一個水稻鋅指蛋白基因的抗白葉枯病基因工程應用的製作方法

2024-03-26 06:14:05 1

一個水稻鋅指蛋白基因的抗白葉枯病基因工程應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於基因工程領域，涉及一種鋅指蛋白基因ZFP181過量表達轉基因水稻的培育方法，重組載體和轉化細胞、轉基因水稻的鑑定方法及載體、轉化細胞、培育方法在水稻抗白葉枯病上的應用。培育方法為(1)重組質粒pMD18T-ZFP181的獲得；(2)重組質粒pCAMBIA1304-ZFP181的獲得；(3)轉基因植株獲得。重組載體包括序列如SEQ ID NO.1所示的A20/AN1鋅指蛋白基因ZFP181，通過DNA連接酶將基因ZFP181連接到植物表達載體，能夠過量表達A20/AN1鋅指蛋白，必要時可包括增強子；基因ZFP181參與水稻的抗病應答反應，增強ZFP181的表達能提高水稻抗白葉枯病性。
【專利說明】一個水稻鋅指蛋白基因的抗白葉枯病基因工程應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於基因工程領域，涉及一種鋅指蛋白基因ZFP181過量表達轉基因水稻 的培育方法，在培育方法中使用的重組載體和轉化細胞、轉基因水稻的鑑定方法及以上載 體、轉化細胞、培育方法在水稻抗白葉枯病上的應用。

【背景技術】
[0002] A20/AN1鋅指蛋白是一類具有A20或ANl鋅指結構的蛋白，其廣泛存在於真核生物 中。已有研究結果表明，A20/AN1鋅指蛋白在動物體中主要參與NF-κB介導的免疫反應， 而在植物體中主要參與非生物脅迫響應。
[0003] 0SISAP1為植物中分離的第一個A20/AN1鋅指蛋白基因。0SISAP1的表達受冷、脫 水、鹽、水浸沒（低氧）、重金屬、機械傷害等脅迫及脅迫激素ABA的誘導。過量表達0SISAP1 可提高轉基因菸草幼苗對鹽、冷及乾旱的耐受性（Mukhopadhyayetal.，2004)。隨著基因 組測序的深入開展，人們在水稻、擬南芥、楊樹、玉米和番茄基因組中分別鑑定了 18、14、19、 11 和 13 個A20/AN1 型鋅指蛋白（Huangetal.，2008Jinetal.，2007;Solankeetal.， 2009;VijandTyagi，2006)。進一步分析研究發現植物中大部分A20/AN1家族鋅指蛋白基 因的表達受一種或多種非生物脅迫誘導（Huangetal.，2008 ;Jinetal.，2007;Solanke etal.，2009;Stroheretal.，2009;VijandTyagi，2006)，可能參與了非生物脅迫響應 (Solankeetal. ,2009；VijandTyagi,2006)
[0004] 隨著植物A20/AN1鋅指蛋白家族基因的鑑定，關於該基因家族成員功能的鑑定 也逐步展開。OsiSAPS受鹽、乾旱、脫水、冷、水浸沒、傷害、重金屬及ABA誘導。過量表達 OsiSAPS能提高苗期菸草及水稻對鹽，冷及乾旱脅迫的耐受性。水稻ZFP177受冷及熱脅迫 誘導，過量表達ZFP177能提高轉基因菸草幼苗對冷、熱及氧化脅迫的耐受性，但導致轉基 因菸草幼苗對鹽及乾旱脅迫敏感。獐毛AlSAP受鹽、冷、熱脅迫及ABA、SA誘導，異源表達 AlSAP能提高轉基因酵母對滲透脅迫及離子脅迫的耐受性。過量表達AlSAP轉基因菸草與 野生型一樣表現正常生長表型，同時能提高轉基因菸草植株對冷、熱、乾旱及鹽脅迫的耐受 性。過量AlSAP轉基因水稻表現與其轉基因菸草相似結果，能提高其對冷、乾旱及鹽脅迫 的耐受性。此外，AlSAP能提高轉基因小麥的抗旱性及耐鹽性（BenSaadetal.