疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094啟動子的製作方法

2024-03-26 07:01:05

疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094啟動子的製作方法【專利摘要】本發明公開一種疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094啟動子，該啟動子屬於組織特異性表達啟動子，該啟動子能驅動GUS基因在轉基因擬南芥的葉片特異表達。該啟動子可以應用於水稻抗白葉枯病育種，通過驅動其它外源基因尤其是抗白葉枯病基因在轉基因水稻葉片中集中特異表達，從而提高水稻對白葉枯病的抗性。同時，該啟動子對於應用於水稻其它葉面病害的防治具有重要的理論及實際意義。【專利說明】疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094啟動子【
技術領域：
】[0001]本發明涉及一種由疣粒野生稻中克隆的抗白葉枯病相關基因Me094啟動子，屬於分子生物學【
技術領域：
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背景技術：
】[0002]基因的表達和調控是植物基因工程研究的重要內容之一，啟動子作為一種重要的調控元件，調控著外源基因在轉基因植物的特定組織、特定發育階段和一定環境條件下的表達。利用基因工程技術將相關抗性基因導入植物，從而使植物抵禦各種生物或非生物脅迫，是實現植物抗逆性改良的較好途徑，而啟動子的配置和外源基因的按需表達則顯得非常重要。目前在植物轉基因研究中最廣泛採用的啟動子有來源於花椰菜花葉病毒（CaMV)的35S啟動子（OdellJT,etal,IdentificationofDNAsequencesrequiredforactivityofthecauliflowermosaicvirus35Spromoter[J].Nature,313(6005):810-812,1985)，玉米泛素基因（Ubil)啟動子（ChristensenAHetal,Maizepolyubiquitingenestructurethermalperturbationofexpressionandtranscriptsplicing,andpromoteractivityfollowingtransfertoprotoplastsbyelectroporation[J]·PlantMolBiol,18(4):675-689,1992)等，它們都屬於組成型啟動子，即在這類啟動子控制下，外源基因在轉基因植株的各個組織、各個發育階段都會持續表達。這不僅造成了能量的浪費，而且對植物的生長發育也有不利的影響。[0003]尋找專一性啟動子，使外源基因特異地表達是植物基因工程的關鍵環節。組織特異性啟動子作為一類專一性啟動子，能調控外源基因在植物發育過程中某一特定時空表達，它不僅能使目的基因的表達產物在一定空間積累，增加區域表達量，而且也避免了植物能量的不必要浪費（楊予濤等，一個光合組織特異表達強啟動子的分離及功能分析[J].中國科學C輯，33(4):298-306,2003)。[0004]葉片是水稻的主要營養器官，同時也是白葉枯病的主要發生器官。因此，在水稻白葉枯病抗性改良中，使抗病基因在葉片中特異表達，不僅避免了基因產物的浪費，同時還能提高水稻植株的抗性，進而提高水稻產量和品質。而找到能調控抗病基因在水稻葉片特異性表達的啟動子，則是解決這一問題的關鍵。[0005]我們在疣粒野生稻受白葉枯病菌誘導的抑制差減文庫（SSH)中，克隆了一個抗白葉枯病相關基因Me094,該基因編碼金屬硫蛋白。金屬硫蛋白是一種小分子量，富含半胱氨酸的重金屬結合蛋白，參與植物中的金屬代謝和過多的重金屬的解毒，此外也參與植物的脅迫保護反應（RobinsonNJetal,Plantmetallothionein[J]·Biochem,295:1-10,1993;CarginaleV,etal,Cadmium-induceddifferentialaccumulationofmetallothioneinisofonnsintheAntarcticicefishwhichexhibitsnobasalproteinbuthighendogenousmRNAlevels[J].Biochem.J,332:475-81,1998)。