一種米麴黴分泌製備錳過氧化物酶的方法
2024-03-02 16:16:15 1
一種米麴黴分泌製備錳過氧化物酶的方法
【專利摘要】本發明一種米麴黴分泌製備錳過氧化物酶的方法，涉及生物工程領域。涉及利用秸稈為主要原料，通過米麴黴（Aspergillusoryzae）發酵，生產錳過氧化物酶的方法，其生產工藝流程是秸稈經過粉碎、預溼等預處理工藝，米麴黴經過液體搖瓶培養、一級種子培養、與秸稈混合進行固態發酵，得到含有錳過氧化物酶的秸稈發酵物，酶活性3～1000U/g幹發酵物，發酵物經過水提取、分子截留、冷凍乾燥可以獲得酶製劑粗品,酶活性達到1000～10000U/g幹粗品。此發酵工藝簡便，不會對環境造成汙染，也不會對資源造成浪費。採用此方法製得的錳過氧化物酶可以用於降解木質素大分子結構、釋放小分子物質，提高含有木質素秸稈的消化利用率，從而有助於提高秸稈的飼用價值。
【專利說明】一種米麴黴分泌製備錳過氧化物酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物工程領域，特指未經高溫、高壓處理的秸杆培養基經發酵製備錳過氧化物酶製品，該製品用水提取，提取液經過分子截留，冷凍乾燥獲得錳過氧化物酶的粗品。
【背景技術】
[0002]我國是農業大國，每年農作物秸杆年產量逾6億噸，除少量被用作紡織、造紙行業，但大部分以堆積、焚燒的形式傾入環境，既浪費了資源也給環境造成了極大地危害。
[0003]秸杆含有植物光合作用所積累的一半以上的能量，富含粗糖、粗蛋白質等有利於家畜家禽所需的成分，作為非競爭性的飼料資源，只要能夠進行合理的加工調製，用來飼餵畜禽，特別是用來飼餵牛、羊等反芻家畜，有可能成為優質的飼料資源。同時，我國又是一個飼料(尤其是蛋白質飼料)嚴重短缺的大國，每年需進口大量的魚粉以彌補蛋白質飼料的不足。所以能否將秸杆纖維轉化為動物可利用且營養價值高的蛋白質飼料，以解決飼料需求的嚴重不足，就顯得尤為重要。
[0004]植物的秸杆主要有木質素和纖維素構成。木質素是一類由苯酚和非苯酚結構單元通過醚鍵和碳碳鍵等連接而成的具有芳香族特性的天然聚合物，其在組分種類和連接鍵類型方面的多樣性，意味著其結構的異質性與不規則性，也決定了對木質素進行生物降解的複雜性和特殊性，且其在植物細胞壁中與半纖維素以共價鍵形式結合後，將纖維素分子包埋在其中，形成堅固的天然屏障，使一般的微生物很難進入其中分解纖維素，因此，木質素的降解也是能否有效利用秸杆資源的關鍵因素。
[0005]目前降解秸杆的主要方法中有代表性的包括蒸汽汽爆預處理、硫酸預處理、氫氧化鈉預處理、氨水預處理和生物預處理等5種方法。蒸汽汽爆則是以高壓蒸汽滲入纖維內部，以氣流的方式從封閉的空 隙中釋放出來，纖維發生一定的機械斷裂，使原料中大部分半纖維素和少量木質素、纖維素降解溶出，該方法成分較高，需要大型的設備，木質素還需要處理；酸處理法是利用硫酸水解糖苷鍵、酯鍵等，使玉米秸杆纖維的網狀結構疏鬆，但是該方法耗用大量的有機酸或無機酸，木質素仍需要進一步處理，不適應大規模的工業化生產。鹼處理和氨水處理是利用木質素溶於鹼性溶液，與酸處理一樣同樣存在環境汙染問題。這些方法普遍都存在反應條件較難掌握、反應溫度高、處理時間長、佔用空間大、處理效果不理想，不能去除木質纖維素等問題，近年來生物處理秸杆越來越受到人們的重視，生物降解木質素的關鍵是微生物能夠分泌降解木質素的酶:錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶和漆酶。
