蓖麻蠶蛹做生物反應器製備重組人表皮生長因子的方法
2024-04-07 11:21:05
蓖麻蠶蛹做生物反應器製備重組人表皮生長因子的方法
【專利摘要】本發明公開了以蓖麻蠶蛹做生物反應器製備重組人表皮生長因子的方法，屬基因工程領域。通過基因工程技術將入門載體pENTRTM4Dual-6xHis-HCEGF整合到目的載體線性化AnpeNPVDNA核多角體基因啟動子下遊，獲得表達載體重組柞蠶杆狀病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPVDNA，所述表達載體經處理後接種蓖麻蠶蛹，高效表達HCEGF，經孵育、分離純化製備出功效類似天然產物的重組人表皮生長因子。本發明屬真核細胞基因表達法，具有蛋白質翻譯後修飾過程，表達效率高，表達產物的生物學特性與天然產物相似的優點，且蠶蛹材料來源豐富，對提升蓖麻蠶的經濟價值，促進廣西的養蠶事業發展具有重要意義。
【專利說明】蓖麻蠶蛹做生物反應器製備重組人表皮生長因子的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程領域，具體涉及蓖麻蠶蛹做生物反應器、重組杆狀病毒做基因表達載體製備重組人表皮生長因子的方法。
【背景技術】
[0002]人表皮生長因子(human epidermal growth factor, hEGF)是由53個胺基酸組成的多肽，分子量約為6000Da，其生物學功能使其在製藥和化妝品領域具有廣泛的應用。人表皮生長因子具有促進上皮再生的功能，可以用於促進外科手術傷口及其它創面的癒合，如皮膚移植、皮膚的擦傷、燒傷、糜爛等；還具有促進角膜上皮細胞的增殖的作用，用來治療角膜損傷、潰瘍以及促進移植角膜的存活；還能抑制胃酸分泌，可用於消化性潰瘍的治療；還能加快表皮更新，使表皮細胞個體年齡年輕化，起到護膚、抗皺、美白等美容效果，可用於化妝品領域。因而，獲得類似天然重組人表皮生長因子具有重要的經濟價值。
[0003]人表皮生長因子曾在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌和家蠶杆狀病毒中成功地表達，但利用蓖麻蠶蛹做生物反應器、重組杆狀病毒做基因表達載體製備重組人表皮生長因子的方法未見有報導。蓖麻蠶蛹做生物反應器、重組杆狀病毒做基因表達載體的方法屬真核細胞基因表達方法，具有蛋白質翻譯後修飾過程，表達效率高，表達產物的生物學特性與天然產物相似等優勢。
[0004]廣西是唯一的蓖麻蠶保種基地，擁有成熟的蓖麻蠶飼養技術和豐富的木薯葉飼料資源。利用蓖麻蠶繭殼加工蠶絲綿、蠶蛹做生物反應器的新用途，對提升蓖麻蠶的經濟價值，促進廣西的養蠶事業發展具有重要意義。所用蠶蛹具有廉價，可儲存，運輸方便，無須飼養或細胞培養，可機械化操作等優點。
【發明內容】
[0005]本發明的發明目的在於:提供一種以蓖麻蠶蛹做生物反應器、重組杆狀病毒做基因表達載體製備重組人表皮生長因子的方法。
[0006]為實現上述目的，本發明採用的技術方案如下:通過基因工程技術將入門載體pENTR?4Dual-6xHis-HCEGF整合到目的載體線性化AnpeNPV DNA核多角體基因啟動子下遊，獲得表達載體重組柞蠶杆狀病毒6xHi s-HCEGF-AnpeNPV DNA，所述表達載體經處理後接種蓖麻蠶蛹，高效表達HCEGF，經孵育、分離純化製備出功效類似天然產物的的重組人表皮生長因子；其中:
[0007]( I)所述入門載體的構建方法為:
[0008]用Nco I /EcoR I雙酶切消化HCEGF/pET_28a質粒，獲得擁有從起始密碼子ATG到終止密碼子TAA結束的完整閱讀框架(orf )、且N端附有6xHis的6xHis-HCEGF基因片段，將該基因片段插入到Nco I /EcoR I雙酶切過的pENTR?4Dual質粒的Nco I和EcoR I之間，獲得入門載體pENTR?4Dual-6xHis-HCEGF，使6xHis_HCEGF片段位於質粒中的attLl和attL2之間；
