一種建立鵝胚上皮細胞系的方法及建立的鵝胚上皮細胞系的製作方法

2024-03-02 20:26:15 1

一種建立鵝胚上皮細胞系的方法及建立的鵝胚上皮細胞系的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種建立鵝胚上皮細胞系的方法及建立的鵝胚上皮細胞系。本發明涉及一種建立鵝胚上皮細胞系的方法，其特徵在於將原代鵝胚胎組織貼壁法、差速酶消化法和單克隆篩選方法相結合，優化了原代培養條件。此方法操作方法簡便，便於推廣應用。本發明還涉及所述方法建立的鵝上皮細胞系，其保藏號為CCTCC?NO:C2014137，該細胞系的建立解決了目前尚未有完善的鵝源細胞系的問題。本發明還涉及一種用於培養和/或增殖小鵝瘟病毒、番鴨細小病毒及I型鴨肝炎病毒及新型鴨肝炎病毒的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒的待感染宿主細胞即為或包括所述的鵝胚上皮細胞系。本發明，驗證了所述鵝胚上皮細胞系對小鵝瘟病毒、番鴨細小病毒及I型鴨肝炎病毒及新型鴨肝炎病毒感染的敏感特性。
【專利說明】一種建立鵝胚上皮細胞系的方法及建立的鵝胚上皮細胞系

【技術領域】
[0001] 本發明屬於動物細胞工程【技術領域】，具體涉及一種建立鵝胚上皮細胞系的方法及 建立的鵝胚上皮細胞系。

【背景技術】
[0002] 我國是水禽生產大國，水禽產量佔世界的60%以上，其中鵝的產量約佔世界總產 量的90%以上。我國的養鵝歷史悠久，據考證，早在距今約6000年前的新石器時代，就已 開始馴養鵝。隨著我國經濟的發展及人民生活水平的不斷提高，動物性食物消費比例的增 加和消費習慣的改善，促進了農業產業結構的調整和畜牧業生產地位的提高，養鵝業因具 有產品用途廣，耗糧少，生產周轉快，投入低，產出高，社會經濟效益好等特點進一步得到社 會的認可，養鵝生產迅速發展。據統計，解放前我國僅養鵝1700萬隻，上世紀的五十年代增 加到6000萬隻，八十年代初為1. 2億隻，八十年代末發展到3億隻；根據FA0公布的數據， 2011年我國鵝存欄3. 32億隻，佔世界總量的89. 72% ;2011年我國鵝出欄6. 10億隻，佔世 界總量的93. 98% ;2012年我國鵝出欄數量接近6. 29億隻。近年仍保持穩定上升趨勢，成 為名符其實的世界養鵝大國。養鵝業每年為社會提供鵝肉、羽毛（絨），在國際上佔有優勢 地位，已成為國家出口創匯和農民增加收入的支柱產業之一。儘管養鵝業今年發展較快，但 鵝產品在國內市場仍供不應求。
[0003] 上世紀9 0年代中期以前，鵝病的傳染病只有小鵝瘟、鵝的鴨瘟病、禽出敗、副傷 寒、大腸桿菌病、流行性感冒、麴黴菌病等幾種，而90年代後期至今，隨著養鵝業的興旺發 展，國內跨省和跨區域交易及引種頻繁，為鵝病的廣泛傳播創造了條件，極易造成鵝病的 大規模流行。鵝雖然具有較強的抗病力，但伴隨我國畜禽業的發展及病原微生物的不斷變 異，過去不引起鵝發病或很少使鵝發病的一些疾病，現在已經成為養鵝生產必須預防的疾 病。近年國內鵝病流行趨勢可看出，鵝的發病種類日趨增多，除了小鵝瘟、細小病毒、禽流 感，逐漸出現了一些新的傳染病如雛鵝新型病毒性腸炎、鵝副粘病毒病、鵝出血性壞死性肝 炎、法氏囊炎、鵝鴨疫李默氏桿菌病等烈性傳染病。從現實情況看，老的傳染病繼續存在，新 的傳染病又不斷發生，加上常見多發的雛鵝感冒、中毒症（藥物、農藥、有害氣體中毒）、寄 生蟲病（重點是絛蟲），給養鵝業造成嚴重損失，成為規模養鵝業健康發展的制約因素。在 諸多的疾病中，鵝傳染性疾病相對危害較大，尤其小鵝癌病毒、細小病毒、禽流感等病毒性 疾病。