[0006]目前，已有不少專利涉及微生物分泌錳過氧化物酶，如專利(申請號/專利號:200810064332)介紹了強化白腐真菌分泌錳過氧化物酶方法，此方法比現有的白腐真菌發酵錳過氧化物酶的方法提前了三天，發酵周期縮短了一半，酶產量高於900U/L ;專利(申請號:200680022879)目標是增加白腐擔子菌生產胞外漆酶和錳過氧化物酶的產量，並降低成本，此方法相對於現有培養技術，可使漆酶和錳過氧化物酶產量顯著增加；專利(申請號:200910079781)介紹了另一種錳過氧化物酶產生菌——哈茨木黴，該菌可在短期內(4-5天)形成大量分生孢子，其形成分生孢子的速度比黃孢原毛平革菌快約一周時間，且產孢子能力可以達到黃孢原毛平革菌的10倍，而黃孢原毛平革菌則是擔子菌中生長和產孢子能力較強的菌種。米麴黴是被美國食品藥物管理局(FDA)和美國飼料公定協會(AAFCO)、我國農業部認定的可以直接飼餵動物的飼料級微生物添加劑菌種，但是未見米麴黴分泌錳過氧化物酶的專利及其相關文獻報導。
[0007]本發明人經過深入的研究，摸索出一種以秸杆為主要原料，通過米麴黴菌體固體培養獲得錳過氧化物酶的方法。該方法與過去的方法不同之處在於所使用的菌種是被美國食品藥物管理局(FDA)和美國飼料公定協會(AAFCO)、我國農業部認定的可以直接飼餵動物的飼料級微生物添加劑的米麴黴菌種，採用秸杆作為主要原料，通過固態發酵獲得含有錳過氧化物酶的發酵物製品，該製品可以經過進一步提取製得錳過氧化物酶粗品。
【發明內容】
[0008]本發明一個目的是提供了一種以米麴黴為菌種，以秸杆為原料進行固態發酵的方法，以及由該方法製備的米麴黴發酵物，該發酵物中含有錳過氧化物酶。
[0009]本發明所述的一種米麴黴分泌製備錳過氧化物酶的方法，按照下述步驟進行:以米麴黴為出發菌株，以含有木質素的農作物秸杆為原料，進行試管擴大培養、液體搖瓶培養、一級種子培養和固體發酵培養，得到含有錳過氧化物酶的固態發酵物，然後進行提取得到含有錳過氧化物酶的米麴黴固體發酵物。
[0010]其中所述的菌種是米麴黴任何一種菌種，如中國普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)、中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)、中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)、中國醫學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)、國家獸醫微生物菌種保藏中心(CVCC)和抗生素菌種保藏管理中心等等保藏的菌種。
[0011]其中所述的含有木質素的農作物秸杆原料是任意一種秸杆，如玉米秸杆、稻草秸杆、麥秸杆、高粱秸杆、大豆秸杆、棉花秸杆等等，秸杆首先經過粉碎，過20-100目的篩。
[0012]其中所述的試管擴大培養工藝中，其擴大培養基為馬鈴薯蔗糖培養基；
其中所述的液體搖瓶培養和一級種子培養的培養基均為:葡萄糖5-30克，酒石酸銨
0.1-5克，苯甲醇0.2-3克，硫酸鎂0.2-I克，吐溫80 0.5-10克，磷酸二氫鉀2-9克，鄰苯二甲酸3-18克，加水定容到I升，調pH 5-8，120-140°C滅菌20-40分鐘；
其中所述的搖瓶培養工藝條件為，接種一環米麴黴試管斜面孢子於裝有體積比16-48%培養基的三角瓶中，在轉速:150轉/分，25-35°C，培養24-72小時；在進行搖瓶培養之前，首先將米麴黴菌種接入新配置的馬鈴薯蔗糖培養基中進行培養，培養溫度25-35°C，培養時間48-144小時；4-10°C保存備用。
