用於骨關節修復的帶魚活性提取物的製作方法
2024-03-30 14:41:05 1
本發明涉及保健品技術領域，具體是一種用於骨關節修復的帶魚活性提取物。
背景技術：
多肽從二十世紀初才開始受到關注，研究發現它區別於蛋白質區別於胺基酸，具有藥物的作用。到了上個世紀九十年代才有了長足發展，在不斷更新的技術指導下，多肽的應用範圍越來越廣，作用也越來越大，這才邁進了我們的生活，在我們生活中佔據的份額越來越大，多肽類藥物高效低毒特異性強具有區別於其他藥物的特有優勢，正不斷影響著我們的生活。而且多肽潛力巨大，是生物科學發展的又一大突破和發展方向。
天然存在的海洋活性多肽由於在生物體中含量低，而且提取困難，難以實現大量生產供給所需，化學人工合成多肽成本昂貴。所以，人們更多地把目光投向開發蛋白酶解產物獲得活性多肽這條途徑上來。由於海洋生物生存的環境與陸地生物完全不同，如高壓、低溫、高溫和高鹽等極端環境，為了適應這些極端的海洋生物環境，海洋生物蛋白質無論胺基酸的組成還是胺基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，同時，海洋生物蛋白資源無論在種類和數量上都遠遠大於陸地蛋白資源，並且未得到很好的開發。種類繁多的海洋蛋白胺基酸序列中，潛在著許多具有生物活性的胺基酸序列，用特異的蛋白酶水解，就釋放出有活性的肽段。海洋生物蛋白資源是21世紀人類重要的蛋白類食物及生物活性物質的重要來源。我國目前的海洋生物蛋白資源總量在世界各國名列前茅，但我國目前的蛋白類水產品中，除一部分直接食用外，大部分通過簡單的加工技術製成食品進入市場，加工技術落後，產品結構單一，產品的附加值低，使得產品在國際市場上的競爭力較差。因此，我國急需對海洋生物蛋白資源進行優化利用和高值化加工。
現有技術如授權公告號為cn103333940b的中國發明專利，公開了一種利用帶魚製備二肽基肽酶iv抑制肽的方法，步驟包括：將帶魚加水絞碎成均勻的魚肉漿；魚肉漿放入酶解罐中，添加內切蛋白酶，攪拌水解4～12h，得水解液；升溫至95～100℃，保持10～15分鐘滅酶；將水解液冷至40～60℃，添加外切蛋白酶，攪拌水解2～8h；升溫至95～100℃，保持10～15分鐘滅酶；內切蛋白酶為木瓜蛋白酶、neutrase中性蛋白酶、alcalase鹼性蛋白酶中的一種。外切蛋白酶為flavourzyme風味蛋白酶。將上述所得滅酶後的水解液離心取上清液；將上清液加入到超濾膜分離器中，調節超濾膜的壓力為0.05～0.1mpa，超濾膜的截留分子量為3000da，收集超濾膜透過液；採用親和層析方法分離純化dpp-iv抑制肽。海洋生物蛋白質無論胺基酸的組成還是胺基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，上述方法採用陸地上提取的蛋白酶對海洋生物進行酶解，酶解效率低。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種能有效消除關節腫痛，促進關節滑液的生成，加速軟組織的重建和恢復的用於骨關節修復的帶魚活性提取物。
本發明針對背景技術中提到的問題，採取的技術方案為：用於骨關節修復的帶魚活性提取物，其由複合酶酶解、多級膜過濾、納濾、hplc洗脫和冷凍乾燥製備得到，上述複合酶酶解步驟為採用海洋芽孢桿菌產鹼性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶酶解帶魚魚肉勻漿液，並採用超聲波輔助酶解。海洋生物蛋白質無論胺基酸的組成還是胺基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，海洋芽孢桿菌產鹼性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶同時對帶魚蛋白進行酶解，可得到大量有活性的肽段。