[0004] 鵝病毒的分離多是通過鵝胚或番鴨胚來分離，但是由於目前國內外尚無商品化的 無特定病原體（Specific pathogen Free, SPF)鵝胚和番鴨胚，用其分離鵝病毒存在內源病 毒幹擾等情況，影響病毒的分離。為了更好有效的分離到鵝病毒，及早檢測出病毒，預防疾 病爆發，許多國內外的學者都在進行鵝細胞系的研究。但目前尚無商品化的鵝源細胞系。因 此，現在急需對其方法改進，建立一株能夠穩定快速傳代的鵝胚細胞系。


【發明內容】

[0005] 本發明基於上述領域的空白，利用原代鵝胚胎組織貼壁法、差速酶消化法及單克 隆篩選方法相結合，優化了原代培養條件，提供了一種操作簡便，易於推廣的建立鵝胚上皮 細胞系的方法，並成功獲得了培養特性穩定、單純、高活力的鵝胚上皮細胞系。本發明的技 術方案如下：
[0006] 建立鵝胚上皮細胞系的方法，其特徵在於，包括如下步驟：
[0007] (1)原代細胞貼壁培養：無菌收集鵝胚組織，加入濃度為PBS 10mL，清洗5?10分 鍾，棄去PBS後，加入10?20mL含有抗生素的消毒液處理5?10分鐘，取出鵝胚組織並剪 成0. 5?1. 5mm3的組織塊，將組織塊平貼入培養板的孔底，每孔一塊，向培養孔加入2? 3mL培養液I，置於37°C、5% C02條件下培養至組織塊完全貼壁，然後加入培養液I至2? 3mL，在37°C、5% C02條件下培養，培養期間更換培養液；
[0008] (2)傳代培養：貼壁培養的細胞長成單層細胞後，棄去培養液I，用胰酶消化處 理，大部分成纖維樣細胞脫落，棄去脫落的細胞，在6孔板加入細胞培養液II 2-3mL，置於 37°C、5% C02條件下培養；
[0009] (3)鵝上皮細胞系的單克隆篩選：以傳代培養法連續傳代至第5代後，將細胞用胰 酶消化處理至單個細胞，然後按照平均1. 5個細胞/孔的密度接種到培養板，標記接種單個 細胞的孔，待所述單個細胞的孔中的細胞長成上皮樣細胞克隆團即得到鵝上皮細胞系的單 克隆；
[0010] 所述培養液I為含有體積比10%胎牛血清，1% -2%的鵝血清及0. 2% -1%鵝胚 尿囊液的DMEM ;
[0011] 所述培養液II為含有體積比5%新生牛血清的DMEM。
[0012] 所述胰酶消化處理指用1?5g/L的胰蛋白酶溶液消化30s?60s。
[0013] 所述含抗生素的消毒液為用PBS配製的質量百分比濃度為20%?70%的慶大黴 素溶液。
[0014] 所述鵝胚組織為來源於孵化10?12日齡的鵝胚胎除腦、眼、四肢、內臟之外的任 何組織。
[0015] 所述的方法建立的鵝胚上皮細胞系。
[0016] 所述的鵝胚上皮細胞系，其保藏號為CCTCC N0:C2014137。
[0017] 用於培養和/或增殖禽病毒的的試劑盒，其特徵在於，包含所述的鵝胚上皮細胞 系，所述鵝胚上皮細胞系用作所述禽病毒的待感染宿主細胞，所述禽病毒指小鵝瘟病毒、番 鴨細小病毒、I型鴨肝炎病毒和/或新型鴨肝炎病毒。
[0018] 所述的試劑盒，其特徵在於，還包含用於病毒培養和/或增殖的常規試劑。
