一株微生物菌株及其應用的製作方法
2024-04-04 06:15:05
專利名稱：一株微生物菌株及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株微生物菌株及其應用，具體涉及ー種能夠兼產澱粉酶和蛋白酶的
菸草煙喊降解菌-菸草節桿菌(Arthrobacter nicotianae GYC103) CCTCC NO M2010312
及其在菸草中的應用，屬於微生物應用技術領域。
背景技術：
菸鹼又名尼古丁(Nicotine)，是菸草生物鹼中的主要成分。烤菸中菸鹼的含量一般在I. 5% 3. 5%,以2. 5%左右為宜。菸鹼含量過低，勁頭太小，菸鹼含量過高，勁頭太大，會引起刺嗆辛辣感。近年來我國部分地區菸葉外觀質量接近國際水平，但菸葉化學成分不太協調，菸鹼偏高，尤其是上部菸葉。降低菸草中的菸鹼含量，目前主要有三條途徑(1)從農業種植的角度進行調控主要從遺傳、生態和栽培等方面來進行控制。(2)從化學的角度菸葉中的生物鹼可通過用熱水漂洗、有機溶劑萃取、氣體抽提和蒸汽蒸餾等處理菸葉的方法將菸葉中的菸鹼脫棹。(3)從微生物和酶的角度從菸葉、煙籽和土壌中分離能夠降解菸鹼的微生物，培養後直接或者分離出酶系後作用於菸葉，降低菸葉中的菸鹼含量，從而提高菸葉的可用性。對於已經成熟採收了的菸葉，就只能採用第2和3種方法。其中，使用溶劑抽提等化學方法雖然可以去除一部分菸鹼，但同時會引起菸草中的一些致香成分的損失和外觀色澤的顯著變化，從而在一定程度上降低了處理菸葉的可用性。而通過微生物或酶來處理菸葉，由於酶具有專ー性，因此可以較好地避免這些問題。利用生物製劑處理菸葉可以縮短發酵時間，調控菸葉有害成分如菸鹼和TSNA等，促進大分子的物質如蛋白質和澱粉等的轉化，增進菸葉香氣。在微生物降解菸鹼方面，C. Enders等早在1947年就對酵母降解菸鹼進行了研究，以後逐漸成為人們關注的課題。國外一些大的菸草企業如菲利普莫瑞斯菸草公司、英美菸草公司等很早就利用微生物對菸草中的菸鹼進行降解，以此來滿足一部分消費群體對低尼古丁香菸的需求。目前已報導的能夠降解菸鹼的微生物主要包括2大類酵母和細菌，國外報導如Denaryomyces nicotianae, Micrococusnicotianae, Pseudomonas, Alcaligenes paradoxus, Arthrobacterglobif ormils, Enterobacter cloacae， Cunninghameila echinulata,Nicotianae plumbaginif olia, Arthrobacter oxidans 等。已報導的煙喊降解途徑有三條(I)批咯燒途徑(pyrrolidine pathway) ； (2)批P定途徑(pyridine pathway) ； (3)脫甲基途徑(Me pathway)。國內孫君社等(2002)從菸葉倉庫或露天煙垛周圍的土壤中分離出降解菸草菸鹼的菸草假單胞菌(Pseudomonas nicotianae),但只提出對降解菸鹼有作用。菸葉中除了菸鹼外，還有大量的澱粉和蛋白質。以澱粉形式存在的糖類在煙支燃吸時會影響燃燒速度和燃燒完全性，其燃燒時產生糊焦氣味，會使菸草香味變壞。蛋白質則是構成細胞的基本材料，它的水解產物和進ー步轉化的產物是許多菸草香氣物質的原始物質，但蛋白質含量高燃吸時會產生ー種如同燃燒羽毛的蛋白質臭味，降低菸葉的燃燒性，而且是煙氣中有害物質的前體，包括奎琳、HCN、和其他含氮化合物，嚴重影響菸葉的香味品質和安全性。若能篩選獲得一株既能降解菸鹼，又能降解菸葉澱粉和蛋白質的微生物，對利用生物技術改善我國菸葉尤其是上部煙質量，提高菸葉可用性具有重要的作用。
發明內容
