一種研究藥物和血清蛋白之間相互作用的方法及其專用的微流控晶片的製作方法

2024-04-03 05:17:05 1

專利名稱：一種研究藥物和血清蛋白之間相互作用的方法及其專用的微流控晶片的製作方法
技術領域：
本發明涉及藥物篩選技術，特別提供了一種研究藥物和血清蛋白之間 相互作用的方法及其專用的微流控晶片。
背景技術：
進入血液裡的藥物，大多數會同血清蛋白發生可逆的結合反應。這一 結合反應極大地影響了藥物在體內的輸送、分布、新陳代謝、排洩等性質。 更為重要的是，這一反應直接決定了該藥物的治療效果，因為只有游離的 藥物才能發揮藥理作用。只有藥物的游離濃度控制在合適的範圍內才能取 得理想的治療效果。如果藥物同血清蛋白的結合比比較高，不但會降低藥 物的有效濃度，抑制藥物的療效，還會延長藥物的半衰期，增強藥物的毒 性。相反，如果藥物同血清蛋白的結合比比較低，則限制了藥物進入受體 部位的能力，也不能取得良好的藥理作用。因而研究藥物和血清蛋白的結 合反應，掌握它們的結合程度，可以篩選出具有不利結合性質的藥物。 目前，研究藥物和蛋白質相互作用的方法比較多，主要有以下幾種。1、文獻1 J. P. Life Sci. 1988,43,2103-2115,平衡透析法。此方法是將藥 物與血清蛋白質的混合物，放入只能透過藥物等小分子，而蛋白等大分子不能透過的透析袋裡。然後將此透析袋浸入在一個已知體積的、藥物濃度 (1/K左右，結合常數)的溶液裡。平衡一段時間後，通過測定透析袋外溶液中藥物的濃度來確定K和n (結合位點數)值。該方法操作簡單，儀器設 備也不複雜，目前被確認為研究藥物和血清蛋白的相互作用的基準方法。 但該方法存在樣品消耗大、平衡時間太長、體積變化、非特異性吸附等缺 點。 一個簡單的實驗通常需要幾天甚至幾周才能完成。2、 文獻2J.Pharm.Sci.l981，70，146-150，超濾方法。超濾也是應用比較 廣泛的用來研究藥物和蛋白質之間相互作用的技術。該技術避免了稀釋影 響和體積變化。但存在著因非特異性吸附和洩露引起的誤差。3、 文獻3J.Chromatogr.B1999，725，113-137，親和色譜法。親和色譜法的 作法是將蛋白質固定在基質上，注入含有藥物的緩衝液之後，進行特異性 或非特異性洗脫。通過分析洗脫曲線，測定藥物和血清蛋白的結合常數。 該方法只能測定結合常數值，不能得到結合位點數值。蛋白的固定限制了 其摺疊能力，降低了蛋白的活性，並且蛋白柱價格昂貴。這種方法所需樣 品量也比較大，分析時間長，通常需要幾個星期甚至幾個月。4、 文獻4Y.S.Ding, X. F. Zhu， Chromatographic 1999， 343-346，毛細 管電泳法。此方法是將蛋白和藥物混和孵育後，進行電泳分離，通過藥物 或者蛋白的峰高或峰面積變化來確定藥物和蛋白是否有結合以及它們的結 合常數和結合位點數。此方法具有較高的分離效率，分析速度快，樣品用 量少以及能夠在生理條件下操作等優點。但該方法的重複性不是很好。

發明內容
本發明的目的在於提供一種高分離效率、快速、高靈敏度、樣品用量 少、可在生理條件下操作的研究藥物和血清蛋白相互作用的方法，及其專用的多功能微流控晶片。本發明提供了一種用於研究藥物和蛋白相互作用的多功能微流控芯 片，其特徵在於晶片有三個單元構成第一個單元為一個單T型的基本分離單元，用於基準物質的分析，來 校正檢測信號。第二個單元為多個串連的T型基本分離單元，用於繪製檢測對象的工 作曲線。第二個分離單元的上端與第一個分離單元的下遊直接相連。第三個單元也為多個串連的T型基本分離單元，用於測定混合物中檢測對象的游離濃度，來判斷有無結合及測定相應的參數。第三個分離單元 的上端與第二個分離單元的下遊直接相連。本發明所提供的多功能微流控晶片，為了節約費用以及便於控制，三 個單元公用一個監測點。徼通道的寬度和深度在10-100微米範圍內。 第二個、第三個分離單元的基本分離單元最好為6-10個。 基於上述多功能微流控晶片，本發明還提供了一種研究藥物和血清蛋 白相互作用的方法。該方法的基本特徵在於以下過程首先將基準物質、檢測對象(蛋白或者藥物)的不同濃度溶液、按不 同比例混合的藥物和蛋白的混合物分別放入第一個、第二個、第三個單元 的相應的樣品池中。然後對第一個單元的儲液池、緩衝液、廢液池施加電 壓，進行進樣、，分離操作。