[0019] 所述的鵝胚上皮細胞系在製備培養和/或增殖禽病毒的試劑盒中的用途，其特徵 在於，採用所述鵝胚上皮細胞系作為所述禽病毒的待感染宿主細胞，所述禽病毒指小鵝瘟 病毒、番鴨細小病毒、I型鴨肝炎病毒和/或新型鴨肝炎病毒。
[0020] 本發明提供的鵝胚上皮細胞系的建立方法，能夠成功獲得鵝胚上皮細胞系。便於 操作、易於推廣、限制少、成功率高。建立過程中細胞培養所用的都是最常規的培養基和試 齊IJ，除原代培養和細胞單克隆篩選加入胎牛血清外，操作簡便，不需要太貴重的儀器設備。 實驗證明，獲得的鵝胚上皮細胞系生長分裂狀態良好、純度高、體外增殖旺盛，可穩定傳代 50代以上。同時本發明還驗證了所述鵝胚上皮細胞系對小鵝瘟病毒、番鴨細小病毒及I型 鴨肝炎病毒及新型鴨肝炎病毒的敏感特性，因此，本發明所述的細胞系可廣泛用於與小鵝 瘟病毒、番鴨細小病毒及I型鴨肝炎病毒及新型鴨肝炎病毒的培養、增殖和/或分離相關的 實驗或研究中。
[0021] 本發明經過原代培養，差速消化及單克隆篩選相結合的方法提供了一種鵝胚上皮 細胞系的建立方法，建立的細胞系來自單克隆，具有純度高，形態均一，呈典型的上皮細胞 形態，連續傳代50代仍保持該形態的特點；同時細胞系還具有分裂增殖旺盛，營養要求低， 連續培養50代仍保持該旺盛的增殖特性。本發明所提供的鵝胚上皮細胞系的建立方法及 獲得的鵝胚上皮細胞系填補了目前尚未完善的鵝源細胞系技術的空白。
[0022] 本發明還提供了培養和/或增殖小鵝瘟病毒、番鴨細小病毒、I型鴨肝炎病毒及新 型鴨肝炎病毒的試劑盒，該試劑盒中的待感染宿主細胞即為或包括本發明所述的鵝胚上皮 細胞系。本發明利用小鵝瘟病毒、番鴨細小病毒、I型鴨肝炎病毒及新型鴨肝炎病毒感染所 述鵝胚上皮細胞系，並於對照細胞比對，驗證了所述細胞系對上述幾種病毒感染的敏感特 性。因此，本發明所述的鵝胚上皮細胞系可用於與上述三種病毒有關的分離、培養和/或 增殖等任何相關細胞實驗或研究中，本發明所述的試劑盒具有靈敏度高、成本較低、操作便 捷、效果良好等特點。
[0023] 生物保藏信息：
[0024] 分類命名：鵝胚上皮細胞系WWX-GEEC03
[0025] 保藏號：CCTCC N0:C2014137
[0026] 保藏日：2014年7月9日
[0027] 保減單位：中國典型培養物保減中心
[0028] 地址：中國，武漢,武漢大學郵編：430072。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 下面結合附圖和實施例對本發明作進一步描述：
[0030] 圖1為原代鵝胚細胞顯微鏡下圖；
[0031] 圖2為原代鵝胚細胞傳至第五代的顯微鏡下圖；
[0032] 圖3為鵝胚上皮細胞克隆；
[0033] 圖4為鵝胚上皮細胞系第30代細胞顯微鏡下圖；
[0034] 圖5為鵝胚上皮細胞系第50代細胞顯微鏡下圖；
[0035] 圖6為鵝胚上皮細胞系HE染色圖；
[0036] 圖7為鵝胚上皮細胞生長曲線圖；
[0037] 圖8為外源基因在鵝胚上皮細胞系中表達48h圖（pEGFP-Nl質粒轉染）；
[0038] 圖9為鵝胚上皮細胞周期圖；
[0039] 圖10為鵝胚上皮細胞接毒試驗中未接毒對照圖；
[0040] 圖11為鵝胚上皮細胞接種番鴨細小病毒病變圖；
[0041] 圖12為鵝胚上皮細胞接種小鵝瘟病毒病變圖；
[0042] 圖13為鵝胚上皮細胞接種I型鴨肝炎病毒病變圖；
[0043] 圖14為鵝胚上皮細胞接種新型鴨肝炎病毒病變圖。

