嗜氣芽孢桿菌及其殺根結線蟲應用的製作方法

2024-03-02 20:22:15 2

本發明屬於微生物技術領域，具體而言，本發明涉及新的分離自海水的嗜氣芽孢桿菌，其經過發酵後具有防治根結線蟲的作用。

背景技術：

嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）多數是從海洋中分離得到的，不同的菌株具有不同的性質，例如，中國專利申請201410168127公開一種嗜氣芽孢桿菌，其保藏號為cgmccno.8840，用於降解石油烴，提高治理海洋石油汙染的效率；又如，中國專利申請201510314671公開一種嗜氣芽孢桿菌fe2，其保藏號為cgmccno.10662，其發酵上清液可完全抑制黃麴黴素的產生，用於飼料、糧食、大田作物等的黃麴黴素汙染的有效防控。

植物病原線蟲對農作物的危害大，常造成嚴重的經濟損失。目前根結線蟲的防治方法包括輪作防病、抗線蟲品種培育、化學防治和生物防治等。其中，輪作防病被廣泛使用，但對一些特殊經濟作物或特定地區無法達到合理輪作的要求，具有較大的局限性。常規抗病育種因研究進展緩慢而不被大家重視。由於化學殺線蟲藥劑的使用可以起到立竿見影的預期效果而被大家廣泛使用，但化學藥劑的長期使用帶來了一系列的副作用，如藥劑殘留造成環境汙染、次要病害猖獗發生、抗性喪失等，正逐步被限制使用。

目前還沒有發現嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）能用於防治根結線蟲對農作物的為害。本發明人憑藉長期研究積累的經驗，幸運地分離到了一株新的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus），發現其經過發酵後具有防治根結線蟲的作用。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題在於提供一種新的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）。另外，本發明還提供了該菌株的16srrna基因片段、發酵液、發酵方法以及防治根結線蟲的應用等。

具體而言，在第一方面，本發明提供了嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01，其保藏號為cgmccno.14104。該菌株分離自海水，已於2017年5月5日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱cgmcc，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所），其菌體為杆狀，大小為（0.2~0.3）µm×（1.0~1.7）µm，能運動，產芽孢，革蘭氏染色呈陽性。在lb培養基上25℃培養48h，菌落呈乳白色，凸起，邊緣規則，不透明，菌落直徑大小為1~1.5mm。本發明人發現了該菌株，尤其是其發酵液，具有防治線蟲的作用。

在第二方面，本發明提供了嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01的16srrna基因片段，其核苷酸序列如seqidno：1所示。本發明人發現了新的菌株（即，本發明第一方面的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01），從來源、鏡檢和培養等角度來看，其為嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus），通過對16srrna基因測序也從分子生物學角度鑑定了該菌株。

在第三方面，本發明提供了嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01的發酵培養基，其配方為玉米粉10g，豆粕粉10g，可溶性澱粉5g，磷酸二氫鉀1g，氯化鈉5g，蒸餾水定容至1000ml，ph為7.2-7.4。本發明第三方面的發酵培養基中的成分可以等比例地放大或縮小，例如其配方為玉米粉1g，豆粕粉1g，可溶性澱粉0.5g，磷酸二氫鉀0.1g，氯化鈉0.5g，蒸餾水定容至100ml，ph為7.2-7.4，這些也都在本發明的保護範圍內。

本發明人發現了使用本發明第三方面的發酵培養基可以培養本發明第一方面的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01，而且培養獲得的發酵液具有防治根結線蟲的作用。因此，在第四方面，本發明提供了本發明第三方面的發酵培養基在培養本發明第一方面的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01中的應用。

相應地，在第五方面，本發明提供了嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01的發酵液，其通過將本發明第一方面的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01接種於本發明第三方面的發酵培養基培養而得。

另外，在第六方面，本發明提供了嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01的發酵液的製備方法，其是將本發明第一方面的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01接種於本發明第三方面的發酵培養基培養。

優選在本發明第五或第六方面中，所述培養的條件是28-30℃（如，30℃）下振蕩培養3-5天。振蕩的條件是100-300rpm，優選是150-250rpm，如200rpm。

也優選在本發明第五或第六方面中，本發明第一方面的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01是經過活化和/或種子培養的，優選先活化然後種子培養以擴大菌量。優選其中，用2216e培養基或lb培養基進行活化和/或種子培養的。通常活化是在固體培養基上進行的，其中培養基每1000ml另加瓊脂15-20g，種子培養和發酵培養是在液體培養基中進行，其中無需加瓊脂。