，2012a)。 AtSAP12受冷及鹽誘導，其重組蛋白四級結構隨著氧化還原狀態改變而改變，高濃度DTT和 硫氧還蛋白TrxA,低濃度DTT，硫氧還蛋白與其依賴的NADPH均能降低氧化的AtSAP12聚合 體，增加AtSAP12單體蛋白量。在鹽及冷脅迫條件下，AtSAP12單體蛋白量顯著降低，推測 AtSAP12可能通過不同氧化還原狀態下功能的改變而來參與非生物脅迫響應（Stroheret al.，2009)。AtSAPlO表達受各種脅迫調節，包括金屬及非金屬離子（Cd、Zn、AsIII、AsIV， Ni和Mn)、ΑΒΑ、熱，鹽和冷。AtSAPlO能提高轉基因擬南芥對高溫、Zn、Mn和Ni脅迫耐受性 (DixitandDhankher,2011)〇
[0005] 以上研究表明A20/AN1型鋅指蛋白在植物抗逆應答反應中發揮了重要的作用，然 而該類基因在植物抗病應答反應中的研究還罕見報導。


【發明內容】

[0006] 針對目前A20/AN1型鋅指蛋白類基因在植物抗病應答反應中研究的空白，公開水 稻A20/AN1鋅指蛋白基因ZFP181在抗白葉枯病基因工程中的應用，過量表達該基因可以提 高植物的抗白葉枯病性，有利於水稻抗病性遺傳改良。
[0007] 本發明的目的具體通過以下技術手段獲得：
[0008] 1.本發明提供一種重組載體，該載體包括序列如SEQIDNO. 1所示的A20/AN1鋅 指蛋白基因ZFP181，通過DNA連結酶將基因ZFP181連接到載體，能夠過量表達A20/AN1鋅 指蛋白。
[0009] 所述表達載體可使用Ti質粒，Ri質粒，植物病毒載體等，該表達載體以任何一種 啟動子啟動表達，例如花椰菜花葉病毒（CAMV) 35S啟動子、Ubiquitin啟動子、Actin啟動 子，自身基因啟動子或其它啟動子，該表達載體中必要時可包括增強子，不論是轉錄增強子 或翻譯增強子。
[0010] 2.本發明還提供包括上述1重組載體的轉化細胞。
[0011] 3.本發明提供一種鋅指蛋白基因ZFP181過量表達轉基因水稻的培育方法，該方 法包括如下步驟：
[0012] (1)重組質粒pMD18T-ZFP181 的獲得
[0013] 選用水稻粳稻品種亜菜青，參照Invitrogen公司的Trizol法提取總RNA，參照 Ferments公司反轉錄系統合成亜菜青cDNA第一鏈；設計基因克隆引物上遊引物ZFP181F: 5，-AACCCATTCCCAAAAGCA-3 '，下遊引物ZFP181R:5 ' -CCATCCAACTTCCAACCTCA-3 '，以 反轉錄獲得的韭菜青cDNA為模板，通過PCR擴增ZFP181基因全長；通過TA-克隆系統將 ZFP181基因片段連接到pMD18-T載體，獲得重組質粒pMD18T-ZFP181;
[0014] (2)重組質粒pCAMBIA1304-ZFP181 的獲得
[0015] 根據ZFP181基因序列，以步驟（1)中獲得的重組質粒pMD18T-ZFP181為模 板，設計引物對，通過PCR擴增ZFP181基因全長；利用NcoI與BstPI將ZFP181全 長正向插入植物雙元表達載體PCAMBIA1304的CaMV35S啟動子下遊，獲得重組質粒 PCAMBIA1304-ZFP181 ；
[0016] (3)轉基因植株獲得
[0017] 將獲得的重組載體PCAMBIA1304-ZFP181轉化農桿菌EHA105;以水稻粳稻品種"中 花11"為受體，通過農桿菌介導的水稻遺傳轉化將重組載體PCAMBIA1304-ZFP181中包含目 的基因ZFP181的T-DNA區整合到水稻基因組中，從而獲得ZFP181過量表達轉基因植株。