【具體實施方式】
[0044] 下面結合【具體實施方式】對本發明作進一步的詳細說明，但並不限制本發明的範 圍。如無特殊說明，下述實施例中使用的操作均為常規方法，所採用的試劑均可以商購獲 得。
[0045] 主要儀器設備
[0046] 1、倒置相差突光顯微鏡：
[0047] 2、_70°C超低溫冰箱：
[0048] 3、C02 培養箱：日本三洋 SANY0-MC0-15AC
[0049] 4、液氮貯存器：四川東亞YES-S0B-125F ;
[0050] 5、電泳儀：北京六一廠DYY 6C ;
[0051] 6、電泳槽：北京六一廠DYC-24A:
[0052] 7、高性能無菌實驗臺
[0053] 8、流式細胞儀
[0054] 主要試劑
[0055] 1、DMEM(Dulbecco's modified eagle medium)
[0056] 2、載體pEGEP-Nl :由本實驗室保存。
[0057] 3、膜蛋白酶（Trypsin 1:250)，吉姆薩（Giemsa) :Amresco ;
[0058] 4、特級胎牛血清（Defined FBS) :Gibco ;
[0059] 5、臺盼藍（Trypan Blue)，Triton(曲拉通 ^-100)99% ;
[0060] 6、二甲基亞諷：invitrogen ;
[0061] 7、脂質體 2000 :invitrogen。
[0062] 鴨胚上皮細胞培養所用液體配製：
[0063] 8、DMEM培養液：DMEM 9. 6g，溶於超純水中，用NaHC03約3. 2g調節pH至7. 2? 7. 4,加水定容至1L，用磁力攪拌器攪拌混勻，0. 22 μ m濾膜過濾除菌，500ml/瓶分裝，貯存 於 4。。。
[0064] 9、培養液I :DMEM培養液中加入終濃度為10% (V/V)胎牛血清，1% -2% (V/V)的 鵝血清及〇. 2% -1 % (V/V)鵝胚尿囊液，0. 22 μ m濾膜過濾500mL/瓶分裝，4°C貯存。
[0065] 培養液II :DMEM培養液中加入終濃度為5% (V/V)新生牛血清，0. 22 μ m濾膜過濾 500mL/瓶分裝，4°C貯存。
[0066] 10、雙抗貯存液：100萬IU的鏈黴素 4支，80萬IU的青黴素 5支溶於400mL滅菌 去離子水中。
[0067] 11、1XPBS 緩衝液：NaCl 14. 00g，KC1 0· 10g，Na2HP04X 12H20 1. 45g， KH2P040. 10g，加超純水定容至500mL，pH為7. 2,高壓滅菌密封后4°C貯存。
[0068] 12、0· 1%?0.5% (質量體積比）胰蛋白酶溶液：1.25g胰蛋白酶乾粉溶於PBS中， 定容至500mL，pH為7. 2?7. 4,0. 22 μ m濾膜過濾分裝，-20°C貯存。
[0069] 13、細胞凍存液：將5mL DMS0加入45mL全培養液（含體積比15% FBS的全培養 液）中，用〇. 22 μ m濾膜過濾100mL/瓶分裝，貯存於-20°c冰箱。
[0070] 14、D-Hanks 培養基：稱取 NaCl 8. 0g，KC1 0· 4g，Na2HP04 · 12H20 0· 133g， KH2P040. 06g，NaHC020. 35g，酚紅0. 02g，將上述成分加入燒杯中，加 lOOmL超純水攪拌使固 體粉末充分溶解，再補加超純水最後定容至l〇〇〇mL。
