天後將T細胞與刺激物分離，有利保持T細胞群的長期刺激。T細胞增殖的速率被定期監測(例如，每天)，例如，通過檢查T細胞的大小或測量體積，例如使用Coulter Counter。在這方面，靜止T細胞的平均直徑約6.8微米，刺激配體存在下起始活化和刺激，T細胞的平均直徑將在4天時增加到超過12微米並在約6天時開始下降。當T細胞的平均直徑下降到約8微米時，T細胞可被再活化和再刺激以誘導T細胞的進一步增殖。另外，可通過分析細胞表面存在的分子監測T細胞增殖的速率和T細胞再刺激的時間，例如，CD154、CD54、CD25、CD137、CD134、B7-1、B7-2，它們被誘導於活化T細胞上。
為誘導CD4+和/或CD8+T細胞群的長期刺激，需要用刺激因子再活化和再刺激T細胞幾次以產生數量增加是原T細胞群約10到約1,000倍的CD4+或CD8+細胞群，例如，抗CD3的抗體和抗CD28的抗體(例如B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besancon，法國))或單克隆抗體ES5.2D8。例如，在本發明的一個實施方案中，如此處所描述T細胞被刺激2-3次。在另一實施方案中，如此處所描述T細胞被刺激4或5次。
在另一實施方案中，可調節或裁剪(tailored)暴露到刺激因子例如抗CD3/抗CD28(即，CD3XCD28)包被小珠的時間以獲得需要的T細胞表型。由於TH細胞的擴增可誘導需要的組織修復和/或再生，因此相對CD8+細胞毒或抑制T細胞(TC)，研究人員可能需要更多的輔助T細胞(TH)，一般為CD4+T細胞。CD4+T細胞，表達重要的免疫調節分子，例如GM-CSF、CD40L和IL-2。當優選CD4介導的輔助時，例如此處描述的那樣，保持或增強CD4∶CD8比例的方法有重要作用。在本發明的一個方面，提高表達GM-CSF或IL-2的輸注細胞數量是有用的，所有這些因子主要由CD4+T細胞表達。另外，在需要增加CD8+T細胞數量和需要較少CD4輔助細胞的情況下，也可使用此處描述的T細胞活化方法，例如，在刺激和/或培養之前預選CD8+T細胞。優選升高水平的IFN-γ時可能發生這樣的情況。另外，在其他應用中，可能需要使用TH1型細胞群而不是TH2型細胞群(或反之亦然)或其上清。
為實行不同T細胞群的分離，可改變或脈動變化(pulsed)誘導活化的細胞表面部分連接的時間。例如，通過改變擴增時間和/或使用不同類型的刺激因子(例如，抗體或其片段、肽、多肽、MHC/肽四聚體、生長因子、細胞因子、趨化因子、糖肽、可溶性受體、類固醇、激素、促分裂原，例如PHA，或其他超抗原)以獲得特定的目的表型。多種表型標誌的表達隨時間而變；因此，可選擇特定的時間點或刺激因子以獲得特定的T細胞群。所以，根據刺激的細胞類型，刺激和/或擴增的時間可以是4周或更短、2周或更短、10天或更短，或8天或更短(4周或更短包括從4周到1天(24小時)範圍的所有時間)。在一些實施方案中，刺激和擴增可進行6天或更短、4天或更短、2天或更短，並在其他實施方案中少至24小時或更短，並優選4-6小時或更短(這些範圍包括其中的任何整數值)。當對T細胞進行短時刺激時，T細胞群的數量可能並不顯著升高，但該群細胞將提供更強壯和更健康的活化T細胞，它們能繼續在體內增殖並更接近類似天然效應T細胞群。
暴露於不同刺激時間和因子的T細胞可具有不同的特性。例如，典型的血液或單採血液成分術的外周血單核細胞產物的輔助T細胞群(TH，CD4+)多於細胞毒或抑制T細胞群(TC，CD8+)。通過刺激CD3和CD28受體體外(exvivo)擴增T細胞產生的T細胞群，在約8-9天前主要由TH細胞組成，而在約8-9天後，該群T細胞主要由不斷增加的TC細胞群組成。因此，根據治療目的，將主要由TH細胞組成的T細胞群輸入受試者可能是有益的。
另外，除CD4和CD8標誌外，其他表型標誌變化顯著，但大部分，在細胞擴增過程期間是可重現的。因此，這種重現性能根據特殊的目的(例如，骨再生相對於血管發生)調整活化的T細胞產物。
在一個這樣的例子中，在隨時間重現性變化的重要表型標誌中，有IL-2高親和力受體(CD25)、CD40配體(CD154)和CD45RO(通過與TCR的優先結合而提高TCR抗原結合敏感性的分子)。作為一名本領域普通的技術人員容易理解，由於多種原因這些分子是重要的。例如，CD25構成了允許T細胞快速分裂的自分泌環的重要部分。CD154已被證明在下述過程中起重要作用刺激抗原呈遞樹突細胞成熟；活化抗體產生B細胞；調節TH細胞增殖；增強TC細胞分化；調節TH細胞抗原呈遞細胞的細胞因子分泌；和刺激共刺激配體的表達，包括CD80、CD86和CD154。
在體外擴增過程中，細胞因子、細胞表面受體和本發明組織修復和再生中的其他重要因子，它們的生成增加經常開始的很早。因此，由於已知細胞因子和其他因子在介導T細胞的活化和功能及細胞分化的調節中是重要的，因此這些因子在開發T細胞治療產品中很可能是關鍵的。這方面的重要分子，包括，但不限於，IL-2、IL-4、TNF-α，和IFN-γ、轉化生長因子(TGF)TGF-β、神經白細胞素(neuroleukin)(磷酸葡萄糖異構酶)、神經生長因子、NF-κB轉錄因子和CD40。因此，通過在擴增前幾天獲得T細胞群並將這些細胞輸入到受試者中，或直接在損傷部位使用這些細胞或其上清，可出現治療效果，其中在體內出現另外的T細胞活化和擴增和/或出現組織修復和再生。