當基準物質的峰出現後，依次對第二個、第三 個單元的各個基本分離單元的樣品池、緩衝池、廢液池施加電壓，使樣品進行進樣、分離的操作。在上述的操作中，維持相同的進樣時間、進樣場強和分離場強。但對使用的場強無特殊要求，只要在該場強下能夠獲得檢 測對象的較好峰形，即可。以基準物質校正檢測信號下，根據第二個單元 的數據，繪製濃度-峰高或者峰面積工作曲線，然後以次為依據測定第三個 單元中各混合物中檢測對象的游離濃度，從而得到結合常數和結合位點數 值。本發明所用的基本分離單元為簡單的，帶有3個儲液池的T型單元。 短通道為樣品通道，長通道為分離通道，儲液池中放樣品的一段為樣品通 道的進樣端，分離通道上下遊端的為裝有緩衝液的緩衝池、廢液池。 微流控晶片技術是當前儀器分析的研究熱門和重點，其主要以分析化學和 生物化學為基礎，利用微機電加工技術，在矽、玻璃、石英、高聚物表面 加工出10-100微米的微通道網絡，主要以電滲流和電泳流為驅動力，通過 改變驅動電壓，控制流體在微通道網絡中的流動方向和速率，從而實現對 目標分析物的採樣、稀釋、富集、萃取、混合、反應、分離、檢測等。但 是到目前為止，微流控晶片用於研究藥物和血清蛋白相互作用報導非常之 少。本發明創造性地設計了用於藥物篩選的多功能微流控晶片，可實現通 過一次在線分析得到結合常數和結合位點數值，這點還未見報導。整個實 驗可以在幾分鐘內完成，樣品消耗在微升級。本發明與平衡透析、親和色 譜、超濾、親和電泳等已經用於藥物蛋白相互作用的研究方法比，具有快 速、靈敏、高分離效率、樣品用量少等優勢。總之，本發明可在一塊小小 的槊料或玻璃片上，非常短的時間內完成藥物和血清蛋白之間相互作用的 研究，具有很髙的靈敏度和低的檢測限。


圖1為本發明的結構原理圖；圖2為實施例1中的人血清白蛋白的工作曲線；圖3為實施例1中的人血清白蛋白和肝素混合前後的電泳譜圖；圖4為實施例2中的人血清白蛋白的工作曲線；圖5為實施例2中的人血清白蛋白和不同濃度的卟啉混合的電泳譜圖。
具體實施例方式如圖1所示首先將基準物質、檢測對象(蛋白或者藥物)的不同濃 度溶液、按不同比例混合的藥物和蛋白的混合物分別放入第一個、第二個、 第三個單元的相應的樣品池中。然後對第一個單元的儲液池、緩衝液、廢 液池施加電壓，進行進樣、分離操作。控制進樣時間，使基準物質呈尖峰 或平臺峰。採用同樣條件依次處理其他樣品。根據第二個單元中檢測對象 的峰髙或峰面積，繪製出相應的工作曲線。再根據第三個單元中檢測對象 游離濃度的變化，判斷藥物和蛋白之間有無結合，並求出相應的結合常數 和結合位點數。實施例l肝素是一種高硫酸化的線形多聚糖。肝素具有多種生物活性，如抗凝、 抗炎、抗病毒、抗血栓和抗脂血等。肝素臨床上主要用作抗凝劑，也可用 作抗血栓和抗脂血。本實施例主要研究肝素和血清蛋白之間的相互作用。 採用羅丹名B作為基準物質。使用的玻璃晶片的微通道的寬度為50微米， 深度為15微米。將羅丹名B、人血清白蛋白(1.36-21.77UM)、人血清白蛋白和不同濃度的肝素混合液(21.77WM人血清白蛋白和125.49， 250.98， 376.50， 501.96， and 627,45 U M的肝素)分別放入第一、第二、第三個單元 的樣品池中。在第一個單元的樣品池和廢液池加上電壓，維持場強在 300V/cm，進樣19s後，在緩衝池和廢液池上加上電壓，維持場強在500 V/cm,進行分離。當羅丹名B完全通過檢測點形成平臺峰後，在同樣的條 件下依次對各個基本分離單元的樣品進行相同的操作。結果如圖2、 3所示。 從圖3中可以看出，與肝素混合後的人血清白蛋白的峰明顯降低，並且有 展寬的趨勢。這表明肝素和人血清白蛋白之間存在相互作用。從這個實驗 得到的結合常數和結合位點數值與文獻相符。整個測定過程在15分鐘內完 成，其他的分析技術根本無法在如此短的時間內完成整個分析過程。 實施例2本實施例類似於實施例1，研究的也是肝素和血清蛋白之間的相互作 用。區別在於1、 使用的玻璃晶片的微通道的尺寸不同，寬度為70微米，深度為20 微米。2、 進樣場強為500V/cm，進樣時間為lls。3、 分離場強為800V/cm。本實施例所觀察到的實驗現象與實施例1的現象吻合，所測得的結合常數和結合位點數值也與實施例1的測量值相符。但因為使用了比實施例1高的場強，整個測定過程的時間縮短至1 1分鐘。 實施例3卟啉在臨床上用作光動力學治療癌症的光敏劑。