本發明的主要目的在於提供一種能夠降解菸鹼同時產澱粉酶和蛋白酶的微生物菌株即菸草節桿菌 Arthrobacter nicotianae GYC103 (保藏號為 CCTCC NO M2010312)及其相應的產酶培養基和培養條件並公開ー種利用微生物降解菸草中的菸鹼、蛋白質和澱粉提高菸葉可用性的方法。本發明通過如下方案實現一種微生物菌株，其特徵在於它為菸草節桿菌Arthrobacter nicotianaeGYC103，保藏號為CCTCC NO M2010312 ;革蘭氏陽性，厭氧陰性，接觸酶陽性，氧化酶陰性，明膠液化陰性，硝酸鹽還原陽性，檸檬酸鹽陽性，脲酶陰性，丙ニ酸鹽陰性，V-P陰性，耐鹽性陽性；葡萄糖陰性，甘露醇陰性，乳糖陰性，蔗糖陰性，麥芽糖陰性，木糖陰性，核糖陰性；在培養基上生長時可見表面光滑不透明、邊緣整齊的黃色菌落，最適生長溫度為25-30°C。所述菌株通過如下途徑獲得首先從土壤或者菸葉中分離出降解菸草菸鹼的微生物菌株；其次將獲得的微生物菌株用牛奶選擇培養基進行篩選，獲得可以產生蛋白酶的菌株;然後將得到的菌株用澱粉選擇培養基篩選能夠產生澱粉酶的菌株，獲得可以同時降解蛋白質和澱粉的菸鹼降解菌，即菸草節桿菌Arthrobacter nicotianae GYC103。所述菌株的培養步驟為A、斜面培養蛋白腖10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH7. 0，
將冷凍保存的甘油懸液接種到斜面培養基上，30°C恆溫培養2天；B、搖瓶培養菸鹼2g，蛋白腖5g，酵母膏5g，氯化鈉5g，K2HPO4 · 3H2013. 3g,KH2P044g, MgSO4 · 7Η200· 2g，0. 5ml微量元素，加蒸餾水1000ml，調pH值為7. 0，高壓蒸汽滅菌；搖瓶裝液量為10 30v/v%，接種量為2 10 v/v%,培養溫度為20 40°C，搖床轉速為100 200rpm，搖瓶培養I 3天，菸鹼降解率達到85 100%，蛋白酶活力達到18 60U/ml，澱粉酶活達到10 40U/ml。所述微量元素為CaCl20.04g, CuSO4O. 07g, MnSO4 · H2OO. 008g, FeSO4 · 7Η200· 004g,Na2MoO4 · 2Η200· lg，加 0. Imol ·じ1 的 HCl 溶解定容 100ml。所述微生物菌株可以降解菸草菸鹼，在生長過程中可以產生澱粉酶和蛋白酶。所述菸草節桿菌Arthrobacter nicotianae GYC103用於降解菸草中的菸鹼、澱粉和蛋白質；所說的用於降解菸草中的菸鹼、澱粉和蛋白質，通過如下步驟獲得A、將權利要求I所述的菸草節桿菌Arthrobacter nicotianae GYC103進行發酵培養，獲得發酵液及菌體；B、將步驟a所得的發酵液或菌體用水、生理鹽水或者緩衝液進行稀釋，稀釋後菌液濃度達到IO6 IO12個菌/ml，將菌液按照菸葉重量的I 5%，加入到含水量為10 50%的菸草中進行發酵，發酵溫度為10 50°C，發酵時間大於4小吋。其中步驟A中所說的發酵液為巴比妥緩衝液、鄰苯ニ甲酸鹽緩衝液、氨-氯化銨緩衝液、硼砂-氯化鈣緩衝液、醋酸-醋酸鈉緩衝液、醋酸-醋酸銨緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液或磷酸鹽緩衝液中的任意ー種。培養後的發酵液經稀釋後菌液濃度達到IO9個/ml，將菌液按照菸葉重量的I 5%，加入到含水量為10 50%的菸草中，發酵6 72小時，可使菸葉菸鹼、蛋白質及澱粉含量降低，刺激性明顯減少，煙氣柔和，煙香增加，菸葉可用性明顯提高。所述菸草節桿菌Arthrobacter nicotianae GYC103,已於 2010 年 11 月 24 日保藏在中國典型培養物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏編號為CCTCC NO M2010312o保藏地址湖北省武漢市武昌珞珈山，郵政編碼430072。與現有技術相比，本發明的有益效果為採用本發明來改善菸葉原料尤其是上部菸葉的品質，エ藝過程簡單，反應條件溫和；經過處理後，菸葉菸鹼、蛋白質及澱粉含量降低，刺激性明顯減少，煙氣柔和，煙香增加，菸葉可用性明顯提高。該方法具有簡單實用，成本低廉等特點，可望在エ業上推廣應用。說明書附圖
為便於理解本發明菸草節桿菌分子生物學特徵，特結合附圖做進ー步說明。圖I為菸草節桿菌的16SrDNA序列圖。
具體實施例方式下面將通過實施例對本發明作進ー步的闡述，其目的是為更好理解本發明的內容。因此，所舉之例並不限制本發明的保護範圍。實施例I斜面培養蛋白腖10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH7. 0，將