在體外擴增過程中，除上面討論過的細胞因子和標誌外，已知在介導T細胞活化和免疫介導的靶細胞調節中重要的粘附分子的表達也變化顯著，但是可重現的。例如，CD62L對於T細胞歸巢到淋巴組織和運輸T細胞到炎症部位是重要的。由於活化後的早期出現CD62L的下調，所以T細胞可進行短期擴增。相反地，長期培養產生的T細胞群具有更高水平的CD62L，並因此在其他優選條件下有更高的能力靶向活化T細胞到這些部位。多肽表達隨時間改變的另一個例子是CD49d，一個從血液向炎症部位組織間隙輸送淋巴細胞中涉及的粘附分子。CD49d配體與CD49d的結合也允許T細胞接受通過VCAM-1或纖連蛋白配體結合的活化和增殖共刺激信號。粘附分子CD54的表達，與T細胞-APC和T細胞-T細胞的相互作用和向炎症部位的歸巢有關，也隨擴增過程而改變。因此，可刺激T細胞與目的標誌特性(profile)一致的選擇時間，並隨後收集和輸入。也可輸入包含活化T細胞上清的組合物。也可在損傷部位直接使用活化T細胞，或其上清。因此，可調整T細胞以表達據信為治療適應症提供最好治療效果的標誌。
在多種實施方案中，本領域的一名普通技術人員理解從細胞中去除刺激信號取決於使用的表面類型。例如，如果使用順磁珠，那麼磁性分離是適宜的選擇。順磁珠的製造商說明書(例如，DYNALInc.，Oslo，挪威)詳細描述了分離技術。另外，如果表面是可從細胞分離的足夠大的小珠則可使用過濾。另外，商業上提供多種輸血過濾器，包括20微米和80微米輸血過濾器(Baxter)。因此，只要小珠大於濾器篩目的尺寸，這種過濾是非常有效力的。在相關的實施方案中，小珠可通過濾器，但可保留細胞而實現分離。
儘管此處描述的方法中使用的抗體易於從公共資源中獲得，例如ATCC，還能通過標準技術製備抗T細胞輔助分子和CD3複合體的抗體。生產本發明方法中使用的抗體的方法學為本領域所公知。
在本發明的一個方面，可使用本領域公知的一些方法對T細胞進行基因修飾。T細胞可用很多本領域普通技術人員公知的RNA或DNA表達載體轉染。基因修飾包括使用本領域公知的任何技術進行RNA或DNA轉染，例如電穿孔法(例如使用，The Gene Pulser II，BioRad，Richmond，CA)、多種陽離子脂類，(LIPOFECTAMINETM，LifeTechnologies，Carlsbad，CA)，或其他技術例如Current Protocols inMolecular Biology.，John Wiley Sons，New York.N.Y.中所描述的磷酸鈣轉染。例如，500μl Opti-MEM中的5-50μg RNA或DNA與濃度為10到100μg的陽離子脂類混合，並在室溫孵育20到30分鐘。其他適合的脂類包括LIPOFECTINTM、LIPOFECTAMINETM。形成的核酸-脂類複合體然後被加入到總體積約2ml(例如，在Opti-MEM中)的1-3×106抗原呈遞細胞中，優選2×106，並在37℃孵育2到4小時。T細胞還可用下述的病毒轉導方法學進行轉導。
另外可使用逆轉錄病毒轉導技術對T細胞進行基因修飾。在本發明的一個方面，逆轉錄病毒載體可是兼嗜性逆轉錄病毒載體，優選具有長末端重複序列特徵(LTR)的載體，例如，衍生自下述病毒的逆轉錄病毒載體莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生肉瘤病毒(myeloproliferative sarcoma virus)(MPSV)、小鼠胚胎幹細胞病毒(MESV)、小鼠幹細胞病毒(MSCV)、形成脾臟病灶病毒(SFFV)，或腺伴隨病毒(AAV)。大多數逆轉錄病毒載體衍生自小鼠逆轉錄病毒。然而，根據本發明，適合使用的逆轉錄病毒可得自任何禽類或哺乳動物來源的細胞。優選的這些逆轉錄病毒是兼嗜性的，意指它們能感染幾種宿主細胞，包括人的。在一個實施方案中，要表達的基因取代了逆轉錄病毒的gag、pol和/或env序列。許多例證性的逆轉錄病毒系統已被描述(例如，美國專利5，219,740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7980-990；Miller，A.D.(1990)Human Gene Therapy 15-14；Scarpa等人(1991)Virology180849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA908033-8037；和Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3102-109)。
T細胞組合物在組織修復和再生中的用途本發明的活化T細胞可普遍應用到需要治療的損壞組織或組織部位，其可包括多種不同的細胞、組織和器官。活化T細胞被「靶向」到損壞組織部位。本發明適於人類醫學中廣泛的多種損壞組織的修復。這些包括，但不限於骨壞死、退化軟骨組織、心肌缺血、損壞內皮細胞、退化或其他損壞神經組織、灼傷部位、術後部位和器官/組織移植部位的修復和/或再生。
例如，使用本發明的活化T細胞或其上清、由該細胞產生或其上清中存在的細胞生長因子和/或其他分子，將通過與細胞表面信號受體的結合影響組織部位的其他細胞，因此刺激和放大一般與創傷癒合、組織修復或改型的過程相關聯的生理事件級聯。例如，將增加創傷癒合的速度，導致更快的上皮細胞再生和組織修復。最後的結果是促進組織修復和再生。本發明的細胞和/或上清可用於招募其他細胞到創傷部位或需要組織再生的部位，例如間充質幹細胞、骨髓衍生的成血管細胞、神經幹細胞或組織修復中涉及的任何形式的前體細胞，包括但不限於單核細胞。可根據需要的結果在體外或體內給予本發明的活化T細胞或其上清。
當目標是阻斷疾病進程，以使組織發生自然癒合，或當目標是替換遺傳缺陷的蛋白質功能時，本發明的活化T細胞或其上清也是有用的。