[0071] 如無特別說明，本發明所用試劑均為本領域常規試劑。
[0072] 主要生物材料
[0073] 鵝胚組織：購自養殖場
[0074] 小鵝瘟病毒：由山東省濱州畜牧獸醫研究院分離保存。（參考文獻：李書光，王 豔，劉吉山，苗立中，沈志強.山東省小鵝瘟病毒BZ株的分離鑑定及VP3基因的序列分 析[J].黑龍江畜牧獸醫，2010, 11:114-115.);
[0075] 番鴨細小病毒：由山東省濱州畜牧獸醫研究院分離保存。（參考文獻：王文秀，莫 玲，王豔，張松林，高三陽，沈志強.番鴨細小病毒的分離及其VP1基因序列[J].中國 家禽，2014, 36(8) :51-53.);
[0076] I型鴨肝炎病毒：由山東省濱州畜牧獸醫研究院分離保存。（參考文獻：謝金文， 苗立中，王豔，肖越強，王金良，沈志強.鴨肝炎病毒的分離鑑定及其理化和生物學特性 初步研究[J].安徽農業大學學報，2011，38(1) :51-54.)。
[0077] 新型鴨肝炎病毒：由山東省濱州畜牧獸醫研究院分離保存，本專利用的是文 獻中提到的山東株（SD株）。（參考文獻：趙金花，沈志強，朱輝，李峰，甄洪花，苗 立中，單虎.新型鴨肝炎病毒的分離鑑定及VP1基因序列分析[J].中國預防獸醫學 報，2011，33(10) :772-780.)。
[0078] 實施例1鵝胚上皮細胞系的建立
[0079] 按照下述步驟建立本發明所述的鵝胚上皮細胞系：
[0080] (1)無菌採取11?13日齡的鵝胚胎組織，用滅菌剪刀剪去頭、四肢和內臟器官後 放入10mL的玻璃燒杯中，加入濃度為PBS 10mL，清洗5?10分鐘；棄去PBS後，加入10? 20mL用PBS配製的質量百分比濃度為20 %?70 %的慶大黴素溶液處理5?10分鐘；
[0081] (2)取出鴨胚組織並剪成0. 5?1. 5mm3的組織塊，將組織塊平貼入6孔培養板 的孔底，每孔一塊，向培養孔加入2?3mL含有體積比10%胎牛血清，1% -2%的鵝血清及 0. 2% -1%鵝胚尿囊液的DMEM培養液，置於37°C、5% C02條件下培養至組織塊完全貼壁， 然後加入上述DMEM培養液至2?3mL，在37°C、5% C02條件下培養，培養期間更換培養液；
[0082] (3)待貼壁培養的細胞長成單層後，用1?5g/L的胰蛋白酶溶液消化30s?60s 並進行傳代培養。原代鵝胚細胞大部分為成纖維樣細胞，少數細胞呈上皮樣形態。成纖維 細胞對胰酶敏感，單層細胞棄去上述DMEM培養液後，加入2. 5g/L胰酶消化30s-60s，大部分 成纖維樣細胞脫落，棄去脫落的細胞，在6孔板加入含有體積比5 %新生牛血清的DMEM培養 液2-3mL，置於37°C、5% C02條件下培養；
[0083] (4)以傳代培養法連續傳代至第5代後，將細胞用2. 5g/L胰酶消化至單個細胞，然 後按照平均1. 5個細胞/孔的密度接種到培養板，標記接種單個細胞的孔，待這些單個細胞 的孔中的細胞長成上皮樣細胞克隆團即得到鵝上皮細胞系的單克隆。
[0084] (5)單克隆鵝上皮細胞系的傳代培養
[0085] 用1?5g/L的胰蛋白酶溶液消化成團的單細胞系30s?60s，然後繼代培養50 代，即完成了本發明所述的鵝胚上皮細胞系的建立。
[0086] 其中一個單細胞系送保藏，信息如下：
[0087] 分類命名：鵝胚上皮細胞系WWX-GEEC03