[0009](2)所述目的載體的構建方法為:
[0010]提取柞蠶杆狀病毒AnpeNPV DNA，通過DNA同源同組技術在AnpeNPV DNA的核多角體基因啟動子下遊插入由Avr II酶切位點相連的attRl和aatR2序列構建目的載體AnpeNPV,抽提AnpeNPV DNA並通過Avr II酶切線性化；
[0011](3)所述表達載體的構建方法為:
[0012]取所述入門載體pENTR?4Dual-6xHis-HCEGF150ng、目的載體線性化AnpeNPVDNA150ng、5XLR 克隆酶混合物 2 μ 1、ρΗ8.0TB 緩衝液混合至 10 μ 1，25°C溫浴 1-16小時；pENTR?4Dual-6xHis-HCEGFDNA與線性化AnpeNPV DNA在LR克隆酶作用下進行重組，生成表達載體重組柞蠶杆狀病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPV DNA。
[0013](2)所述表達載體接種蓖麻蠶蛹前的處理方法為:
[0014]用所述重組柞蠶杆狀病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPV DNA接種柞蠶宿主AnPe細胞，27°C培養I周后收取上清表達載體病毒液並反覆擴大培養後進行斑點形成法測定感染力PFU和_80°C保存備用。
[0015]進一步地，所述孵育的溫度是27 °C，孵育時間為I周。
[0016]進一步地，所述分離純化首先是對孵育後的蠶蛹進行研磨，然後收集上清液，再進行硫酸銨沉澱和N1-NTA Agrose親和層析分離純化，最終得到功效類似天然產物的的重組人表皮生長因子。
[0017]綜上所述，由於採用了上述技術方案，本發明的有益效果是:
[0018](I)本發明利用蓖麻蠶蛹做生物反應器、重組杆狀病毒做基因表達載體製備重組人表皮生長因子，屬真核細胞基因表達法，具有蛋白質翻譯後修飾過程，表達效率高，表達產物的生物學特性與天然產物相似的優點。
[0019](2)廣西是唯一的蓖麻蠶保種基地，擁有成熟的蓖麻蠶飼養技術和豐富的木薯葉飼料資源，因此，蠶蛹材料來源豐富。蓖麻蠶蛹具有廉價、易儲存，運輸方便、無須飼養或細胞培養、可機械化操作等優點。剩餘繭殼還可加工蠶絲棉等綜合利用，因而，對提升蓖麻蠶的經濟價值，促進廣西的養蠶事業發展具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 圖1:入門載體6xHis_HCEGF結構示意圖。
[0021]圖2:重組柞蠶杆狀病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPV構建示意圖。
[0022]圖3:重組人表皮生長因子的基因與胺基酸序列圖(6xHi s-HCEGF)。
【具體實施方式】
[0023]下面通過以下實施例對本發明作進一步詳述。
[0024]實施例1構建入門載體
[0025]用Nco I /EcoR I雙酶切消化HCEGF/pET_28a質粒(蘇州大學，專利號CN1644691A)，獲得擁有從起始密碼子ATG到終止密碼子TAA結束完整閱讀框架(orf)且N端附帶6xHis的6xHis-HCEGF基因片段，將該基因片段插入到Nco I /EcoR I雙酶切過的pENTR?4Dual質粒(Invitrogen公司)的Nco I和EcoR I之間，獲得入門載體pENTR?4Dual-6xHis-HCEGF，使 6xHis_HCEGF 片段位於質粒中的 attLl 和 attL2 之間。