損壞組織可來自組織創傷，來自手術過程、感染、外傷損傷誘導或造成的組織損壞，或者一種疾病狀態，包括但不限於，心肌梗塞、心肌缺血、骨壞死、退化軟骨組織、退化神經組織、灼傷，或移植部位。可使用多種技術將本發明的活化T細胞或其上清轉移到患者。例如，包括細胞和/或其上清的組合物可作為治療植入物(implant)、注射液或經由局部應用的適當製劑由醫師直接轉移到創傷部位。另外，活化T細胞或其上清可局部給藥，或為治療遠端患病組織而外科手術放置在正常組織部位。
創傷癒合過程是一系列協調的事件，它包括出血、血凝塊形成、血塊溶解並發損壞組織去除和肉芽組織作為初期修復物質沉積。肉芽組織是成纖維細胞和毛細血管的混合物。創傷癒合過程涉及不同的細胞群，包括內皮細胞、幹細胞、巨噬細胞和成纖維細胞。已知創傷修復中涉及的調節因子包括全身的激素、細胞因子、生長因子、細胞外基質蛋白質和其他調節生長和分化的蛋白質。
T細胞組合物在骨修復和再生中的用途骨在骨折後有基本的再生能力。複雜但有序的骨折修復順序包括止血、血塊溶解、肉芽組織內生、愈傷組織形成和愈傷組織改型到最佳結構(A.W.Ham.J.Bone Joint Surg.12827-844，1930)。參與此過程的細胞包括血小板、炎性細胞、成纖維細胞、內皮細胞、周細胞、破骨細胞和成骨祖細胞(osteogenic progenitors)。
設計用於骨修復的技術在骨折治療中是很有用的。骨折的骨的大部分仍通過鑄造法(casting)治療，它通過自然機制達到創傷修復。儘管近年在骨折治療上有所進步，包括設備的改良、新的刺激或補充方法的發展，但此創傷修復機制仍將代表本領域的重要進展。
本發明的活化T細胞或其上清可用於促進骨折修復。此技術的其他方面包括細胞或其上清轉移到治療帶有「弱骨」(weak bones)的患者中的用途(例如在象骨質疏鬆症的疾病中)；改善由未知原因產生的不良癒合(例如，纖維不結合(fibrous non-union))；促進移植整合和人工關節的功能；促進其他骨骼組織例如跟腱的癒合；並作為大的缺損修復的輔藥。
轉化生長因子(TGF)，也在通過影響細胞增殖、基因表達和基質蛋白質合成而調節組織癒合中顯示重要作用(Roberts Sporn，1989，M.B.Sporn和A.B.Roberts，Eds.，Springer-Verlag，Heidelberg，95(Part 1))。例如TGF-β1和TGF-β2可起始軟骨形成和骨生成(Joyce等人J.Cell Biol.110195-2007，1990；Izumi等人J.Bone Min.Res.7115-11，1992；Jingushi等人J.Orthop.Res.8364-371，1992)。因此，本發明產生該因子的活化T細胞，可在本發明的實踐中應用以影響骨折後新骨的形成。
在本發明的實施方案中本發明的活化T細胞外科手術植入到骨折部位。這樣的手術過程可包括直接注射活化T細胞製劑到骨折部位、手術修補複雜骨折或關節鏡手術。在活化T細胞或其上清應用於修復骨折的骨的情況下，哺乳動物修復細胞會自然移往骨損壞部位並在該部位增殖。
本發明還可用於刺激軟組織的生長或再生，例如韌帶、腱、軟骨和皮膚。活化T細胞或其上清可用於治療由外傷性損傷造成的骨骼結締組織的損壞。活化T細胞產生的多種因子可促進軟組織修復。這些包括，但不限於，TGF-β超家族成員(例如，TGF-β本身)，其刺激編碼胞外基質蛋白質的基因的表達，和其他細胞因子例如EGF和PDGF。在此過程中可能是重要的由活化T細胞產生的其他因子的實例包括(a)白細胞介素、趨化因子、幹擾素、集落刺激因子；(b)細胞粘附分子家族；(c)核反式作用蛋白質(nuclear trans acting proteins)例如轉錄因子。
本發明的活化T細胞或其上清可置於哺乳動物宿主的結締組織創傷區域。活化T細胞或其上清可直接注射到結締組織創傷區域。另外，外科技術，例如關節鏡手術，可用於傳遞細胞或上清到結締組織創傷區。
在本發明的一個方面，活化T細胞或其上清，可用於刺激體外培養的骨細胞或其前體細胞的骨再生。與活化T細胞或其上清共培養可導致骨細胞的成熟、分化、功能提高和/或移入潛能(engraftmentpotential)增強。另外，多種細胞類型與本發明的活化T細胞或其上清體外共培養可導致非T細胞譜系細胞的功能改變。然後由共培養改變的細胞可施用於哺乳動物用於組織修復和/或再生。
活化T細胞和/或其上清還可用於修復骨轉移(bone metastases)。有幾種病理狀態涉及鈣和磷酸鹽代謝紊亂。這些狀態包含骨相關疾病，包括佩吉特病(Paget’s disease)和骨質疏鬆症，及骨轉移中的骨質溶解。在許多經常發生的惡性腫瘤中骨轉移表現為主要問題。高鈣血症，因骨吸收引起，是惡性腫瘤常見的和非常重要的併發症，引起使人痛苦的症狀，例如劇烈痛苦和自發性骨折，並可導致代謝性昏迷和死亡。而且，瘤細胞誘導的骨質溶解可決定骨腫瘤的定位和生長增加。(參見，G.R.Mundy，Bone，8，supp.1，S9-516(1987)；和Calcium in BiologicalSystems，R.P.Rubin，G.B.Weiss，和J.W.Putney，Jr.eds.PlenumPress，N.Y.(1985))。體內由鈣和磷酸鹽異常沉積引起或導致的其他疾病狀態，例如類風溼性關節炎和骨關節炎。本發明的活化T細胞組合物或其上清可與已知促進所需活性的化合物聯合用於這些疾病的治療，例如使用osteoprotegrin或二膦酸鹽化合物。二膦酸鹽化合物是一類已開發用於多種骨代謝病的藥物，其靶標為過度骨吸收和不正常的鈣化和骨化。(M.D.Francis和R.R.Martodam，「The Role ofPhosphonates in Living Systems」R.L.Hilderbrand，ed.，CRC Press，Boca Raton，Fla，1983，pp.55-96；和H.Fleisch，Bone，1987，8，Supp.1，S23-S28)。