作為優選，冷凍乾燥步驟為：預凍：-35~-45℃預凍3~5h；冷凍乾燥：-45~-35℃，3~5pa冷凍乾燥5~7h，-10~-5℃，10~20pa冷凍乾燥2~3h；升華乾燥：10~15℃，50~60pa升華乾燥3~4h；解析乾燥:7~14℃，3~5pa解析乾燥2~4h，得到用於骨關節修復的帶魚活性提取物。凍幹整個過程都在程序的控制下，操作簡單，工序簡潔，自動化程度高，減少了人力、物力。低溫下乾燥能更好地保留活性肽的活性；低壓下乾燥，活性肽不易氧化，療效更好；凍結時活性肽形成「骨架」，乾燥後保存原形，為多孔疏鬆結構且顏色基本不變，產品外觀更加優良；復水性好，凍幹活性肽能迅速吸水還原成凍幹前狀態，使用方便；脫水徹底，活性肽中含水量低，一般在1%-3%，且有利於長途運輸和長期保存。
作為優選，冷凍乾燥前加入30~40wt%輔料，輔料的成分及其重量份為：80~90份右旋糖酐-40和2~5份活性肽。上述輔料利於產品成型，即防止在抽真空時藥物與水蒸氣一起飛散或成形時收縮，並且可保護活性肽。
作為優選，活性肽的胺基酸序列為hshacasyycskhshacktacakfcgtascthylsylcrvlhpgklcacvncsr。上述活性肽通過氫鍵與具有骨關節修復的活性肽連接，能以極少量的量就能很好的保護功能性肽，使其免於儲藏過程中氧氣及其他因素對其結構的破壞。
作為優選，複合酶酶解步驟中海洋芽孢桿菌產鹼性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶的加入量為1~2wt%，酶解溫度為25~35℃，ph為7.0~9.0，酶解時間為40~60min。上述條件下，蛋白酶的加入量少且酶解效率高。
作為優選，多級膜過濾步驟為先將濾液用0.2~0.4µm微濾膜過濾，濾液再分別通過截留分子量14-18kda、6-8kda的超濾膜，濃縮濾液。通過物理方式對濾液進行純化處理，操作簡單，不會破壞功能肽的活性，得到的超濾液中對骨關節有修復作用的功能肽的含量高。
作為優選，hplc洗脫步驟中洗脫步驟為0~5min，用1~3%三氟乙酸和98~99%乙腈洗脫，流速為0.8~1.5ml/min；5~15min，用5~7%三氟乙酸和93~95%乙腈洗脫，流速為0.8~1.5ml/min；15~30min，用8~12%三氟乙酸和88~92%乙腈洗脫，流速為0.8~1.5ml/min。根據功能肽的極性設計洗脫液組分及洗脫操作，將對骨關節有修復作用的功能肽與其他物質分離開來，對產品進行進一步純化。
作為優選，hplc洗脫步驟中洗脫結束後收集在250nm有吸收的洗脫物，合併並濃縮。對骨關節修復作用優異的功能肽在250nm處有較強吸收。上述操作得到的帶魚活性提取物能促進軟骨細胞的生成，能大量催生和補充關節滑液，潤滑關節軟骨面，減少磨損，增加關節部位的靈活度；能有效促進膠原基質的生成，刺激結締組織細胞再生，進而加速軟組織的重建和恢復；具有抑制微血管衍生的因子，還可增加抗體的產生，提高免疫能力，具有消炎和止痛的功效，可以減輕疼痛，改善運動能力；可以抑制軟骨降解酶的活性，從而起到預防和治療關節退行性變的作用；分子量小，人體對帶魚活性提取物的吸收利用率高，可有效增加骨密度，延緩骨質疏鬆。
與現有技術相比，本發明的優點在於：得到的帶魚活性提取物能促進軟骨細胞的生成，能大量催生和補充關節滑液，潤滑關節軟骨面，減少磨損，增加關節部位的靈活度；能有效促進膠原基質的生成，刺激結締組織細胞再生，進而加速軟組織的重建和恢復；具有抑制微血管衍生的因子，還可增加抗體的產生，提高免疫能力，具有消炎和止痛的功效，可以減輕疼痛，改善運動能力；可以抑制軟骨降解酶的活性，從而起到預防和治療關節退行性變的作用；分子量小，人體對帶魚活性提取物的吸收利用率高，可有效增加骨密度，延緩骨質疏鬆。
具體實施例
下面通過實施例對本發明方案作進一步說明：
實施例1：
用於骨關節修復的帶魚活性提取物，其由複合酶酶解、多級膜過濾、納濾、hplc洗脫和冷凍乾燥製備得到，上述複合酶酶解步驟為採用海洋芽孢桿菌產鹼性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶酶解帶魚魚肉勻漿液，並採用超聲波輔助酶解。海洋生物蛋白質無論胺基酸的組成還是胺基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，海洋芽孢桿菌產鹼性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶同時對帶魚蛋白進行酶解，可得到大量有活性的肽段。