[0026]實施例2構建目的載體
[0027]提取柞蠶杆狀病毒AnpeNPV DNA，通過DNA同源同組技術在AnpeNPV DNA的核多角體基因啟動子下遊插入由Avr II酶切位點相連的attRl和aatR2序列構建目的載體AnpeNPV,抽提AnpeNPVDNA並通過Avr II酶切線性化。
[0028]實施例3構建表達載體
[0029]取入門載體pENTR?4Dual-6xHis-HCEGF150ng、目的載體線性化 AnpeNPVDNA150ng、5XLR克隆酶混合物2 μ 1、pH8.0TB緩衝液混合至10μ 1，25°C溫浴1-16小時。pENTR?4Dual-6xHis-HCEGFDNA與線性化AnpeNPV DNA在LR克隆酶作用下進行重組，生成表達載體重組柞蠶杆狀病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPV DNA。
[0030]實施例4表達載體接種蓖麻蠶蛹前的處理
[0031]用所述重組柞蠶杆狀病毒6xHiS-HCEGF-AnpeNPVDNA接種柞蠶宿主AnPe細胞，27°C培養I周后收取上清表達載體病毒液並反覆擴大培養後進行斑點形成法測定感染力PFU和_80°C保存備用。
[0032]實施例5表達載體接種蓖麻蠶蛹和樣品調製
[0033]用5 X 15PFU (50 μ I)的6xHis-HCEGF_AnpeNPV病毒液注射接種健康蓖麻蠶蛹，置27°C溫箱孵育。以接種當天為第O天，經檢測，接種後的第6天(即孵育I周后)蠶蛹內重組人表皮生長因子表達量較高(0.2 μ g/g蠶蛹)且蠶蛹無液化，因此，收集接種後第6天的蠶蛹，稱重後按0.5ml/g加入pH6.8的PBS緩衝液和I μ g/g的苯硫脲進行勻眾研磨。1700 Xg離心5min，取上清作為蠶蛹提取液。
[0034]實施例6重組人表皮生長因子的分離純化
[0035](I)去除雜蛋白質:①於蓖麻蠶蛹提取液中緩慢加入硫酸銨，至硫酸銨飽和度為35%。②用lmol/L鹽酸調蠶蛹液pH至4.6左右，41:靜置4~2411，利用等電點沉澱法將目的蛋白與雜蛋白質分開。③4°C 8000rpm, 30min離心，收集沉澱。④將沉澱重溶於0.02mol/L PBS (pH7.4)中，4°C靜置4~24h。⑤透析法除硫酸銨，接著0.45 μ m濾膜過濾。
[0036](2)N1-NTA Agrose親和層析法分離純化重組人表皮生長因子:因設計的重組人表皮生長因子含有6 XHis-標籤，故採用N1-NTAAgrose親和層析法分離純化。①三倍柱體積的結合緩衝液(50mmol/L NaH2PO4, pH8.0,300mmol/L NaCl，1mmoI/L 咪唑)平衡樹脂，放置待用。②調劑好的蓖麻蠶蛹提取液上柱，調整流速為每小時10個柱體。10個柱體積的洗滌緩衝液(50mmol/L NaH2PO4, pH8.0, 300mmol/L NaCI，20mmol/L 咪唑)洗柱。③五個柱體積的洗脫緩衝液(50mmol/L NaH2PO4, pH8.0,300mmol/L NaCI，250mmol/L咪唑)衝洗，收集洗脫液，洗脫液內即為純化的目的蛋白質重組人表皮生長因子。
[0037](3)目的蛋白的鑑定:以正常蓖麻蠶蛹為陰性對照，Western blot分析6xHis-HCEGF-AnpeNPV病毒感染後的蓖麻蠶蛹提取液，結果顯示提取液中出現HCEGF蛋白質特異性免疫反應條帶，而正常蠶蛹中未見有HCEGF特異性免疫反應條帶，說明重組病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPV在蓖麻蠶蛹中成功表達了基因並獲得了 HCEGF蛋白質重組人表皮生長因子。
[0038]實施例7檢測重組人表皮生長因子的生物學活性:
[0039](I)細胞實驗