T細胞組合物在血管生成中的用途本發明還可用於調節血管的形成和擴展，或分別為血管發生和血管生成。這兩種生理過程在創傷癒合和組織再生中發揮重要作用。
最初，膠原、基質和血管在創傷部位沉積並提供組織修復中的傷口強度。新血管的形成包括血管內皮細胞增殖、遷移和浸潤，並已知被多種多肽生長因子調節。已鑑定出幾種有內皮細胞生長促進活性的多肽，包括酸性和鹼性成纖維細胞生長因子(FGF)，血管內皮生長因子(VEGF)和血小板衍生生長因子(PDGF)。
活化T細胞表達因子例如，但不限於，TGF-β，其促進這些生長因子的表達，可將該活化T細胞施用到宿主血管系統內或需要創傷癒合/血管生成的部位，以刺激血管的形成和擴展。在一些實例中，可能需要通過組織損傷誘導創傷癒合過程。
本發明的活化T細胞或其上清，也可用於刺激在體外培養的心肌細胞、內皮細胞或這些細胞的前體細胞中的血管生成。共培養這些細胞可導致細胞的成熟、分化、功能提高，和/或移入潛能增強。另外，本發明的細胞與多種細胞類型體外共培養可導致非T細胞譜系細胞的功能改變。
血管生成因子，包括誘導哺乳動物內以血管發生調節為特徵的生理改變的分子，例如，血管內皮生長因子(vasoendothelial growthfactor)，也可與本發明的組合物聯合使用。特徵性的調節實例包括調節(促進或抑制)腫瘤生長、組織修復和組織改造。當與多價配體結合時調節腫瘤生長的肽被認為是生血管的。調節血管發生或內皮細胞表型表達涉及的細胞過程的分子也包括在血管生成因子的定義中。實例包括內皮細胞增殖、內皮細胞存活、內皮細胞運動性、內皮細胞結合。
評價血管生成的體外試驗描述在Tolsma等人，J.Cell Biol.122497(1993)和Vogel等人J.Cell.Biochem.5374(1993)，此處全部引用作為參考。還可使用此處全部引用的美國專利6,225,118描述的體外試驗。簡言之，其中描述的是使用雙重培養並無需額外生長因子的基於合適細胞信號機制的體外血管生成試驗。使用此技術可證明血管發生的刺激和抑制。
T細胞組合物在神經再生中的用途在本發明的另一方面，活化T細胞或其上清用於刺激神經生長。為此，此處描述的組合物可直接應用到培養中的神經細胞或以適合體內給藥的組合物提供。在本發明優選的一個方面，組合物用於體外神經再生。
根據另外的實施方案，刺激軸突向外生長的方法包括用神經營養因子處理病人或體外培養神經細胞的附加步驟。該實施方案包括當給藥給病人時，本發明的組合物和神經營養因子以單劑量或分開的、多劑量形式給藥。如果使用分開的劑量形式，它們可同時地、連續地或彼此在短於約5小時內給藥。
本發明的方法和組合物可用於治療由多種疾病或身體創傷引起的神經損傷。這些包括，但不限於，阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、ALS、多發性硬化症、中風和局部缺血伴隨中風、neural paropathy、其他神經退化疾病、運動神經元疾病、坐骨神經壓傷(sciatic crush)、外周神經病變、糖尿病相關特殊神經病變(particularly neuropathyassociated with diabetes)、脊髓損傷和面神經壓傷。
本領域已鑑定出很多神經營養因子，這些因子中的任何因子均可與本發明的活化T細胞或上清組合物聯合使用。這些神經營養因子包括，但不限於，神經生長因子(NGF)、胰島素生長因子(IGF-1)和其截短的活性衍生物例如gIGF-1、酸性和鹼性成纖維細胞生長因子(分別地，aFGF和bFGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、睫狀神經營養因子(CNTF)、膠質細胞系衍生的神經營養因子(GDNF)、神經營養蛋白-3(NT-3)和神經營養蛋白4/5(NT-4/5)。本發明組合物中一個優選的神經營養因子是NGF。
利用美國專利號5,547,963描述的方法(此處全部引用以供參考)可測定本發明關於神經再生和修復的效果。簡言之，人肌肉片段，清除其纖維鞘，切成小塊，並在由199培養基和10％胎牛血清(FCS)及1％隨時可用(ready-to-use)的抗生素和抗真菌素溶液(青黴素G鈉、鏈黴素、兩性黴素B[GIBCO])組成的條件培養基中孵育過夜。這些片段保存在由4體積條件培養基和1體積人血漿組成的滋養凝塊中。然後外植塊(explant)被轉移到明膠包被的培養皿中，通過在37℃孵育1h增溼並固定在支持物上，並加入含10％FCS、2mM穀氨醯胺、10.mu.g/ml胰島素、10ng/ml FGF和10ng/ml EGF的F14培養基(GIBCO)。大量衛星肌肉細胞(成人體內的肌纖維前體)移到外植塊外。在1周的培養後這些細胞開始增殖和融合。在衛星細胞融合成肌管之前移去外植塊。恰好在融合期前用胰蛋白酶處理細胞並傳代培養以獲得實驗需要量。
最終接種細胞(20.000/cm2)。肌管形成後，13日齡大鼠胚胎的脊髓外植塊被固定在肌細胞層上並在25％199培養基、67.5％MEM培養基(GIBCO)、5％FCS、10.mu.g/ml胰島素和1％抗生素溶液中共培養。此培養基每周更新兩次。試驗化合物溶解在此培養基中。