[0013]其中所述的一級種子培養工藝為，按I-20% (體積比)的接種量將搖瓶培養種子液接種到一級種子培養基中，在溫度25-35°C，攪拌轉速50-200轉/分，通氣量0.2-2: I體積/體積/每分鐘(通氣氣體體積/發酵液體積/每分鐘),培養18-72小時；
其中所述的固體發酵培養中培養基組成為:秸杆10千克，葡萄糖0.5-3千克，黃豆餅粉0.5-2千克；硫酸銅5-15克，硫酸亞鐵5-15克，硫酸錳5-20克，水20-60千克，該培養基各成分可以按此比例放大；
其中所述的發酵工藝為:按2~20% (種子液體積/發酵培養基重量)，培養料厚度為
0.1~0.4米，料寬0.5~2米，長度不限，通氣量為0.3~1.5:1 (氣體體積/發酵培養基重量)/每分鐘，培養時間為3天~23天，中途翻料1~2次。
[0014]其中所述的生產錳過氧化物酶粗品的工藝，將得到的固態發酵物粉碎，過20~100目篩，粉碎的發酵培養物與水按1:10~50比例混合，50~300轉/分鐘攪拌，5~10°c提取4~8小時，抽濾，濾渣用10~50倍的水混合，50~300轉/分鐘攪拌，5~10°C提取4~8小時，抽濾，兩次濾液合併，通過分子量5000~10000的膜截留濃縮50~100倍，-20°C冷凍乾燥，得到酶製劑粗品。
[0015]由此工藝得到的酶製劑粗品，色質白色至褐色，錳過氧化物酶活性可達到1000~10000U/g幹粗品。
[0016]由本發明獲得秸杆發酵物含有大量的黃綠色米麴黴孢子，發酵物桔黃色至褐色，含有酒麴香味，錳過氧化物酶活性達到3~1000U/g幹發酵物。
[0017]根據本發明所述的發酵培養工藝，結合本領域的基本知識，可以根據生產需要，增加二級、三級甚至四級種子罐，進一步擴大固態發酵生產規模，以進行工業化生產。二級、三級甚至四級種子罐採用的培養基與搖瓶培養基和一級種子培養基相同，接種量為5~20%，培養條件同於一級種子培養，
採用此工藝的優點採用固態發酵，並且不經高溫高壓處理，這樣不會給環境造成汙染，也不會浪費資源。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為本專利的工藝流程圖.【具體實施方式】
[0019]根據此工藝採用的錳過氧化物酶測定方法為:準確稱取I克發酵物或酶製劑粗品，溶於50mL水中，室溫振湯2小時，抽濾，濾液定各至50mL,即為酶液。在4 mL反應體系中含pH 4.5 50 mmol/L的乳酸鈉緩衝液3.4 mL, 1.6 mmol/L的硫酸錳溶液0.1 mL，酶液X mL,蒸懼水(0.4-X) mL預熱至37°C時,加1.6 mmol/L的H2O2溶液0.1 mL啟動反應。在240 nm紫外光處，測定反應4 min內OD值變化值。在對照組中，以煮沸滅活15 min酶液代替原酶液，以蒸餾水代替H2O2溶液，其他反應物不變。每分鐘使I U mol/L的Mn2+轉化為Mn3+所需的酶量為1個酶活力單位(U)。
【權利要求】
1.一種米麴黴分泌製備錳過氧化物酶的方法，其特徵在於按照下述步驟進行:以米麴黴為出發菌株，以含有木質素的農作物秸杆為原料，進行試管擴大培養、液體搖瓶培養、一級種子培養和固體發酵培養，得到含有錳過氧化物酶的固態發酵物，然後進行提取得到含有錳過氧化物酶的米麴黴固體發酵物。