通過研究發現，Me094在轉基因水稻中的表達能提商水稻的抗白葉枯病能力，用RNAi幹擾技術幹擾Me094基因的表達後，轉基因水稻的抗病能力明顯減弱。這些結果表明Me094參與了疣粒野生稻抗白葉枯病過程。本發明所述的啟動子即是疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094啟動子，它是一個葉片特異表達的啟動子。目前，已成功克隆了多個葉片特異表達啟動子，如Rbcs(1，5-二磷酸核酮糖羧化加氧酶小亞基基因）啟動子，Cab(捕光葉綠素a/b結合蛋白基因）啟動子等，這些啟動子的利用不同程度地提高了目的基因在葉片的特異表達。[0006]熱不對稱交錯PCR(ThermalAsymmetricInterlacedPCR，簡稱TAIL-PCR)是一種用來分離與已知序列鄰近的未知DNA序列的分子生物學技術。該技術由Liu和Whitter首先石開究並?艮道（LiuYGetal，ThermalasymmetricinterlacedPCR:automatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentfromPlandYACclonesforchromosomewalking[J]·Genomics,25:674-681，1995)。利用該技術分離出的DNA序列可用於圖位克隆、遺傳圖譜繪製的探針，也可以直接測序。近年來，由此形成的技術路線已成功地用於從PUYAC和BAC克隆中分離獲得插入末端的DNA序列，擬南芥的T-DNA側翼序列及多個基因的啟動子序列，並且取得了顯著成效。【
發明內容】[0007]本發明的目的是提供一新的疣粒野生稻中抗白葉枯病相關基因Me094的上遊啟動子序列，以及該啟動子在驅動外源基因尤其是抗病基因在轉基因植物的葉片特異表達，從而提高轉基因植物抵禦病害能力上的應用。[0008]本發明針對上述研究背景，根據已克隆了的疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094序列，通過TAIL-PCR技術分離克隆了該基因的上遊啟動子，並採用農桿菌介導法轉化擬南芥進行啟動子功能研究。[0009]本發明所提供的一種疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094啟動子，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。[0010]本發明還提供了上述疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094啟動子在驅動外源抗病基因在轉基因植物的葉片特異表達提高轉基因植物抵禦病害能力上的應用。[0011]所述的提1?轉基因植物抵禦病害能力上的應用為提1?轉基因水稻抵禦白葉枯病害能力上的應用。[0012]本發明還提供了上述疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094啟動子在轉基因擬南芥中驅動下遊基因葉片特異表達的應用。[0013]本發明還提供了一種擴增本發明疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094啟動子的引物，所述引物由上遊引物和下遊引物組成，所述上遊引物由引物AD1、引物AD2、引物AD3、引物AD4和引物AD5組成，引物AD1的鹼基序列如SEQIDNO:2所示，引物AD2的鹼基序列如SEQIDNO:3所不，引物AD3的喊基序列如SEQIDNO:4所不，引物AD4的喊基序列如SEQIDNO:5所示，引物AD5的鹼基序列如SEQIDNO:6所示，所述下遊引物由引物ME094-1、引物ME094-2和引物ME094-3組成，所述引物ME094-1的鹼基序列如SEQIDNO:7所示，引物ME094-2的鹼基序列如SEQIDNO:8所示，引物ME094-3的鹼基序列如SEQIDNO:9所示。[0014]與現有技術相比，本發明的有益效果：[0015]本發明通過TAIL-PCR技術首次從疣粒野生稻中克隆獲得抗白葉枯病相關基因Me094啟動子，該啟動子能驅動GUS基因在轉基因擬南芥的葉片特異表達，屬於組織特異性表達啟動子。