在標準條件下，4個外植塊中只有1個能與肌纖維建立功能接觸。因此，這些是證明軸突生成(neuritogenesis)和突觸形成的最佳實驗條件。
通過測定下述參數測定本發明的活化T細胞或其上清的效果1)軸突長度2)通過使用帶目鏡測微尺的相差顯微鏡(最終放大倍數200X)測定軸突長度。軸突長度從外植塊中心測定並不計算這些絲狀伸展的彎曲。分支的長度也被測定。至少在15個外植塊中測定軸突總長度。
3)每個外植塊的軸突數4)測定從每一外植塊出現的軸突數，不計算分支。
5)神經肌肉接頭數6)膽鹼能受體聚集體計數7)培養物在125I-α-銀環蛇毒素存在下孵育1h，用2.5％戊二醛固定，乾燥並浸沒在流體照相乳膠液中。曝光10天後進行放射自顯影。顯微鏡下(放大倍數200X)檢查培養物以選擇有清楚明晰受體聚合體的分離的肌纖維(這些肌纖維一般大於顯微鏡視野直徑，並將該視野長度作為長度單位)。至少研究了60條纖維。數值是聚集體數的平均值乘以校正係數並以mm表示。
8)乙醯膽鹼酯酶富集的突觸區數9)通過Kobayashi和Askanas改良的Karnovsky和Roots的技術顯示乙醯膽鹼酯酶(J.Neurosci，vol 7，3131-3141，1987)。根據上述受體聚集體技術計數乙醯膽鹼酯酶富集的突觸區。
10)神經支配區表面11)外植塊周圍神經支配的肌細胞區域的總表面。此參數對應不把存在的非神經支配區和此區域內其他細胞類型計算在內的由運動神經元覆蓋的區域。
12)由神經支配的肌纖維覆蓋的實際表面。通過放射自顯影檢測膽鹼能受體聚集體或乙醯膽鹼酯酶染色確定此區域，並用圖象分析儀數位化(digitalization)後定量。該參數估計神經支配的肌纖維數。
T細胞組合物在黏膜炎中的用途經歷化療或放療治療的惡性腫瘤患者幾乎總要面對由他們的治療引起的中度或重度的副作用。癌症病人面對的一個普遍的副反應是誘導的黏膜潰瘍性黏膜炎。此黏膜炎在口腔中特別突出。此副反應，儘管不象其他副反應例如貧血或免疫抑制那樣有生命威脅，但經常在許多癌症患者的繼續治療中成為劑量限制因素。潰瘍性黏膜炎以在口腔中形成緩慢癒合的開放性潰瘍為標誌，其在患者中導致很多痛苦和不適。吃、喝，和吞咽變得困難和痛苦，加上經常受影響的唾液腺也不適。在由於其治療而經常是免疫抑制的這些患者中，口腔中出現的開放性潰瘍經常導致細菌、病毒，和真菌來源的機會感染。這些口腔感染必需小心監控以避免它們擴散成威脅生命的、全身性的感染。
迄今，除停止治療或進行減輕的和支持性的幹涉外這樣的黏膜炎還沒有治療方法。現在使用的一些減輕的治療包括使用抗生素減少感染機會、使用抗組胺藥和消炎藥，和使用止痛藥。所有這些治療，或因伴隨癌症治療的停止或僅成功的部分緩解黏膜炎的痛苦而不能接受。
因此在本發明的一個方面，活化T細胞或其上清用於黏膜炎的治療。為此，此處描述的組合物可直接應用到黏膜炎部位或以適合體內給藥的藥物組合物提供。另一方面，活化T細胞或其上清可用於抑制黏膜炎的發生。本發明的活化T細胞可在化療之前、同時或之後使用。
T細胞組合物在惡病質中的用途惡病質包括進行性體重減輕、貧血、水腫和食慾缺乏作為主要症狀，其與惡性腫瘤、結核病、糖尿病、homodyscrasia、內分泌病、AIDS等相關「J.Parenteral and Enteral Nutrition，12，286-298，1988」和「American Journal of Medicine，85，289-291，1988」。
到目前為止已經嘗試過，例如，胃腸外或腸內營養和內分泌治療惡病質，但迄今還沒建立起滿意的治療模式。尤其在惡病質由惡性腫瘤引起時，由於進行性的惡病質降低了患者對抗癌化療的耐受性以至於治療遭遇到嚴重挫折。另一方面，惡病質減少的營養性支持傾向於加重惡性腫瘤而縮短患者的存活期。雖然惡病質經常由惡性腫瘤誘導，使用抗腫瘤藥物可引起抗腫瘤效果，但抗腫瘤藥物的副作用被疊加而阻止惡病質的緩解是規律而非例外。在這種情況下，出現了對改善或抑制惡病質症狀進展的例如體重減輕的治療藥物的需求。
在本發明的一個方面，活化T細胞或其上清用於惡病質的治療。為此，此處描述的組合物可以適合體內給藥的藥物組合物提供。另一方面，活化T細胞或其上清可用於抑制惡病質的發展。本發明的活化的T細胞可以在化療前、結合化療或化療之後給藥。本發明的活化T細胞可與本領域提供的惡病質的其他療法聯合給藥。
T細胞組合物在基因發現中的用途此處描述的活化T細胞和/或其上清的體外共培養，還可用於基因發現。例如，活化T細胞和/或其上清與神經細胞、cariomyocytes、內皮細胞、骨細胞，和/或這些細胞的前體共培養，可導致靶細胞基因表達的改變。然後可使用技術人員公知的多種技術例如多種免疫選擇方法分離感興趣的細胞。這樣的技術已被描述，例如，在CurrentProtocols in Immunology，John Wiley Sons，New York.N.Y.中。然後用這種方法分離的細胞可用於建立基因文庫。DNA或cDNA文庫的構建技術為那些本領域的技術人員眾所周知。通常的(custom)文庫還可由很多公司商業產生，例如Clontech(Palo Alto，CA)。然後這些文庫可由，例如PCR和直接測序篩選，以鑑定由活化T細胞或其上清引起的組織修復和再生過程中涉及的已知的和/或獨特的活化基因。