[0018] 轉化方法可用農桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道法或其它方法轉化植物。
[0019] 4.權利要求3所述的鋅指蛋白基因ZFP181過量表達轉基因水稻的培育方法，其特 徵在於：步驟（1)重組質粒PMD18T-ZFP181的獲得過程中使用的引物對，上遊引物ZFP181F: 5，-AACCCATTCCCAAAAGCA-3，，下遊引物ZFP181R:5，-CCATCCAACTTCCAACCTCA-3，； 步驟（2)重組質粒pCAMBIA1304-ZFP181的獲得過程中，設計的引物對為ZFP181F-30a: -TCTCGGATTCGACCATGGC-3^ ;ZFP181Rs:5^ -GAGGTAACCGGAAAATTCAGGTTG-3^ 。
[0020] 5.轉鋅指蛋白基因ZFP181水稻的鑑定方法，其特徵在於：該方法包括如下步 驟（1)設計轉基因檢測引物對：LacZ-F:5 ' -GGCTCGTATGTTGTGTGGAA-3 '，181RT2-R: 5 ^ -AGTCGTGGCGGTCGGAGTA-3 ^，對提取的轉基因水稻DNA進行PCR檢測，能夠擴增出 1313bpDNA片段的植株即為ZFP181過量表達轉基因水稻陽性植株；從而確定ZFP181過量 表達轉基因水稻陽性植株；
[0021] (2)設計ZFP181 基因特異引物 181RT4-F:5 '-AGGAGCCGACGGAGCTGAGG-3 ' 與 181RT4-R:5 ' -TTGTTGGTCGCCGGGTTGCC-3 '及內參基因 18SrRNA引物 18S-F: 5' -ATGGTGGTGACGGGTGAC-3'，ISS-Rj' -CAGACACTAAAGCGCCCGGTA-3'，以野生型水稻 作對照，對待檢測轉基因水稻進行實時螢光定量PCR分析；通過與野生型對照相比，ZFP181 基因的表達高於野生型對照的植株即為ZFP181過量表達轉基因水稻陽性植株；
[0022] (3)提取ZFP181過量表達轉基因植株DNA並利用EcoRI對各個轉基因株系基 因組DNA進行酶切，以hptll基因編碼區內583bpDNA序列為模板，通過隨機引物擴增獲 得地高辛標記的探針，進行Southern雜交分析，具有陽性檢測條帶的待檢測轉基因水稻為 ZFP181過量表達轉基因水稻陽性植株。
[0023] 6.序列如SEQIDNO. 1所示的A20/AN1鋅指蛋白基因ZFP181在抗白葉枯病水稻 育種上的應用，其特徵在於：增強所述的A20/AN1鋅指蛋白基因ZFP181的表達，能夠提高水 稻的抗白葉枯病性。
[0024] 7.權利要求1所述的重組載體在抗白葉枯病水稻育種上的應用。
[0025] 8.權利要求2所述的轉化細胞在抗白葉枯病水稻育種上的應用。
[0026] 9.權利要求3-4任一項所述培育方法抗白葉枯病上的應用。
[0027] 10.根據權利要求3-4任一項所述方法製成的轉基因水稻在抗白葉枯病上的應 用。
[0028] 有益效果：
[0029] 1.本發明公開了一種過量表達水稻ZFP181基因的抗白葉枯病性基因工程應用。 該基因來自水稻（OryzasativaL)，能夠在水稻中穩定過量表達，過量表達該基因可以提 高水稻的抗白葉枯病性，有利於水稻抗病性遺傳改良。
[0030] 2.本發明人提供的ZFP181基因功能是參與水稻的抗病應答反應，屬於誘導性表 達，正常情況下，水稻A20/AN1鋅指蛋白正常表達，當水稻收到白葉枯病感染後能及時在白 葉枯病的誘導下過量表達蛋白，既能提高水稻的抗病性，也避免水稻在正常情況下過表達 蛋白而影響產量。