在第七方面，本發明提供了本發明第一方面的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01或本發明第五方面的發酵液在防治農作物根結線蟲中的應用。

相應地，在第八方面，本發明提供了防治農作物根結線蟲的方法，向農作物或種植其的土壤施用本發明第五方面的發酵液。

優選在本發明第七或第八方面中，農作物是番茄。

在第九方面，本發明提供了本發明第二方面的16srrna基因片段在鑑定本發明第一方面的嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01中的應用。通過測定待測菌株的16srrna基因的序列，將測序結果與本發明第二方面的16srrna基因片段相比較，由此可以進行鑑定。

本發明的有益效果在於，發現了具有防治根結線蟲作用的嗜氣芽孢桿菌zdxc-01或其發酵液，該菌株生長速度快、產孢量大、抗逆性強，在植物根部能夠快速大量定殖，其防治線蟲的活性可以有效替代現有的化學農藥，具有良好的應用前景。

為了便於理解，以下將通過具體的實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，並不構成對本發明範圍的限制。依據本說明書的論述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見的。

另外，本發明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經在本文中重複敘述過一樣。

具體實施方式

以下通過實施例進一步示例性地說明本發明。如未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所知曉的，包括可以商業化委託鑑定，所用的器械和試劑也均可通過商業渠道購買。

實施例1嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01的發現及鑑定

本發明人從海水中用稀釋塗布法分離單克隆菌株，具體分離方法為：稱取1ml海水樣品溶於99ml無菌水中，振蕩使其充分混合，即獲得10-2海水稀釋液。取1ml上述海水稀釋液至9ml無菌水中，搖勻即獲得10-3海水稀釋液。相同的方法配置10-4、10-5、10-6的海水稀釋液。取10-4、10-5、10-6的海水稀釋液100μl於加瓊脂的2216e培養基平板中，用塗布器將稀釋液均勻塗布，平板置於28-30℃的恆溫箱中培養24h，將培養基上的不同形態的菌落在空白2216e培養基平板中進行劃線，純化獲得的菌株，並分別編號保存。其中，一菌株鏡檢特性為，菌體杆狀，大小為（0.2~0.3）µm×（1.0~1.7）µm，能運動，產芽孢，革蘭氏染色呈陽性；該菌株在lb培養基上25℃培養48h，菌落呈乳白色，凸起，邊緣規則，不透明，菌落直徑大小為1~1.5mm；對該菌株的16srrna基因測序，顯示其16srrna基因片段的核苷酸序列如seqidno：1所示。綜合鑑定結果，該菌株是現有技術未被公開的菌株，被命名為嗜氣芽孢桿菌（bacillusaerophilus）zdxc-01，於2017年5月5日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱cgmcc，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所），保藏號為cgmccno.14104。

實施例2抗根結線蟲發酵液的製備

大量製備嗜氣芽孢桿菌zdxc-01的發酵過程如下：

（1）將保存在試管斜面中的嗜氣芽孢桿菌zdxc-01劃線於加瓊脂的2216e培養基或lb培養基進行活化，置於28-30℃恆溫培養箱培養3天；

（2）將步驟（1）的嗜氣芽孢桿菌zdxc-01的孢子移植到2216e（酵母提取物1g，蛋白腖5g，過濾後的海水1000ml，ph7.2-7.4）或lb液體培養基（胰蛋白腖10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，蒸餾水1000ml，ph調至7.2-7.4）中，28-30℃搖床振蕩培養3天，得到種子液；

（3）按10%比例（體積比）將種子液接種到發酵培養基（玉米粉10g，豆粕粉10g，可溶性澱粉5g，磷酸二氫鉀1g，氯化鈉5g，蒸餾水1000ml，ph7.2-7.4）中，28-30℃下振蕩培養3-5天，得到嗜氣芽孢桿菌zdxc-01的抗根結線蟲發酵液。

實施例3抗番茄根結線蟲的室內離體試驗

1.1供試藥劑的準備

按照實施例2新鮮製備的嗜氣芽孢桿菌zdxc-01的抗根結線蟲發酵液。

1.2供試線蟲的準備

供試線蟲由番茄保護地的番茄病根上獲取。取番茄病根，用蒸餾水清洗表面土壤後，用解剖針挑取根結內部卵塊，放入裝有無菌水的培養皿中，28℃靜置孵化24h；收集孵化的根結線蟲二齡幼蟲，於三角瓶中輕輕混勻，獲得線蟲懸液（約100條/ml），4℃保存備用。