製劑/藥物組合物本發明還提供藥物組合物，其包括活化T細胞和/或與活化T細胞或其上清共培養後改變的細胞和藥物可接受的載體。本發明的組合物可單獨給藥，或作為藥物組分與稀釋劑和/或與其他組分例如IL-2/或其他細胞因子或細胞群聯合給藥。簡言之，本發明的藥物組合物可包括此處描述的靶細胞群，結合一種或多種藥物或生理可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。這樣的組合物可包括緩衝液例如中性鹽緩衝液、磷酸鹽緩衝液等；碳水化合物例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白質；多肽或胺基酸例如甘氨酸；抗氧化劑、螯合劑例如乙二胺四乙酸(EDTA)或谷光苷肽；佐劑(例如，氫氧化鋁)；和防腐劑。在某些方面，配製本發明的組合物用於靜脈給藥。
本發明的藥物組合物可根據治療(或預防)的疾病以適當方式給藥。儘管合適的劑量可由臨床試驗決定，但給藥的量和頻率將由如患者的狀態、患者的疾病類型和嚴重性這樣的因素決定。
「治療有效量」是指，本發明組合物的精確給藥量，可由醫師根據個體在年齡、體重、腫瘤尺寸、感染或轉移的程度、患者狀態上的個體差異決定。一般地，在繼承性免疫治療研究中，給藥到患者的活化T細胞大約在2×109到2×1011細胞。(參見，例如，美國專利No.5,057,423)。在本發明的一些方面，尤其在使用同種異體或異種細胞中，可使用106/千克範圍內(106-1011每患者)的低數量細胞。T細胞，或其他共培養後改變的細胞組合物可以這些範圍內的劑量多次給藥。對經歷治療的患者活化T細胞可是自體的或異種的。
受試的藥物組合物可以任何方便的方式進行給藥，包括通過氣溶液吸入、注射、攝食、輸液、植入或移植。本發明的組合物可通過皮下、皮內、肌內、靜脈注射或腹膜內對患者給藥。本發明的T細胞組合物優選通過靜脈注射給藥。該活化T細胞組合物可直接注射到組織損傷部位。
在另一實施方案中，藥物組合物可在控制釋放系統中送遞。在一個實施方案中，可使用泵(參見Langer，1990，Science 2491527-1533；Sefton 1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14201；Buchwald等人，1980；Surgey 88507；Saudek等人，1989，N.Engl.J.Med.321574)。在另一實施方案中，可使用聚合材料(參見Medical Applications ofControlled Release，1974，Langer和Wise(eds.)，CRC Pres.BocaRaton，Fla.；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Designand Performance，1984，Smolen和Ball(eds.)，Wiley，New York；Ranger和Peppas，1983；J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361；還參見Levy等人，1985，Science 228190；During等人，1989，Ann.Neurol.25351；Howard等人，1989，J.Neurosurg.71105)。在另一實施方案中，控制釋放系統可靠近治療靶標放置，因此僅需要全身劑量的一部分(參見，例如，Medical Applications of ControlledRelease，1984，Langer和Wise(eds.)，CRC Pres.Boca Raton，Fla.，Vol.2，pp.115-138)。
本發明的組合物還可使用很多基質給藥。在組織工程中基質已被使用多年(參見，例如，Principle of Tissue Engineering(Lanza，Langer，和Chick(eds.))，1997)。本發明在新的實踐中使用這樣的基質作為人工淋巴器官以支持、保持，或調節免疫系統，一般通過調節T細胞。因此，本發明可使用在組織工程中已顯示效用的那些基質組合物和製劑。因此，本發明的組合物、裝置和方法可使用的基質類型實際沒有限制，並可包括生物學的和合成的基質。在一個特定的實施例中，使用由美國專利5,980,889；5,913,998；5,902,745；5,843,069；5,787,900；或5,626,561所述的組合物和裝置，這些專利全部引用作為參考。當向哺乳動物宿主給藥時基質包含的特徵一般與是生物相容的相關。基質可從天然和合成材料產生。在希望在動物體內留下永久結構或可移去的結構的情況中，例如植入物，基質可是非生物降解的；或基質也可是生物降解的。基質可用海綿、植入物，管、telfa pads、纖維、中空纖維、凍幹成分、凝膠、粉末、多孔成分，或納米微粒。另外，基質可設計成允許持續釋放接種的細胞或產生的細胞因子或其他活性因子。在某些實施方案中，本發明的基質是柔韌的和有彈性的，並可被描述為無機鹽、水性流體和溶解的氣體成分包括氧等物質可透過的半固體支架。
此處使用的物質作為生物相容性物質的實例。然而，本發明並不局限於這樣的物質，無論術語基質出現在哪裡這些術語都應被理解為包括允許細胞停留和通過的裝置和其他物質，是生物相容性的，並能允許大分子直接通過，物質本身為半透膜的物質或用於和特殊的半透過物質連接的物質。
使用那些本領域普通技術人員已知的配製方法，可以提供此處描述的包括活化T細胞和/或其上清和/或已與活化T細胞或其上清共培養的細胞的組合物的藥物可接受的製劑。這些製劑可由標準的途徑給藥。一般而言，組合物可通過局部、經皮、口腔、直腸或胃腸外的(例如，靜脈、皮下或肌內)途徑給藥。另外，組合物可摻入生物可降解的聚合物以允許組合物的持續釋放，聚合物被植入到需要釋放的地方的附近，例如，在組織損傷部位。生物可降解的聚合物和其用途有詳細描述，例如，在Brem等人J.Neurosurg.74441-446(1991)中。
