穩定分泌抗人aeg-1單克隆抗體的雜交瘤細胞的製作方法

2024-04-01 07:27:05

專利名稱：穩定分泌抗人aeg-1單克隆抗體的雜交瘤細胞的製作方法
技術領域：
本發明屬於雜交瘤細胞技術領域，涉及一種穩定分泌抗人AEG-I單克隆抗體的雜交瘤細胞。
背景技術：
AEG-I 又名 LYRIC、Metadherin (MTDH)，2002 年該基因在 HIV、TNF 誘導的胎兒星形膠質細胞上調基因中被克隆。人AEG-I為單次跨膜蛋白，分子量64kD，pI為9. 3，基因序列中含有12個外顯子和11個內含子，染色體定位於8q22。AEG-I表達蛋白由582個富含賴氨酸的胺基酸組成，含有三個核定位肽(NSL) 79-91aa、432-451aa、561-580aa，一個跨膜結構域(TMD) 51-72aa，一個肺歸巢結構域(LHD) 38l_443aa 和一個 N-terminal LXXLL motif 基序。AEG-I與腫瘤發生、發展以及預後密切相關。應用細胞系表達分析顯示，AEG-I在乳腺癌、前列腺癌、食管癌、肝癌、黑色素瘤、膠質瘤及神經細胞瘤中表達明顯高於其正常對照組織。應用肝組織標本檢測結果顯示，9例正常肝組織幾乎檢測不到AEG-I表達，而109 例肝癌組織中僅有7例檢測不到表達，其餘102例不同分期、不同分級肝癌組織中AEG-I表達水平與其分期和分級呈正相關性。AEG-I過表達還可增強乳腺癌細胞和293T細胞的肺部轉移能力，增加乳腺癌細胞與肺的內皮細胞粘附性，抑制AEG-I基因的表達則會逆轉腫瘤細胞與內皮細胞的粘附作用進而抑制其轉移能力。下調具有高度肺轉移能力的LM2乳腺癌細胞系中AEG-I表達，可明顯抑制腫瘤細胞肺轉移。目前雖然發現了不少癌基因可作為腫瘤生物治療的靶基因，但臨床效果均不理想，有待進一步研發臨床效果更好的惡性腫瘤治療新靶點，而AEG-I基因及其表達產物有望成為一個惡性腫瘤預後評估及靶向治療新的切入點。AEG-I參與了多種信號轉導通路。①Ha-ras及PI3K/Akt通路螢光素酶活性分析顯示，永生化細胞THV中過表達Ha-ras可使MTDH啟動子活性上調4倍。乳腺癌細胞中原癌基因Ha-ras通過激活PI3K/Akt通路，促進轉錄調控因子c_Myc與MTDH啟動子-356/-302 區域的E-box元件結合，從而啟動AEG-I基因轉錄。②NF-K B通路第一個被證實受AEG-I 上調的通路是NF-kB通路，在Hela細胞和惡性膠質瘤細胞中，TNF_a可誘導AEG-I表達，後者轉位到核內與NF-κ B的p65亞單位結合併上調NF-kB基因的表達。③MEK/ERK通路在進一步對多種腫瘤的研究中發現，MEK/ERK下遊的癌基因轉錄因子AP-I受到AEG-I的激活。 抑制MEK/ERK或p38MAPK通路可減弱惡性腫瘤細胞的侵襲能力。惡性腫瘤細胞內信號轉導通路的研究雖然取得了巨大的進展，但惡性腫瘤的發生、發展以及預後是一個多因素、多環節、多階段的複雜演變過程，因此仍需進一步探討並明確信號轉導通路中各分子的作用，為惡性腫瘤的預防、治療及早期診斷奠定基礎。

發明內容
本發明解決的問題在於提供穩定分泌抗人AEG-I單克隆抗體的雜交瘤細胞，可用於研究AEG-I在惡性腫瘤細胞中的功能以及信號轉導通路中的作用，並用於惡性腫瘤的診斷、預後判斷和治療研究。本發明是通過以下技術方案來實現穩定分泌抗人AEG-I單克隆抗體的雜交瘤細胞，該雜交瘤細胞保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為=CCTCC C2011117。所述的穩定分泌抗人AEG-I單克隆抗體的雜交瘤細胞，所分泌的單克隆抗體能夠識別細胞內所表達的AEG-I分子。