2.根據權利要求1所述的一種米麴黴分泌製備錳過氧化物酶的方法，其特徵在於其中所述的菌種是米麴黴任何一種菌種，如中國普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)、中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC)、中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)、中國醫學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)、國家獸醫微生物菌種保藏中心(CVCC)和抗生素菌種保藏管理中心等等保藏的菌種。
3.根據權利要求1所述的一種米麴黴分泌製備錳過氧化物酶的方法，其特徵在於其中所述的含有木質素的農作物秸杆原料是任意一種秸杆，如玉米秸杆、稻草秸杆、麥秸杆、高粱秸杆、大豆秸杆、棉花秸杆等等，秸杆首先經過粉碎，過20-100目的篩。
4.根據權利要求1所述的一種米麴黴分泌製備錳過氧化物酶的方法，其特徵在於其中所述的試管擴大培養工藝中，其擴大培養基為馬鈴薯蔗糖培養基。
5.根據權利要求1所述的一種米麴黴分泌製備錳過氧化物酶的方法，其特徵在於其中所述的液體搖瓶培養和一級種子培養的培養基均為:葡萄糖5-30克，酒石酸銨0.1-5克，苯甲醇0.2-3克，硫酸鎂0.2-I克，吐溫80 0.5-10克，磷酸二氫鉀2-9克，鄰苯二甲酸3-18克，加水定容到I升，調pH 5-8，120-140°C滅菌20-40分鐘。
6.根據權利要求1所述的一種米麴黴分泌製備錳過氧化物酶的方法，其特徵在於其中所述的搖瓶培養工藝條件為，接種一環米麴黴試管斜面孢子於裝有體積比16-48%培養基的三角瓶中，在轉速:150轉/分，25-35°C，培養24-72小時；在進行搖瓶培養之前，首先將米麴黴菌種接入新配置的馬鈴薯蔗糖培養基中進行培養，培養溫度25-35°C，培養時間48-144小時；4-10°C保存備用。
7.根據權利要求1所述 的一種米麴黴分泌製備錳過氧化物酶的方法，其特徵在於其中所述的一級種子培養工藝為，按體積比I-20%的接種量將搖瓶培養種子液接種到一級種子培養基中，在溫度25-35°C，攪拌轉速50-200轉/分，通氣量0.2-2:1體積/體積/每分鐘(通氣氣體體積/發酵液體積/每分鐘),培養18-72小時。
8.根據權利要求1所述的一種米麴黴分泌製備錳過氧化物酶的方法，其特徵在於其中所述的固體發酵培養中培養基組成為:秸杆10千克，葡萄糖0.5-3千克，黃豆餅粉0.5-2千克；硫酸銅5-15克，硫酸亞鐵5-15克，硫酸錳5-20克，水20-60千克，該培養基各成分可以按此比例放大。
9.根據權利要求1所述的一種米麴黴分泌製備錳過氧化物酶的方法，其特徵在於其中所述的發酵工藝為:按2-20% (種子液體積/發酵培養基重量)，培養料厚度為0.1-0.4米，料寬0.5-2米，長度不限，通氣量為0.3-1.5:1 (氣體體積/發酵培養基重量)/分鐘，培養時間為3天-23天，中途翻料I-2次。
10.根據權利要求1所述的一種米麴黴分泌製備錳過氧化物酶的方法，其特徵在於其中所述的生產錳過氧化物酶粗品的工藝，將得到的固態發酵物粉碎，過20-100目篩，粉碎的發酵培養物與水按1:10-50比例混合，50-300轉/分鐘攪拌，5-10°C提取4-8小時，抽濾，濾渣用10-50倍的水混合，50-300轉/分鐘攪拌，5-10°C提取4-8小時，抽濾，兩次濾液合併，通過分子量5000-10000的膜截留濃縮50-100倍，-20°C冷凍乾燥，得到酶製劑粗 品。
【文檔編號】C12R1/69GK103451162SQ201210169836
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年5月29日 優先權日:2012年5月29日
【發明者】張志才, 陳鈞, 任曉鋒, 李佳少, 黃達明 申請人:江蘇大學