組合物的劑量取決於治療的情況，和其他臨床因素例如人和動物的體重和狀態、組合物的性質，和組合物的給藥途徑。可以理解本發明有人和獸醫應用的用途。
該製劑包括那些適合口腔、直腸、眼睛(包括玻璃體內或intracameral)、鼻腔、局部(包括含服和舌下)、陰道或胃腸外(包括皮下、肌內、靜脈、皮內、氣管內、硬膜外)給藥的製劑。該製劑可便利地以劑量形式提供並可由常規的藥學技術製備。這樣的技術包括將活性成分與藥物載體或賦形劑結合的步驟。一般而言，通過將活性成分與液態載體或精細分離的固體載體或與兩者均勻和緊密結合製備製劑，然後，如果需要，定型產品。
適合皮膚局部給藥的製劑可以為藥物可接受的載體中含有給藥成分的軟膏劑、乳膏劑、凝膠劑和泥膏劑。優選的局部遞送系統是含有給藥成分的皮膚膜片(transdermal patch)。
直腸給藥的製劑可以帶有適當基質(base)的栓劑，包括可可脂(cocoa butter)或水楊酸酯。
適合鼻腔給藥的製劑，其中載體是固體，例如，包括顆粒大小在20到500微米範圍內的粗粉末，其通過給予鼻吸藥的方式給藥，即，從靠近鼻子舉起的粉末容器中通過鼻道快速吸入。合適的給藥製劑，其中載體是液體，例如，像鼻噴霧劑或滴鼻劑，包括活性成分的水性或油性溶液。
適合陰道給藥的製劑可以是除活性成分外還含有本領域公知的合適載體的陰道栓劑、tamports、乳膏劑、凝膠劑、泥膏劑，泡沫或噴霧製劑。
適合胃腸外給藥的製劑包括水性和非水性無菌注射液，其可含有抗氧劑、緩衝液、抑菌劑和使製劑與預期受體血液等滲的溶質；和包含懸浮成分和增稠成分的水和非水無菌混懸液。該製劑可以單劑量或多劑量包裝提供，例如，封口安瓿和管形瓶(vial)，並可以冷凍乾燥(低壓凍幹)的狀態貯存，其僅需要在臨用之前，加入無菌液態載體，例如，注射用水。臨時注射液和混懸液可從上述的此類無菌粉末、顆粒劑和片劑中製備。
優選的單位劑量製劑含有如以上所列舉的，每日劑量或單位、每日亞劑量，或其適當的部分的給藥成分。
應當理解除該成分外，尤其是上面提到的，本發明的製劑可包括有關所談論的製劑類型的其他常規成分，例如，那些適合口服的可包括調味劑。
在本發明的一個實施方案中，通過使用順磁珠和在靶組織內部或外部應用磁力，將包含本發明的細胞，活化T細胞或預先與活化T細胞共培養的細胞的組合物靶向需要的部位(例如，如美國專利6,203,487中所描述，此處全部引用作為參考)。簡言之，在體內或體外或二者結合，將本發明的細胞，活化T細胞或預先與活化T細胞共培養的細胞，暴露於綴合適當表面標誌的順磁珠以便順磁微粒與細胞的結合。如果在體外進行，包含與順磁微粒結合的細胞和藥物可接受的賦形劑的組合物被給藥到哺乳動物。磁體可靠近靶組織放置，即，在其中需要局部細胞遞送的身體區域或所選的組織或器官。在局部遞送的靶組織的內部或外部使用外科或經皮的方法可將磁體定位於體表表面或放置到體表內部。遞送結合細胞的磁粒可以通過直接注射進所選組織或遠端使之被動循環到靶位點或由磁體或靶向作用的配體導入靶位點來進行。
本文中引用的所有文獻此處全部引用作為參考。而且，此處使用的所有數值範圍明確地包括此範圍內的所有整數值，並根據特定的用途選擇此範圍內的特定數值。另外，下面提供的實施例用於說明，不用於限制。
實施例實施例1創傷癒合的動物模型檢查表面(皮膚)創傷的動物模型以研究本發明的組合物對創傷修復和癒合的效果。
根據由Staiano-Coico等人J Clin Invest.77(2)396-404(1986)描述的方法，在麻醉的豬的背上製造約2×2cm的剖開的厚皮傷口。由於豬皮最像人的皮膚因此在這樣的研究中一般使用豬模型。包含本發明組合物的少量溶液放置到約11處傷口上並用封閉粘附敷料覆蓋傷口。安慰劑溶液(鹽水，50到100.mu.l)放置到11處「對照(mirror)」的每個上，也由封閉敷料覆蓋的同樣的傷口。3天後，麻醉動物，處死並移出它們包含的如原皮膚傷口兩倍大的完整厚皮樣本。編碼樣本以致盲病理學家分析的處理和對癒合的百分比評分。此評分方法主要測量從創傷開始在3天的修復和癒合中發生的上皮形成(由角質化細胞覆蓋的傷口)數量，用本發明的組合物治療的11處傷口的結果與鹽水對照比較並表示為癒合百分比。較高的百分比反映較多的癒合。
實施例2
心肌缺血的動物模型使用本發明的T細胞或其上清成功研究組織修復和再生的重要前提是(a)應用於臨床的心肌缺血動物模型的結構可提供心肌缺血情況下關於血管生成機制的有用數據，和(b)精確評價此處描述的組合物的效果。使用模仿臨床冠狀動脈疾病的豬的心肌缺血模型，如美國專利6,174,871中所描述，此處全部引用。環繞左旋冠狀動脈(LCx)放置ameroid縮窄器產生最小梗塞形成(左心室的1％，左旋冠狀動脈床的4.+-.1％)的逐漸完全閉合(放置7天內)(Roth等人Circulation821778，1990；Roth等人Am J Physiol 235H1279，1987；White等人Circ Res 711490，1992，Hammond等人Cardiol 23475，1994；和Hammond等人J Clin Invest 922644，1993)。由於側副血管的發生，由閉塞動脈以前灌注的區域(指的是作為局部缺血區域)中心肌功能和血流量一般是靜止的，但當心肌氧需要增加時，儲備的血流量不足以阻止局部缺血。因此，LCx床易發生局部缺血，類似臨床心絞痛。在ameroid放置21天中側副血管的發生和血流-功能的關係是穩定的，並四個月保持不變(Roth等人Circulation 821778，1990；Roth等人Am J Physiol 235H1279，1987；White等人Circ Res 711490，1992)。由遙測術證明，動物全天都有在所述床中出現階段性局部缺血功能障礙的危險，與進食、被人幹擾等過程中(未公開數據)的心率突然升高有關。因此，該模型具有穩定但不足的側副血管的床，易發生階段性局部缺血。該模型另一獨特的優勢是灌注和功能正常的區域(LAD床)鄰近灌注和功能異常的區域(LCx床)，因此在每一個動物中提供對照床。