1.3試驗設計

以採集的番茄根結線蟲為供試線蟲，採用24孔板液體浸漬法進行抗根結線蟲活性室內測定。在24孔板中分別加入100μl線蟲懸液、100μl抗根結線蟲發酵液和300μl無菌水，用移液器輕輕吹打均勻，試驗設置三個重複，以空白髮酵培養基代替發酵液作對照。於28℃放置24h後在倒置顯微鏡下觀察，蟲體僵直或捲曲的即視為擊倒，計算線蟲校正擊倒率。向24孔板中加入600μl無菌水，觀察恢復情況，不能恢復活性的記為死亡，計算校正死亡率。

1.4計算方法

校正擊倒率(%)=100%×(處理擊倒率-對照擊倒率)/(1-對照擊倒率)

校正死亡率(%)=（1-恢復率）×校正擊倒率

1.5試驗結果

試驗結果表明，嗜氣芽孢桿菌zdxc-01發酵液對根結線蟲的校正死亡率平均為78.3%。

實施例4測定番茄根結線蟲防效的盆栽試驗

1.1供試藥劑

按照實施例2新鮮製備的嗜氣芽孢桿菌zdxc-01的抗根結線蟲發酵液；市售的1.8%阿維菌素乳油（作為陽性對照）。

1.2供試作物與防治對象：

供試作物：番茄，品種為「大明星」

防治對象：番茄根結線蟲

1.3供試土壤

供試沙壤土經100℃高溫滅菌30min，經檢查無線蟲存活後，向其中加入線蟲懸液，使土壤中根結線蟲濃度為5條/10g。加入線蟲懸液後的土壤稱為帶線土，每個花盆裝帶線土2kg。

1.4試驗設計及安排

將番茄種子用1%次氯酸鈉表面消毒10min後，用無菌水衝洗3遍，於培養皿中催芽後播種。待番茄幼苗達到5葉齡時，將長勢一致的苗子移栽到裝有帶線土的花盆中，每盆3株。試驗共有4處理，①加入50ml抗根結線蟲發酵液；②加入100ml抗根結線蟲發酵液；③加入50ml稀釋2000倍的1.8%阿維菌素乳油；④對照（加入100ml發酵培養基）。每個處理3盆番茄幼苗，試驗重複3次。

1.5試驗調查及計算方法

試驗30天及45天後檢查試驗結果。檢查時將番茄苗與土全部取出，用流水緩緩衝洗根部，直至將泥土全部衝掉，每株番茄幼苗根部分東、西、南、北、中五個方位隨機採樣，每個方位選取2個完整根，共計10個。統計番茄根部根瘤發生的嚴重程度，進行病情分級，計算防治效果。

番茄根結線蟲病情分級標準：

0級：無可見根瘤或卵塊；

1級：根瘤長度佔總根長度的1-10%；

3級：根瘤長度佔總根長度的11-30%；

5級：根瘤長度佔總根長度的31-50%；

7級：根瘤長度佔總根長度的51-70%；

9級：根瘤長度佔總根長度的71%以上；

按下列公式計算病情指數和防治效果：

病情指數=100×(∑(各病級植株數×病級數值))/(調查總數值×9)

防治效果(%)=100%×(空白對照區病指-處理區病指)/空白對照區病指

2.結果

供試藥劑對番茄根結線蟲的防治效果如表1所示。

表1嗜氣芽孢桿菌zdxc-01抗根結線蟲發酵液對番茄根結線蟲的盆栽試驗

試驗結果表明，嗜氣芽孢桿菌zdxc-01抗根結線蟲發酵液對番茄根結線蟲有可持續的較好防治效果，可以代替阿維菌素使用。番茄幼苗移栽30天後，嗜氣芽孢桿菌zdxc-01抗根結線蟲發酵液對番茄根結線蟲的防效為65.24-69.52%，嗜氣芽孢桿菌zdxc-01發酵液50ml與阿維菌素乳油的處理在防效上已經無顯著性差異。番茄幼苗移栽45天後，嗜氣芽孢桿菌zdxc-01抗根結線蟲發酵液100ml的防效為74.12%，嗜氣芽孢桿菌zdxc-01抗根結線蟲發酵液50ml與阿維菌素乳油的處理仍然無顯著性差異。

序列表

青島中達農業科技有限公司

嗜氣芽孢桿菌及其殺根結線蟲應用

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