[0031] 3.利用本發明ZFP181基因作為目的基因構建植物表達載體，其中可用任何一種 啟動子例如花椰菜花葉病毒（CAMV) 35S啟動子、Ubiquitin啟動子、Actin啟動子，自身基因 啟動子或其它啟動子，該表達載體中必要時可包括增強子，不論是轉錄增強子或翻譯增強 子。為了簡化轉化細胞的鑑定可使用選擇性標記包括對抗生素抗性的酶，對除草劑具有抗 性的酶，也可利用顏色變化（例如β-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或發光（例如螢光素酶）來識 別的化合物的酶類，也可用無標記選擇。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1重組質粒pCAMBIA1304-ZFP181載體的構建
[0033]Α.重組質粒pCAMBIA1304-ZFP181的載體結構圖。Β.重組質粒 PCAMBIA1304-ZFP181 雙酶切鑑定。Ml:DNA分子標記DL2000plus;M2:DNA分子標記DL15k bps ;1 :重組質粒 pCAMBIA1304-ZFP181 ;2 :重組質粒 pCAMBIA1304-ZFP181pro 經 BstP I 和 Nco I雙酶切
[0034] 圖2重組質粒pTCK303-ZFP181載體的構建
[0035] A.重組質粒pTCK303-ZFP181的載體結構圖。重組質粒pTCK303-ZFP181雙 酶切鑑定。Ml :DNA分子標記DL2000plus ;M2 :DNA分子標記DL15k bps ; 1 :重組質粒 PTCK303-ZFP181 經 Kpn I 和 BamH I 雙酶切；2:重組質粒 pTCK303-ZFP181 經 Sac I 和 Spe I 雙酶切；3重組質粒pTCK303-ZFP181經SacI和BamHI雙酶切；4 :重組質粒pTCK303-ZFP181
[0036] 圖3ZFP181過量表達轉基因水稻的PCR鑑定
[0037] 1-14 :ZFP181過量表達轉基因水稻Ttl代株系；WT，-，+ :分別為野生型（中花11)， 陰性對照，陽性對照；M:DNA分子標記DL2000plus。
[0038] 圖4 ZFP181RNAi幹涉抑制表達轉基因水稻的PCR鑑定
[0039]1-33 :ZFP181幹涉抑制表達轉基因水稻Ttl代株系；WT，_，+ :分別為野生型（中花 11)，陰性對照，陽性對照；M:DNA分子標記DL2000plus。
[0040]圖 5 ZFP181 轉基因水稻植株的 Real-time PCR 和 Southern blot 鑑定
[0041] A. Real-time PCR 鑑定 ZFP181 過量表達轉基因水稻。B. Real-time PCR 鑑定 ZFP181RNAi轉基因水稻。C. Southern blot鑑定ZFP181過量表達轉基因水稻。D. Southern blot鑑定ZFP181RNAi抑制表達轉基因水稻。0xl-0x8 :ZFP181過量表達轉基因株系；Wild type :野生型植株；Kdl-Kd8 :ZFP181RNAi轉基因株系。
[0042] 圖6ZFP181轉基因水稻白葉枯病抗性鑑定
[0043] A. ZFP181轉基因水稻白葉枯病抗性鑑定；B. ZFP181轉基因水稻劍葉經白葉枯侵 染14後病斑長度統計。
[0044] 0x3, 0x4 :ZFP181過量表達轉基因水稻株系；WT :野生型植株；Kd2, Kd4 :ZFP181 RNAi轉基因株系。

【具體實施方式】
[0045] 下面結合實施例對本發明做進一步說明，下列實施例中未註明具體條件的實驗方 法，通常按照本領域的公知手段。
[0046] 實施例1.