使用心肌心臟超聲造影術(contrast echocardiography)評價局部心肌灌注。造影劑(contrast material)由半乳糖顆粒組成並提高圖象的產生回聲性(白)。顆粒以與血流成比例的方式分散到冠狀動脈和心肌壁(Skyba等人Circulation 901513-1521，1994)。通過中心體(microsphere)測定顯示造影劑的峰強度與心肌血流緊密相關(Skyba等人Circulation 901513-1521，1994)。環繞靠近ameroid的近端LCx放置液壓套囊閉合器，以說明本發明使用的超聲心動圖像可精確鑑定LCx，和心肌的心臟超聲造影術可用於評價心肌血流。
為通過顯微術定量毛細血管生長，當動物被處死時，心臟被灌注固定(戊二醛、生理壓力、原位)。在接受基因轉移的動物心肌中用PCR檢測生成血管的蛋白質DNA和mRNA。最後，用抗血管生成蛋白質的多克隆抗體，檢查來自本發明組合物給藥動物的細胞和心肌中血管生成蛋白質的表達。
治療研究策略包括組合物給藥時間、組合物給藥途徑和組合物類型(活化T細胞、其上清、與活化T細胞共培養後的細胞)。在心肌局部缺血的ameroid模型中，在穩定但不足的側副血管形成後給予需要的組合物。那些本領域的技術人員會理解在豬中證明的結果是人的預期結果。豬有與人的冠狀循環非常相似的天然冠狀循環，包括缺少天然冠狀側副管。
實施例3在兩個接受活化T細胞(XCELLERATETM)+IL-2療法的患者中修復成骨細胞和溶解的骨損傷三個患者進入轉移腎細胞癌I期試驗(XT00)並接受活化T細胞(XCELLERATETM)+IL-2療法的治療。患者(患者#003)顱骨有成骨細胞損傷，在用(XCELLERATETM)+IL-2療法治療後的其損傷完全消退(圖1，圈點區域)。第二個患者(患者#004)在其骨盆中有一個大的7釐米的溶解損傷並在其肋骨中有第二個溶解損傷。在(XCELLERATETM)+IL-2治療後，兩個骨損傷都完全癒合，並在10個月的隨訪中保持癒合(圖2，圈點區域)。
實施例4使用活化T細胞的體外血管生成模型如Iruela-Arispe等人Proc.Nat.Acad.Sci.USA 885026-5030，1991中所述(此處全部引用)，使用體外血管生成模型。簡言之，基本上如Sage H.等人Biochemistry 245433-5442，1979中所述分離牛的主動脈血管內皮細胞和大鼠血管內皮細胞(分別為，BAEC和RVEC)。選擇表達芽殖表型的BAEC克隆和組成內皮細胞索(endothelialcords)RVEC克隆。兩種類型細胞都在37℃含10％(體積/體積)熱滅活FCS的Dulbecco’s改良的Eagle’s培養基中培養。使用BAEC的5-10代及RVEC的25-30代的細胞。內皮細胞索的自發形成一般發生在融合後的10-15天。
來自2周內細胞索(cord)的BAEC在12孔Coster平板(Corning)上鋪板。一個細胞索定義為兩個交叉(頂點)點之間的長度。為確定管(tube)的數量，在預標記的平板上檢查10個顯微視野(使用X10的物鏡和X1的目鏡)。對於每個試驗，計數五個重複的培養物(0天)。然後用無血清的培養基洗滌該培養物三次並與活化T細胞或其上清孵育。優化使用的T細胞數量和用T細胞活化後的時間。
在0天和2天，計算每一批試驗的細胞索±SEM的平均數。將每一培養物中0天細胞索的數量作為100％，數值還可表示為百分數(±SEM)。由配對樣本t檢驗分析數據，當P≤0.025時認為差異有顯著性。
權利要求
1.誘導組織修復和/或再生的方法，包含(a)提供細胞群，其中至少其一部分包含活化T細胞；(b)將組織暴露到該T細胞或其上清；並因此誘導組織修復和/或再生。
2.根據權利要求1的方法，其中組織選自骨、心肌、上皮，和神經組織。
3.根據權利要求1的方法，其中組織再生包含血管生成。
4.根據權利要求1的方法，其中組織再生包含新骨生成。
5.根據權利要求1的方法，其中組織再生包含神經再生。
6.根據權利要求1的方法，其中組織修復包含損傷組織的新血管形成。
7.根據權利要求6的方法，其中損傷組織包括心臟組織。
8.由下面的方法產生的基因文庫，該方法包含(a)活化T細胞；(b)將T細胞與選自心肌、骨、骨髓、皮膚、神經、內皮和上皮的組織源共培養，持續的時間長度足以誘導基因表達的改變；(c)收穫該組織；(d)從此產生基因文庫；
9.在患者中或在體外神經細胞中刺激軸突生長的方法，包括給予所述患者或所述神經細胞神經營養量的包含活化T細胞或其上清的組合物的步驟。
全文摘要
本發明涉及T細胞或其上清，更具體而言，涉及活化T細胞用於促進和/或調節多種細胞/組織的分化、去分化、成熟、組織形成、修復和再生的方法。公開了在體外和體內誘導組織修復和再生的方法。本發明還涉及細胞組合物，其包括活化T細胞和/或與活化T細胞共培養產生的細胞，及其在體內誘導組織修復和再生中的用途。
文檔編號A61L27/00GK1520312SQ02813001
公開日2004年8月11日 申請日期2002年6月3日 優先權日2001年6月1日
發明者M·博奈哈迪, M 博奈哈迪, R·貝倫森, 諮 申請人:埃克斯西特治療公司