冷凍保存的甘油懸液接種到斜面培養基上，30°C恆溫培養2天。搖瓶培養菸鹼lg，蛋白腖5g，酵母膏5g，氯化鈉5g，K2HPO4 *3H2013. 3g，KH2P044g，MgSO4 7H200. 2g，0. 5ml微量元素，加蒸餾水1000ml，調pH值為7. 0，高壓蒸汽滅菌。250ml搖瓶裝液量為30ml，接種量為3v/v%，培養溫度為30°C，搖床轉速為200rpm，搖瓶培養36小時，菸鹼降解率達到100%,蛋白酶活力達到28U/ml,澱粉酶活達到36U/ml。微量元素CaCl2O. 04g, CuSO4O. 07g, MnSO4 H2OO. 008g, FeSO4 7H200. 004g, Na2MoO4 2H200. lg,加
0.Imol じ1的HCl溶解定容IOOml0澱粉酶酶活力(U)定義在45°C、pH7.0條件下，每10分鐘內水解Img澱粉所需的酶量。蛋白酶酶活力(U)定義在37で、？117.0條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1118酪氨酸所需的酶量。實施例2斜面培養與實施例I相同。在250ml搖瓶裝入30ml培養基，其組成如下菸鹼2g，玉米漿 15g，酵母膏 5g，氯化鈉 5g，K2HPO4 3H2013. 3g，KH2P044g，MgSO4 7H200. 2g，0. 5ml微量元素，加蒸餾水1000ml，調pH值為7. 0，高壓蒸汽滅菌。250ml搖瓶裝液量為30ml，接 種量為2v/v%，培養溫度為30°C，搖床轉速為200rpm，搖瓶培養48小時，菸鹼降解率達到100%,蛋白酶活力達到54U/ml,澱粉酶活達到28U/ml。微量元素與實施例I相同。澱粉酶酶活力和蛋白酶酶活力的定義與實施例I相同。實施例3
取實施例I中的發酵液10ml，用無菌蒸餾水稀釋至IO9個菌/ml，將菌液按照菸葉重量的I %，噴施到含水量為18%的2008年邵陽上部菸葉B2F中，在35で、相対溼度75%的條件下發酵10小時，可使菸葉菸鹼含量下降2. 9 %、蛋白質含量下降5. 6%，澱粉含量降低10. 8%，菸葉刺激性明顯減少，雜氣減少，煙氣柔和，煙香增加。實施例4取實施例I中的發酵液10ml，用無菌蒸餾水稀釋至IO9個菌/ml，將菌液按照菸葉重量的I %，噴施到含水量為18%的2008年邵陽上部菸葉B2F中，在35で、相対溼度75%的條件下發酵36小時，可使菸葉菸鹼含量下降9. I %、蛋白質含量下降12. 2%，澱粉含量降低13. 6 %，菸葉刺激性明顯減少，雜氣減少，煙氣柔和，煙香增加。 實施例5取實施例I中的發酵液10ml，用無菌蒸餾水稀釋至IO9個菌/ml，將菌液按照菸葉重量的I %，噴施到含水量為18%的2008年邵陽上部菸葉B2F中，在35で、相対溼度75%的條件下發酵48小時，可使菸葉菸鹼含量下降12%、蛋白質含量下降18. 5%，澱粉含量降低28. 8%，菸葉刺激性明顯減少，雜氣減少，煙氣柔和，煙香增加。實施例6取實施例I中的發酵液10ml，用無菌蒸餾水稀釋至IO9個菌/ml，將菌液按照菸葉重量的2%，噴施到含水量為20%的2008年邵陽上部菸葉B2F中，在35で、相対溼度75%的條件下發酵36小時，可使菸葉菸鹼含量下降11.2%、蛋白質含量下降21.6%，澱粉含量降低31. 3%，菸葉刺激性明顯減少，雜氣減少，煙氣柔和，煙香增加。實施例I取實施例I中的發酵液10ml，用無菌蒸餾水稀釋至IO9個菌/ml，將菌液按照菸葉重量的2%，噴施到含水量為20%的2008年邵陽上部菸葉B2F中，在35で、相対溼度75%的條件下發酵48小時，可使菸葉菸鹼含量下降18.8%、蛋白質含量下降25.3%，澱粉含量降低35. 2%，菸葉刺激性明顯減少，雜氣減少，煙氣柔和，煙香增加。
權利要求
1.微生物菌株,其特徵在於它為菸草節桿菌Arthrobacternicotianae GYC103,保藏號為 CCTCC NO M2010312o