[0047] 鋅指蛋白基因ZFP181過量表達轉基因水稻的培育
[0048] (1)重組質粒 pMD18T-ZFP181 的獲得
[0049] 選用水稻粳稻品種韭菜青，於人工氣候培養箱（16h光照/8h黑暗，白天30°C夜晚 26°C)中水培生長，營養液採用國際水稻所常規營養液配方。待幼苗生長至3-4葉期時，取 幼苗於液氮中速凍並於-80°C冰箱中保存備用。取保存的水稻幼苗樣品，參照Invitrogen 公司的Trizol法提取總RNA的提取。總RNA的質量以及濃度通過1 %瓊脂糖凝膠電泳分 析，獲得符合質量的總RNA即28srRNA和18ssRNA條帶清晰，進一步用於合成cDNA第一 鏈。cDNA第一鏈的合成參照Ferments公司反轉錄系統的操作手冊進行。
[0050]設計基因克隆引物ZFP181F:5 ' -AACCCATTCCCAAAAGCA-3 '及ZFP181R: 5 ' -CCATCCAACTTCCAACCTCA-3 ^，以反轉錄獲得的韭菜青cDNA為模板，通過PCR擴增 ZFP181基因全長。PCR擴增使用PrimestarHSDNA聚合酶（Takara)，PCR程序如下：98°C 預變性5!1^11，981：變性58,561：復性1〇8,721：延伸4〇8,30個循環後，721：1〇1^11。然後在PCR產物中加入普通DNA聚合酶72°C保溫30min，通過電泳檢測PCR擴增結果並利用DNA片 段純化試劑盒回收所擴增的DNA片段。進一步通過TA-克隆系統將DNA片段連接到pMD18-T 載體，利用CaCl2轉化法將其轉入大腸桿菌DH5a中獲得重組質粒PMD18T-ZFP181。重組質 粒經測序後獲得具有完整ORF的水稻A20/AN1鋅指蛋白基因ZFP181的cDNA序列SEQID NO. 1。ZFP181的ORF全長516bp，編碼171個胺基酸。
[0051] (2)重組質粒pCAMBIA1304-ZFP181 的獲得
[0052] 根據ZFP181基因序列，設計一對載體構建引物ZFP181F_30a: 5，-TCTCGGATTCGACCATGGC-3，與ZFP181Rs:5，-GAGGTAACCGGAAAATTCAGGTTG-3，，以實 施例1中獲得的重組質粒PMD18T-ZFP181為模板通過PCR擴增ZFP181基因全長。利用Nco I與BstPI將ZFP181全長正向插入植物雙元表達載體pCAMBIA1304的CaMV35S啟動子下 遊，獲得重組質粒PCAMBIA1304-ZFP181並通過測序驗證其正確性（圖1)。
[0053] (3)轉基因植株獲得
[0054] 將獲得的重組載體通過凍融法轉化農桿菌EHA105。以水稻粳稻品種"中花11" 為受體，通過農桿菌介導的水稻遺傳轉化將重組載體PCAMBIA1304-ZFP181中目的基因 ZFP181的T-DNA區整合到水稻基因組中，從而獲得ZFP181過量表達轉基因植株。
[0055] 實施例2
[0056] 鋅指蛋白基因ZFP181RNAi轉基因水稻的培育
[0057] 步驟（1)重組質粒pMD18T-ZFP181的獲得如實施例1
[0058] (2)重組質粒pTCK303-ZFP181 的獲得