[0088] 保藏號：CCTCC N0:C2014137
[0089] 保藏日：2014年7月9日
[0090] 保藏單位：中國典型培養物保藏中心
[0091] 地址：中國，武漢,武漢大學郵編：430072
[0092] 實施例2鵝胚上皮細胞系的生物學特性分析
[0093] 1.形態學觀察
[0094] 通過倒置顯微鏡觀察，建立的鵝胚上皮細胞系F30代（圖4)和F50代（圖5)與原 代細胞（圖1)相比形態有明顯差異，原代細胞含有多種雜細胞，大多數細胞形態為長梭狀， 少數為多角形和卵圓形，而建立的上皮細胞系是由細胞單克隆獲得，其純度高於99. 9%，均 為上皮樣細胞，HE染色也顯示細胞呈多角形或短梭狀的的上皮樣細胞形態（圖6)，有圓形 的細胞核，細胞生長與分裂能力十分旺盛，群體倍增時間僅為17. lh。
[0095] 2.生長曲線測定
[0096] 取待測30代、50代生長狀態良好的細胞，增至接近匯合時，用常規方法消化細胞 製成細胞懸液並計數。按1X 104個/孔細胞量向24孔培養板內分別接種細胞，於37°C C02 培養箱中繼續培養。從接種時間算起，每隔24h用2. 5g/L胰蛋白消化細胞，用全自動自動計 數儀計數3孔內的細胞密度，算出平均值，如此至第8天結束。以培養時間（d)為橫坐標、 細胞密度為縱坐標，將結果在坐標紙上繪圖，即得培養細胞的生長曲線。
[0097] 通過對所培養的鵝胚上皮細胞用常規方法製備細胞懸液，計數，接種24孔培養 板，每孔lmL細胞懸液，對接種於24孔培養板的細胞進行連續7d定時計數，記錄各次細胞 密度，繪製而成培養細胞生長曲線如圖7所示，接種後第2d細胞數開始增加，第3d進入對 數生長期，第6d細胞生長緩慢，細胞生長期總體趨勢均呈S型，本發明方法培養的鵝胚上皮 細胞系的純度為99. 9%，細胞群體倍增時間（PDT)為17. lh，證明細胞純度高、生命力旺盛。
[0098] 3.細胞系周期測定
[0099] (1)將待測所述鵝胚上皮細胞系樣本用2. 5g/L胰酶消化後製成單細胞懸液，然後 800轉/分鐘離心8分鐘，棄去上清。
[0100] ⑵用4°c預冷的700mL/L冷乙醇固定，4°C保存，至少固定18小時。
[0101] (3)調整細胞濃度為106個/mL，37°C孵育30分鐘，進行流式細胞儀分析，見圖9。
[0102] 實施例3鵝胚上皮細胞系對番鴨細小病毒的敏感性驗證
[0103] 1.方法
[0104] 取鵝胚上皮細胞系第50代細胞，待長成80%單層時吸棄培養液並以D-Hanks培 養基洗2次後接種番鴨細小病毒，37°C吸附1小時，棄去病毒液並補充DMEM維持液（含有 1%新生牛血清）培養，同時設空白對照（不接種番鴨細小病毒的鵝胚上皮細胞系）。同樣 方法接種小鵝瘟病毒、I型鴨肝炎病毒、新型鴨肝炎病毒。
[0105] 2.結果
[0106] 經觀察所述鵝胚上皮細胞對番鴨細小病毒敏感，96h內感染細胞均產生特有的細 胞病變，見圖11 ;而對照細胞形態正常，見圖10。
[0107] 實施例4鵝胚上皮細胞系對小鵝瘟病毒的敏感性驗證
[0108] 按照實施例3所述的方法驗證鵝胚上皮細胞系對小鵝瘟病毒的敏感性，經觀察所 述鵝胚上皮細胞對小鵝瘟病毒敏感，96h內感染細胞均產生特有的細胞病變，見圖12 ;而對 照細胞形態正常，見圖10。
[0109] 實施例5鵝胚上皮細胞系對I型鴨肝炎病毒的敏感性驗證