冷凍乾燥步驟為：預凍：-40℃預凍5h；冷凍乾燥：-40℃，4pa冷凍乾燥6h，-7℃，16pa冷凍乾燥2.6h；升華乾燥：13℃，57pa升華乾燥3h；解析乾燥:10℃，4pa解析乾燥3h，得到用於骨關節修復的帶魚活性提取物。凍幹整個過程都在程序的控制下，操作簡單，工序簡潔，自動化程度高，減少了人力、物力。低溫下乾燥能更好地保留活性肽的活性；低壓下乾燥，活性肽不易氧化，療效更好；凍結時活性肽形成「骨架」，乾燥後保存原形，為多孔疏鬆結構且顏色基本不變，產品外觀更加優良；復水性好，凍幹活性肽能迅速吸水還原成凍幹前狀態，使用方便；脫水徹底，活性肽中含水量低，且有利於長途運輸和長期保存。
冷凍乾燥前加入36wt%輔料，輔料的成分及其重量份為：87份右旋糖酐-40和3份活性肽。上述輔料利於產品成型，即防止在抽真空時藥物與水蒸氣一起飛散或成形時收縮，並且可保護活性肽。
活性肽的胺基酸序列為hshacasyycskhshacktacakfcgtascthylsylcrvlhpgklcacvncsr。上述活性肽通過氫鍵與具有骨關節修復的活性肽連接，能以極少量的量就能很好的保護功能性肽，使其免於儲藏過程中氧氣及其他因素對其結構的破壞。
複合酶酶解步驟中海洋芽孢桿菌產鹼性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶的加入量為1.6wt%，酶解溫度為30℃，ph為8.0，酶解時間為50min。上述條件下，蛋白酶的加入量少且酶解效率高。
多級膜過濾步驟為先將濾液用0.3µm微濾膜過濾，濾液再分別通過截留分子量15kda、7kda的超濾膜，濃縮濾液。通過物理方式對濾液進行純化處理，操作簡單，不會破壞功能肽的活性，得到的超濾液中對骨關節有修復作用的功能肽的含量高。
hplc洗脫步驟中洗脫步驟為0~5min，用2%三氟乙酸和98%乙腈洗脫，流速為1ml/min；5~15min，用6%三氟乙酸和94%乙腈洗脫，流速為1ml/min；15~30min，用10%三氟乙酸和90%乙腈洗脫，流速為1ml/min。根據功能肽的極性設計洗脫液組分及洗脫操作，將對骨關節有修復作用的功能肽與其他物質分離開來，對產品進行進一步純化。
hplc洗脫步驟中洗脫結束後收集在250nm有吸收的洗脫物，合併並濃縮。對骨關節修復作用優異的功能肽在250nm處有較強吸收。
實施例2：
用於骨關節修復的帶魚活性提取物，其由複合酶酶解、多級膜過濾、納濾、hplc洗脫和冷凍乾燥製備得到，上述複合酶酶解步驟為採用海洋芽孢桿菌產鹼性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶酶解帶魚魚肉勻漿液，並採用超聲波輔助酶解。海洋生物蛋白質無論胺基酸的組成還是胺基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，海洋芽孢桿菌產鹼性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶同時對帶魚蛋白進行酶解，可得到大量有活性的肽段。
冷凍乾燥步驟為：預凍：-40℃預凍5h；冷凍乾燥：-40℃，3pa冷凍乾燥5h，-5℃，12pa冷凍乾燥2h；升華乾燥：13℃，52pa升華乾燥3.4h；解析乾燥:10℃，4pa解析乾燥3h，得到用於骨關節修復的帶魚活性提取物。凍幹整個過程都在程序的控制下，操作簡單，工序簡潔，自動化程度高，減少了人力、物力。低溫下乾燥能更好地保留活性肽的活性；低壓下乾燥，活性肽不易氧化，療效更好；凍結時活性肽形成「骨架」，乾燥後保存原形，為多孔疏鬆結構且顏色基本不變，產品外觀更加優良；復水性好，凍幹活性肽能迅速吸水還原成凍幹前狀態，使用方便；脫水徹底，活性肽中含水量低，且有利於長途運輸和長期保存。
冷凍乾燥前加入34wt%輔料，輔料的成分及其重量份為：85份右旋糖酐-40和3份活性肽。上述輔料利於產品成型，即防止在抽真空時藥物與水蒸氣一起飛散或成形時收縮，並且可保護活性肽。
活性肽的胺基酸序列為hshacasyycskhshacktacakfcgtascthylsylcrvlhpgklcacvncsr。上述活性肽通過氫鍵與具有骨關節修復的活性肽連接，能以極少量的量就能很好的保護功能性肽，使其免於儲藏過程中氧氣及其他因素對其結構的破壞。