[0059]利用在線RNAi祀定位點預測軟體（http://bioinfo.clontech.com/ rnaidesignerhttp：//www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html), 對ZFP181 全長cDNA序列的可能siRNA位點進行預測，選取可能siRNA位點最多且序列特異性最 好的cDNA片段，長度為254bp，作為幹涉區段插入植物幹涉表達載體。根據選取的幹涉 區段設計引物RNAi-181Fl:5 ' -GGTACCGTTAGGTTCTAAAAGGATAATAC-3 '與RNAi-181Rl: 5' -TTGGATCCTCAACCACCACTACA-3'，以重組質粒pMD18T-ZFP181 為模板擴增幹涉DNA區段 並通過BamHI和KpnI酶切位點將該序列反向插入pTCK303植物幹涉表達載體MCSl中獲得 PTCK303-C1。同時，設計引物RNAi-ISlFZji-CCAAACTAGTTAGGTTCTAAAAGGATAATAC-3' 與RNAi-181R2 :5' -GAGCTCAACCTCAACCACCACTA-3'，以重組質粒pMD18T-ZFP181 為模板擴 增幹涉DNA區段並通過SpeI與SacI酶切位點將該序列正向插入pTCK303-Cl植物幹涉 表達載體MCS2中，從而獲得重組質粒pTCK303-ZFP181並通過測序驗證其正確性（圖2)。
[0060] (3)轉基因植株獲得
[0061] 將獲得的重組載體通過凍融法轉化農桿菌EHA105。以水稻粳稻品種中花11為受 體，通過農桿菌介導的水稻遺傳轉化將重組載體PTCK303-ZFP181中包含目的片段的T-DNA 區整合到水稻基因組中，從而獲得ZFP181RNAi轉基因植株。
[0062] 實施例3
[0063]ZFP181過量表達轉基因水稻分子鑑定
[0064] 取T3代轉基因水稻葉片，通過SDS小量DNA提取法提取水稻基因組DNA。以 提取的DNA為模板，通過引物LacZ-F:5 '-GGCTCGTATGTTGTGTGGAA-3 '與 181RT2-R: 5' -AGTCGTGGCGGTCGGAGTA-3'進行PCR檢測，其中能夠擴增出1313bpDNA片段的植株即 為ZFP181過量表達轉基因水稻陽性植株，結果所檢測的14株水稻植株中有13株為ZFP181 過量表達轉基因水稻陽性植株（圖3)。
[0065]設計ZFP181 基因特異引物 181RT4-F:5，-AGGAGCCGACGGAGCTGAGG-3， 與 181RT4-R:5 ' -TTGTTGGTCGCCGGGTTGCC-3 '及內參基因 18SrRNA引物 18S-F: 5，-ATGGTGGTGACGGGTGAC-3，，18S-R:5，-CAGACACTAAAGCGCCCGGTA-3，，對ZFP181 過量 表達轉基因水稻陽性植株進行實時螢光定量PCR分析，結果表明所檢測的8個陽性轉基因 水稻株系除0x6和0x7外，其餘6個陽性轉基因水稻株系中ZFP181基因的表達均高於野生 型對照（圖5-A)
[0066] 提取ZFP181過量表達轉基因植株DNA並利用EcoRI對各個轉基因株系基因組 DNA進行酶切，以hptll基因編碼區內583bpDNA序列為模板，通過隨機引物擴增獲得地高 辛標記的探針，從而進行Southern雜交分析，實驗方法參照Southern雜交試劑盒（Roche)， 結果顯示所檢測的轉基因株系成功整合了外源目的DNA(圖5-C)
[0067] 實施例4
[0068] 鋅指蛋白基因ZFP181RNAi轉基因水稻的分子鑑定
[0069] 設計多克隆插入位點MCS2兩側載體特異性引物LacZ-F:5 '-GGCTCG TATGTTGTGTGGAA-3'與PSOSCZU' -TGGTCCAGTCTTTCCGCTGATA-3'，以提取的DNA為模 板進行PCR陽性驗證，其中能夠擴增出934bpDNA片段的植株即為ZFP181RNAi轉基因水 稻陽性植株，結果所檢測的33株水稻中有23株為ZFP181RNAi轉基因水稻陽性植株（圖 4)。