[0110] 按照實施例3所述的方法驗證鵝胚上皮細胞系對I型鴨肝炎病毒的敏感性，經觀 察所述鵝胚上皮細胞對I型鴨肝炎病毒敏感，96h內感染細胞均產生特有的細胞病變，見圖 13 ;而對照細胞形態正常，見圖10。
[0111] 實施例6鵝胚上皮細胞系對新型鴨肝炎病毒的敏感性驗證
[0112] 按照實施例3所述的方法驗證鵝胚上皮細胞系對新型鴨肝炎病毒的敏感性，經觀 察所述鵝胚上皮細胞對新型鴨肝炎病毒敏感，96h內感染細胞均產生特有的細胞病變，見圖 14 ;而對照細胞形態正常，見圖10。
【權利要求】
1. 一種建立鵝胚上皮細胞系的方法，其特徵在於，包括如下步驟： (1) 原代細胞貼壁培養：無菌收集鵝胚組織，加入濃度為PBS 10mL，清洗5?10分鐘， 棄去PBS後，加入10?20mL含有抗生素的消毒液處理5?10分鐘，取出鵝胚組織並剪成 0. 5?1. 5_3的組織塊，將組織塊平貼入培養板的孔底，每孔一塊，向培養孔加入2?3mL 培養液I，置於37°C、5% C02條件下培養至組織塊完全貼壁，然後加入培養液I至2?3mL， 在37°C、5% C02條件下培養，培養期間更換培養液； (2) 傳代培養：貼壁培養的細胞長成單層細胞後，棄去培養液I，用胰酶消化處理，大部 分成纖維樣細胞脫落，棄去脫落的細胞，在6孔板加入細胞培養液II 2-3mL，置於37°C、5% C02條件下培養； (3) 鵝上皮細胞系的單克隆篩選：以傳代培養法連續傳代至第5代後，將細胞用胰酶消 化處理至單個細胞，然後按照平均1. 5個細胞/孔的密度接種到培養板，標記接種單個細 胞的孔，待所述單個細胞的孔中的細胞長成上皮樣細胞克隆團即得到鵝上皮細胞系的單克 隆； 所述培養液I為含有體積比10%胎牛血清，1% -2%的鵝血清及0. 2% -1 %鵝胚尿囊 液的DMHM ; 所述培養液II為含有體積比5%新生牛血清的DMEM。
2. 根據權利要求1所述的方法，所述胰酶消化處理指用1?5g/L的胰蛋白酶溶液消化 30s ?60s。
3. 根據權利要求1所述的方法，所述含抗生素的消毒液為用PBS配製的質量百分比濃 度為20 %?70%的慶大黴素溶液。
4. 根據權利要求1?4任一所述的方法，所述鵝胚組織為來源於孵化10?12日齡的 鵝胚胎除腦、眼、四肢、內臟之外的任何組織。
5. 權利權利要求1?4任一所述的方法建立的鵝胚上皮細胞系。
6. 根據權利要求5所述的鵝胚上皮細胞系，其保藏號為CCTCC C2014137。
7. 用於培養和/或增殖禽病毒的的試劑盒，其特徵在於，包含權利要求5或6所述的鵝 胚上皮細胞系，所述鵝胚上皮細胞系用作所述禽病毒的待感染宿主細胞，所述禽病毒指小 鵝瘟病毒、番鴨細小病毒、I型鴨肝炎病毒和/或新型鴨肝炎病毒。
8. 根據權利要求7所述的試劑盒，其特徵在於，還包含用於病毒培養和/或增殖的常規 試劑。
9. 權利要求5或6所述的鵝胚上皮細胞系在製備培養和/或增殖禽病毒的試劑盒中的 用途，其特徵在於，採用所述鵝胚上皮細胞系作為所述禽病毒的待感染宿主細胞，所述禽病 毒指小鵝瘟病毒、番鴨細小病毒、I型鴨肝炎病毒和/或新型鴨肝炎病毒。
【文檔編號】C12R1/91GK104152403SQ201410408788
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月19日 優先權日:2014年8月19日
【發明者】王文秀, 沈志強, 於金枝 申請人:山東省濱州畜牧獸醫研究院