研究表明血清白蛋白可以作為卟啉的內源載體實現光動力學治療癌症。為了加深理解作用機理， 卟啉和血清白蛋白之間的相互作用常數無疑是十分重要的參數。本實施例 研究了卟啉和人血清白蛋白之間的相互作用。使用的玻璃晶片的微通道的寬度為60微米，深度為18微米。除採用螢光素鈉作為基準物質和進樣時 間改為5s外，其他操作類似實施例1。圖4、 5給出了實驗結果。從圖5中， 可以看出隨著卟啉濃度的增加，血清白蛋白的峰逐漸降低。這表明了卟啉和 血清白蛋白之間存在結合反應。所求得的結合常數及結合位點數與文獻相 符。整個分析過程在5分鐘內完成。 實施例4本實施例類似於實施例3 ,研究了卟啉和人血清白蛋白之間的相互作 用。區別在於1、 使用的玻璃晶片的微通道的尺寸不同，寬度為40微米，深度為15 微米。2、 進樣場強為600V/cm，進樣時間為2.5s。3、 分離場強為900V/cm。本實施例所觀察到的實驗現象與實施例3的現象吻合，所測得的結合 常數和結合位點數值也與實施例3的測量值相符。但因為使用了比實施例 3高的場強，整個測定過程的時間縮短至2分鐘。注在以上兩個實施例中，使用了PH7.4的磷酸緩衝液。
權利要求
1. 一種用於研究藥物和血清蛋白質之間相互作用的多功能微流控晶片，其特徵在於晶片由三個單元組成第一個單元為一個單T型的基本分離單元；第二個單元為多個串聯的單T型的基本分離單元；第三個單元為多個串連的單T型的基本分離單元；第二個、第三個單元的上遊端分別與前一個單元的下遊端相連。
2、 按照權利要求1所述用於研究藥物和血清蛋白質之間相互作用的多 功能微流控晶片，其特徵在於所述的三個單元的下遊端公用一個檢測口。
3、 按照權利要求1所述用於研究藥物和血清蛋白質之間相互作用的多 功能微流控晶片，其特徵在於三個單元公用一個緩衝池、 一個廢液池。
4、 按照權利要求書1或2的用於研究藥物和血清蛋白質之間相互作用 的多功能微流控晶片，其特徵在於所述的第二個、第三個單元的基本分離 單元為6 — 1 0個。
5、 一種研究藥物和血清蛋白質之間相互作用的方法，其特徵在於 ——使用專用的多功能微流控晶片，該多功能微流控晶片由三個單元組成第一個單元為一個單T型的基本分離單元； 第二個單元為多個串聯的單T型的基本分離單元； 第三個單元為多個串連的單T型的基本分離單元； 第二個、第三個單元的上遊端分別與前一個單元的下遊端相連；過程如下將基準物質、檢測對象蛋白或者藥物的不同濃度溶液、按不同比例混合 的藥物和蛋白的混合物分別放入第一個、第二個、第三個單元的相應的樣 品池中；然後對第一個單元的儲液池、緩衝液、廢液池施加電壓，進行進 樣、分離操作；當基準物質的峰出現後，依次對第二個、第三個單元的各 個基本分離單元的樣品池、緩衝池、廢液池施加電壓，使各個樣品在相同 的場強下進行進樣、分離的操作；以基準物質校正檢測信號下，根據第二 個單元的數據，繪製濃度-峰高或者濃度-峰面積工作曲線，然後以此曲線為 依據測定第三個單元中各混合物中檢測對象的游離濃度，從而得到結合常 數和結合位點數。
6. 按照權利要求書5所述的藥物和血清蛋白質之間相互作用的研究方 法，其特徵在於所有的樣品都在相同的場強下，進行進樣和分離。
7. 按照權利要求書5所述的藥物和血清蛋白質之間相互作用的研究方 法，其特徵在於所有樣品的進樣時間都相同。
全文摘要
一種用於研究血清蛋白和藥物相互作用的多功能微流控晶片，由三個單元組成。每個單元的分離通道上遊端與上一個單元的下遊端相連。研究過程如下將基準物質、不同濃度的檢測對象、按不同比例混合的藥物和蛋白的溶液分別放入第一個、第二個、第三個單元的樣品池中。依次對各個樣品池中的樣品進行同場強下的進樣、分離等電泳操作。以基準物質來校正檢測信號，根據第二單元的數據繪製工作曲線，根據第三單元的數據得到結合常數和結合位點數。本發明可以在蝕刻有寬度和深度在10-100微米範圍內的微通道的槊料或玻璃片上，在極短的時間內通過一次在線分析，完成藥物和蛋白相之間互作用的研究。整個實驗可以在幾分鐘內完成，樣品消耗在微升級。此外，本發明具有很高的靈敏度和低的檢測限。
文檔編號G01N33/68GK101266250SQ200710010588
公開日2008年9月17日 申請日期2007年3月14日 優先權日2007年3月14日
發明者劉曉君, 戴忠鵬, 林炳承, 秦建華 申請人:中國科學院大連化學物理研究所