所述的細胞為腫瘤細胞。所述的腫瘤細胞為惡性腫瘤細胞。所述的惡性腫瘤細胞為宮頸癌細胞或肺癌細胞。穩定分泌抗人AEG-I單克隆抗體的雜交瘤細胞的製備方法，包括以下步驟首先將AEG-I胞外段基因克隆於表達載體pGSTag構建pGSTag-AEG-Ι載體，將重組表達載體pGSTag-AEG-Ι轉化大腸桿菌，利用IPTG誘導目的蛋白表達，超聲裂菌，純化得到具有抗原性的AEG-I胞外段蛋白；以具有抗原性的AEG-I胞外段蛋白作為免疫原免疫小鼠，取血清效價大於IO5的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0用50% PEG進行融合，用含有IXHAT和20%小牛血清的RPMI-1640培養，出現融合細胞後收集上清；以純化的AEG-I胞外段蛋白包被96孔板，通過ELISA方法進行篩選，保留AEG-1 陽性的雜交瘤細胞，在通過有限稀釋克隆方法獲得穩定分泌抗AEG-I單克隆抗體的雜交瘤細胞株。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明構建了能穩定分泌抗人AEG-I單克隆抗體的雜交瘤細胞，所分泌的單克隆抗體能夠特異性的識別AEG-I分子,Western Blot法證明此腹水中的抗體能夠識別腫瘤細胞中AEG-I抗原，利用免疫組織化學方法證明此抗體可以識別惡性腫瘤細胞中的AEG-I蛋白。此株雜交瘤細胞分泌的抗AEG-I單克隆抗體為進一步研究AEG-I在腫瘤細胞中信號轉導通路以及其在腫瘤發生、發展中的作用研究奠定了基礎，同時也為惡性腫瘤診斷、治療及預後判斷奠定了物質基礎。


圖I為利用western blot法檢測純化的AEG-1胞外段蛋白的抗原性；圖2為雜交瘤細胞1E3染色體分析；圖3為ELISA方法檢測腹水中抗AEG-I單克隆抗體的效價；圖4為利用western blot法檢測雜交瘤細胞所分泌的單抗與腫瘤細胞裂解物的反應結果圖；圖5為利用免疫組織化學法檢測雜交瘤細胞所分泌的單抗與肺癌細胞A549中表達的AEG-I蛋白的結合結果圖；圖6為雜交瘤細胞1E3分泌的抗AEG-I抗體亞型鑑定結果。保藏說明本發明獲得的穩定分泌抗人AEG-I單克隆抗體的雜交瘤細胞進行了以下保藏
保減單位中國典型培養物保減中心(CCTCC);地址武漢市武昌洛咖山；保藏時間2011年12月5日；保藏號為CCTCC C2011117，培養物名稱為小鼠雜交瘤細胞 AEG-1/1E3。
具體實施例方式本發明通過以表達純化的AEG-I蛋白為免疫原，應用雜交瘤細胞技術，得到一株能穩定分泌抗人AEG-I單克隆抗體的雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞株所分泌的單克隆抗體能特異性的識別AEG-1。下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。I.抗原的製備利用分子克隆方法將AEG-I胞外段基因克隆於表達載體pGSTag的Ncol/Sac I 之間，構建pGSTag-AEG-Ι載體，將重組表達載體pGSTag-AEG-1轉化大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS,利用IPTG誘導目的蛋白表達,超聲裂菌,利用Glutathione Sepharose 4B beads純化目的蛋白，以Western Blot方法進行所表達蛋白的鑑定。