2.如權利要求I所述的微生物菌株，其特徵在於所述菌株為革蘭氏陽性，厭氧陰性，接觸酶陽性，氧化酶陰性，明膠液化陰性，硝酸鹽還原陽性，檸檬酸鹽陽性，脲酶陰性，丙ニ酸鹽陰性，V-P陰性，耐鹽性陽性；葡萄糖陰性，甘露醇陰性，乳糖陰性，蔗糖陰性，麥芽糖陰性，木糖陰性，核糖陰性；在培養基上生長時可見表面光滑不透明、邊緣整齊的黃色菌落，最適生長溫度為25-30°C。
3.如權利要求I所述的微生物菌株，其特徵在於所述菌株通過如下途徑獲得 首先從土壤或者菸葉中分離出降解菸草菸鹼的微生物菌株； 其次將獲得的微生物菌株用牛奶選擇培養基進行篩選，獲得可以產生蛋白酶的菌株； 然後將得到的菌株用澱粉選擇培養基篩選能夠產生澱粉酶的菌株，獲得可以同時降解蛋白質和澱粉的煙喊降解菌，即菸草節桿菌Arthrobacter nicotianae GYC103。
4.如權利要求I至3任一所述的微生物菌株，其特徵在於所述菌株的培養步驟為 A、斜面培養蛋白腖10g，酵母膏5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，蒸餾水1000ml，pH7.O，將冷凍保存的甘油懸液接種到斜面培養基上，30°C恆溫培養2天； B、搖瓶培養菸鹼2g，蛋白腖5g，酵母膏5g，氯化鈉5g，K2HPO4· 3Η2013· 3g，KH2P044g,MgSO4 ·7Η200. 2g，0. 5ml微量元素，加蒸餾水1000ml，調pH值為7. 0，高壓蒸汽滅菌；搖瓶裝液量為10 30v/v%，接種量為2 10v/v%，培養溫度為20 40°C，搖床轉速為100 200rpm,搖瓶培養I 3天，菸鹼降解率達到85 100%，蛋白酶活力達到18 60U/ml，澱粉酶活達到10 40U/ml。
5.如權利要求4所述的微生物菌株，其特徵在於所述微量元素為CaCl20.04g，CuSO4O. 07g, MnSO4 · H2OO. 008g, FeSO4 · 7Η200· 004g, Na2MoO4 · 2Η200· Ig,加 O. Imol ·じ1 的HCl溶解定容100ml。
6.如權利要求I至3任一所述的微生物菌株，其特徵在於它可以降解菸草菸鹼，在生長過程中可以產生澱粉酶和蛋白酶。
7.—株微生物菌株的應用，其特徵在於，所說菸草節桿菌ArthrobacternicOtianaeGYC103用於降解菸草中的菸鹼、澱粉和蛋白質；所說的用於降解菸草中的菸鹼、澱粉和蛋白質，通過如下步驟獲得A、將權利要求I所述的菸草節桿菌Arthrobacternicotianae GYC103進行發酵培養，獲得發酵液及菌體； B、將步驟a所得的發酵液或菌體用水、生理鹽水或者緩衝液進行稀釋，稀釋後菌液濃度達到IO6 IO12個菌/ml，將菌液按照菸葉重量的I 5%，加入到含水量為10 50%的菸草中進行發酵，發酵溫度為10 50°C，發酵時間大於4小吋。
8.如權利要求6所述的微生物菌株的應用，其特徵在於，其中步驟A中所說的發酵液為巴比妥緩衝液、鄰苯ニ甲酸鹽緩衝液、氨-氯化銨緩衝液、硼砂-氯化鈣緩衝液、醋酸-醋酸鈉緩衝液、醋酸-醋酸銨緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液或磷酸鹽緩衝液中的任意ー種。
全文摘要
本發明公開了一株微生物菌株及其應用，具體涉及一種能夠兼產澱粉酶和蛋白酶的菸草菸鹼降解菌——菸草節桿菌(Arthrobacter nicotianae GYC103)CCTCC NOM2010312及其在菸草中的應用。本發明所說的菌株在生長過程中可以分解利用菸鹼並產生澱粉酶和蛋白酶。將該菌株的發酵液或菌體按照菸葉重量的1～5％，加入到含水量為10～50％的菸草中，發酵6～72小時可以使菸葉的菸鹼含量降低2～20％，澱粉含量降低10～35％，蛋白質含量降低5～25％，菸葉刺激性明顯減少，雜氣減少，煙氣柔和，煙香增加，感官質量明顯改善。本發明通過使用微生物來實現降解菸草菸鹼、澱粉和蛋白質的目的，可以適當調整菸葉原料的菸鹼、澱粉和蛋白質的含量大小，提高菸葉的可用性。
文檔編號C12N1/20GK102643772SQ20121014242
公開日2012年8月22日 申請日期2012年5月10日 優先權日2012年5月10日
發明者張紀利, 白森, 胡亞傑, 蔡聯合, 鄒克興, 金亞波, 韋建玉, 黃泰松, 龍章德 申請人:廣西中煙工業有限責任公司