[0070]設計ZFPl8I基因特異引物 1S1RT4-F:5，-AGGAGCCGACGGAGCTGAGG-3，（SEQ IDNO. 12)與 181RT4-R:5 ' -TTGTTGGTCGCCGGGTTGCC-3 '(SEQIDNO. 13)及內參 基因 18SrRNA引物 18S-F:5 ' -ATGGTGGTGACGGGTGAC-3 '(SEQIDNO. 14), 18S-R： 5/-CAGACACTAAAGCGCCCGGTA-3，（SEQIDN0·15)，對ZFP181RNAi轉基因水稻陽性植株 進行實時螢光定量PCR分析。結果表明所檢測的8個陽性轉基因水稻株系中ZFP181基因 的表達均低於野生型對照（圖5-B)。
[0071] 提取ZFP181RNAi轉基因植株DNA並利用EcoRI對各個轉基因株系基因組DNA 進行酶切，以hptll基因編碼區內583bpDNA序列為模板，通過隨機引物擴增獲得地高辛標 記的探針，從而進行Southern雜交分析，實驗方法參照Southern雜交試劑盒（Roche)，結果 顯示所檢測的轉基因株系成功整合了 1-3個拷貝外源目的DNA(圖5-D)
[0072] 實施例5
[0073] 轉基因植株抗病性鑑定
[0074] 分別將ZFP181過量表達轉基因水稻和ZFP181RNAi轉基因水稻播種並種植於大 田中生長到孕穗期，對水稻植株劍葉進行剪葉接種白葉枯病菌，具體方法如下：首先將白葉 枯菌系Z173劃線於牛肉汁蛋白腖培養基（蛋白腖5-10g/L，牛肉浸膏3g/L，酵母浸膏lg/L， 蔗糖10g/L，瓊脂15/L，PH6. 8-7. 0)，28-30°C恆溫培養箱中培養2-5天至長出菌落。然後 將白葉枯菌落用去離子水重懸並稀釋至〇D_ = 0. 5(菌液濃度約為5X108cfu/mL)，用於進 一步水稻葉片接菌。接種時將剪刀進入白葉枯菌懸液l_2s，再用沾有菌液的剪刀從距劍葉 頂部l-2cm處剪去葉尖，每株水稻接菌3-5片劍葉，每個株系接菌3-5株植株，接菌2-3周 後，統計發病情況。結果顯示ZFP181過量表達轉基因水稻接菌葉片病斑長度顯著低於野生 型水稻，而ZFP181RNAi幹涉抑制轉基因水稻接菌葉片病斑長度與野生型無明顯差異，表明 ZFP181過量表達能增強水稻對白葉枯病的抗性（圖6)。
[0075]可以知道，上述實施例僅為了說明發明原理而採用的示例性實施方式，然而本發 明不僅限於此，本領域技術人員在不脫離本發明實質情況下，可以做出各種改進和變更，這 些改進和變更也屬於本發明的保護範圍。
【權利要求】
1. 一種重組載體，其特徵在於：該載體包括序列如SEQ ID NO. 1所示的A20/AN1鋅指 蛋白基因 ZFP181，通過DNA連接酶將基因 ZFP181連接到植物表達載體，能夠過量表達A20/ AN1鋅指蛋白ZFP181。
2. 包括權利要求1所述重組載體的轉化細胞。
3. -種鋅指蛋白基因 ZFP181過量表達轉基因水稻的培育方法，其特徵在於：該方法包 括如下步驟： (1) 重組質粒PMD18T-ZFP181的獲得 選用水稻粳稻品種亜菜青，參照Invitrogen公司的Trizol法提取總RNA，參照 Ferments公司反轉錄系統合成亜菜青cDNA第一鏈；設計基因克隆引物，以反轉錄獲得的亜 菜青cDNA為模板，通過PCR擴增ZFP181基因全長；通過TA-克隆系統將ZFP181基因片段 連接到PMD18-T載體，獲得重組質粒pMD18T-ZFP181 ; (2) 重組質粒pCAMBIA1304-ZFP181的獲得 根據ZFP181基因序列，以步驟（1)中獲得的重組質粒pMD18T-ZFP181為模板，設計引 