[0040]①促細胞酶活性:用實施例6分離純化的重組人表皮生長因子培養Balb/c3T3小鼠成纖維細胞作為測試組，對照組採用標準蛋白(購買的重組人表皮生長因子)培養Balb/c3T3小鼠成纖維細胞。用MTT法檢測在0.0625 μ g/L~1.0 μ g/L濃度範圍內促細胞酶活性結果如表1所示，從表中可以看出，本發明實施例6所得的重組人表皮生長因子與對照組的標準蛋白(購買的重組人表皮生長因子)一樣，具有酶促活性，蛋白濃度越高酶促活性越強，呈現劑量依賴性，最高活性濃度為1.0 μ g/L。
[0041]表1本發明實施例5所得重組人表皮生長因子與標準蛋白的
[0042]促細胞酶活性結果
【權利要求】
1.蓖麻蠶蛹做生物反應器製備重組人表皮生長因子的方法，其特徵在於:通過基因工程技術將入門載體pENTR?4Dual-6xHis-HCEGF整合到目的載體線性化AnpeNPV DNA核多角體基因啟動子下遊，獲得表達載體重組柞蠶杆狀病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPV DNA，所述表達載體經處理後接種蓖麻蠶蛹，高效表達HCEGF，經孵育、分離純化製備出功效類似天然產物的的重組人表皮生長因子；其中: (1)所述入門載體的構建方法為: 用Nco I /EcoR I雙酶切消化HCEGF/pET-28a質粒，獲得擁有從起始密碼子ATG到終止密碼子TAA結束的完整閱讀框架(orf )、且N端附有6xHis的6xHis-HCEGF基因片段，將該基因片段插入到Nco I /EcoR I雙酶切過的pENTR?4Dual質粒的Nco I和EcoR I之間，獲得入門載體pENTR?4Dual-6xHis-HCEGF，使6xHis_HCEGF片段位於質粒中的attLl和attL2之間； (2)所述目的載體的構建方法為: 提取柞蠶杆狀病毒AnpeNPV DNA，通過DNA同源同組技術在AnpeNPV DNA的核多角體基因啟動子下遊插入由Avr II酶切位點相連的attRl和aatR2序列構建目的載體AnpeNPV,抽提AnpeNPV DNA並通過Avr II酶切線性化； (3)所述表達載體的構建方法為: 取所述入門載體pENTR?4Dual-6xHis-HCEGF150ng、目的載體線性化AnpeNPVDNA150ng、5XLR 克隆酶混合物 2 μ 1、ρΗ8.0TB 緩衝液混合至 10 μ 1，25°C溫浴 1-16 小時；pENTR?4Dual-6xHis-HCEGFDNA與線性化AnpeNPV DNA在LR克隆酶作用下進行重組，生成表達載體重組柞蠶杆狀病毒6xHi S-HCEGF-AnpeNPVDNA ； (4)所述表達載體接種蓖麻蠶蛹前的處理方法為:用所述表達載體重組柞蠶杆狀病毒6xHis-HCEGF-AnpeNPV DNA接種柞蠶宿主AnPe細胞，27°C培養I周后收取上清表達載體病毒液並反覆擴大培養後進行斑點形成法測定感染力PFU和-80°C保存備用。
2.根據權利要求1所述的蓖麻蠶蛹做生物反應器製備重組人表皮生長因子的方法，其特徵在於:所述孵育的溫度是27°C，孵育時間為I周。
3.根據權利要求2所述的蓖麻蠶蛹做生物反應器製備重組人表皮生長因子的方法，其特徵在於:所述分離純化首先是對孵育後的蠶蛹進行研磨，然後收集上清液，再進行硫酸銨沉澱和N1-NTA Agrose親和層析分離純化,最終得到功效類似天然產物的的重組人表皮生長因子。
【文檔編號】C07K1/22GK104073518SQ201410160406
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年4月21日 優先權日:2014年4月21日
【發明者】黃元姣, 小林淳, 伍玉婷 申請人:廣西醫科大學