本發明發掘的疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因啟動子，可以應用於水稻抗白葉枯病育種，對於驅動其它外源基因尤其是抗白葉枯病基因在轉基因水稻葉片中集中特異表達，從而提高水稻對白葉枯病的的抗性具有重要的理論及實際意義。同時該啟動子也可以應用於水稻其它葉面病害的防治。[0016]序列表中SEQIDNO:1所示的是本發明疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094啟動子的核苷酸序列。[0017]序列表中SEQIDNO:2所示的是引物ADl的鹼基序列。[0018]序列表中SEQIDNO:3所示的是引物AD2的鹼基序列。[0019]序列表中SEQIDNO:4所示的是引物AD3的鹼基序列。[0020]序列表中SEQIDNO:5所示的是引物AD4的鹼基序列。[0021]序列表中SEQIDNO:6所示的是引物AD5的鹼基序列。[0022]序列表中SEQIDNO:7所示的是引物ME094-1的鹼基序列。[0023]序列表中SEQIDNO:8所示的是引物ME094-2的鹼基序列。[0024]序列表中SEQIDNO:9所示的是引物ME094-3的鹼基序列。[0025]序列表中SEQIDNO:10所示的是Me94Pr-l引物的鹼基序列。[0026]序列表中SEQIDNO:11所示的是Me94Pr-2引物的鹼基序列。[0027]序列表中SEQIDNO:12所示的是疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094的cDNA全長的核苷酸序列。[0028]序列表中SEQIDNO:13所示的是疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094編碼的胺基酸序列。[0029]序列表中SEQIDNO:14所示的是Me094的EST序列上遊引物Me094-E(+)的鹼基序列。[0030]SEQIDNO:15所示的是Me094的EST序列下遊引物Me094-E(_)的鹼基序列。[0031]SEQIDNO:16所示的是接頭引物AP的鹼基序列。[0032]SEQIDNO:17所示的是Me094的ORF序列上遊引物Me094-F(+)的鹼基序列。[0033]SEQIDNO:18所示的是Me094的ORF序列下遊引物Me094-F(_)的鹼基序列。[0034]SEQIDNO:19所示的是Me094基因的3'端核苷酸序列。[0035]SEQIDNO:20所示的是Me094基因的5'端核苷酸序列。[0036]SEQIDNO:21所示的是疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094的EST序列。【專利附圖】【附圖說明】[0037]圖1:本發明啟動子序列的TAIL-PCR擴增圖譜。圖中MJPM2分別DL15000Marker和DL2000Marker，1、3、5、7、9泳道分別為引物AD1-AD5的第2輪擴增產物，2、4、6、8、10泳道分別為引物AD1-AD5的第3輪擴增產物。[0038]圖2:本發明啟動子表達載體的PCR鑑定（左）及HindIII和XbaI雙酶切鑑定(右）圖譜。圖中M為DL2000Marker，1為非轉基因植株對照，2為質粒對照，3-8為轉基因陽性植株。[0039]圖3:本發明啟動子表達載體轉入農桿菌後的菌液PCR鑑定圖譜。圖中M為DL2000Marker，1-4為4個不同的農桿菌單克隆。[0040]圖4:本發明啟動子表達載體轉入擬南芥後的PCR檢測圖譜。圖中M為DL2000Marker，1為非轉基因對照，2-8為轉基因植株。[0041]圖5:本發明啟動子表達載體轉入擬南芥後的GUS化學染色圖譜。圖中1為非轉基因對照，2為轉入空載體pBI121的對照，3-4為轉基因植株。3-4中箭頭所指是藍色較深的部位。[0042]圖6:含有Me094基因的表達載體pCAMBIA1300-BI_Me094圖譜。[0043]圖7:轉Me094基因水稻的DNA的PCR檢測陽性植株圖，圖中M為DL2000Marker，1為陽性對照，2為陰性對照，3-15為再生植株。[0044]圖8:Me094基因的半定量RT-PCR顯示圖。