結果顯示,純化的AEG-I胞外段蛋白(分子量約46KD)與商品化的抗AEG-I多克隆抗體(Proteintech公司，Cat. No. 13860-1-AP)能夠發生免疫反應，如圖I所示，在46KD大小有明顯的陽性條帶出現，結果表明純化的AEG-I胞外段蛋白具有抗原性。2.免疫第一次免疫取8周齡雌性BALB/C小鼠，於背部皮下注射與等體積弗氏完全佐劑混合的25 μ g純化的AEG-I胞外段蛋白。第二次免疫3-4周後用等體積弗氏不完全佐劑加25 μ g純化的AEG-I胞外段蛋白重複免疫一次。免疫20天後通過間接ELISA方法監測小鼠血清抗體效價。第三次免疫間隔4周後，融合前72h，腹腔注射50 μ g純化的AEG-I胞外段蛋白加強免疫。福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑均使用Sigma公司商品化產品。3.雜交瘤細胞株的製備和篩選按單克隆抗體製備方法(細胞和分子免疫學實驗技術第一版，P9-P17)，經腹腔注射抗原再加強免疫後，3天後處死動物取脾進行細胞融合，收集免疫小鼠脾細胞並計數。取對數生長的小鼠骨髓瘤細胞SP2/0計數，同時製備免疫脾細胞懸液。將骨髓瘤細胞與脾細胞按I : 10比例混合進行細胞融合(用50% PEG)。融合後細胞懸液加入含有飼養細胞(正常Balb/c小鼠腹腔巨噬細胞)的96孔板，以含1%HAT、20%小牛血清的 RPMI-1640篩選培養，37°C、5% CO2孵箱培養。當克隆長至1/3板底時，收集培養上清。以純化的AEG-I抗原及GST抗原分別包被ELISA板，間接ELISA法檢測培養上清中抗AEG-I抗體，篩選分泌抗人AEG-I抗體的克隆； 對含有陽性克隆孔的細胞採用有限稀釋法進行克隆化，直至獲得能夠穩定分泌抗體的雜交瘤細胞系(體外連續培養超過6個月)，最終獲得一株可穩定分泌抗AEG-I單克隆抗體的細胞株，標記為1E3，擴大培養。4.雜交瘤細胞染色體分析篩選出的分泌抗人AEG-I單克隆抗體的雜交瘤細胞株1E3，20% 1640擴大培養至對數生長期，添加O. 4yg/ml秋水仙素，37°C培養3h ；0. 075M KC低滲處理後固定細胞，10% Giemsa染液染色，100倍油鏡下觀察。觀察結果如圖2所示，1E3細胞染色體平均數目為92 條，可見明顯的特徵性中部著絲粒染色體。5.腹水的製備和亞型測定應用此株雜交瘤細胞株以5X IO7/只腹腔注射預先用液體石蠟處理的8-10周齡 BALB/C雌性小鼠，10-14天後採集腹水並純化抗體，以純化的AEG-I抗原包被96孔板，利用 ELISA方法檢測腹水，以吸光度A為縱坐標，以稀釋倍數為橫坐標，繪製曲線圖。如圖3所示，腹水中有抗AEG-I的單克隆抗體產生，能與純化的AEG-I胞外段蛋白發生免疫反應，其效價為1X10_7，結果表明所篩選的雜交瘤細胞所分泌的單克隆抗體能夠與AEG-I特異性
彡口口 以宮頸癌HeLa細胞和肺癌A549細胞的全細胞裂解蛋白(25ug)為抗原，Western Blot方法檢測此腹水中的抗體與腫瘤細胞中的AEG-I蛋白的結合，結果如圖4所示，可以看到在A549、Hela細胞中均有SOkd的目的條帶出現，說明所分泌的抗體能夠識別腫瘤細胞中的AEG-I抗原分子，並發生了免疫結合。肺癌細胞A549製備細胞爬片，以腹水作為檢測抗體，山羊抗小鼠IgG-HRP為第二抗體，免疫組織化學法檢測腹水中單克隆抗體與腫瘤細胞AEG-I的結合，結果如圖5所示， 在A549細胞中(主要在胞膜和胞漿)，可見明顯的棕色陽性反應產物，結果表明所分泌的單克隆抗體與AEG-I分子識別並生了免疫結合。利用AbD serotec 公司的 MOUSE MONOCLONAL ANTI BODY ISOTYPING TEST KIT 試紙條方法確定細胞株1E3分泌的抗體亞型，檢測結果如圖6所示，結果表明所分泌的抗體的亞型為IgGl，輕鏈為K鏈。