複合酶酶解步驟中海洋芽孢桿菌產鹼性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶的加入量為1.5wt%，酶解溫度為30℃，ph為8.0，酶解時間為44min。上述條件下，蛋白酶的加入量少且酶解效率高。
多級膜過濾步驟為先將濾液用0.3µm微濾膜過濾，濾液再分別通過截留分子量16kda、7kda的超濾膜，濃縮濾液。通過物理方式對濾液進行純化處理，操作簡單，不會破壞功能肽的活性，得到的超濾液中對骨關節有修復作用的功能肽的含量高。
hplc洗脫步驟中洗脫步驟為0~5min，用2%三氟乙酸和98%乙腈洗脫，流速為1ml/min；5~15min，用6%三氟乙酸和94%乙腈洗脫，流速為1ml/min；15~30min，用10%三氟乙酸和90%乙腈洗脫，流速為1ml/min。根據功能肽的極性設計洗脫液組分及洗脫操作，將對骨關節有修復作用的功能肽與其他物質分離開來，對產品進行進一步純化。
hplc洗脫步驟中洗脫結束後收集在250nm有吸收的洗脫物，合併並濃縮。對骨關節修復作用優異的功能肽在250nm處有較強吸收。
實施例3：
用於骨關節修復的帶魚活性提取物，其由複合酶酶解、多級膜過濾、納濾、hplc洗脫和冷凍乾燥製備得到，具體製備步驟為：
1）複合酶酶解：採用海洋芽孢桿菌產鹼性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶酶解帶魚魚肉勻漿液，並採用超聲波輔助酶解。海洋芽孢桿菌產鹼性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶的加入量為1.4wt%，酶解溫度為30℃，ph為8.0，酶解時間為44min，超聲波頻率為25khz。酶解結束後沸水浴滅酶3min。海洋生物蛋白質無論胺基酸的組成還是胺基酸的序列都與陸地生物蛋白有很大的不同，海洋芽孢桿菌產鹼性蛋白酶和條斑紫菜蛋白酶同時對帶魚蛋白進行酶解，可得到大量有活性的肽段；
2）多級膜過濾：先將濾液用0.3µm微濾膜過濾，濾液再分別通過截留分子量16kda、7kda的超濾膜，濃縮濾液至原來體積的1/20。通過物理方式對濾液進行純化處理，操作簡單，不會破壞功能肽的活性，得到的超濾液中對骨關節有修復作用的功能肽的含量高；
3）納濾：將步驟2得到的濃縮液進行納濾操作，納濾膜的分離機理為篩分和溶解擴散並存，同時又具有電荷排斥效應，可以有效地去除二價和多價離子、去除分子量大於200的各類物質，可部分去除單價離子和分子量低於200的物質，能很好的達到去鹽和分子量大於200的雜質的目的；
4）hplc洗脫：hplc洗脫步驟中洗脫步驟為0~5min，用2%三氟乙酸和98%乙腈洗脫，流速為1ml/min；5~15min，用6%三氟乙酸和94%乙腈洗脫，流速為1ml/min；15~30min，用10%三氟乙酸和90%乙腈洗脫，流速為1ml/min。洗脫結束後收集在250nm有吸收的洗脫物，合併並濃縮至原來體積的1/30；
5）冷凍乾燥：在步驟4得到的濃縮液中加入35wt%輔料進行冷凍乾燥。輔料的成分及其重量份：86份右旋糖酐-40和3份活性肽。活性肽的胺基酸序列為hshacasyycskhshacktacakfcgtascthylsylcrvlhpgklcacvncsr。預凍：-40℃預凍5h；冷凍乾燥：-40℃，3pa冷凍乾燥5h，-5℃，12pa冷凍乾燥2h；升華乾燥：13℃，52pa升華乾燥3.4h；解析乾燥:10℃，4pa解析乾燥3h，得到用於骨關節修復的帶魚活性提取物。
本發明的操作步驟中的常規操作為本領域技術人員所熟知，在此不進行贅述。
以上所述的實施例對本發明的技術方案進行了詳細說明，應理解的是以上所述僅為本發明的具體實施例，並不用於限制本發明，凡在本發明的原則範圍內所做的任何修改、補充或類似方式替代等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
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用於骨關節修復的帶魚活性提取物
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