圖中β-Acti是內參基因，CK、24h、48h、72h、96h、120h分別為接無菌水對照、白葉枯病病原菌處理24h、48h、72h、96h、120h的cDNA半定量RT-PCR的擴增結果。【具體實施方式】[0045]以下各實施例無特殊說明均為常規方法。[0046]實驗材料：撫粒野生稻（Oryzameyeriana),白葉枯病菌Cl是中國典型的致病菌株，白葉枯病菌Y8是雲南省典型的致病菌株，用所述白葉枯病菌Cl和白葉枯病菌Y8接種是利用其對水稻的侵染能力的共性從而導致水稻葉片形成白葉枯病病斑，因此，具有同樣致病能力的各種白葉枯病菌菌株都能達到本發明的效果。以下各實施例的實驗試劑等均為市售產品。[0047]實施例1-實施例2是本發明疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094啟動子的克隆、序列分析及功能驗證。實施例3-實施例7分別是疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094的表達序列標籤的驗證和表達分析、基因Me094全長的克隆、含目的Me094基因重組農桿菌的獲得、含目的Me094基因農桿菌介導的水稻遺傳轉化、轉目的Me094基因再生植株的分子生物學檢測和抗性鑑定。[0048]實施例1疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094啟動子的克隆及分析[0049](1)設計擴增Me094啟動子的引物[0050]Me094基因是本申請人:前期從疣粒野生稻受白葉枯病菌誘導的SSH文庫中篩選克隆出來的1個金屬硫蛋白基因，已進行了功能驗證，但其上遊啟動子序列未知，從而限制了對該基因表達調控情況的研究。根據Me094基因全長cDNA序列信息，再結合TAIL-PCR技術的原理，用生物軟體Primer5.0設計引物對Me094基因啟動子進行擴增，Me094基因全長cDNA的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:12所示，設計的擴增本發明啟動子（即疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094啟動子）的引物由上遊引物和下遊引物組成，所述上遊引物由引物AD1、引物AD2、引物AD3、引物AD4和引物AD5組成（即5條隨機簡併上遊引物），引物ADl的喊基序列如SEQIDNO:2所不，引物AD2的喊基序列如SEQIDNO:3所不，弓丨物AD3的鹼基序列如SEQIDNO:4所示，引物AD4的鹼基序列如SEQIDNO:5所示，引物AD5的鹼基序列如SEQIDN0:6所示，所述下遊引物由引物ME094-1、引物ME094-2和引物ME094-3組成（即3條嵌套的特異性下遊引物），所述引物ME094-1的鹼基序列如SEQIDNO:7所示，引物ME094-2的鹼基序列如SEQIDNO:8所示，引物ME094-3的鹼基序列如SEQIDNO:9所示。[0051](2)以接種白葉枯病菌處理的疣粒野生稻葉片提取總DNA[0052]對疣粒野生稻葉片用白葉枯病菌Cl和Y8進行接菌處理，分別於24h、48h、72h、96h、120h5個時期取樣，然後將樣品等量混合後用CTAB法提取其葉片DNA，具體如下：[0053]1)取0.2g疣粒野生稻接菌後的混合樣品加液氮研磨至粉末狀，加入Iml提取緩衝液（2%CTAB，100mMTris-cLPH8·0,20mMEDTAPH8·0，l·4MNaCl)置於65°C保溫60-90min，其間不斷搖勻；[0054]2)取出後12000rpm離心10min(4°C);[0055]3)離心結束後將上清液轉到另一乾淨離心管中，加入等體積的氯仿：異戊醇(24:1)，其間不斷搖勻；[0056]4)靜置片刻後12000rpm離心10min(4°C)，取出上清液加入2/3體積的異丙醇置於-20°C進行沉澱約30min;[0057]5)5000印111離心5111；[11(41€)，棄去上清液，加入1111175%的酒精洗漆沉澱，重複二次；[0058]6)然後將離心管在室溫無菌風乾至透明狀，加入50μITE(K)OmMTris-clΡΗ4.0,ImMEDTA)或CldH2O溶解沉澱，加入2μIRNA酶；[0059]7)取3μ1上清液，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，並用分光光度計測定其濃度。