以上檢測結果表明所篩選的雜交瘤細胞株能穩定的分泌抗AEG-I的單克隆抗體， 將該細胞株保藏於中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC C2011117。雜交瘤細胞CCTCC C2011117分泌的抗AEG-I單克隆抗體為進一步研究AEG-I在腫瘤細胞中信號轉導通路以及其在腫瘤發生、發展中的作用研究奠定了基礎，同時也為惡性腫瘤診斷、治療及預後判斷奠定了物質基礎。鑑於該雜交瘤細胞所分泌的單克隆抗體能夠特異識別腫瘤細胞內所表達的AEG-I 蛋白分子並且產生免疫反應。以此為基礎，可以對腫瘤組織、細胞內的AEG-I進行研究、檢測，從而可以預防、診斷、治療相關腫瘤。
權利要求
1.穩定分泌抗人AEG-I單克隆抗體的雜交瘤細胞，其特徵在於，該雜交瘤細胞保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為=CCTCC C2011117。
2.如權利要求I所述的穩定分泌抗人AEG-I單克隆抗體的雜交瘤細胞，其特徵在於，所述的雜交瘤細胞所分泌的單克隆抗體能夠識別細胞所表達的AEG-I分子。
3.如權利要求2所述的穩定分泌抗人AEG-I單克隆抗體的雜交瘤細胞，其特徵在於，所述的細胞為腫瘤細胞。
4.如權利要求3所述的穩定分泌抗人AEG-I單克隆抗體的雜交瘤細胞，其特徵在於，所述的腫瘤細胞為惡性腫瘤細胞。
5.如權利要求4所述的穩定分泌抗人AEG-I單克隆抗體的雜交瘤細胞，其特徵在於，所述的惡性腫瘤細胞為宮頸癌細胞或肺癌細胞。
6.穩定分泌抗人AEG-I單克隆抗體的雜交瘤細胞的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟首先將AEG-I胞外段基因克隆於表達載體pGSTag構建pGSTag-AEG-Ι載體，將重組表達載體pGSTag-AEG-Ι轉化大腸桿菌，利用IPTG誘導目的蛋白表達，超聲裂菌，純化得到具有抗原性的AEG-I胞外段蛋白；以具有抗原性的AEG-I胞外段蛋白作為免疫原免疫小鼠，取血清效價大於IO5的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0用50% PEG進行融合，用含有IXHAT和20%小牛血清的 RPMI-1640培養，出現融合細胞後收集上清；以純化的AEG-I胞外段蛋白包被96孔板，通過ELISA方法進行篩選，保留AEG-I陽性的雜交瘤細胞，在通過有限稀釋克隆方法獲得穩定分泌抗AEG-I單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
全文摘要
本發明公開了穩定分泌抗人AEG-1單克隆抗體的雜交瘤細胞，該雜交瘤細胞保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC C2011117。所述的穩定分泌抗人AEG-1單克隆抗體的雜交瘤細胞，所分泌的單克隆抗體能夠識別細胞內所表達的AEG-1分子，尤其是對腫瘤細胞所表達的AEG-1分子的識別和結合。
文檔編號C12N15/06GK102586192SQ20121001779
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月19日 優先權日2012年1月19日
發明者張惠中, 王希, 董軻, 龍敏 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學