物對，通過PCR擴增ZFP181基因全長；利用Nco I與BstP I將ZFP181全長正向插入植物 雙元表達載體PCAMBIA1304的CaMV 35S啟動子下遊，獲得重組質粒pCAMBIA1304-ZFP181 ; (3) 轉基因植株獲得 將獲得的重組載體PCAMBIA1304-ZFP181轉化農桿菌EHA105 ;以水稻粳稻品種中花11 為受體，通過農桿菌介導的水稻遺傳轉化將重組載體PCAMBIA1304-ZFP181中包含目的基 因 ZFP181的T-DNA區整合到水稻基因組中，從而獲得ZFP181過量表達轉基因植株。
4. 權利要求3所述的鋅指蛋白基因 ZFP181過量表達轉基因水稻的培育方法，其特徵 在於：步驟（1)重組質粒PMD18T-ZFP181的獲得過程中使用的引物對，上遊引物ZFP181F :5，-AACCCATTCCCAAAAGCA-3，，下遊引物 ZF 181R :5，-CCATCCAACTTCCAACCTCA-3，； 步驟（2)重組質粒pCAMBIA1304-ZFP181的獲得過程中，設計的引物對為ZFP181F-30a: 5' -TCTCGGATTCGACCATGGC-3' JFPISIRsj' -GAGGTAACCGGAAAATTCAGGTTG-3'。
5. 轉鋅指蛋白基因 ZFP181水稻的鑑定方法，其特徵在於：該方法包括如下步 驟（1)設計轉基因檢測引物對：LacZ-F :5 ' -GGCTCGTATGITGTGTGGAA-3 '，181RT2-R : 5 ' -AGTCGTGGCGGTCGGAGTA-3 ';對待檢測的轉基因水稻DNA進行PCR檢測，能夠擴增出 1313bp DNA片段的植株即為ZFP181過量表達轉基因水稻陽性植株； (2) 設計 ZFP181 基因特異引物 181RT4-F :5 ' -AGGAG CCGACGG AGCTGAGG-3 ' 與 181RT4-R :5 ' -TTGTTGGTCGCCGGGTTGCC-3 '及內參基因 18S rRNA 引物 18S-F : 5' -ATGGTGGTGACGGGTGAC-3' aSS-Rj' -CAGACACTAAAGCGCCCGGTA-3'，以野生型水稻 作對照，對待檢測轉基因水稻進行實時螢光定量PCR分析；通過與野生型對照相比，ZFP181 基因的表達高於野生型對照的植株即為ZFP181過量表達轉基因水稻陽性植株； (3) 提取待檢測轉基因植株DNA並利用EcoR I對各個轉基因株系基因組DNA進行酶 切，以hptll基因編碼區內583bp DNA序列為模板，通過隨機引物擴增獲得地高辛標記的探 針，進行Southern雜交分析，具有陽性檢測條帶的待檢測轉基因水稻為ZFP181過量表達轉 基因水稻陽性植株。
6. 序列如SEQ ID NO. 1所示的A20/AN1鋅指蛋白基因 ZFP181在抗白葉枯病水稻育種 上的應用，其特徵在於：增強所述的A20/AN1鋅指蛋白基因 ZFP181的表達，能夠提高水稻的 抗白葉枯病性。
7. 權利要求1所述的重組載體在抗白葉枯病水稻育種上的應用。
8. 權利要求2所述的轉化細胞在抗白葉枯病水稻育種上的應用。
9. 權利要求3-4任一項所述培育方法在抗白葉枯病轉基因水稻育種上的應用。
10. 根據權利要求3-4任一項所述方法製成的轉基因水稻在抗白葉枯病上的應用。
【文檔編號】C12N15/84GK104357478SQ201410614799
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月4日 優先權日:2014年11月4日
【發明者】黃驥, 張紅生, 藍虹霞, 鮑永美, 王州飛, 唐海娟 申請人:南京農業大學