[0060](3)疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因ΜΕ094啟動子的擴增[0061]以步驟⑵所提取的DNA作為PCR反應的模板，濃度稀釋到0.Iyg/μ1，以步驟1中設計的引物作為PCR反應引物，即分別以3條下遊引物：引物ΜΕ094-1、引物ΜΕ094-2和引物ΜΕ094-3和5條上遊隨機引物：引物AD1、引物AD2、引物AD3、引物AD4和引物AD5配對，做3輪TAIL-PCR擴增反應，擴增疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094啟動子。[0062]①第1輪PCR反應，反應體系：10XLAPCRBuffer(Mg2+Plus)2μ1，dNTPMixture(2.5mMeach)1.6yl，模板DNA25ng，特異弓丨物（Me094-l)0.2uM，隨機引物（AD1-AD5)各4uM，LATaq聚合酶I.0U，CldH2O補足到20μ1。反應條件：93°Clmin,95°Clmin，然後5個循環（94°C30s，6(TClmin，72°C2min)，94°C30s，3(TC3min，Rampingto72°C(0.2t：/s)2min。最後15個循環（94°C30s，62°Clmin，72t：2min;94°C30s，62°Clmin，72°C2min;94°C30s，44°Clmin，72°C2min)，72°ClOmin。[0063]②第2輪PCR反應：[0064]將第I輪PCR產物稀釋50倍作為第2輪PCR的模板。反應體系同步驟⑶①，只是模板改為第1輪PCR產物稀釋液1μ1，特異引物改為Me094-2,隨機引物改為2μM。反應條件：15個循環（94°C30s，6(TClmin，72°C2min;94°C30s，6(TClmin，72°C2min;94°C30s，44°Clmin，72°C2min)，72°ClOmin。[0065]③第3輪PCR反應：[0066]將第2輪PCR產物稀釋50倍作為第3輪PCR的模板，反應體系同步驟（3)②，模板改為第2輪PCR產物稀釋液1μ1，特異引物改為Me094-3。反應條件：15個循環（94°C30s，61°Clmin,72〇C2min；94〇C30s,61°Clmin,72〇C2min；94〇C30s,44°Clmin,72〇C2min),72°C10min〇[0067](4)Me094基因啟動子片段的回收[0068]圖1為本發明啟動子的PCR擴增結果，結果顯示除引物AD3外，其它引物的第3輪PCR產物都有較特異的條帶，將它們用I%瓊脂糖凝膠電泳，然後進行凝膠回收，具體方法如下：[0069]1)在紫外燈下將目的條帶切下，儘量除去不含DNA片段的凝膠，置於I.5ml的離心管中，稱重；[0070]2)按每IOOmg膠塊加入300μ1溶膠液的比例加入溶膠液，置於50°C水浴中IOmin,期間不斷搖動混勻；[0071]3)膠塊完全溶解後將溶膠液轉移到吸附柱中，室溫，8000rpm離心30s，去掉廢液；[0072]4)向吸附柱中加入500μ1漂洗液，室溫，9000rpm離心30s，去掉廢液；[0073]5)重複步驟4,9000rpm離心Imin,倒掉廢液；[0074]6)將吸附柱移至乾淨的I.5ml離心管中，室溫放置5min左右，使殘餘漂洗液中的乙醇揮發；[0075]7)向吸附柱中央加入15-4(^1提前預熱至601：的洗脫緩衝液，室溫放置1-21^11，9000rpm離心Imin洗脫DNA，即獲得疣粒野生稻受白葉枯病菌脅迫表達的基因Me094的啟動子片段，即為本發明所述的疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094啟動子。[0076](5)本發明啟動子片段的克隆測序及分析[0077]將步驟（4)中獲得的Me094基因啟動子片段回收產物分別與pMD18-T載體連接，反應體系為：4μ1回收產物，1μIpMD18-T，5μIsolutionI，16°C連接30min或過夜，次日將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，塗布於添加了Amp、IPTG和X-gal的LB平板上，37°C倒置培養12-16h，進行藍白斑篩選。待培養基上長出單克隆後，挑取白色單克隆於3ml液體LB中（含lmg/mlAmp)，37°C，200r/min振蕩培養14h-16h，用鹼裂解法提取質粒。[0078]提取的質粒用EcoRI和SalI進行雙酶切鑑定，反應體系為：10XHBufferΙμ?，質粒4yl，EcoRI和SalI各0.5μ1，補足ddH20至1(^1。371：反應3h，結束後用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。結果Me094啟動子克隆載體大多數都能切出與理論值相符的條帶，將酶切鑑定正確的克隆送到上海生工測序。[0079]對測序結果用http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/進行在線分析，結果表明本實驗獲得了Me094基因1761bp的啟動子序列，序列如SEQIDNO:1所示。該啟動子序列中位於第516鹼基至第565鹼基，第602鹼基至第651鹼基，第1187鹼基至第1237鹼基分別為預測的基礎啟動子序列；位於第556鹼基，第642鹼基，第1228鹼基分別為預測的轉錄起始位點；有4個TATA-box，分別位於第526鹼基至第531鹼基，第539鹼基至第543鹼基，第896鹼基至第899鹼基，第1417鹼基至第1420鹼基；有3個CAAT-box元件，分別位於第324鹼基至第328鹼基，第728鹼基至第731鹼基，第829鹼基至第832鹼基；位於第1535鹼基至第1537鹼基是翻譯起始密碼子ATG(詳見序列表）。[0080]說明本實驗所獲得的序列的確是撫粒野生稻抗白葉枯病相關基因ME094的上遊啟動子序列。[0081]實施例2構建本發明Me094啟動子高效表達載體，轉化擬南芥研究該啟動子功能[0082]l.Me094啟動子表達載體的構建[0083]在獲得Me094啟動子序列基礎上構建該啟動子表達載體，即用Me094啟動子替換載體PBI121上的35S啟動子（載體pBI121為市售）。根據pBI121上35S啟動子兩側的酶切位點和Me094啟動子的序列分析結果，用HindIII和XbaI分別酶切pBI121和Me094啟動子克隆載體，酶切體系為：[0084]【權利要求】1.疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094啟動子，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.權利要求1所述的疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094啟動子在驅動外源抗病基因在轉基因植物的葉片特異表達以提高轉基因植物抵禦病害能力上的應用。3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於：所述的提高轉基因植物抵禦病害能力上的應用為提高轉基因水稻抵禦白葉枯病害能力上的應用。4.權利要求1所述的疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094啟動子在轉基因擬南芥中驅動下遊基因葉片特異表達上的應用。5.-種擴增權利要求1所述的疣粒野生稻抗白葉枯病相關基因Me094啟動子的引物，所述引物由上遊引物和下遊引物組成，所述上遊引物由引物AD1、引物AD2、引物AD3、引物AD4和引物AD5組成，引物AD1的鹼基序列如SEQIDNO:2所示，引物AD2的鹼基序列如SEQIDNO:3所不，引物AD3的喊基序列如SEQIDNO:4所不，引物AD4的喊基序列如SEQIDN0:5所示，引物AD5的鹼基序列如SEQIDN0:6所示，所述下遊引物由引物ME094-1、引物ME094-2和引物ME094-3組成，所述引物ME094-1的鹼基序列如SEQIDN0:7所示，引物ME094-2的鹼基序列如SEQIDNO:8所示，引物ME094-3的鹼基序列如SEQIDNO:9所示。【文檔編號】C12N15/113GK104404043SQ201410673732【公開日】2015年3月11日申請日期:2014年11月21日優先權日:2014年11月19日【發明者】李定琴,程在全,鍾巧芳,肖素勤,柯學,李維蛟,餘騰瓊,張敦宇,付堅,王玲仙,陳玲,陳越,蔣聰,羅紅梅,曾民,王波,黃興奇申請人:雲南省農業科學院生物技術與種質資源研究所